AT396115B - Verduennungsloesung fuer normalerweise trockene naehrmediumfolien und verfahren zur zuechtung von milchsaeurebakterien - Google Patents

Verduennungsloesung fuer normalerweise trockene naehrmediumfolien und verfahren zur zuechtung von milchsaeurebakterien Download PDF

Info

Publication number
AT396115B
AT396115B AT66486A AT66486A AT396115B AT 396115 B AT396115 B AT 396115B AT 66486 A AT66486 A AT 66486A AT 66486 A AT66486 A AT 66486A AT 396115 B AT396115 B AT 396115B
Authority
AT
Austria
Prior art keywords
dilution solution
nitrite
solution according
film
dilution
Prior art date
Application number
AT66486A
Other languages
English (en)
Other versions
ATA66486A (de
Original Assignee
Pioneer Hi Bred Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pioneer Hi Bred Int filed Critical Pioneer Hi Bred Int
Publication of ATA66486A publication Critical patent/ATA66486A/de
Application granted granted Critical
Publication of AT396115B publication Critical patent/AT396115B/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/335—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Lactobacillus (G)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

AT 396 115 B
Gegenstand dar vorliegenden Erfindung ist eine Verdünnungslösung, um normalerweise trockene, vollständige, gebrauchsfertige Bakterien-Nährmediumfolien spezifisch für das selektive Wachstum von Milchsäurebakterien unter anaeroben Bedingungen zu machen.
Außerdem betrifft die Erfindung eine Kombination einer normalerweise trockenen, vollständigen, gebrauchs-5 fertigen Bakteriennährmedienfolie mit einem derartigen Verdünner sowie ein Verfahren zur anaeroben Züchtung von Milchsäurebakterien.
In letzter Zeit konnte die Entwicklung von Trockenmedium-Kulturplatten beobachtet worden, von denen ein typisches Beispiel die Platte ist, die von der 3M Company verkauft wird, wobei diese Produkte in der Regel aus einem trockenen, vollständigen, gebrauchsfertigen Bakterienkulturmedium bestehen, das auf eine Folienunterlage 10 aufgezogen und mit beispielsweise einer Polyethylenfolie überzogen ist Die Unterlage enthält Nährstoffe für die Standardmethode und ein in kaltem Wasser lösliches Quellmittel. Die Überzugsfolie ist ebenfalls mit dem Quellmittel beschichtet und enthält zusätzlich die Indikatorfarbe 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid, um die Zählung zu erleichtern. Ein auf der untersten Folie gezeichneter Raster (jedes Quadrat 1 cm x 1 cm) unterstützt ebenfalls das Zählverfahren. Das Gesamtausmaß einer derartigen Folie oder Platte beträgt 20 cm^. 15 Diese Trockenmedium-Kulturplatten, wie sie oben beschrieben sind, haben oft Vorteile gegenüber den üblicheren Petrischalen und Agarplatten, die meist zum Beimpfen und für das Bakterienwachstum verwendet werden. Beispielsweise erfordert die ältere, üblichere Verwendung von Petrischalen und Ager-Nährmedien einen beträchtlichen gewichtsmäßigen und räumlichen Aufwand. Dadurch wird der Transport von Organismenproben vom Feld in die Läboratoriumseinrichtungen günstigenfalls umständlich. Andererseits stellt die trockene 20 Nährmediumfolie, auf der das Bäkterienwachstum einfach durch Zusatz einer wässerigen Probe unterstützt wird, eine wirksamere Methode zur Zählung lebensfähiger Bakterien dar als die derzeit üblichen Methoden.
