AT262040B

AT262040B - Verfahren zur Herstellung eines Milchsäurebakterienpräparates

Info

Publication number: AT262040B
Application number: AT642165A
Authority: AT
Inventors: Theodor Dr Beck; Friedrich Dr Gross
Original assignee: Theodor Dr Beck; Friedrich Dr Gross
Priority date: 1964-07-13
Filing date: 1965-07-13
Publication date: 1968-05-27

Description


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  Verfahren zur Herstellung eines   Milchsäurebakterienpräparates   
 EMI1.1 
 

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Bakterienzellen nach Abtrennung vom Nährmedium im Gemisch mit einem Schutzstoff in an sich be- kannter Weise der Gefriertrocknung unterwirft,
Ein gutes erfindungsgemäss hergestelltes Trockenpräparat hat beispielsweise eine Keimdichte von etwa   1012   vermehrungsfähigen Keimen pro 1 g Präparat und weist nach 35 Tagen noch eine Überlebens- rate von etwa 2 x 1011 Keimen auf. 



   Es handelt sich also um ein haltbares streufähiges Impfpräparat, das im Gegensatz zu Präparaten, die Bakterien nur in einem bestimmten Prozentsatz enthalten, fast durchwegs aus aktiven lebensfähigen
Bakterien besteht. Bei längerer Züchtungsdauer nach bekannten Verfahren, wie sie für eine Massenpro- duktion auf komplexen natürlichen Nährböden notwendig ist, kommt man zwar ebenfalls zu einer gro- ssen Bakterienmasse, die jedoch nur einen verschwindend geringen Prozentsatz lebens- und vermehrungs- fähiger Keime besitzt (s. Tabelle 1). Dadurch wird die Wirksamkeit der bekannten Präparate für die
Praxis stark herabgesetzt. 



   Unter einem stark gepufferten Nährmedium verstehen wir eine Nährflüssigkeit (oder einen festen
Nährboden), die Substanzen enthält, die einer   PH- Wert nderung   entgegenwirken. Solche Substanzen sind beispielsweise Natriumacetat   (1 (lu).   Die optimale Zusammensetzung eines solchen Nährmediums liegt dann vor, wenn alle für das Wachstum der Lactobazillen notwendigen Substanzen in ausreichender
Menge und im richtigen Verhältnis untereinander vorliegen. Solche Substanzen   sind beispielsweise 20/0  
Melasse,   0, 2% Hefeextrakt, MnS04 (50 ppm).   



   Es ist bekannt, Milchsäurebakterien in gepuffertem Milieu zu züchten (italienische Patentschrift Nr.   396227).   Die bekannte Pufferung mit Calciumsalzen hat den Zweck, die Milchsäureproduktion der Bakterien anzuregen. Die Zahl und die Lebensfähigkeit der Milchsäurebakterien wird dadurch jedoch nicht erhöht. 



   Der pH-Wert eines Nährmediums, in   dem Milchsäurebakterien   gezüchtet werden, sinkt mit der An-. reicherung von Milchsäure in dem Nährmedium ab. Der pH-Wert wird reguliert, indem man laufend oder portionsweise dem Nährmedium eine alkalisch wirkende Substanz zusetzt. Solche alkalisch wirkende Substanzen sind beispielsweise   Kaliumhydroxydlösung,     Natriumhydroxylösung,   Sodalösung. 



   Der Zusatz der alkalischen Substanz erfolgt in dem Mass, dass der pH-Wert des Nährmediums sich nur innerhalb eines kleinen Bereiches ändert. 



   Das Abtrennen der Zellen kann in beliebiger Weise erfolgen. Es muss jedoch schonend vorgenommen werden, um die Aktivität der Milchsäurebakterien nicht zu verringern. Beispielsweise können die Zellen in bekannter Weise mit einer Zentrifuge vom Nährmedium abgetrennt werden. Den Zellen wird anschliessend ein Schutzstoff zugesetzt, beispielsweise ein Schutzkolloid, insbesondere ein Schutzkolloid auf Eiweissbasis, z. B. Milchpulver. Es können aber auch andere Schutzstoffe, beispielsweise Lactose, Ascorbinsäure, verwendet werden. 



