AT396116B - Verfahren zum differenzieren von streptococcen - Google Patents

Description

AT 396 116 B

Diese Erfindung betrifft eine Lösung des Verdünnungsmittels für die Herstellung einer normalerweise trockenen, selbständigen, verwendungsbereiten Schicht eines künstlichen Bakterien-Nährbodens, der unter anaeroben Bedingungen für das selektive Wachstum von Laktobazillen-Stämmen spezifisch ist, eine Kombination einer normalerweise trockenen, selbständigen, verwendungsbereiten Schicht eines künstlichen Bakterien-Nährbodens und eines Verdünnungsmittels, das so dargestellt wird, daß es die verwendungsbereite Schicht des künstlichen Nährbodens unter anaeroben Bedingungen für das selektive Wachstum von Laktobazillen-Stämmen spezifisch macht, um Milchsäure-Kokken auszuschließen, sowie ein Verfahren zur qualitativen Sicherheitsprüfung eines Futter-Inokuliermittels, um das Vorhandensein von Laktobazillen-Stämmen zu bestimmen, ohne daß auch Kokken gezählt werden.

Früher wurden Platten mit einem trockenen künstlichen Nährboden entwickelt, wobei ein typisches Beispiel dafür von der 3M-Company (Medical Products Divison, St. Paul, Minnesota 55144, unter der Warenbezeichnung Petrifilm) vertrieben wird, deren Produkte typisch aus einem trockenen, selbständigen, verwendungsbereiten künstlichen Nährboden für Bakterien bestehen, mit dem ein Schichtträger überzogen ist, wobei darüber beispielsweise eine Polyäthylenschicht liegt. Der Träger trägt Nährstoffe für ein Verfahren von Standard Method, sowie ein kaltwasserlösliches gelbindendes Mittel. Die Überzugsschicht ist weiters mit dem gelbildenden Mittel sowie zusätzlich mit einem 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid-Indikatorfarbstoff überzogen, um das Zählen zu erleichtern. Gitter (1 cm x 1 cm im Quadrat), die auf der Bodenschicht aufgezeichnet sind, unterstützen gleichfalls den Zählvorgang. Die Gesamtabmessung einer einzigen Petrifilm-Platte beträgt 20 cnA

Derartige Platten mit trockenem künstlichen Nährboden, wie sie oben beschrieben wurden, sind oft gegenüber den herkömmlicheren Petrischalen und Agar-Platten im Vorteil, die gewöhnlich für das Inokulieren und Züchten von Bakterien verwendet werden. Beispielsweise sind die älteren, herkömmlicheren Petrischalen und nährstoffhaltigen Agar-Medien beträchtlich sperrig, schwer und groß. Dadurch wird der Transport von Organismen-Proben vom Einsatzgebiet zum Labor bestenfalls schwierig. Andererseits würde die Schicht eines trockenen künstlichen Nährbodens, die das Wachstum der Bakterien einfach durch die Beigabe einer Wasserprobe unterstützt, einen wirkungsvolleren Weg darstellen, um brauchbare Bakterienzählungen durchzufühlen, als dies bei herkömmlichen Verfahren der Fall ist.

Es ist richtig, daß die zur Verfügung stehenden Schichten mit trockenem künstlichen Nährboden nur einen künstlichen Nährboden von Standard Method besitzen, mit dem der Schichtträger überzogen ist. Anders ausgedrückt: der derzeit verwendete künstliche Nährboden ist für die Zucht von allen Arten von Organismen geeignet und nicht selektiv für das Züchten einer bestimmten Art. Ein Bakteriologe, der in der Vergangenheit einen bestimmten Organismus zu züchten versuchte, mußte auf die Möglichkeit verzichten, die äußerst wünschenswerten Schichten mit künstlichen Nährböden zu verwenden, und zur Verwendung von ermüdenden, herkömmlichen Agar-Platten mit besonders zugeschnittenen künstlichen Nährböden zurückkehren, von denen bekannt ist, daß sie das Wachstum der gewünschten, besonderen Organismen fördern, wobei sie gleichzeitig das Wachstum von unerwünschten Organismen hemmen. Da Bakteriologen und Mikrobiologen oft nur einen bestimmten Organismus für eine weitere Isolierung, Forschung, Auswertung und Verwendung züchten wollen, waren die Schichten mit trockenen künstlichen Nährboden von Standard Method in vielen Fällen nicht zu verwenden, da sie kein selektives Medium enthielten.

In einer früheren Erfindung wurde ein Verdünnungsmittel oder eine Trägerlösung entwickelt, um Schichten mit trockenen künstlichen Nährboden herzustellen, besonders für das Züchten von Lactobacillacae, die sowohl Laktobazillen als auch Streptokokken enthalten. Obwohl das Verfahren dieser Erfindung in den meisten Fällen zufriedenstellend arbeitet, gibt es Fälle, in denen eine weitere Beschreibung zwischen Laktobazillen und bestimmten Streptokokken gewünscht wird. So ist es beispielsweise für die richtige Herstellung von Silofutter-Inokulier-mittein wesentlich, daß entsprechende Mengen von Lactobacillacae-Stämmen vorhanden sind. Wenn dies nicht der Fall ist, hat das Inokuliermittel keinen wesentlichen Wert.

Es ist ungewöhnlich, daß bei Proben von Silofutter-Inokuliermitteln sowohl Laktobazillen-Stämme als auch Streptokokken-Stämme in derselben Probe vorhanden sind. Während der Streptokokken-Stamm für die Eigenschaften des Futter-Inokuliermittels unschädlich ist, wenn man bestimmen kann, ob eine zufriedenstellende Menge des Laktobazillen-Stammes vorhanden ist, kann eine positive Prüfung mit der Platte mit trockenem künstlichen Nährboden unter Verwendung des Verdünnungsmittels der früheren Erfindung nicht bestimmend sein, da entweder das Vorhandensein von laktobazillen-Stämmen oder von Streptokokken-Stämmen oder von beiden angezeigt wird. Es ist daher in bestimmten Fällen notwendig, eine weitere Verfeinerung meines künstlichen Nährbodens zu entwickeln, um Platten mit trockenen künstlichen Nährböden dazu verwenden zu können, um zwischen Laktobazillen-Stämmen und Streptokokken-Stämmen unterscheiden zu können. Damit wäre eine qualitative Sicherheitspriifung von Futter-Inokuliermitteln möglich, wobei eine positive Prüfung die Sicherheit liefert, daß die Laktobazillen-Stämme wie gewünscht vorhanden sind, ohne daß irgend ein Zweifel zurückbleibt, daß eine "falsche" Ablesung besteht, da Streptokokken-Stämme vorhanden sind.

