DE10136927B4

DE10136927B4 - Verwendung eines wäßrigen Nährmediums zur Vermehrung von heterofermentativen Milchsäurebakterien unter unsterilen Bedingungen zum Einsatz als Silierhilfsmittel bei der Gärfutterbereitung

Info

Publication number: DE10136927B4
Application number: DE10136927A
Authority: DE
Inventors: Dr. Beck Theodor; Dr. Groß Friedrich
Original assignee: Addcon Europe GmbH
Current assignee: Addcon Europe GmbH
Priority date: 2001-07-28
Filing date: 2001-07-28
Publication date: 2013-04-18
Anticipated expiration: 2021-07-29
Also published as: DE10136927A1

Abstract

Verwendung eines wäßrigen Nährmediums zur Vermehrung von heterofermentativen Milchsäurebakterien unter unsterilen Bedingungen umfassend mindestens ein Monosaccharid in einer Menge von 1 bis 2 Gew.-% bezogen auf die Wassermenge, mindestens ein Alkalisalz der Essigsäure in einer solchen Menge, dass das Gesamtgewicht an Acetat-Anionen und Essigsäure zwischen 0,2 bis 0,7 Gew.-% bezogen auf die Wassermenge beträgt, Stickstoffquellen, Spurenelemente, zusätzliche Makroelemente sowie neben den Alkalisalzen der Essigsäure weitere Pufferverbindungen, wobei die weiteren Pufferverbindungen mindestens in einer solchen Menge vorliegen, dass der pH-Wert des wäßrigen Nährmediums während einer zweitägigen Vermehrung ausschließlich heterofermentativer Milchsaurebakterien, die zu Beginn der Vermehrung in einer Keimdichte von 107 Keimen/ml im wäßrigen Nährmedium vorliegen, bei 24°C nicht kleiner als 4,5 wird.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines wäßriger Nährmediums zur Vermehrung von heterofermentativen Milchsäurebakterien unter unsterilen Bedingungen. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von Milchsäurebakterienkulturen als Silierhilfsmittel sowie ein Kombinationspräparat zur gleichzeitigen Vermehrung von homofermentativen und heterofermentativen Milchsäurebakterien.
Milchsäure erzeugende Bakterien spielen beim Einsilieren von Grünfutter, welches eine außerordentliche wirtschaftliche Bedeutung hat, eine wichtige Rolle, da die Milchsäuregärung ein wesentlicher Vorgang beim Einsilieren von Grünfutter ist.
So beschreibt die EP 0 250 786 A2 ein Verfahren zum Einsäuern von Grünfutter unter Verwendung von Bakterienpräparaten aus Milchsäure erzeugenden Bakterien. Dabei wird dem Anwender (Landwirt) ein Bakterienpräparat hoher Keimdichte zur Verfügung gestellt, welches in bekannter Weise mit der Hand, Dosiergeräten, Pulverspritzen und dergleichen dem einzusilierenden Gut zugesetzt wird.
Die DE 262 040 A beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines als Silierhilfsmittel bei der Futterbereitung geeigneten Milchsäurebakterienpräparates, welches dem Anwender (Landwirt) als gefriergetrocknetes Trockenpräparat mit hoher Keimdichte von ca. 10¹² vermehrungsfähigen Keimen pro 1 g Präparat zur Verfügung gestellt wird.
Daneben sind Kombinationspräparate von Milchsäurebakterien mit Alkali- und/oder Erdalkaliformiaten ( EP 0 399 385 A2 ) bekannt.
Diesen Erfindungen ist gemeinsam, dass dem Landwirt ein Milchsäurebakterienpräparat mit hoher Ausgangskeimdichte zur Verfügung gestellt wird, um eine ausreichende Keimzahl im zu silierenden Gut von etwa 10⁵ bis 10⁶ Keimen pro 1 g Trockensubstanz zu erzielen. Die aufwendige Herstellung solcher Milchsäurebakterienpräparate mit hoher Keimdichte führt dazu, dass dem Endverbraucher bislang nur relativ teure Präparate auf dem Markt zugänglich sind.
Die Herstellung einer als Silierhilfsmittel geeigneten Milchsäurebakterienkultur mit hoher Keimdichte durch den Endverbraucher selbst scheiterte jedoch lange Zeit an der Sterilitätsbedingung, die der Endverbraucher aufgrund des damit verbundenen Aufwands nicht realisieren konnte. In der EP 0 578 912 A2 wurde jedoch erstmals die Verwendung einer durch den Endverbraucher herstellbaren Milchsäurebakterienkultur als Silierhilfsmittel beschrieben. Die in diesem Dokument beschriebenen Milchsäurebakterienkulturen wurden dabei durch Vermehrung von Milchsäurebakterien in einem geeigneten wäßrigen Nährmedium mit definierter chemischer Zusammensetzung unter unsterilen Bedingungen erhalten. Die Milchsäurebakterienkulturen wurden dabei auf der Basis homofermentativer Vertreter den Genus Lactobacillus und/oder Pediococcus entwickelt und getestet, da für die Steuerung der Vergärung von leicht bis mittelschwer vergärbarem Grünfutter die verstärkte Bildung von Milchsäure, wie seit Langem bekannt, der entscheidende Faktor für gute Gärqualität ist. Die bisherigen Erfahrungen beim Einsatz dieser Milchsäurebakterienkulturen in der landwirtschaftlichen Praxis bei der Silierung von leicht bis mittel angewelktem Grünfutter sind sehr zufriedenstellend. Als wenig erfolgreich bzw. problematisch stellt sich jedoch der Einsatz der in der EP 0 578 912 A2 beschriebenen homofermentativen Milchsäurebakterienkulturen bei der Silierung von Problemsilagen wie etwa stark angewelktem Futter oder bei Mais heraus. Auch hier war zwar eine verstärkte Milchsäurebildung nach Bakterienbeimpfung feststellbar, die damit zusammenhängende Reduzierung des Gehaltes flüchtiger Carbonsäuren, wie beispielsweise Essigsäure, führte jedoch nach Öffnung des Silos und Luftzutritt zu mehr oder weniger starker Vermehrung von Hefen und Pilzen. Dieser als aerobe Instabilität seit langem bekannte Vorgang führt zu Erwärmung und zum teilweisen Verderb von Auslagerungssilagen. Bei Mais, der auch ohne Impfzusätze zumeist unter Luftabschluß sehr gut siliert, ist dieser nachträgliche Erwärmungs- und Verderbprozeß in der Praxis gefürchtet. Zusätze von Propionsäure oder Propionaten beim Einsilieren können diese Verderbprozesse durch die Hemmung der sie verursachenden Hefeorganismen meist recht gut verhindern. Allerdings liegt die Aufwandmenge in einem ökonomisch kaum mehr vertretbaren Bereich.
Seit wenigen Jahren ist jedoch bekannt, dass durch die Impfung solcher Problemsilagen mit geeigneten, Essigsäure bildenden helerofermentativen Milchsäurebakterien der Gehalt der Essigsäure über einen für Hefen nicht mehr tolerierbaren Bereich von etwa 0,45 bis 0,55% angehoben und diese Silagen somit aerob stabil gemacht werden können. Heterofermentative Milchsäurebakterien bilden im Gegensatz zu homofermentativen Milchsäurebakterien über den Fructose-1,6-biphosphat-Weg neben Milchsaure auch CO₂, Essigsäure und Ethanol. Heterofermentative Milchsäurebakterien wurden bisher jedoch ausschließlich in Form von gefriergetrockneten Trockenpräparaten hoher Keimdichte eingesetzt, was, wie bereits im Zusammenhang mit der Verwendung homofermentativer Milchsäurebakterien als gefriergetrocknetes Trockenpräparat ausgeführt, mit hohen Kosten für den 20 Endverbraucher (Landwirt) verbunden ist.
In H. G. SCHLEGEL et. al. „Allgemeine Mikrobiologie”, 5. Auflage, 1981, sind für das Wachstum von Milchsäurebakterien notwendige Suppline angegeben.