   Die mit dem Schutzstoff gemischten Zellen werden anschliessend auf Temperaturen unter   OOC,   beispielsweise auf-30 bis-25 C, abgekühlt und dann im Hochvakuum, beispielsweise bei einem Luftdruck von 0, 1 bis 0,01 Torr getrocknet. Man erhält auf diese Weise ein stabiles Präparat, das aktive Milchsäurebakterien enthält und lange Zeit ohne Verlust ihrer Aktivität haltbar ist. 



   Aufgabe der Erfindung ist es ferner, diese in der richtigen Wahl der Impfstämme und ihrer Konser- 
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   Bisher sind als Kriterien für eine entsprechende Stammauswahl nur folgende Eigenschaften benutzt worden : a) Stärke der Säuerung unter verschiedenen   Temperaturverhältnissen ;   b) homofermentatives Verhalten (Vermögen, aus Zucker als alleiniges Gärungsprodukt Milchsäure zu bilden). 



   Die Stammauswahl kann sich aber nur auf eine Gruppe von in der Natur relativ selten unter den Milchsäure bildenden Bakterien vorkommenden Lactobazillen erstrecken, nämlich auf Vertreter des Lactobacillus plantarum-Formenkreises, die als obligate Siloorganismen erkannt wurden. Nur Vertreter dieser Gruppe, die eine grosse Zahl von Varietäten umfasst, besitzen alle Eigenschaften, die für eine Verwendung für Impfzwecke notwendig sind. 



   Erfindungsgemäss wird nun die Auslese der Lactobazillen auf folgende weitere entscheidende im Kulturversuch erfassbare physiologische Eigenschaften erstreckt : a) Hoher Bereich mit günstiger   Wachstumstemperaturkurve   zwischen 18 und 410C ; b) möglichst niedrig liegende proteolytische Aktivität ; c) Vermehrungsfähigkeit und Säurebildungsvermögen in Medien mit einem pH-Wert zwischen 4, 1 

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 und 3,6 in stark gepufferten Medien ; d) Vergärungsvermögen gegenüber möglichst vielen in den Futterpflanzen vorkommenden Mono-,
Di-und Polysacchariden ; e) antagonistisches Verhalten gegenüber Gärungsschädlingen, insbesondere Silagehefen, die in der
Reifungsphase Instabilität vorschriftsmässig vergorenen Gärfutters bewirken. 



   Bei Anwendung dieses Ausleseverfahrens gelangt man zu Isolationen von spezifisch für Impfzwecke geeigneten Lactobacillus   plantarum-Stämmen   von Frischmaterial und von 3 tägigen Versuchssilagen mit Gras, Luzerne, Kartoffeln   usw.,   die diese Merkmalskombinationen besitzen. Als Besonderheit gegen- über den in der Literatur beschriebenen Lactobacillus   plantarum-Stämmen   sind die auf diese Weise ausselektierten Kulturen durch eine PH-Wert-Senkung in sehr stark gepufferten Medien bis auf Pa 3, 1 bereits nach 16 stündiger Kultur und fehlendes Wachstum bei Bebrütung in Lackmusmilch sowie durchvoll-   ständige Unterdrückung von Silagehefen, beispielsweise Pichia,   Candida, Hansenula und Torulopsis, gekennzeichnet. 



   Für die praktische Anwendung des Präparates, das beispielsweise mit Hand oder einer Pulverspritze schichtenweise in den Futterstock, auf Förderbänder oder in das Gebläse eingebracht wird, ist der Zusatz eines festen oder flüssigen Streckmittels, z. B. Wasser, verdünnter Melasse,   Mehle   aller Art, insbesondere Grünmehl, Futterzucker oder in besonderer Weise durch Hitzebehandlung gewonnene Trokkenmelasse, zweckmässig erst unmittelbar vor der Anwendung, beispielsweise im Gewichtsverhältnis Bakterienpräparat zu Streckmittel wie 1 : 10 bis 1   : 10 000 möglich.   Silierversuche mit abgestuften Mengen eines erfindungsgemässen Präparates ergaben die in Tabelle 2 zusammengestellten Ergebnisse. 