Eine primäre Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu schaffen, um eine normalerweise trockene, selbständige, verwendungsbereite Schicht eines künstlichen Nährbodens herzustellen, die besonders für das selektive Züchten von bestimmten Laktobazillen geeignet ist, während gleichzeitig das Wachstum von Streptokokken-Stämmen gehemmt wird. -2-

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Im besonderen ist es eine Aufgabe der Erfindung, die oben beschriebene Nährbodenschicht besonders für das selektive Wachstum von Laktobazillen unter anaeroben Bedingungen geeignet zu machen, während gleichzeitig das Wachstum von anderen Streptokokken-Stämmen gehemmt wird.

Eine andere Aufgabe der Erfindung liegt in der Entwicklung eines Verfahrens, einer Vorrichtung und einer Technik, um 3M-Petrifilm Schichten für künstliche Nährböden besonders für das Züchten von Lactobacillacae-Organismen geeignet zu machen, anders ausgedrückt: für Milchsäurebakterien.

Eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Lösung des Verdünnungsmittels zu entwickeln, die bei der Herstellung von Proben für das Inokulieren von selbständigen, verwendungsbereiten Schichten von künstlichen Nährböden verwendet wird, wobei sie den Film besonders für Laktobazillen spezifisch macht, während gleichzeitig das Wachstum von Streptokokken-Stämmen gehemmt wird.

Eine andere spezielle Aufgabe besteht darin eine Lösung des Verdünnungsmittels zu entwickeln, die bei der Prüfung von Futter-Inokuliermitteln verwendet werden kann, um das Auftreten der gewünschten Lactobacillacae-Stämme festzustellen und zwischen Laktobazillen- und Streptokokken-Stämmen zu unterscheiden, die in diesem Inokuliermittel vorhanden sein können.

Eine weitere Aufgabe ist es, eine Lösung des Verdünnungsmittels herzustellen, die mit einer trockenen, selbständigen verwendungsbereiten Schicht eines künstlichen Nährbodens verwendet werden kann, beispielsweise eines Petrifilms, wobei das mögliche Wachstum von pathogenen Stoffen beseitigt wird.

Diese Aufgaben werden bei der Lösung der eingangs angeführten Art dadurch gelöst, daß sie aus einer wässerigen Lösung besteht die enthält: (a) einen Inhibitor für gram-negative Organismen in einer Menge von 24 Einheiten/ml bis 40 Einheiten/ml des Verdünnungsmittels; (b) ein wasserlösliches fungizides Mittel in einer Menge von 10 ttg/ml bis 250 μβ/ιηΐ Verdünnungsmittel; (c) ein wasserlösliches Nitrit in einer Menge von 600 μg/ml bis 1800 μg/ml Verdünnungsmittel; (d) Fluorid-Ionen in einer Konzentration von zumindest 40 mM/ml Verdünnungsmittel und daß (e) diese Lösung einen pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 7,5 hat.

Die erfindungsgemäße Kombination ist die normalerweise trockene, selbständige, verwendungsbereite Schicht des künstlichen Bakterien-Nährbodens, die (a) einen künstlichen Bakterien-Nährboden enthält, mit dem ein Schichtträger beschichtet ist, der mit einer durchsichtigen Schicht überzogen ist; wobei (b) der Schichtträger Nährstoffe für standardisierte Verfahren sowie ein kaltwasserlösliches Gelieimittel trägt; und wobei (c) die Überzugsschicht mit einem Geliermittel und mit einem 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid-Indikator-farbstoff beschichtet ist, um das Zählen der Organismen zu erleichtern.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt folgende Schritte: (a) Herstellen einer biologischen Platte, die einen künstlichen Nährboden für standardisierte Verfahren enthält; (b) Darstellen einer wäßrigen Lösung des Verdünnungsmittels, die in Kombination enthält: 24 Einheiten/ml der Lösung des Verdünnungsmittels bis 40 Einheiten/ml der Lösung des Verdünnungsmittels eines gramnegativen Organismen-Hemmstoffs, 10 μg/ml der Lösung bis 250 μg/ml der Lösung eines wasserlöslichen fungiziden Mittels, 600 μg/ml bis 1800 pg/ml eines wasserlöslichen Nitrits sowie eine Konzentration von Fluorid-Ionen von zumindest 40 mM/ml, wobei die Lösung einen pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 7,5 besitzt; und (c) Aufbringen einer geringen, jedoch wirkungsvollen Menge dieser Lösung auf die Platte im Zusammenhang mit einem zu prüfenden Futter-Inokuliermittel; und (d) Inkubieren der inokulierten Platte unter anaeroben Bedingungen, um ausschließlich Laktobazillen-Stäm-me zu züchten, während gleichzeitig das Wachstum von Milchsäure-Kokken gehemmt wird.

Das Verfahren und die Vorrichtung, um jeden der oben beschriebenen Gegenstände sowie andere Gegenstände auszuführen, wird aus der ausführlichen Beschreibung der Erfindung ersichtlich.

Normalerweise trockene, selbständige, verwendungsbereite Schichten mit künstlichem Nährboden für Bakterien werden besonders für das selektive Züchten von Milchsäurebakterien unter anaeroben Bedingungen hergestellt, während gleichzeitig Streptokokken-Stämme gehemmt werden. Dies erfolgt mit einer Lösung des Verdünnungsmittels auf wäßriger Basis oder einem Verdünnungsmittel, das einen gram-negativen Organismen-Hemm-Stoff besitzt, zusammen mit einem wasserlöslichen fungiziden Mittel, einem wasserlöslichen Nitrit sowie einer Quelle von Fluorid-Ionen. Die Lösung besitzt einen pH-Wert in einem Bereich von 6,5 bis 7,5 und ist vorzugsweise neutral. Wenn die Lösung als Verdünnungsmittel oder Träger für bakterielle Inokulierungen verwendet wird, dient sie dazu, um den künstlichen Nährboden von Standard Method, der auf den Schichtträger geschichtet -3-

AT 396 116 B ist, ftir Laktobazillen spezifisch zu machen, während er gleichzeitig Streptokken-Stämme hemmt.

Eine Schicht mit einem trockenen künstlichen Nährboden, die einen Nährboden von Standard Method enthält, unterstützt das Bakterienwachstum einfach durch die Beigabe einer Wasserprobe. In Übereinstimmung mit dieser Verfeinerung gegenüber meiner früheren Erfindung wurde folgendes festgestellt: wenn die Wasserprobe auf die 5 Nährbodenschicht unter Verwendung einer speziellen Lösung geimpft wird, die eine Quelle von Fluorid-Ionen besitzt, wie dies später beschrieben wird, dann und nur dann wird die Schicht für Laktobazillen spezifisch, wobei Streptokokken-Stämme ausgeschlossen werden.