Die EP 0 399 385 A2 beschreibt ein Kombinationspräparat als Silierhilfe zum Einsäuern von Grünfutter und Verhindern von aeroben Abbauvorgängen im Gärfutter, welches Alkali- und/oder Erdalkaliformiate und gegebenenfalls übliche Trägerstoffe und/oder Hilfsstoffe sowie Milchsäure erzeugende Bakterien enthält.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand demnach darin, ein wässriges Nährmedium bereit zu stellen, welches es dem Landwirt ermöglicht, anstelle von sehr teuren, gefriergetrockneten Bakterienkulturen auf der Basis heterofermentativer Milchsäurebakterien mit hohem Keimgehalt mit Hilfe eines kostengünstigen, im folgenden beschriebenen Nährmedium mit extrem geringer Ausgangskeimdichte selber auf einfache Weise unter unsterilen Bedingungen heterofermentative Milchsäurebakterien mit hoher Keimdichte herzustellen. Die so erhaltenen Bakterienkulturen auf der Basis heterofermentativer Milchsäurebakterien sollen als Silierhilfsmittel eingesetzt werden können und eine deutlich Verbesserung der aeroben Stabilität des Siliergutes gegenüber den in der EP 0 578 912 A2 beschriebenen Silierhilfsmitteln ermöglichen.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass diese Aufgabe durch die Verwendung eines wässrigen Nährmediums gelöst werden kann, welches in seiner Zusammensetzung im wesentlichem dem in der EP 0 578 912 A2 beschriebenen Nährmedium entspricht, wobei jedoch die meisten Bestandteile des Nährbodens in einer Konzentration vorliegen, die im unteren des in der EP 0 578 912 A2 für die einzelnen Bestandteile offenbarten Konzentrationsbereiches liegen.
Die Erkenntnis, dass ein derartiges wäßriges Nährmedium zur Lösung dieser Aufgabe verwendet werden kann, war insofern überraschend und somit nicht vorhersehbar, als dass zum einen eine Anzucht heterofermentativer Milchsäurebakterien im geschlossenen Behälter wegen der zu erwartenden Gasbildung größere Probleme in der Praxis erwarten ließ. Bei den verwendeten Kulturen zeigte sich jedoch, dass die Gasentwicklung während der Keimvermehrung bis zum Erreichen der maximalen Keimdichte in einem geschlossenen Behälter so gering war, dass es z. B. zu keiner Aufblähung des Zuchtbehälters kam. Die gebildete CO₂-Menge blieb weitgehend im Nährmedium gelöst. Zum anderen war die Verwendbarkeit dieses Nährmediums zur Vermehrung der heterofermentativen Milchsäurebakterien überraschend, weil von einer im Vergleich zu homofermentativen Milchsäurebakterien sehr viel geringeren pH-Toleranz heterofermentativer Bakterien auszugehen war. Es ist bekannt, dass gerade heterofermentative Milchsäurebakterien hinsichtlich ihrer pH-Empfindlichkeit im Baustoffwechsel (Biomassebildung = Vermehrung) und im Betriebsstoffwechsel (z. B. Säure- und Gasbildung) unterschiedlich reagieren. Ihre Vermehrung wird bereits bei pH-Werten gehemmt, bei denen der Stoffwechsel noch weiterläuft (siehe , der pH-Abfall geht vom 2. bis zum 4. Bebrütungstag bei Lb. 98c (100%) weiter, während die Zellvermehrung stark verringert ist). Aufgabe von Kulturversuchen im Labor war es deshalb, für die in Frage kommenden heterofermentativen Stämme durch Optimierung des Substratangebotes und der den pH-Abfall regulierenden Puffersubstanzen eine passende Nährbodenauswahl zu finden, um so Bedingungen für eine möglichst lange und nicht durch zu tiefe pH-Werte gehinderte Vermehrungsphase zu schaffen.
Die vorliegende Erfindung betrifft demnach die Verwendung eines wäßrigen Nährmediums zur Vermehrung von heterofermentativen Milchsäurebakterien unter unsterilen Bedingungen umfassend mindestens ein Monosaccharid in einer Menge von 1 bis 2 Gew.-% bezogen auf die Wassermenge, mindestens ein Alkalisalz der Essigsäure in einer solchen Menge, dass das Gesamtgewicht aus Acetat-Anionen und Essigsäure zwischen 0,2 bis 0,7 Gew.-% bezogen auf die Wassermenge beträgt, Stickstoffquellen, Spurenelemente, zusätzliche Makroelemente sowie neben den Alkalisalzen der Essigsäure weitere Pufferverbindungen, wobei die weiteren Pufferverbindungen in einer solchen Menge vorliegen, dass der pH-Wert des wäßrigen Nährmediums während einer zweitägigen Vermehrung ausschließlich heterofermentativer Milchsäurebakterien, die zu Beginn der Vermehrung in einer Keimdichte von 10⁷ Keimen/ml im wäßrigen Nährmedium vorliegen, bei 24°C nicht kleiner als 4,5 wird.
Geeignete Monosaccharide sind Glucose, Fructose und Galactose. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Glucose als Monosaccharid. Im Nährmedium können jedoch auch andere Kohlenhydrate, wie z. B. Saccharose, Melasse, Lactose, Malzextrakte, Dextrine und/oder Stärke enthalten sein. Als Alkalisalz des Essigsäure wird bevorzugt das Natriumacetat eingesetzt. Als Stickstoffquellen eignen sich üblicherweise z. B. Proteine, Peptone, Sojamehl, Hefeextrakte und Ammoniumsulfat. Geeignete Macroelemente sind z. B. Phosphate, Kalium- oder Magnesium-Salze. Als Spurenelemente können üblicherweise z. B. Mangan, Molybdän, Zink, Kupfer oder Kobalt in Form ihrer Salze zugesetzt werden.
Die untere Grenze des Monosaccharidgehalts des wäßrigen Nährmediums beträgt, bezogen auf die Wassermenge, mindestens 1 Gew.-%, bevorzugt mindestens 1,25 Gew.-%. Die obere Grenze des Monosaccharidgehalts beträgt, bezogen auf die Wassermenge, höchstens etwa 2 Gew.-%, besonders bevorzugt höchstens 1,75 Gew.-%. Besonders bevorzugt liegt der Monosaccharidgehalt des wäßrigen Nährmediums, bezogen auf die Wassermenge, bei 1,5 Gew.-%.
Die untere Grenze des Gesamtgewichtes aus Acetat-Anionen und Essigsäure beträgt, bezogen auf die Wassermenge, mindestens 0,2 Gew.-%, bevorzugt mindestens 0,35 Gew.-%. Die obere Grenze des Gesamtgewichtes aus Acetat-Anionen und Essigsäure beträgt, bezogen auf die Wassermenge, höchstens 0,7 Gew.-%, besonders bevorzugt höchstens 0,55 Gew.-%. Besonders bevorzugt beträgt das Gesamtgewicht aus Acetat-Anionen und Essigsäure, bezogen auf die Wassermenge, 0,45 Gew.-%.
Die starke Pufferung der bei der Vermehrung der Milchsäurebakterien gebildeten Milchsäure wird durch einen unüblich hohen Zusatz von weiteren Pufferverbindungen neben dem Alkalisalz der Essigsäure erreicht. Die weiteren Pufferverbindungen werden in dem wäßrigen Nährmedium in einer solchen Menge zugesetzt, dass der pH-Wert des wäßrigen Nährmediums während einer Zweitägigen Vermehrung ausschließlich heterofermentativer Milchsäurebakterien, die zu Beginn der Vermehrung in einer Keimdichte von 10 Keimen/ml im wäßrigen Nährmedium vorliegen, bei 24°C nicht kleiner als 4,5 wird. Unterhalb eines pH-Wertes von 4,5 ist eine Vermehrung von heterofermentativen Milchsäurebakterien nicht mehr möglich (siehe ).
Bevorzugte weitere Pufferverbindungen sind Pepton und Hydrogenphosphatsalze. Diese können jeweils allein oder in Kombination mit anderen Pufferverbindungen zugesetzt werden. Als Hydrogenphosphatsalz wird besonders bevorzugt Dikaliumhydrogenphosphat zugesetzt. Dabei beträgt die untere Grenze des Dikaliumhydrogenphosphatgehaltes des wäßrigen Nährmediums, bezogen auf die Wassermenge, mindestens 0,2 Gew.-%. bevorzugt mindestens 0,3 Gew.-%. Die obere Grenze des Dikaliumhydrogenphosphatgehaltes des wäßrigen Nährmediums beträgt, bezogen auf die Wassermenge, höchstens 0,6 Gew.-%, bevorzugt höchstens 0,5 Gew.-%. Besonders bevorzugt beträgt die Dikaliumhydrogenphosphatmenge 0,4 Gew.-%. Die untere Grenze des Peptongehaltes beträgt mindestens 0,6 Gew.-%, bevorzugt mindestens 0,8 Gew.-%. Die obere Grenze des Peptongehaltes beträgt höchstens 1,5 Gew.-%, bevorzugt höchstens 1,2 Gew.-%. Besonders bevorzugt beträgt der Peptongehalt im wäßrigen Nährmedium 1,0 Gew.-%.