   Beispiel : Zum Einsilieren von 30 m3 Grünfutter werden unmittelbar vor dem Befüllen des Behälters 30 g Bakterienpräparat mit 30 kg Grünmehl vermischt. Dieses wird dann mit einer Pulverspritze oder von Hand gleichmässig dem Futter fortlaufend zugesetzt. Die Ergebnisse beweisen die gute Wirksamkeit des erfindungsgemässen Präparates. 



   Bei Prüfungen der Wirksamkeit des Bakterienpräparates im Vergleich zur bekannten Anwendung von Zucker oder zuckerhaltigen Zusätzen (Melasse, Zuckerrübenschnitzel) wie auch bei Verwendung bekannter chemischer Sicherungszusätze (Natriumbisulfit, Natriumformiat) hat sich bisher in allen Fällen die   Überlegenheit   des erfindungsgemässen Präparates sowohl in der Geschwindigkeit als auch in der Stärke der Säuerung erwiesen. Die Unterschiede betrugen meist mehr als eine Güteklasse, bewertet nach Flieg (DLG-Schlüssel). 



   Tabelle 1 
 EMI3.1 
 
<tb> 
<tb> Zahl <SEP> der <SEP> lebensfähigen <SEP> Bakterienzellen <SEP> in <SEP> zwei <SEP> Nährböden <SEP> unterschiedlicher <SEP> Behandlung <SEP> in <SEP> Abhängigkeit <SEP> von <SEP> der <SEP> Bebrütungsdauer
<tb> Bebrütungs-Normaler <SEP> Nährboden <SEP> opti-Erfindungsgemäss <SEP> hergedauer <SEP> maler <SEP> Zusammensetzung <SEP> stelltergepufferterNähr-
<tb> 280C <SEP> PR <SEP> Keimdichtejml <SEP> boden <SEP> mit <SEP> kontinuierlicher <SEP> pH-Einstellung
<tb> Keimdichte/ml
<tb> 16 <SEP> h <SEP> 3, <SEP> 56 <SEP> 740 <SEP> 000 <SEP> 000 <SEP> 1 <SEP> 600 <SEP> 000 <SEP> 000
<tb> 22 <SEP> h <SEP> 3, <SEP> 38 <SEP> 1 <SEP> 200 <SEP> 000 <SEP> 000 <SEP> 1 <SEP> 860 <SEP> 000 <SEP> 000 <SEP> 
<tb> 40 <SEP> h <SEP> 3, <SEP> 26 <SEP> 110 <SEP> 000 <SEP> 000 <SEP> 360 <SEP> 000 <SEP> 000
<tb> 64 <SEP> h <SEP> 3,

   <SEP> 20 <SEP> 30 <SEP> 000 <SEP> 000 <SEP> 200 <SEP> 000 <SEP> 000 <SEP> 
<tb> 6 <SEP> Tage <SEP> 3, <SEP> 18 <SEP> 4200000 <SEP> 156000000 <SEP> 
<tb> 12 <SEP> Tage <SEP> 3, <SEP> 18 <SEP> 24 <SEP> 000 <SEP> 22 <SEP> 000 <SEP> 000 <SEP> 
<tb> 18 <SEP> Tage <SEP> 3, <SEP> 22 <SEP> 800 <SEP> 290 <SEP> 000 <SEP> 
<tb> 
 

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 Tabelle 2 
 EMI4.1 
 
<tb> 
<tb> Gärverlauf <SEP> und <SEP> Gärfutterqualität <SEP> ohne <SEP> und <SEP> mit <SEP> Zusatz <SEP> eines <SEP> erfindungsgemässen <SEP> MilchsäurebakterienPräparates <SEP> in <SEP> verschiedener <SEP> Dosierung.
<tb> 