Es gibt viele Gründe, warum Bakteriologen und Mikrobiologen einen bestimmten Organismus züchten wollen, wobei andere Organismen ausgeschlossen werden. Ein derartiger Fall liegt, wie oben erwähnt, in der quali-10 tativen Sicherheitsprüfung von Futter-Inokuliermitteln. Diese Erfindung erlaubt die bequeme Verwendung der gewünschten Vorteile der Schichten mit künstlichem Nährboden, um nur die Laktobazillen-Organismen zu zählen, ohne eine "falsche" Ablesung des Streptokokken-Stammes zu erhalten.

Milnes, et al., erkennen in J. Dent. Res., März 1985, Seite 401-404, im allgemeinen, daß Natriumfluorid das Wachstum von Streptokokken-Stämmen aber nicht von Laktobazillen-Stämmen hemmen kann, doch erörtern sie 15 nicht eine Vereinigung dieser Information mit der Petrifilm-Technologie und der Technologie von Futter-Inokuliermitteln und schlagen dies auch nicht vor, um ein Qualitätssteuerprogramm für Futter-Inokuliermittel zu entwickeln. Ihre Forschung betrifft Karieserkrankungen.

Das Verdünnungsmittel, das bei dieser Erfindung verwendet wird, ist ein Vierkomponenten-System auf wäßriger Basis. Die Lösung enthält einen gram-negativen Organismen-Hemmstoff, ein fungizides Mittel, ein wasser-20 lösliches Nitrit sowie eine Quelle von Fluorid-Ionen. Weiters muß die Lösung einen pH-Wert innerhalb des Bereiches von 6,5 bis 7,5 besitzen, wobei sie vorzugsweise neutral ist. Wenn diese Bedingungen erfüllt sind, kann ein Verdünnungsmittel, wenn es auf einer Schicht eines trockenen künstlichen Nährbodens angeordnet wird, die Schicht für Laktobazillen Organismus-spezifisch machen, während Streptokokken-Stämme gehemmt werden.

Beim gram-negativen Organismen-Hemmstoff kann es sich um ein Polymixin-Antibiotikum handeln, das 25 eine Konzentration im Bereich von 24 Einheiten/ml der Lösung des Verdünnungsmittels bis 40 Einheiten/ml der Lösung des Verdünnungsmittels besitzt, wobei 24 Einheiten/ml für Polymixin-B Sulfate zufriedenstellend waren. Das bevorzugte Antibiotikum ist Polymixin, wobei Polymixin-B Sulfate das bevorzugte Polymixin ist.

Die Inokulierlösung enthält weiters ein wasserlösliches fungizides Mittel in einer Konzentration im Bereich von 10 pg/ml bis 250 μg/ml, wobei etwa 10 pg/ml bis 20 pg/ml bevorzugt werden. Ein bevorzugtes fungizides 30 Mittel ist Cycloheximid. Zusätzlich zu Cycloheximid können andere fungizide Mittel und Schutzmittel, beispielsweise Kaliumsorbat, butyliertes Hydroxyanisol (BHA) und butyliertes Hydroxytoluol (BHT) verwendet worden.

Die dritte Komponente der Trägerlösung oder des Verdünnungsmittels ist ein wasserlösliches Nitrit mit einer Konzentration innerhalb des Bereiches von 600 pg/ml bis 1800 pg/ml. Das Nitrit kann irgend ein wasserlös-35 liches Metallnitrit sein, doch wird ein Nitrit der Gruppe I Metalle und am besten entweder Natriumnitrit oder Kaliumnitrit bevorzugt. Am meisten wird Kaliumnitrit bevorzugt. Wenn ein Nitrit innerhalb dieser Konzentrationsbereiche verwendet wird, wurde entdeckt, daß das Wachstum von Organismen mit Ausnahme der Milchsäurebakterien gehemmt wird.

Die vierte Komponente besteht aus einer wäßriger Lösung einer Quelle von Fluorid-Ionen. Geeignete Beispie-40 le enthalten Fluoride der Gruppe I und Gruppe II Metalle. Das am meisten bevorzugte Salz ist Natriumfluorid, einfach deshalb, weil es leicht erhältlich ist. Die benöügte Menge an Fluorid-Ionen kann funktionell als Menge beschrieben werden, die ausreicht, um das Wachstum von Streptokokken-Stämmen zu hemmen, ohne das Wachstum von Laktobazillen-Stämmen zu hemmen. Weiters kann sie als eine Menge festgelegt werden, die ausreicht, um beispielsweise den Plattenzählwert des Streptokokken-Stammes während einer Verdünnungsreihe von 10^ auf 45 zumindest 10^ abzusenken. Im allgemeinen kann man zufriedenstellende Ergebnisse erreichen, wenn die Konzentration von Fluorid-Ionen zumindest 40 mM/ml und vorzugsweise zumindest 50 mM/ml beträgt. Die Obergrenze der Beimengung ist lediglich praktisch gegeben, da es kleine Werte bei größeren Konzentrationen gibt als den Minimalwert, der notwendig ist, um das gewünschte Ergebnis zu erreichen.

Die Trägerlösung muß einen pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 7,5 und vorzugsweise von 6,5 bis 7,0 besitzen. 50 Im Idealfall ist die Lösung des Verdünnungsmittels neutral. Es wurde für kritisch gefunden, daß dann, wenn die Nährbodenschicht für Lactobacillacae spezifisch gemacht wird, der pH-Wert im allgemeinen im Bereich des Neutralen bleibt, d. h. zwischen 6,5 und 7,5. Dies rührt daher, da im Handel erhältliche Schichten, beispielsweise der Petrifilm, der von 3M-Company vertrieben wird, einen Tetrazolium-Farbstoff besitzen, um die gezüchteten Bakterien rot zu färben, um das Zählen zu erleichtern. Der Tetrazolium-Farbstoff kann jedoch für alle wachsenden 55 Organismen giftig werden, wenn der pH-Wert saurer wird, beispielsweise bei einem Pegel des pH-Wertes von 5,5. Die Trägerlösung dieser Erfindung muß daher einen pH-Wert innerhalb des angegebenen Bereiches besitzen, wodurch die nachteilige Reaktion mit dem Tetrazolium-Farbstoff vermieden wird.