Als heterofermentative Milchsäurebakterien werden bevorzugt solche des Genus Lactobacillus verwendet. Bei Vergleichsuntersuchungen stellt sich heraus, dass aus der großen Zahl von heterofermentativen Vertretern des Genus Lactobacillus, die aus Silagen isolierbar sind, nur sehr wenige die erwünschte Eigenschaft einer ausreichenden Bildung von Essigsäure bei möglichst niedrigem pH-Wert und gleichzeitig möglichst geringer CO₂-Produktion unter den Bedingungen im Silo besitzen. Diese Kriterien wurden auch deshalb ausgewählt, damit sichergestellt werden konnte, dass Nährstoffverluste gering gehalten werden kennen. Eine Reihe der nach diesen Kriterien ausgesuchten heterofermentativen Arten des Genus Lactobacillus erbrachten nach Impfzusatz die erwünschte, auf verstärkter Essigsäure-Bildung beruhende, die aerobe Stabilität verbessernde Wirkung. Die in einem solchen Screening-Test ermittelten positiven Eigenschaften konnten, wie die Tabelle 1 zeigt, bei einzelnen, jedoch nicht bei allen der zum Formenkreis der taxonomisch als Lactobacillus buchneri bestimmten heterofermentativen Lactobacillen (frühere Bezeichnung: „Betabakterien”) beobachtet werden. Für die Zuordnung zur Art Lactobacillus buchneri ist nach R. Reck (R. Reck: „Taxonomie und Physiologie der Milchsäurebakterien in Silagen”, Dissertation, München 1989) neben der Melezitosevergärung auch die elektrophoretische Mobilität der Lactatdehydrogenasen maßgeblich. Tabelle 1: Gärfutterqualität und aerobe Stabilität von Maissilage nach Impfung mit Lactobacillen (Mais, geerntet am 28.9.1998, ¹⁾TS 42%, Silierdauer: 68 Tage. Anlage und Durchführung, z. B. Luftstress in bestimmten Zeitintervallen sowie die Auswertung erfolgte in der gleichen Weise wie bei den in Tab. 3 zusammengestellten Silierversuchen).