Tatsache ist es jedoch, daß die erhältlichen trockenen Nährmediumfolien nur ein Standard-Kulturmedium auf der Folienunterlage aufgezogen enthalten. Anders gesagt ist das derzeit verwendete Kulturmedium eines, das zur Züchtung aller Arten von Organismen geeignet und nicht selektiv für das Wachstum einer speziellen Art ist. 25 Somit mußte der Bakteriologe, der einen speziellen Organismus züchten wollte, bisher auf die Möglichkeit der Verwendung der sehr angenehmen Nährmediumfolien verzichten und auf die umständlichen üblichen Agarplatten zurückkommen, die speziell zugerichtete Kulturmedien aufweisen, von denen es bekannt ist, daß sie das Wachstum des gewünschten speziellen Organismus fördern und gleichzeitig das Wachstum der unerwünschten Arten inhibieren. Da die Bakteriologen und Mikrobiologen aber sehr oft nur einen einzigen speziellen Organismus zur 30 weiteren Isolierung, zum Studium, zur Auswertung und zur Verwendung züchten wollen, waren daher die das Standardmedium enthaltenden trockenen Nährmediumfolien wegen ihres nichtselektiven Mediums in vielen Fällen nicht brauchbar.
Die vorliegende Erfindung stellt daher eine Verdünnerlösung zur Verfügung, um normalerweise trockene, vollständige, gebrauchsfertige Nährmediumfolien spezifisch für das selektive Wachstum von Milchsäurebakterien 35 unter anaeroben Bedingungen zu machen, während gleichzeitig das Wachstum anderer Organismen inhibiert wird.
Erfindungsgemäß ist eine derartige Verdünnerlösung dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer wässerigen Lösung besteht, die enthält: a) einen Inhibitor für gram-negative Organismen in einer Menge von 24 Einheiten/ml bis 40 Einheiten/ml 40 Verdünnungslösung, b) ein wasserlösliches antimykotisches Mittel in einer Menge von 10 pg/ml bis 250 μg/ml Verdünnungslösung und c) ein wasserlösliches Nitritsalz in einer Menge von 600 μg/ml bis 1800 μg/ml Verdünnungslösung, und daß d) diese Lösung einen pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 7,5 hat. 45
Basierend auf dieser Verdünnerlösung wird ein Verfahren zur anaeroben Züchtung von Milchsäurebakterien, die bis zu ein Jahr lang lagerfähig sind, zur Verfügung gestellt, das gekennzeichnet ist durch folgende Schritte: a) Gewinnung einer biologischen Filmplatte, die ein Standardkulturmedium enthält, 50 b) Herstellung einer wässerigen oben genannten Verdünnerlösung und Aufbringen einer geringen, doch wirksamen Menge dieser Lösung auf die genannte Filmplatte gemeinsam mit einer Milchsäureorganismen enthaltenden Probe; sowie c) Inkubation des Films unter anaeroben Bedingungen zur Herstellung einer lagerfähigen Kultur. 55 Es gibt zahlreiche Gründe, warum Bakteriologen und Mikrobiologen einen speziellen Organismus unter Aus schluß anderer Organismen züchten möchten. Die gemäß der vorliegenden Erfindung entwickelte Träger- oder Verdünnungslösung ist speziell darauf ausgerichtet, Nährmedienfolien spezifisch für Lactobacillaceae zu machen. Somit erlaubt sie die angenehme Nutzung der wünschenswerten Vorteile der Nährmedienfolien, wie die Auswärts-Probennahme, den Transport und die Untersuchung, auch wenn speziell nur der Organismus Lactobacillaceae 60 gezüchtet wird.
Typische Milchsäureorganismen, die selektiv auf den oben beschriebenen Nährmediumfolien gezüchtet -2-