Um die Hemmwirkung für das Wachstum von anderen Organismen zu maximieren, ist es für diese Erfindung weiters wesentlich, daß der inokulierte Film unter anaeroben Bedingungen inkubiert wird. Anders gesagt: die 60 Lösung des Verdünnungsmittels ist nur unter anaeroben Bedingungen für Lactobacillacae-Organismen spezifisch. Diese anaerobe Umgebung kann auf viele herkömmliche Arten eingeführt werden, beispielsweise unter Verwen- -4-

AT 396 116 B düng von anaeroben Generatoren von Gas Pack, die von BBL Microbiology Systems of Cokeysville, Maryland hergestellt werden.

Die obige Beschreibung erfolgte im Zusammenhang mit der Verwendung von Polymixin Antibiotika als gram-negative Organismen-Hemmstoffe. Eine bevorzugte Formulierung wurde entwickelt, die für viele Zwecke geeignet ist und bei qualitativen Sicherheitsprüfungen für Futter-Inokuliermittel auch besser als die früher beschriebene Formulierung ist. Sie beruht auf der Verwendung von 2-Phenyläthanol als gram-negativen Organis-men-Hemmstoff. Wenn 2-Phenyläthanol verwendet wird, erhält man folgende bevorzugte Zusammensetzung: die Konzentration von 2-Phenyläthanol sollte von 1 mg/ml bis 4 mg/ml reichen. Die Konzentration des fungiziden Mittels sollte von 10 μg/ml bis 250 pg/ml, die Konzentration des wasserlöslichen Nitrits von 600 pg/ml bis 800 μg/ml reichen, und die Konzentration des Fluorids sollte 50 μg/ml betragen. Der pH-Wert wird somit im Bereich von 6,5 bis 7,5 und vorzugsweise von 6,5 bis 7,0 liegen.

Die Verwendung der mit dem trockenen Medium überzogenen Schicht mit den Trägerlösungen dieser Erfindung stellt ein herkömmliches Verfahren dar, das Mikrobiologen und Bakteriologen bekannt ist. Grundsätzlich schließt die Verwendung das folgende Verfahren ein. Der Film wird auf einer ebenen Fläche angeordnet, die obere durchsichtige Schicht angehoben, so daß ein Milliliter einer Probe des Verdünnungsmittels, das den Organismus trägt, auf dem Schichtträger angeordnet werden kann. Die obere Schicht wird dann sorgfältig über dem Schicht-träger geschlossen. Daraufhin wird ein Kunststoffprobenverteiler leicht nach unten über die obere Schicht gedrückt, um die Trägerlösung über den Schichtträger zu verteilen, der mit dem Medium überzogen ist. Daraufhin wird die Schicht für etwa eine Minute ungestört gelassen, um eine Gelbildung zu ermöglichen. Daraufhin wird die Schicht in horizontaler Stellung mit der klaren Schichtseite nach oben bei 32 °C bis zu 48 Stunden inkubiert. Die Organismen reduzieren den Tetrazolium-Indikatorfarbstoff im Schichtträger, wodurch die Organismuskolonien auf der Schicht als rote Punkte erscheinen, die abgezählt werden können.

Die folgenden Beispiele dienen dazu, um das Verfahren, die Technik und die Produktzusammensetzung dieser Erfindung weiter zu erläutern. Diese Beispiele bis zur Tabelle V zeigen die frühere Erfindung.

Beispiele

In jedem der folgenden Beispiele handelt es sich bei der Platte mit trockenem künstlichen Nährboden um die Petrifilm-Platte, die von 3M-Company (Medical Products Division, St. Paul, Minnesota 55144) entwickelt wurde. Dieser Petrifilm besteht aus einem trockenen, selbständigen, verwendungsbereiten künstlichen Nährboden, der auf einen Schichtträger aufgebracht und mit einer Polyäthylenschicht überzogen ist Die Grundschicht besteht aus Nährstoffen von Standard Method sowie einem kaltwasserlöslichen gelbildenden Mittel. Die Überzugsschicht, die gleichfalls mit einem gebildenden Mittel beschichtet wurde, enthielt gleichfalls einen 2,3,5-Triphe-nyltetrazoliumchlorid-Indikatorfarbstoff, um das Zählen der Organismen zu erleichtern. Auf der Grundschicht war ein Gitter von 1 cm x 1 cm aufgezeichnet, um gleichfalls das Zählen zu unterstützen. Die Gesamtabmessungen der Petrifilm-Platte betrugen 20 cm2.

Das Grundverfahren enthielt die Darstellung von Stammlösungen des Verdünnungsmittels, das Inokulieren der Petrifilme, auf das ein Inkubieren bei 32 °C für 48 Stunden unter anaeroben Bedingungen folgte, sowie das darauffolgende Zählen der Organismen. Als Prüfkultur wurde eine Bodenprobe von einem Gewächshaus verwendet, wobei eine andere Probe, die mit S/80 bezeichnet wurde, zur Kontrolle diente, bei der bekannt war, daß es sich um eine Laktobazillen-Kultur handelt. Bei der Bodenprobe war bekannt, daß sie viele andere Organismen enthielt, bei denen es sich um keine Laktobazillen handelte.

Die Stammlösungen des Verdünnungsmittels wurden mit den folgenden Werten von Natriumnitrit in Ge-wichtsprozenten/Volumen dargestellt: 1 Gewichtsprozent/Volumen, 6 Gewichtsprozent/Volumen, 12 Gewichts-prozent/Volumen und 18 Gewichtsprozent/Volumen. Cycloheximid wurde mit folgenden Werten von Gewichtsprozent/Volumen verwendet: 0,1; 0,5; 1 und 2,5 Gewichtsprozent/Volumen. Polymixin-B wurde in diesen ersten Beispielreihen mit einem konstanten Verhältnis von 0,03 Gewichtsprozent/Volumen verwendet, da die Beispielreihen dazu dienen sollten, um die Änderungen in der Konzentration von Natriumnitirit und Cycloheximid zu untersuchen.