Varianten	²⁾n	Verluste (g)	pH	Hefen + Pilze	³⁾aerobe Stabilität (mg CO₂/g/70h)	Milchsäure (%)	Essig- säure (%)	Alkohol (%)
Kontrolle	6	3,49	3,83	200000	3,5	1,33	0,22	0,064
L. plantarium	3	2,89	3,82	250000	> 5	1,41	0,33	0,063
L. buchneri A	3	3,34	3,87	50000	2,8	1,34	0,34	0,068
L. buchneri B	3	3,41	3,86	4000	1,9	1,36	0,32	0,086
L. buchneri Lb. 98c	3	3,87	3,88	500	0,3	1,15	0,59	0,110

¹ ⁾TS = Trockensubstanz
²⁾n = Anzahl der Messungen mit den einzelnen Varianten
³⁾Bestimmung der CO₂-Abgabe in einer IR-Messanlage nach Luftdurchleitung bei 23°C (erschwerte Stabilität)

Ein besonders wirksamer und daher erfindungsgemäß besonders bevorzugter Stamm des Lactobacillus buchneri ist unter der Bezeichnung Lactobacillus buchneri Lb. 98c bei der DSM hinterlegt (DSM 13573). Nur bei Impfzusatz mit Lactobacillus buchneri Lb. 98c geht eine nahezu völlige aerobe Stabilität einher mit geringem Hefe- und Pilzbesatz sowie mit erhöhtem Essigsäure- und Alkoholgehalt. Bevorzugt sind ferner Subspecies des Lactobacillus buchneri Lb. 98c.
Die unter Grenze der Keimdichte der heterofermentativen Milchsäurebakterien im wäßrigen Nährmedium beträgt zu Beginn der Vermehrung zweckmäßig mindestens 5 × 10⁶/ml, bevorzugt mindestens 10⁷/ml. Die obere Grenze der Ausgangskeimdichte beträgt zweckmäßig höchstens 10⁶/ml, bevorzugt höchstens 5 × 10⁷/ml. Besonders bevorzugt beträgt die Ausgangskeimdichte der heterofermentativen Milchsäurebakterien 2,5 × 10⁷/ml.
Um eine wirkungsvolle Beherrschung einer möglichen Gasentwicklung nach Lagerung der Kulturen in den Anzuchtgefäßen zu ermöglichen, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, zu Beginn der Anzucht dem wäßrigen Nährmedium neben den ausgewählten heterofermentativen Milchsäurebakterien gleichzeitig homofermentative Milchsäurebakterien in einer im Vergleich zu den heterofermentativen Milchsäurebakterien sehr geringen Keimzahl zuzusetzen. Während der ersten 36–48 Stunden der Keimvermehrung entwickeln sich aus der Mischkultur entsprechend der sehr viel größeren Impfmenge zunächst die heterofermentativen Milchsäurebakterien. Mit fortschreitender Bebrütungsdauer holen die homofermentativen Milchsäurebakterien wegen ihrer deutlich größeren Zellteilungsrate auf. Nach einer bestimmten, von der Ausgangskeimdichte abhängigen Bebrütungsdauer wird durch ihr Wachstum der pH-Wert soweit abgesenkt, dass die vorhandenen heterofermentativen Milchsäurebakterien ihren Stoffwechsel einstellen. Wie zeigt, wird der Grenz-pH-Bereich für das Wachstum der homofermentativen Milchsäurebakterien von etwa 4,6 bereits bei Keimdichten von homofermentativen Milchsäurebakterien weit unterhalb der von den zwischenzeitlich gewachsenen heterofermentativen Kulturen erreicht. Verantwortlich dafür ist die gegenüber Essigsäure sehr viel stärkere pH-Absenkung durch das alleinige Fermentationsprodukt Milchsäure der homofermentativen Milchsäurebakterien, die einen erheblich größeren Dissoziationswert aufweist als Essigsäure. Die Vermehrungs- und Lebensfähigkeit der im Kulturmedium bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 4,6 gewachsenen heterofermentativen Milchsäurebakterien wird durch die Inkubation der Bakterien bei einem pH-Wert unterhalb 4,6 nicht beeinträchtigt. Als homofermentative Milchsäurebakterien werden bevorzugt homofermentative Vertreter des Genus Lactobacillus und/oder Pediococcus, besonders bevorzugt solche der bei der DSM hinterlegten Species Lactobacillus plantarium B 5 (DSM 3676) und/oder Lactobacillus plantarum W 2 (DSM 3677) verwendet.
Im Falle des Einsatzes einer Mischkultur aus heterofermentativen und homofermentativen Milchsäurebakterien beträgt die untere Grenze der Ausgangskeimdichte der homofermentativen Milchsäurebakterien zu Beginn der Vermehrung zweckmäßig mindestens 0,05%, bevorzugt mindestens 0,075% der Ausgangskeimdichte der heterofermentativen Milchsäurebakterien (Ausgangskeimdichte = Keimdichte zu Beginn der Vermehrung). Die obere Grenze der Ausgangskeimdichte der homofermentativen Milchsäurebakterien zu Beginn der Vermehrung beträgt zweckmäßig höchstens 0,15%, bevorzugt höchstens 0,09% der Ausgangskeimdichte der heterofermentativen Milchsaurebakterien. Besonders bevorzugt beträgt die Ausgangskeimdichte der homofermentativen Milchsäurebakterien im Falle des Einsatzes einer Mischkultur 0,075% der Ausgangskeimdichte der heterofermentativen Milchsäurebakterien.