AT 396 115 B werden können, wenn man das erfindungsgemäße Verdünnungsmittel verwendet, sind Streptococci, Pediococci, Lactobacilli und Leuconostocs.
Das erfindungsgemäß zu verwendende Verdünnungsmittel ist ein Dreikomponentensystem und basiert auf Wasser. Die Lösung enthält eine Kombination eines Inihibitors für gram-negative Organismen, ein antimykotisches Mittel und ein wasserlösliches Nitritsalz. Die Lösung muß auch einen pH-Wert innerhalb des Bereiches von etwa 6,5 bis etwa 7,4, also vorzugsweise neutral, haben. Wenn diese Bedingungen eingehalten werden, ergibt sich ein Verdünnungsmittel, das beim Aufbringen auf eine trockene Nährmediumfolie die Folie organismenspezifisch für Lactobacillaceae macht
Der Inibitor für die gram-negativen Organismen kann ein Polymixin-Antibiotikum sein und besteht vorzugsweise aus Polymixin B-SulfaL
Die Impflösung enthält auch ein wasserlösliches antimykotisches Mittel in einer Konzentration innerhalb des Bereiches von 10 pg/ml bis etwa 250 pg/ml, wobei etwa 10 pg/ml bis etwa 20 pg/ml bevorzugt sind. Ein bevorzugtes antimykotisches Mittel ist Cycloheximid. Man kann jedoch außer Cycloheximid andere antimykotische Mittel und Konserviermittel, wie Kaliumsorbat, butyliertes Hydroxyanisol (BHA) und butyliertes Hydroxytoluol (BHT) verwenden.
Die dritte Komponente der Träger- oder Verdünnungslösung ist das wasserlösliche Nitritsalz. Dieses kann jedes wasserlösliche Metallnitritsalz sein, ist vorzugsweise jedoch ein Nitritsalz eines Metalles der Gruppe I des Periodensystems und ist insbesondere entweder Natriumnitrit oder Kaliumnitrit. Kaliumnitrit ist das am meisten bevorzugte. Ein Nitritsalz, das innerhalb dieses Konzentrationsbereichs verwendet wird, zeigte eine Wachstumsinhibierung für Organismen mit Ausnahme von Milchsäurebakterien.
Die Trägerlösung muß einen pH-Wert innerhalb des Bereiches von 6,5 bis etwa 7,5 vorzugsweise von etwa 6,5 bis etwa 7,0 haben. Ideal ist es, wenn die Verdünnungslösung neutral ist. Es hat sich als wichtig herausgestellt, daß, wenn man die Nährmediumfolie Lactobacillaceae-spezifisch macht, der pH-Wert im allgemeinen innerhalb des Neutralbereichs, d. h. zwischen etwa 6,5 bis etwa 7,5 bleibt. Das hat seinen Grund darin, daß die handelsüblichen Folien eine Tetrazolium-Farbe zur Rotfärbung der gezüchteten Bakterien zur Erleichterung der Faibzählung enthalten. Die Tetrazolium-Farbe wird jedoch für alle wachsenden Organismen giftig, wenn der pH-Wert saurer wird, beispielsweise in einen Bereich von 5,5 kommt. Daher muß die erfindungsgemäße Trägerlö-sung einen pH-Wert innerhalb des genannten Bereichs haben, der die nachteilige Reaktion mit der Tetrazolium-Farbe verhindert.
Um den Inhibitionseffekt für das Wachstum der anderen Organismen so groß als möglich zu halten, ist es für die vorliegende Erfindung auch wichtig, daß die beimpfte Folie unter anaeroben Bedingungen inkubiert wird. Anders gesagt ist die Verdünnungslösung nur unter anaeroben Bedingungen für Lactobacillaceae organismenspezifisch. Diese anaerobe Umgebung kann man durch viele bekannte Möglichkeiten, wie die Verwendung von An-aerob-Generatoren, die von BBL Microbiology Systems in Cokesville, Maryland, hergestellt werden, erzeugen.