Die Stammlösungen wurden im Filter sterilisiert, wobei das endgültige Verdünnungsmittel unter Verwendung von 97 ml sterilisiertem, destilliertem Wasser hergestellt wurde, dem 1 ml von jeder der drei folgenden Komponenten pro 100 ml Wasser beigegeben wurde: Natriumnitrit, Cycloheximid und Polymixin-B, alle in den oben erwähnten Bereichen. Die sterilen Mischungen wurden dann keimfrei in Reagenzröhrchen mit einer Menge von 9 ml/Röhrchen abgefüllt. Folgende Mischungen wurden dargestellt. -5-

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Endkonzentration der Bestandteile

Kontrolle B utterfield's*)-Puffer plus 0,1 % Tensid Variation 1 100 μg/ml Nitrit 10 μι/ιηΐ Cycloheximid 24 Einheiten/ml Polymixin-B Variation 2 600 μg/ml Nitrit 10 μg/ml Cycloheximid 24 Einheiten/ml Polymixin-B Variation 3 1200 μg/ml Nitrit 10 pgfrd Cycloheximid 24 Einheiten/ml Polymixin-B Variation 4 1800 μg/ml Nitrit 10 μg/ml Cycloheximid 24 Einheiten/ml Polymixin-B Variation 5 600 μg/ml Nitrit 50 μg/ml Cycloheximid 24 Einheiten/ml Polymixin-B Variation 6 600 μg/ml Nitrit 100 μg/ml Cycloheximid 24 Einheiten/ml Polymixin-B Variation 7 600 μg/ml Nitrit 250 μg/ml Cycloheximid 24 Einheiten/ml Polymixin-B *) Beim Butterfield’s-Puffer handelt es sich um eine herkömmliche Kaliumphosphat-Pufferlösung in der Nahrungsmittel-Mikrobiologie.

Es folgten die standardisierten Petrifilm-Verdünnungsverfahren, wobei die S/80-Kontrolle aufgetragen wurde, wobei insbesondere 1 ml einer über Nacht angesetzten Kultur unter Verwendung der Prüflösung seriell verdünnt und 1 ml auf die Platte gegeben wurde. Eine 11 Gramm-Probe des Gewächshausbodens wurde anfangs mit 100 ml des Butterfield's-Puffers verdünnt. Diese Darstellung wurde dann unter Verwendung der Prüflösung in einer Reihe verdünnt 1,0 ml Volumen von 10A10'? und 10’^ Verdünnungen von S/80 wurden dem Petrifilm-Plattenmedium zugeführt 1,0 ml Volumen von IO"4, 10*^ und 10'^ Verdünnungen des Bodens wurden dem Petrifilm-Plattenmedium zugeführt. Überzogene Proben wurden in Gefäßen, die Generatoren von Gas Pack (BBL) enthielten, anaeiob inkubiert, wobei das Inkubieren bei 32 °C für 48 Stunden durcbgeführt wurde.

Tabelle I zeigt den resultierenden Organismen-Zählwert, wobei die hier erwähnte Lösung des Verdünnungsmittels verwendet wurde.

Tabelle I

Probe Kolonienbildung

Einheiten/ml fcfu/mfl 5 x 107 3,3 xlO6 2,3 xlO7 5 x 104 Ox 104 7,0 xlO6 7,1 xlO7 4,0 xlO7

Boden:

Kontrolle Variation 1 Variation 2 Variation 3 Variation 4 Variation 5 Variation 6 Variation 7 -6- AT 396 116 B (Forsetzung Tabelle I)

Kontrolle 2,4 x 109 Variation 1 7,5 x 108 Variation 2 1,3 x 109 Variation 3 1,3 x 109 Variation 4 1,3 x 109 Variation 5 9,6 x 108 Variation 6 1,2 x 109 Variation 7 1,0 xlO9

Man erkennt deutlich, daß ein beträchtlicher Anstieg in der Hemmwirkung des Verdünnungsmittels auf Mikroorganismen des Bodens auftritt, wenn die Konzentration von Nitrit von 600 μg/ml auf 1200 μg/ml erhöht wurde. S/80 blieb von einer Änderung sowohl der Nitrit- als auch der Cycloheximid-Konzentration oberhalb eines Bereichs von 100 μg/ml bis 1800 μg/ml bzw. 10 μg/ml bis 250 μ£/ιη1 unbeeinflußt. Weiters erkennt man, daß das Verdünnungsmittel den Nährboden für Lactobacillacae-Organismen spezifisch macht, wobei das Wachstum von anderen Organismen gehemmt wird. Ähnliche Versuche, wie sie in den Varationen 1-7 gezeigt sind, wurden auch mit einer Veränderung der Polymixin-B Konzentration durchgeführt, wobei sich keine Auswirkungen auf S/80-Organismen in einem Bereich von 24-40 Einheiten/ml zeigten. Bei Bodenorganismen senkten Mengen unterhalb von 24 Einheiten/ml des Polymixin-B die Hemmwirkung.

Beispiele, in denen der Ersatz von Polvmixin-B Sulphat durch 2-Phenvläthanol gezeigt wird.

In diesem Verdünnungsmittel wurde 2-Phenyläthanol verwendet, das bei Sigma Scientific als Flüssigkeit (1 ml = 1,02 g) gekauft wurde. 2-Phenylalkohol wurde einem gegebenen Volumen von destilliertem Wasser beigegeben, um die unten angeführten Konzentrationen zu erhalten, und dann im Autoklaven behandelt. Filtersterilisierte 6 Gewichtsprozent/Volumen Natriumnitrit- und 0,1 Gewichtsprozent/Volumen Cycloheximid-Lösun-gen wurden dazu verwendet, um die unten angegebenen Mischungen durch die Beigabe von 1 ml pro 100 ml des dargestellten Verdünnungsmittels zu vervollständigen.

Tabelle TT

Hergestellte Mischungen Gewichtsprozent/Volumen

8 600 μg/ml Nitrit 10 μg/ml Cycloheximid 0,05 % PEA 9 600 μ§/πι1 Nitrit 10 μg/ml Cycloheximid 0,10 % PEA 10 600 μg/ml Nitrit 10 μg/ml Cycloheximid 0,20 % PEA 11 600 μς/πιΐ Nitrit 10 μg/ml Cycloheximid 0,4% PEA

Die Beimpfung und das Verfahren wurden so durchgeführt, wie dies bei den obigen Beispielen beschrieben wurde. Eine S/80-Lösung und Erde waren die Prüfproben. S/80 wurde aus einer über Nacht angesetzten Kultur mit den Mischungen des Verdünnungsmittels in einer Reihe verdünnt und auf einen Petrifilm mit 10'? und 10*8 geschichtet Die Erde wurde anfangs 1:10 mit 99 ml abgeändertem Butterfield's-Puffer verdünnt und dann mit dem vorgegebenen Verdünnungsmittel in einer Reihe verdünnt. Die 10*^-, 10*5- und 10*^-Verdünnungen der Erde wurden dem Petrifilm zugeführt. Die Filme wurden anaerob unter Verwendung von BBL-Gas Packs für 48 Stunden bei 32 °C inkubiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle QI dargestellt -7- AT396116B Tahelle III Ergebnisse

Innkulierlösungen # cfu/ml Erde: Variation 8 6,2 x 105 Variation 9 5x 103 Variation 10 Οχ 103 Variation 11 Οχ 103 S/80: Variation 11 9,4 x 108

Wie man sieht, scheint der Ersatz durch Phenyläthylalkohol in der Formierung für das Polymixin-B Sulphat Antibiotikum sehr wirkungsvoll, was die Hemmung von Mikroorganismen des Erdbodens betrifft.