Im Falle einer Mischkultur von homofermentativen und heterofermentativen Milchsäurebakterien ist eine Anhebung der Konzentrationen an puffernd wirkenden Komponenten (Dikaliumhydrogenphosphat, Pepton) auf Werte, die im oberen Bereich des auf der Seite 6 beschriebenen oberen bzw. bevorzugten oberen Konzentrationsbereiches für diese puffernd wirkenden Komponenten liegen, notwendig. Denn bedingt durch die Anwesenheit der homofermentativen Milchsäurebakterien kommt es im Vergleich zu einer reinen heterofermentativen Milchsäurebakterienkultur zu einer deutlich größeren Milchsäurebildung. Im Falle einer Mischkultur aus hetero- und homofermentativen Milchsäurebakterien werden die weiteren Pufferverbindungen bevorzugt in einer solchen Menge zugesetzt, dass der pH-Wert des wäßrigen Nährmediums während einer zweitägigen Vermehrung von heterofermentativen Milchsäurebakterien, die zu Beginn der Vermehrung in einer Keimdichte von 10⁷ Keimen/ml im wäßrigen Nährmedium vorliegen, und homofermentativen Milchsäurebakterien, die zu Beginn der Vermehrung in einer Ausgangskeimdichte, die zwischen 0,05 und 0,1% der Ausgangskeimdichte der heterofermentativen Milchsäurebakterien beträgt, vorliegen, bei 24°C nicht kleiner als 4,5 wird.
Die Vermehrung der heterofermentativen Milchsäurebakterien bzw. der Mischkulturen im wäßrigen Nährmedium erfolgt in einem Temperaturbereich zwischen 22 und 35°C, bevorzugt in einem Temperaturbereich zwischen 23 und 24°C. Eine einfache Bebrütung der angesetzten Kulturen bei konstanten Temperaturen im Bereich zwischen 22 bis 35°C über einen längeren Zeitraum ist z. B. durch Einsatz eines Heizstabes für Aquarien möglich. Ähnlich wie bei den in der EP 0 578 912 beschriebenen homofermentativen Milchsäurebakterien ist auch bei den heterofermentativen Milchsäurebakterien die Lebensfähigkeit der bei höheren Temperaturen (> 25°C) gewachsenen Kulturen gegenüber den bei niedriger Temperatur gezüchteten deutlich erniedrigt.
Durch die erfindungsgemäße Verwendung des wäßrigen Nährmediums wird eine als Silierhilfsmittel verwendbare Kulturflüssigkeit mit hoher Keimdichte von 2 bis 4 × 10⁹ Keimen/ml an homo- und/oder heterofermentativen Milchsäurebakterien erzeugt, die darüber hinaus über einen langen Zeitraum von bis zu 10 Tagen brauchbar bleibt, was zu Vorteilen bei der Verwendung als Silierhilfsmittel führt. Kann die Kulturflüssigkeit innerhalb von 2 bis 10 Tagen nicht verwendet werden (z. B. wegen ungünstiger Witterungsbedingungen für das Einsilieren), so besteht die Möglichkeit, das Kulturgefäß mit Kulturflüssigkeit (im Normalfall 1 bis 10 l) bei Kühlschrankaufbewahrung eine weitere Woche ohne merklichen Keimabfall (< 10%) zu konservieren. Die so hergestellten Milchsäurebakterienkulturen sind in ihrer Wirksamkeit als Silierhilfsmittel zumindest gleich oder besser zum Einsilieren geeignet als die aus dem Stand der Technik bekannten getrockneten (lyophilisierten) heterofermentativen Milchsäurebakterien gleicher Keimdichte, weil die gewachsenen Milchsäurebakterienkulturen im Gegensatz zu Trockenprodukten keine Lac-Phase benötigen.
Die Erfindung betrifft des weiteren ein Kombinationspräparat zur gleichzeitigen Vermehrung von homofermentativen und heterofermentativen Milchsäurebakterien umfassend (a) ein Trockennährmedium, welches mindestens ein Monosaccharid, mindestens ein Alkalisalz der Essigsäure, Stickstoffquellen, Spurenelemente, zusätzliche Makroelemente sowie neben den Alkalisalzen der Essigsäure weitere Pufferverbindungen in solchen Mengenverhaltnissen enthält, daß nach Lösen des Trockennährmediums in Wasser ein wäßriges Nährmedium gemäß Anspruch 1 erhalten werden kann, sowie (b) heterofermentative Milchsäurebakterien in einer Menge von 10⁵ bis 10⁸ Keimen/g Trockennährmedium.
Dieses Trockennährmedium wird zur Herstellung des erfindungsgemäßen Silierhilfsmittels in Wasser gelöst. Dabei wird das Trockennährmedium in einer solchen Menge gelöst, das die Konzentration der heterofermentativen Milchsäurebakterien in der wässrigen Lösung zwischen 10⁴ und 10⁷ Keimen/ml liegt.
Als heterofermentative Milchsäurebakterien sind diejenigen bevorzugt, die auch bei der erfindungsgemäßen Verwendung des wäßrigen Nährmedium zur Vermehrung von heterofermentativen Milchsäurebakterien bevorzugt sind.
Es ist weiterhin bevorzugt. dass das erfindungsgemäße Kombinationspräparat neben den heterofermentativen Milchsäurebakterien auch homofermentative Milchsäurebakterien in einer Keimdichte von 0,1 bis 1% der Keimdichte der heterofermentativen Milchsäurebakterien enthält. Als homofermentative Milchsäurebakterien sind ebenfalls diejenigen bevorzugt, die auch bei der erfindungsgemäßen Verwendung des wäßrigen Nährmedium zur Vermehrung von heterofermentativen Milchsäurebakterien in Gegenwart homofermentativer Milchsäurebakterien bevorzugt sind.
Das Kombinationspräparat gemäß der Erfindung wird dem Endverbraucher zweckmäßig in Form einer Mischung von steril verpacktem Trockennährmedium und Bakterienpräparat bereitgestellt. Das Verkaufspräparat liegt üblicherweise als Pulver vor, welches eine sehr gute Lagerstabilität von mindestens einem halben Jahr hat. Die Zusammensetzung des Trockennährmediums und die Zugabe des Bakterienpräparates können aber auch durch den Anwender erfolgen.
Zum Aufschließen von Stärke und Rohfasern im Silofutter können dem Kombinationspräparat bzw. dem wäßrigen Nährmedium gemäß der Erfindung noch verschiedene Enzyme wie Amylase, Glukosidase, Amylo-Glukosidase, Zellulase und ähnliches zugesetzt werden.
AUSFÜHRUNGSBEISPIEL

