DE1081605B - Verfahren zur Herstellung einer stabilen, oral anwendbaren Poliomyelitis-Vaccine - Google Patents

Verfahren zur Herstellung einer stabilen, oral anwendbaren Poliomyelitis-Vaccine

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Description

  • Verfahren zur Herstellung einer stabilen, oral anwendbaren Poliomyelitis-Vaccine Die Erfindung betrifft die Herstellung einer stabtilen, oral anwendbaren Poliomyelitis-Vaccine.
  • Durch Verwendung zahlreicher bekannter Medien, wie Hühnerembryo, Gehirn und Rückenmark von Nagetieren und Gewebskulturen, hat man den Poliomyelitis-Virus so angepaßt, daß er sich entwickeln kann und nichtpathogen geworden ist. Im allgemeinen ist die Aktivität des Virus in gefrorenem Zustand in Anwesenheit von Feuchtigkeit stabil. Diese Stabilität der Aktivität nimmt mit steigender Temperatur ab.
  • Bei beispielsweise ungefähr 40° C stirbt der Poliomyelitis-Virus im allgemeinen in ungefähr 3 Tagen ab. Bei üblichen Kühltemperaturen (4° C) ist die Aktivität des Virus weniger stabil als im gefrorenen Zustand. Obgleich der Poliomyelitis-Virus im gefrorenen Zustand stabil ist, wird er während des Gefriertrocknungsverfahrens im wesentlichen inaktiviert.
  • Es ist bereits bekannt, eine beliebige Trockenvaccine dadurch herzustellen, daß man an wasserunlösliche Salze der Elemente der II. Gruppe des Periodischen Systems adsorbierte Viren mit Antibioticis oder Sulfonamiden bis zur vollständigen Abschwachung der infektiösen Komponenten behandelt und die so erhaltene Vaccine isoliert und trocknet, gegebenenfalls gefriertrocknet.
  • Man hat weiterhin schon lebende Poliomyelitis-Vaccinen oral in der Weise appliziert, daß man eine Poliomyelitis-Virussuspension nachAuftauen aus dem gefrorenen Zustand in Milch gab. Der Virus wurde auch als Polyäthylenglykolsuspen. sion zur oralen Anwendung in Kapseln gefüllt. Alle diese Anwendungsweisen erfordern jedoch wegen der Instabilität der Aktivität des Virus beim Stehenlassen der fertigen Zubereitung in Milch, Polyäthylenglykol oder anderen Medien oder im ungefrorenen Zustand eine Zubereitung unmittelbar vor der Gabe. Es sind noch viele andere Vorschläge gemacht worden. Jedoch führten sie alle nicht zu einer für die orale Anwendung geeigneten, aktiven, stabilen Vaccine.
  • E, s ist daher erforderlich, einen Träger oder ein Suspensionsmedium zu finden, das die Aktivität des Virus stabil hält und zur Kapselabfüllung geeignet ist.
  • Vorzugsweise sollte es sich hierbei um ein trockenes, frei fließendes Suspensionsmedium handeln. Die Probleme, die sich bei dem Abfüllen, Verteilen, Lagern und Applizieren einer Poliomyelitis-Virus-Vaccine ergeben, haben die Fortschritte bei der Immunisierung gegen Poliomyelitis-Virus stark behindert.
  • Es wurde nun gefunden, daß man eine stabile, oral anwendbare und zur Kapselabfüllung geeignete Poliomyelitis-Vaccine erhält, wenn man eine flüssige Suspension eines abgeschwächten, nichtpathogenen Poliomyelitis-Virus und gemahlene, nicht hydratisierte Gelatine mit einer TeilchengröBe entsprechend einer lichten Maschenweite von ungefähr 0, 105 bis 2, 00 mm im Gewichtsverhältnis Gelatine zu Virussuspension von 10 : 1 bis 1 : 4 bei ungefähr -5 bis +20° C miteinander vermischt, wodurch die Gelatineteilchen hydratisiert werden, den Virus absorbieren und eine frei fließende, granulare Vaccine bilden.