Die obige Beschreibung erfolgte im Zusammenhang mit der Verwendung von Polymixin-Antibiotika als Inhibitor für gram-negative Organismen. Eine weitere Formulierung wurde entwickelt, die für viele Zwecke geeignet ist und in manchen Fällen sogar besser arbeitet als die oben beschriebene Zusammensetzung. Sie beruht auf der Verwendung von 2-Phenylethanol als Inhibitor für die gram-negativen Organismen. Wenn 2-Phenyl-ethanol verwendet wird, so ist eine bevorzugte Zusammensetzung eine gemäß der folgenden Beschreibung. Die Konzentration des 2-Phenylethanols sollte im Bereich von etwa 1 mg/ml bis etwa 4 mg/ml liegen. Die Konzentration des antimykotischen Mittels sollte im Bereich von etwa 10 Mikrogramm/ml bis etwa 250 Mikro-gramm/ml liegen und die Konzentration des wasserlöslichen Nitritsalzes sollte bei etwa 600 Mikrogramm/ml bis etwa 800 Mikrogramm/ml liegen. Der pH-Wert wird im Bereich von etwa 6,5 bis etwa 7,5, vorzugsweise von etwa 6,5 bis etwa 7,0 liegen.
Die Anwendung der mit Trockenmedium beschichteten Folien im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Verdünnerlösungen erfolgt nach einem üblichen, für Mikrobiologen und Bakteriologen bekannten Verfahren. Prinzipiell besteht das Verfahren aus Folgendem: Die Fölie wird auf eine glatte Oberfläche aufgelegt, die transparente obere Folie wird angehoben, sodaß eine 1 ml-Probe des den Organismus enthaltenden Verdünnungsmittels auf die untere Folie aufgebracht werden kann. Die obere Folie wird dann sorgfältig wieder auf die untere Folie aufgelegt Ein Probenausbreiter aus Kunststoff wird dann leicht auf die obere Folie gepreßt, um die Trägerlösung über die untere, das Medium enthaltende Folie auszubreiten. Daraufhin wird die Folie etwa 1 min ruhen gelassen, damit sie quellen kann. Dann wird die Folie in horizontaler Lage mit der klaren Folienseite nach oben 48h bei 32 °C inkubiert. Die Organismen reduzieren die Tetrazolium-Indikatorfarbe in der unteren Folie, sodaß die Organismenkolonien auf der Folie als rote Flecken erscheinen, die gezählt werden kämen.
Die folgenden Beispiele werden zur weiteren Erläuterung, jedoch nicht zur Einschränkung des Verfahrens, der Technik und der Produktzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung angeboten.
Beispiele
Bei jedem der im folgenden gezeigten Beispiele bestand die trockene Nährmediumfolie aus der von der 3M-Company (Abteilung Medizinische Produkte, St. Paul, Minnesota 55144) entwickelten Platte. Diese Platte bestand aus einem trockenen, vollständigen, gebrauchsfertigen Bakterienkulturmedium, das auf ein»- Folienunterlage aufgebracht und mit einer Polyethylenfolie überzogen war. Die Unterlage enthielt Nährstoffe für die Stan- -3-
AT396115B dardmethode und ein kaltwasserlösliches Quellmittel. Die Überzugsfolie, die ebenfalls mit einem Quellmittel beschichtet war, enthielt auch 23,5-TriphenyltetrazoUumchlorid-Indikatorfarbe, um die Zählung der Organismen zu erleichtern. Ein Raster mit Quadraten von 1 cm x 1 cm war in der Unterlagsfolie vorgesehen und unterstützte auch den Zählvorgang. Die Gesamtdimensionen der Petrifilm"'-Platte betrugen 20 cm^. 5 Zum Grundverfahren gehört die Herstellung von Vorratslösungen des Verdünnungsmittels, die Inokulierung der Nährmedium-Platte mit anschließender Inkubation bei 32 °C während 48 h unter anaeroben Bedingungen und schließlich die Auszählung der Organismen (cfu/ml). Eine Bodenprobe aus einem Glashaus wurde als Testkultur verwendet und eine andere, mit S/80 bezeichnete Probe, von der bekannt war, daß sie eine Lactobacillus-Kultur war, wurde als Vergleich herangezogen. Die Bodenprobe enthielt bekanntermaßen neben dem Lactobacillus noch 10 viele andere Organismen.