Zur Bestimmung der Wirksamkeit des erfindungsgemäß hergestellten Siliermittels bei der Gärfutterbereitung wird zunächst das folgende Trockennährmedium für die erfindungsgemäße Anzucht heterofermentativer Milchsäurebakterien beziehungsweise für die gleichzeitige Anzucht homo- und heterofermentativer Milchsäurebakterien durch das Zusammengeben folgender Komponenten in den angegebenen Mengen hergestellt:

a) Glucose	12 g
b) Pepton (aus trypt. Verdautem Casein)	10 g
c) Hefeextrakt	5 g
d) CH₃COONa	3 g
e) Diammoniumhydrogencitrat	2 g
f) Dikaliumhydrogenphosphat·3H₂O	4 g
g) MgSO₄·7H₂O	200 mg
h) MnSO₄·4H₂O	50 mg

Die gesamte Menge des so erhaltenen Trockennährmediums wird nach Zugabe von etwa 20 mg der gefriergetrockneten heterofermentativen Milchsäurebakterien des Stammes Lactobacillus buchneri Lb. 98c einer Keimdichte von etwa 5 × 10¹¹/g bzw. einer gefriergetrockneten Milchsäurebakterienmischkultur enthaltend homo- und heterofermentative Milchsäurebakterien in einem Liter nicht geschlortem Leitungswasser nach mehrmaligem Schütteln oder Rühren gelöst und bebrütet. Bei einer Temperatur von 24°C wurde nach einer Bebrütungsdauer von 48 Stunden eine Keimdichte von 2,3 × 10⁹ Keime/ml, nach 4-tägiger Bebrütungsdauer von 4,1 × 10⁹ Keime/ml erreicht (Tabelle 2). Der pH-Wert des Nährmediums erreicht nach 2 Tagen 4,6 bzw. nach 4 Tagen 4,25. Bei höheren Bebrütungstemperaturen wird das Maximum der Keimdichte früher, bei niedrigen Temperaturen nach längerer Bebrütungsdauer erreicht.
Die Gasentwicklung während der Keimvermehrung bis zum Erreichen maximaler
Keimdichte (2–4 Tage) im geschlossenen Zustand war so gering, dass es zum Beispiel zu keiner Aufblähung des Kunststoff-Zuchtbehälters kam. Die gebildete CO₂-Menge blieb weitgehend in der Nährflüssigkeit gelöst. Eine erkennbar stärkere CO₂ Freisetzung konnte erst nach dem Erreichen des End-pH-Wertes in der stationären Entwicklungsphase nach mehrtägiger Lagerung der Kultur bei Zimmertemperatur festgestellt werden. Bei kühler Lagerung (Kühlschrank) unterblieb die verstärkte Gasbildung. Tabelle 2 Keimzahlentwicklung und pH-Abfall beim Wachstum heterofermentativer Milchsäurebakterien (Lactobacillus buchneri Lb. 98c) im zuvor beschriebenen Nährmedium in Abhängigkeit von Bebrüfungstemperatur und Bebrütungsdauer

Bebrütungstemperatur Keimza (10⁹ Keime/ml) pH-Wert

24 h 48 h 4 Tage 24 h 48 h 4 Tage

21°C 0,25 1,9 4 5,91 4,74 4,31

24°C 0,87 2,3 4,1 5,68 4,61 4,26

in zahlreichen Silierversuchen mit Mais und Grünfutter mit höherem TS-Gehalt ist der Einsatz dieses wäßrigen Nährmediums zur Vermehrung ausgewählter heterofermentativer Milchsäurebakterien als Silierhilfsmittel untersucht worden. Die dabei erzielten Ergebnisse hinsichtlich des Gärverlaufes und der Gärfuttereigenschaften sowie im besonderen hinsichtlich der verbesserten Wirkung bei der aeroben Stabilität sind in der Tabelle 3 zusammengestellt.