  • Suspensionen jeder der bisher bekannten Poliomyelitis-Virusarten in ihren Züchtungsmedien können in dieser Weise mit nicht hydratisierter Gelatine kombiniert werden, wobei man eine hydratisierte, frei fließende, in Kapseln abfüllbare, granulare Poliomyelitis-Virus-Vaccine erhält, deren Virusaktivität sehr lange stabil bleibt. Obgleich die erfindungsgemäß hergestellte Vaccine hydratisiert ist, bleibt sie im Aussehen im wesentlichen trocken, was durch ihre granulare, frei fliebende Beschaffenheit bewiesen wird.
  • Diese Vaccine macht die Kapselabfüllung des Poliomyelitis-Virus und die Lagerung der in Kapseln abgefüllten Vaccine für lange Zeitabschnitte ohne ungünstige Einwirkungen auf die Stabilität der Aktivität möglich. Man kann so eine oral anwendbare Poliomyelitis-Vaccine in großen Mengen herstellen, die nicht unmittelbar vor dem Zeitpunkt der Verabreichung hergestellt zu werden braucht. Die Virusaktivität dieser in Kapseln abgefüllten Poliomyelitis-Vaccine ist sowohl bei Raumtemperatur, d. h. bei ungefähr 20° C, wie auch üblicher Kühltemperatur, d. h. bei ungefähr 4° C, mehrere Monate lang stabil.
  • Zur Herstellung der Vaccine gemäß der Erfindung wird ein Züchtungsmedium einen abgeschwächten Poliomyelitis-Virus enthält. durch Bewegung mit der Gelatine vermischt. Während der Bewegung hydratisiert die Gelatine mit dem Züchtungsmedium, das den Virus enthält, so daß der Virus durch die Gelatine absorbiert wird. Die Vaccine verwandelt sich während der Hydratisierung von einer anfänglich dünnen Paste zu einer aus einzelnen voneinander getrennten, hydratisierten Teilchen bestehenden Masse. Die so hergestellte Vaccine ist frei fließend und granular und enthält den Virus im wesentlichen gIeichmäßig verteilt.
  • Im allgemeinen wird der-Titer des Virus zwischen 103 und 108 liegen. Der Titer der bevorzugten oralen Virusdosis liegt zwischen ungefähr 104 und 10';. Nach Züchtung im Gewebskulturmedium der folgenden Beispiele (Virusmedium Nr. 1) hat der Poliomyelitis-Virus im allgemeinen Titer von ungefähr 106 bis 109.
  • Der für die orale Gabe bevorzugte Titer wird durch Verdünnung erhalten. Nach Züchtung im Gehirn-oder Rückenmarksmedium von Nagetieren gemäß den folgenden Beispielen (Virusmedium Nr. 2) hat der Poliomyelitis-Virus im allgemeinen Titer zwischen ungefähr 103 und t06 Für das erfindungsgemäße Verfahren kann Gelatine mit einer Teilchengröße von ungefähr 0. 105 bis 2, 0 mm lichte Maschenweite, vorzugsweise von 0, 149 bis 0, 250 mm lichte Maschenweite, verwandt werden.
  • Man kann zahlreiche antibakterielle Mittel und Mittel gegen Pilze zu dem virushaltigen Medium vor der Verarbeitung mit der Gelatine zufügen. So wurde es bei der vorliegenden Erfindung als günstig befunden, Glycerin, einen der verschiedenen sechswertigen Alkohole, wie Sortit, Dulcit oder Mannit, Nystatin, (Antibiotikum aus Streptomyces noursei), p-Naphthol.
  • Mischungen des Methyl-und Propylesters der p-Oxybenzoesäure, beispielsweise eine Mischung von 1 bis 5 Gewichtsteilen des Methylesters mit 1 Gewichtsteil des Propylesters, einzeln oder gemischt miteinander zusammen mit dem Virus und seinen Züchtungs medien zu verwenden. So ist es beispielsweise günstig.
  • Nystatin oder ein äquivalentes Mittel dem zur Züchtung des Virus verwendeten Medium vor der Inkubation zuzusetzen. Nach der Inkubation, jedoch vor der Verarbeitung mit Gelatine, wird Glycerin oder ein äquivalentes Mittel zugefügt. Beispiel von verwendeten antibakteriellen Mitteln sind Penicillin, Tetracyclin, Chlortetracyclin oder Streptomycin. Diese antibakteriellen und fungiciden Mittel werden zusammen mit dem Wasser, dem Virus und den anderen Stoffen, die in den virushaltigen Medien enthalten sind, während der Hydratisierung der Gelatine absorbiert. Die so erhaltene, frei fließende, granulare Vaccine kann nach üblichen Verfahren unter Verwendung üblicher Vorrichtungen entweder in weichwandige oder hartwandige Gelatinekapseln abgefüllt werden.