Die folgenden Beispiele zeigen verschiedene Abänderungen der Formel, wobei Phenyläthylalkohol als gram-negativer Hemmstoff verwendet wird.

Tabelle IV Aufstellung

Hergestellte Natriumnitrit Cycloheximin Phenyläthylalkohol Mischungen Konzentration Konzentration Konzentration Kontrolle (Butterfield's Puffer) 12 800 μg/ml 10 μg/ml 0,1 % 13 800 μg/ml 10 μg/ml oa% 14 600 μg/ml 10 μg/ml 0,1 % 15 600 μg/ml 10 μg/ml oa% 16* 800 μg/ml 10 μg/ml 0,1 % 17* 600 μg/ml 10 μ£/πι1 0,1 % * Einschließlich Polymixin B mit einer Menge von 24 Einheiten/ml. S/80 und Erde waren die Prüfproben. S/80-Verdünnungen wurden mit 10'7 und 10'** aufgetragen. Die Erde wurde anfangs mit 99 ml (1:10) eines abgewandelten Butterfield's-Puffers verdünnt und mit 10"3 oder bis 10*6 aufgetragen. Die Petrifilme wurden anaerob unter Verwendung von BBL Gas Packs bei einer Temperatur von 32 °C für 48 Stunden inokuliert, wie dies auch bei den obigen Beispielen ähnlich der Fall war. Die Ergebnisse sind unten angeführt

Tabelle V Ergebnisse cfu/ml 9,8 OO o X 8,7 OO o X 8,5 xio8 8,7 x 108 1,0 x 109 7,4 X t—» o OO 1,1 x 109 2,7 xlO7 1,8 xlO4 3,0 x 102 3,4 x 106 3,3 x 104 4,2 x 104 9,0 x 104

Probe Kontrolle: SMl

Kontrolle M?:

Mischung

Kontrolle 12 13 14 15 16 17 12 13 14 15 16 17 -8-

AT 396 116 B

Wie man sieht, liefert die Lösung #13 die besten Hemmergebnisse mit der Erde, ohne das Wachstum von S/80 nachteilig zu beeinflussen.

Beispiele für die Differenzierung zwischen Laktobazillen-Stämmen und Streptokokken-Stämmen

Die folgenden Beispiele zeigen die Verwendung von Natriumfluorid, wenn dieses selektiv auf Schichten eines trockenen Nährbodens aufgebracht wird, um eine Auswahl gegenüber Milchsäure-Kokken zu treffen und das Wachstum von Laktobazillen-Stämmen zu ermöglichen.

Beim verwendeten selektiven Verdünnungsmittel handelt es sich um jenes Verdünnungsmittel, das in der früheren Erfindung beschrieben wurde, wobei es in diesem Fall enthielt: 5 ml 8 %-Natriumnitrit, 5 ml 0,1 %-Cycloheximid, 1 ml Phenyläthylalkohol und 489 ml steriles, destilliertes Wasser. In der unten angeführten Tabelle wird die Lösung kurz mit PECAN bezeichnet.

Es wurde eine 1 %-Natriumfluorid-Lösung dargestellt, wobei das entsprechende Volumen dazu verwendet wurde, um Lösungen mit den folgenden Konzentrationen von Natriumfluorid zu erhalten: 0, 20, 30,40 und 50 mM. Die bestimmten Lösungen sind in Tabelle VI angeführt.

Tabelle VI mMNaF Gramm NaF/L Gramm NaF/500 ml 1 %-NaF/500 ml PECAN 20 840 mg 420 mg 42 30 1.26 g 0,63 g 63 40 1,68 g 0,84 g 84 50 2,1 g 1,05 g 105 100 4,2 g 2,10 g 210

Die Lösungen des Verdünnungsmittels, die Natriumfluorid enthalten, wurden im Filter sterilisiert und in 9 ml Blindproben abgefüllt. Es wurden vier Isolierungen untersucht: 2 Streptokokken und 2 Laktobazillen. Ein ml einer Aufschlämmung einer über Nacht angesetzten Kultur (Normbrühe) wurde in 99 ml eines Butterfield's-Puf-fers pipettiert. Die fünf Natriumfluorid-Lösungen wurden dazu verwendet, um die Isolierungen auf dem Petrifilm in einer Reihe von 10*4 bis 10"^ zu verdünnen. Es wurde das standartisierte Beschichtungsverfahren verwendet, das oben beschrieben wurde. Die Petrifilme wurden bei einer Temperatur von 32 °C zwei Tage inkubiert. Die kolonienbildenden Einheiten wurden gezählt, wobei man die folgenden Daten erhielten.

Tabelle VII geprüfte Darstellung mM NaF ID Nr Art 0 20 30 40 50 100 PC202 Streptokokken 9,1 x 109 7,8 x 108 1,5 x 108 3,0 xlO5 N6 0 PC301 Streptokokken 7,6 x 108 9,0 x 108 2,5 x 105 1,4 x 104 2 xlO3 0 286 Laktobazillen 1,8 x 109 1,7 x 109 1,6 x 109 1,7 xlO9 1,4 x 109 1,5 x 109 287 Laktobazillen 4,0 xlO9 3,8 x 109 3,7 x 109 4,6 xlO9 3,8 x 109 3,4 x 109

Die ID-Nummem beziehen sich auf die Identifizierungsnummem für die Proben. Wie Tabelle VH zeigt, wurden die beiden geprüften Streptokokken durch Natriumfluorid gehemmt. Die Hemmung wurde bei 30 mM NaF für eine Isolierung gezeigt, wobei bei 50 mM NaF die Hemmung im wesentlichen vollständig war. Die geprüften Laktobazillen wurden bei diesen Konzentrationen durch Natriumfluorid nicht gehemmt

Es wurden andere Lactobacillacae-Organismen geprüft, um festzustellen, ob die Natriumfluorid-Selektivi-tät breit gestreut ist oder nicht. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle VIII angegeben. Andere Fluorionen-Quel-len, beispielsweise wasserlösliche Metalle der Gruppe I und Gruppe II, arbeiten auf die gleiche Weise, so daß man eine passende Hemmung der Milchsäure-Kokken erhält -9-