Die Silberversuche wurden wie folgt durchgeführt: 450 g Frischsubstanz werden mit 5 ml der mit Wasser verdünnten Flüssigkeitskultur von heterofermentativen Milchsäurebakterien nach zweitägiger Anzucht bei Zimmertemperatur gemischt. Das Mischverhältnis wird so gewählt, dass auf 1 g Frischsubstanz 5 × 10⁵ Keime entfallen. Die Befüllung erfolgte in einem Kleinbehälter mit einem Volumen von einem Liter. Für 24 Stunden werden die Gefäße nur mit einem lose aufliegenden Deckel abgedichtet, danach erfolgte der feste Abschluß mit Gummiring, Deckel und Klammer. Die Gärtemperatur beträgt 25°C und es werden für die unbehandelte Kontrolle 6, für die einzelnen Behandlungsvarianten 3 Wiederholungen angelegt. Nach 3 Tagen wird ein Gefäß geöffnet und Proben für die pH-Bestimmung entnommen. Die Messung der Gärverluste (am) erfolgt durch Differenzwägung. Nach ca. 30-tägiger Gärdauer wird zur Initierung eines Luftstresses jedes Gefäß für 24 Stunden geöffnet (lose aufliegender Deckel) und danach wieder dicht verschlossen. Die Messung der aeroben Stabilität der nach ca. 3 monatiger Gärdauer ausgelagerten Silageproben erfolgt entweder über die Registrierung eines Temperaturanstiegs in den dazu geeigneten Messanlagen oder über die Bestimmung der CO₂ Abgabe durch IR-Messung in einer Luftdurchströmungsanlage bei konstant 23°C. Tabelle 3 Ergebnisse vergleichender Kleinbehälter-Silierversuche mit der erfindungsgemäß hergestellten Milchsäurebakterienkultur (DSM Lb. 98c) sowie der erfindungsgemäß hergestellten Mischkultur (Lb. 98c und L. plantarum). Die Bakterienkulturen wurden 2 5 Tage angezüchtet. Das Silierfutter wurde mit 5 × 10⁵ Keimen/g Futter beimpft.)

	Futterart	Varianten	n	¹⁾Δm (g)	pH	²⁾a. S.	Milchsäure (%)	Essigsäure (%)	Alkohol (%)
1	Weidegrass TS 35% 11.5.98 Gärdauer 134 Tage	Kontrolle Lb. 98c Lb. 98c + L.plant.	6 4 2	3,00 3,89 3,82	4,12 4,01 3,94	6,76 0,31 0,20	2,98 2,97 3,44	0,36 0,60 0,51
2	Gras-Weißklee TS 30,7%, 27.7.98 Gärdauer 117 Tage	Kontrolle Lb. 98c	4 5	3,85 3,86	4,37 4,24	3,50 0,37
3	Mais TS 40,5% E97 tiefgefroren Gärdauer 146 Tage	Kontrolle Lb. 98c Lb. 98c + L.plant.	3 3 2	2,89 4,46 3,00	3,75 3,63 3,45	2,75 0,90 0,90	1,27 1,49 1,41	0,33 0,66 0,64
4	Mais TS 42% 28.9.98 Gärdauer 68 Tage	Kontrolle Lb. 98c	6 4	3,49 3,87	3,83 3,88	3,50 0,30	1,41 1,15	0,22 0,59	0,064 0,110
5	Mais TS 40% 23.9.98 Gärdauer 75 Tage	Kontrolle Lb. 98c	6 4	3,54 5,34	3,94 4,15	0,34 0,10	1,51 0,92	0,32 0,79	0,066 0,095
6	Mais TS 42% E99 tiefgefroren Gärdauer 83 Tage	Kontrolle Lb. 98c Lb. 98c + 0,1% L.pl. Lb. 98c + 1,0% L.pl.	5 5 5 5	2,40 4,44 2,98 2,33	3,88 4,02 3,89 3,86	5,50 0,88 0,33 1,30

¹⁾ Δm = Gärverluste
²⁾a. S.: aerobe Stabilität in mg CO₂/g/172 h. Die Bestimmung der CO₂-Menge erfolgte mittels IR nach Luftdurchleitung bei 23°C. Die aerobe Stabilität wurde bei den Futterarten Nr. 1 bis 3 nach 172 h, bei Futtermittel Nr. 4 und 5 nach 79 h und bei Futtermittel 6 nach 90 h ermittelt.

Die in Tabelle 3 angeführten Versuchsergebnisse belegen in überzeugender Weise, dass der Einsatz der in dem erfindungsgemäß verwendeten Nährmedium vermehrten, ausgewählten heterofermentativen Milchsäurebakterien der Art L. buchneri oder der Einsatz von im erfindungsgemäß verwendeten Nährmedium vermehrten Mischkulturen aus heterofermentativen Milchsäurebakterien und homofermentativen Milchsäurebakterien in Problemsilagen wie Mais oder Grünfutter mit höherem TS-Gehalt eine lang anhaltende aerobe Lagerstabilität bewirkt, ohne die übrigen Merkmale der Gärfutterqualität wesentlich zu beeinträchtigen.