  Mähweidegras <SEP> angewelkt <SEP> 43% <SEP> TS <SEP> 4tägige <SEP> Gärdauer <SEP> 18 <SEP> tägige <SEP> Gärdauer
<tb> Erfindungsgemä-Keimdichte <SEP> pro <SEP> PH <SEP> Gesamtsäure <SEP> PH <SEP> Gesamtsäure <SEP> MH-N <SEP> Essig-Butter-Milch-Qualitätder <SEP> 
<tb> sser <SEP> Zusatz <SEP> von <SEP> 1 <SEP> g <SEP> Frischmate- <SEP> n/10 <SEP> NaOH <SEP> n/10 <SEP> NaOH <SEP> säure <SEP> säure <SEP> säure <SEP> Silage <SEP> in
<tb> 0, <SEP> l <SEP> Gew.-% <SEP> der <SEP> rial <SEP> % <SEP> % <SEP> % <SEP> Punkten
<tb> Mischung <SEP> zu <SEP> dem <SEP> nach <SEP> der
<tb> Grünfutter.

   <SEP> Mi- <SEP> Bewertung <SEP> 
<tb> schung <SEP> aus <SEP> Bak- <SEP> von <SEP> Flieg
<tb> terienpräparat <SEP> (DLGund <SEP> Grünmehl <SEP> im <SEP> Schlüssel)
<tb> Gewichtsverhältnis
<tb> 0 <SEP> 10 <SEP> 6, <SEP> 20 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 5, <SEP> 09 <SEP> 0, <SEP> 60 <SEP> 0, <SEP> 032 <SEP> 0, <SEP> 33 <SEP> 0, <SEP> 29 <SEP> 1, <SEP> 27 <SEP> 63
<tb> 1 <SEP> : <SEP> 5000 <SEP> 1x105 <SEP> 5,90 <SEP> 0,15 <SEP> 4,30 <SEP> 1,10 <SEP> 0,022 <SEP> 0,32 <SEP> 0,11 <SEP> 2,24 <SEP> 85
<tb> 1 <SEP> : <SEP> 1000 <SEP> 5x105 <SEP> 5,37 <SEP> 0,50 <SEP> 3,98 <SEP> 2,30 <SEP> 0,022 <SEP> 0,27 <SEP> 0,03 <SEP> 2,86 <SEP> 90
<tb> 1 <SEP> : <SEP> 500 <SEP> 1x106 <SEP> 5,19 <SEP> 0,55 <SEP> 3,99 <SEP> 2,40 <SEP> 0,015 <SEP> 0,30 <SEP> 0,12 <SEP> 2,83 <SEP> 85
<tb> 1:

   <SEP> 100 <SEP> 5x106 <SEP> 4,65 <SEP> 1,10 <SEP> 3,79 <SEP> 2,5k0 <SEP> 0,018 <SEP> 0,35 <SEP> 0,03 <SEP> 3,93 <SEP> 95
<tb> 1 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> 5x107 <SEP> 4,39 <SEP> 1,30 <SEP> 3,70 <SEP> 2,90 <SEP> 0,018 <SEP> 0,39 <SEP> 0,0 <SEP> 3,97 <SEP> 100
<tb>

Claims

PATENT ANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Herstellung eines Milchsäurebakterienpräparates, dadurch gekennzeich- net, dass man Lactobacillus plantarum-Stämme in einem stark gepufferten, durch Zusatz alkalischer Substanzen auf ungefähr gleichbleibendem -Wertgehaltenem Nährmedium züchtet und die Bakterienzellen nach Abtrennung vom Nährmedium im Gemisch mit einem Schutzstoff in an sich bekannter Weise der Gefriertrocknung unterwirft. EMI5.1 solche Lactobacillus plantarum-Stämme verwendet, die folgende physiologische Merkmalskombinationen besitzen : a) Hoher Bereich mit günstiger Wachstumstemperaturkurve zwischen 18 und 410C ; b) möglichst niedrig liegende proteolytische Aktivität ;

c) Vermehrungsfähigkeit und Säurebildungsvermögen in Medien niedriger Reaktion zwischen 4, 1 und 3, 6 in stark gepufferten Medien ; d) Vergärungsvermögen gegenüber möglichst vielen in den Futterpflanzen vorkommenden Mono-, Di-und Polysacchariden ; e) antagonistisches Verhalten gegenüber Gärungsschädigungen, insbesondere Silagehefen, die in der Reifungsphase Instabilität vorschriftsmässig vergorenen Gärfutters bewirken.