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Tabelle ΥΠΓ

Organismen- Proben zählung bei Art Ursprung ID Toleranz 0,0 mM NaF 1 L.Acidophilus Portland 04 1,7E9* 2 L.Acidophilus Produkt S/Chris Hansen - 5.0E8 3 L.Acidophilus Portland 19/KL421 - 5.6E8 4 L.Acidophilus Schwein 296/PIG75 - 9.2E8 5 L.Acidophilus Portland 6/KL321 - 2.4E9 6 LAmylovorus Geschenk 41 - 3.1E9 7 L.Brevis Rind 289/D15B + 2.0E9 8 LBievis Rind 289/A14A + 1,28E9 9 L.Brevis Schwein 288/37 + 2.4E9 10 L.Buchneri Rind 289/D27B + 1.06E9 11 L.Casei Portland 02/KL322 + 2,9E9 12 L.Casei (Pseudo) Mais 285/129A + 1,6E9 13 L.Cellobiosus Rind 289/D24A + 1.36E9 14 L.Cellobiosus Rind 289/D24B + 1.75E9 15 L.Cellobiosus Rind 289/A44B + 1.07E9 16 L.Cellobiosus Rind 289/A22A + 1,26E9 17 L.Cellobiosus Rind 289/A13B +/- 1,5E9 18 L.Cellobiosus Rind 289/C26A - 1,0E6 19 L.Coryniformis Mais 285/66A + 1.00E9 20 L.Coryniformis Rind 289/B9B +/- 1,1E9 21 L.Coryniformis Mais 285/81A - 1,16E9 22 L.Curvatis Rind 289/B3B + 4,4E8 23 L.Delbrueckii Alfalfa 285/148A + 3.4E8 24 LPermentum Schwein 305/PIG38 + 6.3E8 25 L.Helveticus Portland 129 - 1,5E7 26 L.Homohiochii Weize 285/151C + 1,18E9 27 LJensenii Rind 289/D2A + 1,01E8 28 LJensenii Rind 289/D2B + 1.07E9 29 LJensenii Rind 289/A6A - 9.0E8 30 LJensenii Rind 289/C3B - 4,6E8 31 L.Lactis Mais 377/504C + 1,08E9 32 L.Lactis Portland 124/L.Lacl5808 - 2,2E8 33 L.Oenus Heu 285/17A - 2,0E9 34 LPlantarum Portland 29/C7 + 1,03E9 35 L.Plantarum Portland 28/C54 + 8E8 36 LPlantarum Portland 26/S80 + 7.9E8 37 L.Plantarum Alfalfa 31/Alpha5 + 2.8E9 38 LPlantarum Gras 286 + 3,2E9 39 LPlantarum Mais 287 + 5,1E9 40 LPlantarum Gras 318 + 2,8E9 41 LPlantarum Gras 319 + 1,8E9 42 LPlantarum Alfalfa 346 + 2.13E9 43 LPlantarum Alfalfa 347 + 7.6E8 44 LPlantarum Alfalfa 345 + 2,0E9 45 LMesenteriodes Mais 377/618B + 2,1E8 46 LMesenteriodes Rind 289/A13A +/- 7,3E8 47 L.Mesenteroides Mais 285/12A +/- 3,7E8 48 Pediococci Mais 247/P-2 + 4,7E9 49 S.Anginosus Gras 377/629A - 1,0E8 50 S.Anginosus Rind 289/D23A - 9,3E7 51 S. Avium Gras 377/622 - 4.8E8 52 S.Bovis Rind 289/A36B - 1,4E8 53 S.Equi Rind 289/C15A - 1.35E8 54 SPquisimiles Mais 377/615A - 7,1E8

Organismenzählung bei 50 mM NaF 0 0 0 0 0 0 1,9E9 1.34E9 2,4E9 6,8E8 2,2E9 2.1E9 1.24E9 1.51E9 3.5E8 9,4E8 1,0E6 0 7,2E8 5,5E6 5,7E4 2.4E8 2,7E8 5,4E8 0 1.04E9 1.13E9 8,1E8 0 0 1.20E9 0 0 9,8E8 1,3E9 6,5E8 1,9E9 2,0E9 4,1E9 2,7E9 2.5E9 2.18E9 4,8E8 1,7E9 1,1E8 9E6 2,00E8 4.8E9 0 1,0E4 0 0 1.04E4 0 -10-

Claims (18)