Die Vorratslösungen des Verdünners wurden mit folgenden Gehalten an Natriumnitrit in Gew.-%/Volumen hergestellt: 1 Gew.-%/Volumen, 6 Gew.-%/Volumen, 12 Gew.-%/Volumen und 18 Gew.-% Volumen. Cyclo-heximid wurde mit Gehalten von 0,1,0,5,1 und 23 Gew.-%/Volumen eingesetzt. Da bei dieser ersten Serie von Beispielen die Konzentrationsänderungen von Natriumnitrit und Cycloheximid untersucht werden sollten, wurde 15 Polymixin B mit einem konstanten Wert von 0,03 Gew.-%/Volumen eingesetzt.
Die Vorratslösungen wurden filtersterilisiert und der endgültige Verdünner wurde unter Verwendung von 97 ml sterilisiertem destilliertem Wasser und Zusatz von jeweils 1 ml pro 100 ml Wasser jeder der drei Komponenten, d. h. Natriumnitrit, Cycloheximid und Polymixin B, alle innerhalb der oben genannten Bereiche, hergestellt. Sterile Mischungen wurden dann aseptisch in Teströhrchen in einer Menge von 9 ml/Röhrchen einge-20 bracht. Die folgenden Mischungen wurden hergestellt:
Endkonzentration der Bestandteile
Vergleich Butterfield-Puffer* plus 0,1 % Tween 80 Variation 1 100 μg/ml Nitrit 10 μg/ml Cycloheximid 24 Einheiten/ml Polymixin B Variation 2 600 μg/ml Nitrit 10 μg/ml Cycloheximid 24 Einheiten/ml Polymixin B Variation 3 1200 μΐ/ml Nitrit 10 μg/ml Cycloheximid 24 Einheiten Polymixin B Variation 4 1800 μg/ml Nitrit 10 μg/ml Cycloheximid 24 Einheiten/ml Polymixin B. Variation 5 600 μg/ml Nitrit 50 μg/ml Cycloheximid 24 Einheiten/ml Polymixin B Variation 6 600 μg/ml Citrit 100 μg/ml Nycloheximid 24 Einheiten/ml Polymixin B Variation? 600 μg/ml Nitrit 250 μβ/ιηΐ Cycloheximid 24 Einheiten/ml Polymixin B * Butterfield-Puffer ist eine in der Lebensmittel-Mikrobiologie übliche Kaliumphosphat-Pufferlösung. 55
Gemäß den standardisierten Petrifilmm-Verdünnungsmethoden wurde der S/80 Vergleich bearbeitet, insbesondere wurde 1 ml einer Übemacht-Kultur unter Verwendung der Testlösung serienmäßig verdünnt und Volumina von 1 ml wurden auf die Platten aufgebracht. Eine Probe von 11 g aus der Glashauserde wurde ursprünglich in 60 100 ml Butterfield-Puffer verdünnt. Diese Zubereitung wurde dann unter Verwendung der Testlösung serienmäßig verdünnt. -4-
AT 396 115 B
Volumina von 1,0 ml der 10'^-, IO"7- und 10"8-Verdünnungen von S/80 wurden auf das Petrifilm'"-
Beschichtungsmedium aufgebracht. Volumina von 1,0 ml der 10"4-, 10'^- und 10'^-Verdünnungen der Bodenprobe wurden auf das Petrifilm,n-Schichtmedium aufgebracht Die aufgestrichenen Proben wurden unter anaeroben Bedingungen in Behältern mit Gas Pack ®-Generatoren (BBL) inkubiert Sie wurden 48 h bei 32 °C inkubiert Die folgende Tabelle I zeigt die Auszählung der entstandenen Organismen bei Verwendung der oben spezifizierten Veidünnungslösung.
Tabelle!
Probe
Erde: Vergleich
Variation 1 Variation 2 Variation 3 Variation 4 Variation 5 Variation 6 Variation? S/80: Vergleich
Variation 1 Variation 2 Variation 3 Variation 4 Variation 5 Variation 6 Variation 7
Koloniebildende Einheiten/ml (cfu/mfi 5 xlO7 33 x 106 23 x 107 5 x1ο4 OxlO4 7.0 x 106 7.1 x 107 4.0 x 107 2.4 x IO9 7.5 x 108 1.3 x 109 13 x 109 1.3 x 109 9.6 x 108 13 x 109 1.0 x 109