Claims

Verwendung eines wäßrigen Nährmediums zur Vermehrung von heterofermentativen Milchsäurebakterien unter unsterilen Bedingungen umfassend mindestens ein Monosaccharid in einer Menge von 1 bis 2 Gew.-% bezogen auf die Wassermenge, mindestens ein Alkalisalz der Essigsäure in einer solchen Menge, dass das Gesamtgewicht an Acetat-Anionen und Essigsäure zwischen 0,2 bis 0,7 Gew.-% bezogen auf die Wassermenge beträgt, Stickstoffquellen, Spurenelemente, zusätzliche Makroelemente sowie neben den Alkalisalzen der Essigsäure weitere Pufferverbindungen, wobei die weiteren Pufferverbindungen mindestens in einer solchen Menge vorliegen, dass der pH-Wert des wäßrigen Nährmediums während einer zweitägigen Vermehrung ausschließlich heterofermentativer Milchsaurebakterien, die zu Beginn der Vermehrung in einer Keimdichte von 10⁷ Keimen/ml im wäßrigen Nährmedium vorliegen, bei 24°C nicht kleiner als 4,5 wird.
Verwendung eines wäßrigen Nährmediums nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Monosaccharid Glucose im wäßrigen Nährmedium enthalten ist.
Verwendung eines wäßrigen Nährmediums nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass neben den Monosacchariden weitere Kohlenhydrate im wäßrigen Nährmedium enthalten sind.
Verwendung eines wäßrigen Nährmediums nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als weitere Pufferverbindung Hydrogenphosphatsalze und/oder Pepton im wäßrigen Nährmedium enthalten sind.
Verwendung eines wäßrigen Nährmediums nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrogenphosphatsalz Dikaliumhydrogenphosphat ist.
Verwendung eines wäßrigen Nährmediums nach einem oder mehreren der Ansprüche 4 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Dikaliumhydrogenphosphat in einer Menge von 0,2 bis 0,6 Gew.-% bezogen auf die Wassermenge im wäßrigen Nährmedium enthalten ist.
Verwendung eines wäßrigen Nährmediums nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Pepton in einer Menge von 0,6 bis 1,5 Gew.-% bezogen auf die Wassermenge im wäßrigen Nährmedium enthalten ist.
Verwendung eines wäßrigen Nährmediums nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es weitere Pufferverbindungen in einer solchen Menge enthält, dass der pH-Wert des wäßrigen Nährmediums während einer zweitägigen Vermehrung von heterofermentativen Milchsäurebakterien, die zu Beginn der Vermehrung in einer Keimdichte von 10 Keimen/ml im wäßrigen Nährmedium vorliegen, und homofermentativen Milchsäurebakterien, die zu Beginn der Vermehrung in einer Ausgangskeimdichte, die zwischen 0,05 und 0,1% der Ausgangskeimdichte der heterofermentativen Milchsäurebakterien beträgt, vorliegen, bei 24°C nicht kleiner als 4,5 wird.
Verwendung eines wäßrigen Nährmediums nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die heterofermentativen Milchsäurebakterien zu heterofermentativen Vertretern des Genus Lactobacillus gehören.
Verwendung eines wäßrigen Nährmediums nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die heterofermentativen Milchsäurebakterien Lactobacillus buchneri Lb. 98c (DSM 13573) oder Subspecies davon sind.
Verwendung eines wäßrigen Nährmediums nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass neben den heterofermentativen Milchsäurebakterien auch homofermentative Milchsäurebakterien in einer Ausgangskeimdichte, die zwischen 0,05 und 0,15% der Ausgangskeimdichte der heterofermentativen Milchsaurebakterien beträgt, vermehrt werden.
Verwendung eines wäßrigen Nährmediums nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die homofermentativen Milchsäurebakterien zu den homofermentativen Vertretern des Genus Lactobacillus und/oder Pediococcus gehören.
Verwendung eines wäßrigen Nährmediums nach einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die homofermentativen Milchsäurebakterien Lactobacillus plantarum B 5 (DSM 3676) und/oder Lactobacillus plantarum W 2 (DSM 3677) sind.
Verwendung einer Milchsäurebakterienkultur erhältlich durch einen oder mehrere der Ansprüche 1 bis 13 als Silierhilfsmittel.
Kombinationspräparat zur gleichzeitigen Vermehrung von homofermentativen und heterofermentativer Milchsäurebakterien umfassend (a) ein Trockennährmedium, welches mindestens ein Monosaccharid, mindestens ein Alkalisalz der Essigsäure, Stickstoffquellen, Spurenelemente, zusätzliche Makroelemente sowie neben den Alkalisalzen der Essigsäure weitere Pufferverbindungen in solchen Mengenverhältnissen enthält, daß nach Lösen des Trockennährmediums in Wasser ein wäßriges Nährmedium gemäß Anspruch 1 erhalten werden kann, sowie (b) heterofermentative Milchsäurebakterien in einer Menge von 10⁵ bis 10⁸ Keimen/g Trockennährmedium.
Kombinationspräparat gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet dass die heterofermentativen Milchsäurebakterien Lactobacillus buchneri Lb. 98c (DSM 13573) oder Subspecies davon sind.
Kombinationspräparat gemäß Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass es neben den heterofermentativen Milchsaurebakterien homofermentative Milchsäurebakterien in einer Keimdichte, die 0,1 bis 1% der Keimdichte der heterofermentativen Milchsäurebakterien beträgt, enthält.
Kombinationspräparat nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die homofermentativen Milchsäurebakterien Lactobacillus plantarum B 5 (DSM 3676) und/oder Lactobacillus plantarum W 2 (DSM 3677) sind.
Verfahren zur gleichzeitigen Vermehrung von homofermentativen und heterofermentativen Milchsäurebakterien, wobei zur Vermehrung derselben ein Kombinationspräparat nach einem der Ansprüche 15 bis 18 verwendet wird.