1. AT396116B Tabelle VIII ('Fortsetzung') Organismen- Organismen Proben zählung bei zählung bei Art Ursprung ID Toleranz 0,0 mM NaF SOmMNaF 55 S.Faecalis ? 97/JH2-2 - 9,5E8 5,0E4 56 S.Faecalis 9 98/DS16-C3 - 1.35E9 0 57 S.Faecium Portland 32/PC201 + 1,29E9 1,3E9 58 S.Faecium Portland 18/PC101 - 1.22E9 1.07E5 59 SPaecium Portland PC 102 - 6.0E8 0 60 SPaecium Portland 8/PC202 - 9,1E9 0 61 SPaecium Portland 3/PC301 - 7,6E8 2,0E3 62 S.Faecium Portland 13/PC401 - 9,3E8 9,0E4 63 SJFaecium Portland 9/PC402 - 8,5E8 1,4E4 64 S.Faecium Portland UR411 - 1,6E9 3,6E4 65 S.Lactis Geschenk 101 - 1,00E8 0 66 S.Mitis Schwein 288/C51 - 2,9E8 1,6E4 67 S Pneumoniae Alfalfa 285/122B + 2,0E9 3,0E9 68 S .Pneumoniae Schwein 288/A6 + 1,9E9 1,4E9 69 S.Salivarus Schwein PIG99 - 2,0E8 0 70 S.Sanguis Gras 377/622B - 4,7E8 0 71 S.Ubens Rind 289/B5A - 2,2E8 0 * 1,7E9 bedeutet 1,7 x 10^ Wie man sieht, waren nahezu alle 44 Isolierungen der geprüften Laktobazillen-Stämme gegenüber Fluorid-Ionen tolerant. Weiters handelt es sich bei den wenigen, die eine Intoleranz zeigten, um Arten, die in einem Futter-Inokuliermittel nur schwer zu finden sind. Auf ähnliche Weise wurden nahezu alle Stieptokokken-Stämme erfolgreich gehemmt, die wahrscheinlich in einem Futter-Inokuliermittel zu finden sind. Aus jedem der obigen Beispiele, die in den verschiedenen Tabellen angeführt sind, erkennt man, daß effektive Zusammensetzungen des Verdünnungsmittels Nährböden für Milchsäurebakterien spezifisch machen können, womit sie ihre beabsichtigten Absichten wirkungsvoll erfüllen. PATENTANSPRÜCHE 1. Lösung des Verdünnungsmittels für die Herstellung einer normalerweise trockenen, selbständigen, verwendungsbereiten Schicht eines künstlichen Bakterien-Nährbodens, der unter anaeroben Bedingungen für das selektive Wachstum von Laktobazillen-Stämmen spezifisch ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer wässerigen Lösung besteht, die enthält: (a) einen Inhibitor für gram-negative Organismen in einer Menge von 24 Einheiten/ml bis 40 Einheiten/ml des Verdünnungsmittels; (b) ein wasserlösliches fungizides Mittel in einer Menge von 10 μg/ml bis 250 μg/ml Verdünnungsmittel (c) ein wasserlösliches Nitrit in einer Menge von 600 pg/ml bis 1800 μg/ml Verdünnungsmittel; (d) Fluorid-Ionen in einer Konzentration von zumindest 40 mM/ml Verdünnungsmittel und daß (e) diese Lösung einen pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 7,5 hat.
2. 2. Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluorid-Ionen aus Fluoriden der Gruppe I und Gruppe II des Periodensystems stammen. -11- AT 396 116 B
3. 3. Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor für gram-negative Organismen ein Polymixin-Antibiotikum ist.
4. 4. Lösung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymixin-Antibiotikum Polymixin-B Sulfat ist
5. 5. Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das fungizide Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe Cycloheximid, Kaliumsorbat, butyliertes Hydroxytoluol (BHT) und butyliertes Hydroxyanisol (BHA).
6. 6. Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nitrit ein Nitrit der Metalle der Gruppe I des Periodensystems ist
7. 7. Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nitrit Natriumnitrit ist.
8. 8. Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert zwischen 6,5 und 7,0 liegt.
9. 9. Lösung des Verdünnungsmittels für die Herstellung einer normalerweise trockenen, selbständigen, verwen-dungsbereiten Schicht eines künstlichen Bakterien-Nährbodens, der unter anaeioben Bedingungen für das selektive Wachstum von Laktobazillen-Stämmen spezifisch ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie enthält: (a) 2-Phenyläthanol in einer Konzentration von 1,0 mg/ml bis 4,0 mg/ml des Verdünnungsmittels; (b) ein wasserlösliches fungizides Mittel in einer Konzentration von 10 pg/ml bis 250 pg/ml der Lösung; (c) ein wasserlösliches Nitrit in einer Konzentration von 600 pg/ml bis 800 pg/ml Lösung; (φ Fluorid-Ionen in einer Konzentration von zumindest 40 mM/ml Lösung und daß (e) die Lösung einen pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 7,5 besitzt
10. 10. Lösung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluorid-Ionen aus Fluoriden der Gruppe I und Gruppe II des Periodensystems ausgewählt sind.
11. 11. Lösung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das fungizide Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe Cycloheximid, Kaliumsorbat, butyliertes Hydroxytoluol (BHT) und butyliertes Hydroxyanisol (BHA).
12. 12. Lösung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert zwischen 6,5 und 7,0 liegt
13. 13. Lösung des Verdünnungsmittels nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Nitrit ein Nitrit der Metalle der Gruppe I des Periodensystems ist.
14. 14. Lösung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Nitrit Natriumnitrit ist.
15. 15. Kombination einer normalerweise trockenen, selbständigen, verwendungsbereiten Schicht eines künstlichen Bakterien-Nährbodens und eines Verdünnungsmittels, das so dargestellt wird, daß es die verwendungsbereite Schicht des künstlichen Nährbodens unter anaeroben Bedingungen für das selektive Wachstum von Laktobazillen-Stämmen spezifisch macht, um Milchsäure-Kokken auszuschließen, dadurch gekennzeichnet, daß die normalerweise trockene, selbständige, verwendungsbereite Schicht des künstlichen Bakterien-Nährbodens (a) einen künstlichen Bakterien-Nährboden enthält, mit dem ein Schichtträger beschichtet ist, der mit einer durchsichtigen Schicht überzogen ist; wobei (b) der Schichtträger Nährstoffe für standardisierte Verfahren sowie ein kaltwasserlösliches Geliermittel trägt; und wobei (c) die Überzugsschicht mit einem Geliermittel und mit einem 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid-Indikatorfarb-Stoff beschichtet ist, um das Zählen der Organismen zu erleichtern.
16. 16. Kombination nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung des Verdünnungsmittels eine wäßrige Lösung ist, die von 24 Einheiten/ml des Verdünnungsmittels bis 40 Einheiten/ml des Verdünnungsmittels eines Tolymixin-Antibiotikums, von 10 pg/ml des Verdünnungsmittels bis 250 μg/ml des Verdünnungsmittels eines wasserlöslichen fungiziden Mittels und von 600 pg/ml bis 1800 pg/ml des Verdünnungsmittels eines Nitrits sowie eine Fluoridionen-Konzentration von zumindest 40 mM/ml enthält, wobei die Lösung einen pH-Wert von 6,5 bis 7,0 besitzt.
17. 17. Kombination nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Medienlösung eine Lösung ist, die 1,0 mg/ml bis 4,0 mg/ml 2-Phenyläthanol, 10 pg/ml bis 250 pg/ml Cycloheximid, 600 μg/ml bis 800 μg/ml Natriumnitrit sowie eine Fluorionen-Konzentration von zumindest 40 mM/ml enthält -12- AT 396 116 B
18. 18. Verfahren zur qualitativen Sicherheitsprüfung eines Futter-Inokuliermittels, um das Vorhandensein von Laktobazillen-Stämmen zu bestimmen, ohne daß auch Kokken gezählt werden, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt: S (a) Herstellen einer biologischen Platte, die einen künstlichen Nährboden für standardisierte Verfahren enthält; (b) Darstellen einer wäßrigen Lösung des Verdünnungsmittels, die in Kombination enthält: 24 Einheiten/ml der Lösung des Verdünnungsmittels bis 40 Einheiten/ml der Lösung des Verdünnungsmittels eines gram-negativen Organismen-Hemmstoffs, 10 μg/ml der Lösung bis 250 μg/ml der Lösung eines wasserlöslichen fungiziden Mittels, 600 μg/ml bis 1800 μg/ml eines wasserlöslichen Nitrits sowie eine Kozentration von 10 Fluorid-Ionen von zumindest 40 mM/ml, wobei die Lösung einen pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 7,5 besitzt; und (c) Aufbringen einer geringen, jedoch wirkungsvollen Menge dieser Lösung auf die Platte im Zusammenhang mit einem zu prüfenden Futter-Inokuliermiltel; und (d) Inkubieren der inokulierten Platte unter anaeroben Bedingungen, um ausschließlich Laktobazillen-Stämme zu 15 züchten, während gleichzeitig das Wachstum von Milchsäure-Kokken gehemmt wird. -13-