Man sieht, daß hier ein signifikanter Anstieg des Inhibitionseffektes des Verdünners auf die Bodenmikroofga-nismen zu beobachten ist, wenn die Nitritkonzentration von 600 pg/ml auf 1200 gesteigert wird. Die Vergleichsprobe S/80 blieb unberührt von den Änderungen der Nitrit- und Cycloheximidkonzentrationen in den Bereichen von 100 μg/ml bis 1800 μg/ml bzw. 10 μg/ml bis 250 μg/ml. Man sieht auch, daß der Verdünner bewirkte, daß die Nährmedienfolie organismenspezifisch für den Organismus Lactobacillus war und das Wachstum anderer Organismen inhibierte. Ähnliche Versuche wie die für die Variationen 1-7 gezeigten wurden unter Veränderung der Polymixin B-Konzentration vorgenommen, von der sich herausstellte, daß sie keine Wirkung auf den S/80-Organismus in einem Bereich von 24 - 40 Einheiten/ml hatte. Bei den Bodenorganismen sank der Inhibitionseffekt bei Gehalten von unter 24 Einheiten Polymixin B/ml.
Beispiele, die den Austausch des Polvmixin B-Sulfates durch 2-Phenvlethanol zeigen. 2-Phenylethanoi (PEA), im Handel erhältlich von Sigma Scientific in Form einer Flüssigkeit (1 ml = 1,02 g) wurde in dem Verdünner verwendet. Das PEA wurde zur Herstellung der unten genannten Konzentrationen zu einem gegebenen Volumen Wasser zugesetzt und autoklaviert Filtersterilisierte Natriumnitritlösung mit 6 Gew.-%/Volumen und Cycloheximid-Lösungen mit 0,1 Gew.-%/Volumen wurden zur Vervollständigung der unten aufgezählten Mischungen verwendet wobei 1 ml pro 100 ml zubereitetem Verdünner zugesetzt wurden.
Tabellen Hergestellte Mischungen Gew.-%/Vol. 8 600 μg/ml Nitrit 10 pg/ml Cycloheximid 0.05 % PEA -5-
Hereestellte Mischungen AT396115B (Fortsetzung Tabelle ID Gew.-%/Vol. 9 600 pg/ml Nitrit 10 pg/ml Cycloheximid 0.10 % PEA 10 600 μg/ml Nitrit 10 μg/ml Cycloheximid 0.20 % PEA 11 600 μg/ml Nitrit 10 pg/ml Cycloheximid 0.4% PEA
Die Beimpfung und das Verfahren erfolgten wie in den oben beschriebenen Beispielen. Eine Lösung von S/80 und eine Erdprobe waren die untersuchten Proben. S/80 wurde aus einer Übemacht-Kultur serienmäßig mit den η o
Verdünnungsmischungen verdünnt und mit 10' und 10° auf Petrifilm"’ aufgebracht. Die Erdprobe wurde ursprünglich 1: lß mit 99 ml Butterfield-Puffer verdünnt und dann in dem gegebenen Verdünner serienmäßig verdünnt. Die ΙΟ-4-, 10'5 und 10’^-Verdünnungen der Bodenprobe wurden auf Petrifilm aufgebracht Die Folien wurden anaerob unter Verwendung von BBL Gas Packs® 48 h bei 32 °C inkubiert. Die Ergebnisse sind in Tabellen! gezeigt
Tabelle_m
Ergebnisse
Imnflösungen cfu/ml Ente: Variation 8 6,2 x 105 Variation 9 5X103 Variation 10 OxlO3 Variation 11 OxlO3 S/80: Variation 11 9,4 x 108
Wie man sieht bewirkt der Ersatz des Polymixin B - Sulfat-Antibiotikums durch Phenylethylalkohol sehr wohl die Inhibierung der Bodenmikroorganismen.
Die folgenden Beispiele zeigen verschiedene Änderungen in der Formulierung bei Verwendung von Phenylethylalkohol (PEA) als Inhibitor für die gram-negativen Organismen.
Tabelle IV -Formulierungen
Phenylethyl- Hergestellte Natriumnitrat- Cycloheximid- alkohol- Mischungen Konzentration Konzentration Konzentration Vergleich (Butterfield- Puffer) 12 800 pg/ml 10 μg/ml 0,1% 13 800 μg/ml 10 μg/ml 0,2% 14 600 pg/ml 10 pg/ml 0,1 % 15 600 pg/iml 10 μg/ml 0,2% 16* 800 pg/ml 10 μg/ml 0,1 % 17* 600 pg/ml 10 μ^/ιηΐ 0,1 % * enthält Polymixin B in einer Menge von 24 Einheiten/ml -6-