  • Zur weiteren Steigerung der freien Fließbarkeit der erfindungsgemäß hergestellten Vaccine können verschiedene bekannte Hilfsmittel vor der Kapselabfüllung zugefügt werden. Beispielsweise kann man Stärke, wie Kartoffel-, Milo-oder Maisstärke, erfindungsgemäß zur Erleichterung bei der Kapselabfüllung in weichwandige Kapseln verwenden.
  • Die verwendeten Mengen an Gelatine und Virussuspension können beträchtlich schwanken. Beispielsweise kann man die Vaccine unter Verwendung von 10 Gewichtsteilen Gelatine auf ein Volumenteil der Virussuspension (25 bis 75 Volumprozent Glycerin, vorzugsweise ungefähr 50/o) herstellen. Man kann aber auch ein Gewichtsteil Gelatine auf 4 Volumteile Virussuspension verwenden. Steigert man dieGelatinemenge beträchtlich über das oben beschriebene 10 : 1-Verhältnis, so erhält man keine gleichmäßige Verteilung des Virus in den Gelatineteilchen, da nicht genügend Flüssigkeit zur anfänglichen vollständigen Benetzung der gesamten Oberfläche der Gelatineteilchen vorhanden ist. Vermindert man andererseits die Gelatinemenge unter das 1 : 4-Verhältnis, so wird die Zusammensetzung klumpig und feucht und kann nur mit Schwierigkeit gehandhabt werden. Der bevorzugte Bereich für alle drei Poliomyelitis-Virusarten liegt zwischen 1 und 2 Gewichtsteilen Gelatine auf 3 Volumteile Virussuspension. Falls ein Hilfsmittel zur Zusammensetzung zugegeben werden soll, so kann dies in einer Menge von ungefähr 5 bis 20 Gewichtsprozent, berechnet auf das Gesamtgewicht von Gelatine und Virussuspension, erfolgen. Bevorzugt ist eine Menge von ungefähr 10 bis 12 Gewichtsprozent.
  • Im folgenden seien einige wesentliche Punkte des erfindungsgemäBen Verfahrens wiedergegeben. Zur Erleichterung der Kapselabfüllung sollte die Temperatur aller Bestandteile innerhalb eines recht engen Bereichs von ungefähr-5 bis ungefähr +20° C gehalten werden. Zur Erzielung bester Ergebnisse ist eine Arbeitstemperatur von ungefähr 3 bis 5° C erforderlich. Darüberhinaus sollte die Gelatine vorzugsweise in kleinen Anteilen unter Bewegung zum virushaltigen Medium zugegeben werden. Es ist auch möglich, das Medium zu der Gelatine zu geben. Geht man jedoch in dieser Weise vor, so muß man aufpassen. daß die Zugabe langsam unter heftiger Bewegung vor sich geht, um eine extrem schnelle Hydratisierung zu vermeiden, die eine Herstellung von großen Gelatineaggregaten, die unvollständig hydratisiert sind, bewirken würde.
  • Werden die oben angegebenen Temperaturgrenzen nicht eingehalten, so erhält man ein nicht zufriedenstellendes Produkt. Überschreitet man die obere Temperaturgrenze (20° C) so werden große, klebrige, unvollständig hydratisierte Gelatineteilchen infolge zu schneller Hydratisierung erhalten. Bei diesen hoheren Temperaturen werden die großen Teilchen, die zur Kapselabfüllung ungeeignet sind, gewichtsmäßig gesehen die feineren, zur Kapselabfüllung geeigneten Teilchen übertreffen. Nur bei Verwendung von 10° C und darunterliegenden Temperaturen ist man sicher, daß man vollständig zufriedenstellende Ergebnisse erhält. Verwendet man Temperaturen, die unterhalb -5° C liegen, so trennen sich virushaltige feste Massen von der flüssigen Phase ab. Man sollte daher vorzugsweise bei oberhalb 0° C arbeiten. Gelatine mit einer Teilchengröße außerhalb eines Bereiches von ungefähr 0, 105 bis 2, 0mm lichte Maschenweite ist nach ihrer Hydratisierung ungeeignet zur Kapselabfüllung.
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Es ist klar daß äquivalente Verfahrensmaßnahmen und Mengen verwendet werden können, beispielsweise kann man Hühnerembryo als Züchtungsmedium des nichtpathogenen, abgeschwächten Poliomyelitis-Virus verwenden.
  • Beispiel 1 1. Im folgenden wird eine Beschreibung gegeben von einer typischen Verfahrensweise zur Herstellung eines Gewebskulturmediums und dessen Verwendung zur Züchtung von Poliomyelitis-Virus Typ I (SM-Stamm), Typ II (TN-Stamm) oder Typ III (Fox-Stamm) und 2. eine typische Herstellung eines Mäusegehirn-und Rückenmarkmediums und dessen Verwendung zur Herstellung von abgeschwächtem Poliomyelitis-Virus der unter l beschriebenenArten und Stämme.
  • In den folgenden Beispielen werden diese Medien als virushaltiges Medium Nr. 1 und virushaltiges Medium Nr. 2 bezeichnet.
  • (1) Virushaltiges Medium Nr. 1 A. Wachstum von Affennierenzellen (vgl. Virology, Bd. 2 [August 1956], S. 575 und 576) Von Rhesus-oder Cynomolgusaffen entfernte Nieren werden in kleine Stücke zerhackt und über Nacht (ungefähr 15 Stunden lang) bei 4° C mit 0, 25%iger Trypsinlösung verdaut und hieraus lebende Zellen gewonnen. Annähernd 150 000 dieser Zellen pro ccm werden in einer Gewebskultur der folgenden Zusammensetzung suspendiert : Rinderserum-Ultrafiltrat... 15 Volumteile Hank-Balanced-Salz-Lösung 80 Volumteile Rinder-Embryo-Extrakt... 5 Volumteile Penicillin ................. 50 Einheiten/ml Flüssigkeit Streptomycin.............. 50 microgramm/ml Flüssigkeit Hank-Balanced-Salz-Lösung :
    Na 8, 0 g
    K 0, 4 g
    CaCl2 (wasserfrei)........ 0, 2 g
    Mgso4. 7H20.......... 0, 2 g pro 1000 ml
    Na2 H P 04 2 H2 0 0, 06 g Wasser
    KH2PO4................... 0,06 g
    Glukose 1, 00 g
    Nua 35 go
    Die erhaltene Zellsuspension wird in 1-1-Povitsky-Flaschen gefüllt und bei 370 C bebrütet. Nach 6 Tagen haften die Zellen am Glasbehälter. Sie bilden am Boden der Behälter eine vollständige Zellschicht.
  • B. Wachstum des Virus Nach 6 Tagen wird der flüssige Inhalt des Gewebskulturmediums aus den Flaschen entfernt und durch 500ml eines Gewebskulturmediums Nr. 199 ersetzt (vgl. »Reagents & Media for Tissue Culture & Virus Propagation «, herausgegeben von Difco). Der Inhalt der Flaschen wird dann mit je 5 ml abgeschwächtem Poliomyelitis-Virus beimpft (vgl. Journal of the American Medical Association, Bd. 162, [1. 12. 1956], S. 1281). Das beimpfte Medium und die Zellen werden bei 37° C bebrütet. Wenn im wesentlichen alle Zellen zerstört sind, d. h. wenn sie nicht länger am Glas haften, werden das Flüssigkeitsmedium und die Zelltrümmer geerntet. Dies wird im allgemeinen am Ende des vierten Tages vorgenommen. Nach der Aberntung wird das abgeerntete virushaltige Medium Nr. 1 auf seine Wirkungsstärke durch Titration in Gewebskulturröhren geprüft. Es kann dann mit Gelatine zur Herstellung einer frei fließenden, granularen Vaccine verarbeitet werden. Falls gewünscht, kann es jedoch auch eingefroren und bis zur gewünschten Verarbeitung mit der Gelatine gelagert werden.
  • (2) Virushaltiges Medium Nr. 2 Schweizer Albinomäusen werden jeweils 0, 03 ml eines abgeschwächten Virus intracerebral via Rückenmark eingegeben. Wenn die Mäuse paralysiert sind, werden Gehirne und Rückenmarke der Tiere entnommen. Aus den entnommenen Gehirnen und Rückenmarken wird dann eine 20neige Suspension (Gewicht/ Volumen) in normaler Salzlösung hergestellt, zu der 50 Microgramm Streptomycin und 50 Einheiten Penicillin/ml Flüssigkeit zugefügt werden. Dieses Medium stellt das virushaltige Medium Nr. 2 dar, das ebenso wie das virushaltige Medium Nr. 1 mit Gelatine verarbeitet oder eingefroren und bis zum gewünschten Gebrauch gelagert werden kann.