Claims (15)

  1. AT396115B Die Testproben bestanden aus S/80 und Erde. Die S/80-Verdünnungen wurden mit 10'7 und 10*8 aufgebracht Die Erde wurde ursprünglich mit 99 ml (1: 10) modifizierten Butterfield-Puffer verdünnt und mit 10‘8 oder bis 10"^ aufgebracht Die Petrifilme wurden anaerob unter Verwendung von BBL Gas Packs"' 48 h bei 32 °C inkubiert wie es ähnlich auch bei den früheren Beispielen beschrieben wurde. Die Resultate sind im Folgenden angegeben: Tabelle V - Resultate Probe Mischung cfu/ml Vergleich Vergleich 9,8 x 108 S/80 12 8,7 x 108 13 8,5 x 108 14 8,7 x 108 15 1,0 x 109 16 7,4 x 108 17 1,1 x 109 Vergleich: -- 2,7 x 107 Erde: 12 1,8 x 104 13 3,0 x 102 14 3,4 x 106 15 3,3 x 104 16 4,2 x 104 17 9,0 x 104 Wie man sieht ergab die Lösung Nr. 13 die besten Inhibitionswirkungen für die Erde, ohne das Wachstum von S/80 nachteilig zu beeinflussen. Man sieht aus jedem der obigen in den verschiedenen Tabellen dargestellten Beispiele, daß wirksame Verdünnungszusammensetzungen Nährmediumfolien spezifisch für Milchsäurebakterien machen können und daher ihre Brauchbarkeit wirksam ergänzen. PATENTANSPRÜCHE 1. Verdünnungslösung, um normalerweise trockene, vollständige, gebrauchsfertige Bakterien-Nährmediumfolien spezifisch für das selektive Wachstum von Milchsäurebakterien unter anaeroben Bedingungen zu machen, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer wässerigen Lösung besteht, die enthält: a) einen Inhibitor für gram-negative Organismen in einer Menge von 24 Einheiten/ml bis 40 Einheiteu/ml Verdünnungslösung, b) ein wasserlösliches antimykotisches Mittel in einer Menge von 10 μg/ml bis 250 μg/ml Verdünnungslösung und c) ein wasserlösliches Nitritsalz in einer Menge von 600 μg/ml bis 1800 pg/inl Verdünnungslösung, und daß d) diese Lösung einen pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 7,5 hat.
  2. 2. Verdünnungslösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor für die gram-negativen Organismen ein Polymixin-Antibiotikum ist
  3. 3. Verdünnungslösung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymixin-Antibiotikum ein Polymixin-B-Sulfat ist. -7- AT396115B
  4. 4. Verdünnungslösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das antimykotische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cycloheximid, Kaliumsorbat, butyliertem Hydroxytoluol (BHT) und butyliertem Hydroxyanisol (BHA).
  5. 5. Verdünnungslösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nitrit ein Nitrit der Metalle der Gruppe I des Periodensystems ist
  6. 6. Verdünnungslösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nitrit Natriumnitrit ist
  7. 7. Verdünnungslösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert bei 6,5 bis 7,0 liegt
  8. 8. Verdünnungslösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer wäßrigen Lösung besteht, die enthält: a) 2-Phenylethanol in einer Konzentration von 1,0 mg/ml bis 4,0 mg/ml Verdünnungslösung, b) ein wasserlösliches antimykotisches Mittel in einer Konzentration von 10 pg/ml bis 250 pg/ml Verdünnungslösung und c) ein wasserlösliches Nitritsalz in einer Konzentration von 600 μg/ml bis 800 μg/ml Verdünnungslösung, und daß φ diese Lösung einen pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 7,5 hat.
  9. 9. Verdünnungslösung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das antimykotische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cycloheximid, Kaliumsorbat butyliertem Hydroxytoluol (BHT) und butyliertem Hydroxyanisol (BHA).
  10. 10. Verdünnungslösung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert zwischen 6,5 und 7,0 liegt
  11. 11. Verdünnungslösung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Nitrit ein Nitrit eines Metalls der Gruppe I des Periodensystems ist
  12. 12. Verdünnungslösung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Nitrit Natriumnitrit ist
  13. 13. Kombination einer normalerweise trockenen, vollständigen, gebrauchsfertigen Bakteriennährmedienfolie und eines Verdünners nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
  14. 14. Kombination nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die normalerweise trockene, vollständige, gebrauchsfertige Bakteriennähimedienfolie enthält a) ein auf einer Folienunterlage aufgebrachtes Bakteriennährmedium und eine darüber geschichtete transparente Folie, wobei b) diese Folienunterlage Nährstoffe für Standardmethoden sowie ein kaltwasserlösliches Quellmittel enthält und c) die Überzugsschicht mit einem Quellmittel beschichtet ist und eine 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid-Indi-katorfarbe zur Erleichterung der Keimzählung enthält
  15. 15. Verfahren zur anaeroben Züchtung von Milchsäurebakterien, die bis zu einem Jahr lang lagerfähig sind, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: a) Gewinnung einer biologischen Filmplatte, die ein Standardkulturmedium enthält b) Herstellung einer wässerigen Verdünnungslösung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und Aufbringen einer geringen, doch wirksamen Menge dieser Lösung auf die genannte Filmplatte gemeinsam mit einer Milchsäureorganismen enthaltenden Probe; sowie c) Inkubation des Films unter anaeroben Bedingungen zur Herstellung einer lagerfähigen Kultur. -8-
AT66486A 1985-07-08 1986-03-13 Verduennungsloesung fuer normalerweise trockene naehrmediumfolien und verfahren zur zuechtung von milchsaeurebakterien AT396115B (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US75282685A 1985-07-08 1985-07-08

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ATA66486A ATA66486A (de) 1992-10-15
AT396115B true AT396115B (de) 1993-06-25

Family

ID=25028027

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
AT66486A AT396115B (de) 1985-07-08 1986-03-13 Verduennungsloesung fuer normalerweise trockene naehrmediumfolien und verfahren zur zuechtung von milchsaeurebakterien

Country Status (8)

Country Link
JP (1) JPS6229967A (de)
AT (1) AT396115B (de)
BE (1) BE904174A (de)
CA (1) CA1273308A (de)
DE (1) DE3607591A1 (de)
FR (1) FR2584417B1 (de)
GB (2) GB2177419B (de)
NL (1) NL8600468A (de)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1290272C (en) * 1985-12-30 1991-10-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for differentiation with film medium of lactobacillus organisms from streptococcus organisms
US5462860A (en) * 1994-06-06 1995-10-31 Minnesota Mining And Manufacturing Company Conditioned culture medium for rapid growth and detection of microbes
FR3031988B1 (fr) 2015-01-28 2018-10-19 Charles Cervin Detection selective de bacteries lactiques et/ou acetiques ou de champignons

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3122480A (en) * 1961-05-25 1964-02-25 Warner Lambert Pharmaceutical Diagnostic preparation for detection of pseudomonas
US3360440A (en) * 1966-04-13 1967-12-26 Haab Walter Cold water reconstitutable microbiological medium, process for preparation and use, ad product
US4072570A (en) * 1972-04-11 1978-02-07 Beatrice Foods Co. Preparation of a tuberculosis test medium by reconstituting a storage stabilized dry powdered Lowenstein-Jensen medium
JPH0249705B2 (de) * 1981-01-27 1990-10-31 Minnesota Mining & Mfg
FR2559499B1 (fr) * 1984-02-09 1986-09-19 Hoechst Behring Applic Pharmac Nouveau milieu de culture, solide, a delitement rapide, pret a l'emploi et procede pour le preparer

Also Published As

Publication number Publication date
JPH0550269B2 (de) 1993-07-28
GB8616322D0 (en) 1986-08-13
NL8600468A (nl) 1987-02-02
BE904174A (fr) 1986-05-29
FR2584417B1 (fr) 1989-08-04
GB2177419B (en) 1989-08-23
GB8603351D0 (en) 1986-03-19
DE3607591A1 (de) 1987-01-08
ATA66486A (de) 1992-10-15
JPS6229967A (ja) 1987-02-07
CA1273308A (en) 1990-08-28
GB2177419A (en) 1987-01-21
FR2584417A1 (fr) 1987-01-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Burkholder et al. Antibiotic activity of some marine algae of Puerto Rico
EP0006192B1 (de) Vorrichtung und Verfahren für mikrobiologische Arbeiten
DE69610879T2 (de) Ein schneller mikrobiologischer test zum nachweis antibakterieller verbindungen
CH316291A (de) Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin
EP0024048A2 (de) Zweiseitig beschichtbares Membranfilter zum Einsatz im mikrobiologischen Screening
DE2833846C2 (de)
DE69807935T2 (de) Verfahren zur herstellung einer mikrobiellen kultur zur behandlung von abwasser
AT396115B (de) Verduennungsloesung fuer normalerweise trockene naehrmediumfolien und verfahren zur zuechtung von milchsaeurebakterien
DE69429385T2 (de) Selektives medium und verfahren zur zählung von propionischen bakterien
EP0006671A2 (de) Verfahren zur Erhaltung lebender Mikroorganismen
AT396116B (de) Verfahren zum differenzieren von streptococcen
DE1692313A1 (de) Verfahren zum Herstellen von Milchprodukten
DE2810453C3 (de) Verfahren zur Herstellung von ein bestimmtes Element in angereicherter Form enthaltenden Algen
DE69632373T2 (de) Selektive Medien zur Kultivierung und Isolierung von Gram-negativen Bakterien, antibiotische Zusammensetzung
DE2556737A1 (de) Verfahren zum entfernen von phosphor aus abfallwasser
Edlund et al. Comparative in vitro activities of ciprofloxacin, enoxacin, norfloxacin, ofloxacin and pefloxacin against Bacteroides fragilis and Clostridium difficile
DE60303024T2 (de) Verfahren zur herstellung einer probiotischen präparation
Stewart XVI.—Algal Metabolism and Water Pollution in the Tay Region
DE2729500A1 (de) Ansatz und verfahren fuer den mikrobennachweis durch fluoreszenz
DE1517852A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12
DE2903852A1 (de) Mikrobiologischer abbau von acrylnitril in waessrigen dispersionen
WO1987005625A1 (fr) Procede de regulation de biocenoses mixtes, microbiennes et stables
DE10136927B4 (de) Verwendung eines wäßrigen Nährmediums zur Vermehrung von heterofermentativen Milchsäurebakterien unter unsterilen Bedingungen zum Einsatz als Silierhilfsmittel bei der Gärfutterbereitung
DE3238819C2 (de)
DE933565C (de) Verfahren zur Gewinnung von Enzympraeparaten aus Mikroorganismen

Legal Events

Date Code Title Description
UEP Publication of translation of european patent specification
ELJ Ceased due to non-payment of the annual fee
REN Ceased due to non-payment of the annual fee