  • Beispiel 2 Eine Poliomyelitis-Virus-Vaccine vom Typ I (SM-Stamm) wurde aus den folgenden Bestandteilen bereitet : Gelatine (0, 250 bis 0, 177 mm lichte Maschenweite)................ 50 g Maisstärke 13 g Virushaltiges Medium Nr. 1........ 37, 5 ccm Glycerin................... 37, 5 ccm Virushaltiges Medium Nr. 1 und Glycerin wurden zur Virussuspension vereinigt. Vor dem Vermischen wurden Suspension und Gelatine getrennt in Athanol-Trockeneis-Bädern auf ungefähr 4° C abgekühlt. Die Gelatine wurde dann bei ungefähr 4° C unter Bewegung zwecks Herstellung von einzelnen hydratisierten Teilchen mit der Virussuspension getränkt.
  • Darauf wurde die Maisstärke unter Bewegung in die Zusammensetzung eingemischt.
  • Die so hergestellte, hydratisierte, frei fließende, granulare Vaccine wurde dann in hartwandige Gelatinekapseln abgefüllt und deren Wirksamkeit bestimmt.
  • Die Ergebnisse sind wie folgt : Titer der Vaccine-Aktivität
    Temperatur Zeit in Tagen
    0 1 1 1 7 1 13
    +27° C 104,s 104, 5
    +4°C 104,3 104,5 104,5 1042,2
    -15°C 104,3 105, 2
    Beispiel 3 Eine Poliomyelitis-Virus-Vaccine des Typs I (SM-Stamm) wurde gemäß der Verfahrensweise des Beispiels 2 aus den folgenden Materialmengen bereitet : Gelatine (0, 250 bis 0, 177 mm lichte Maschenweite)................ 23, 8 g Maisstärke 6, 8 g Virussuspension Nr. 2 (50°/o) und Glycerin (50°/o) 34 ccm Alle Bestandteile und Zusätze mit Ausnahme der Maisstärke wurden vor dem Vermischen auf 4° C gekühlt. Die Gelatine wurde unter Bewegung bei tiefen Temperaturen wie im Beispiel 2 langsam hydratisiert.
  • Nach vollständiger Hydratisierung wurde die Maisstärke in drei Anteilen unter Bewegung zugefügt. Man erhielt eine wie im Beispiel 2 frei fließende, granulare Vaccine von wirksamem Titer.
  • Beispiel 4 Eine Poliomyelitis-Virus-Vaccine vom Typ II (TN-Stamm) von wirksamem Titer und frei fließender, granularer Form wurde gemäß Beispiel 2 unter Verwendung der folgenden Bestandteile bereitet : Gelatine (0, 250 bis 0, 177 mm lichte Maschenweite)................ 14, 05 g Maisstärke 14, 05 g Virussuspension Nr. 2 (50"/o) und Glycerin (50%) 56, 3 ccm Die Hydratisierungstemperatur betrug 4° C. Nach vollständiger Hydratisierung wurde die Maisstärke in drei Anteilen unter Bewegung zugegeben.
  • Beispiel 5 Eine Poliomyelitis-Vaccinevom Typ II (TN-Stamm) von wirksamem Titer und frei fließender, granularer Form wurde nach Beispiel 2 aus den folgenden Bestandteilen bereitet : Gelatine (0, 250 bis 0, 149mm lichte Maschenweite).................. 70 g Maisstärke 20 g Virushaltiges Medium Nr. 1........ 50 ccm Glycerin........................... 50 ccm Nach Vermischen der flüssigen Bestandteile bei 4° C wurde die Maisstärke zugemischt, bis einzelne Teilchen gebildet wurden.
  • Beispiel 6 Es wurde eine Poliomyelitis-Virus-Vaccine vom Typ III (Fox-Stamm) von wirksamem Titer gemäß der Verfahrensweise und unter Verwendung derselben Bestandteile und Mengen mit Ausnahme des Virus selbst, d. h. von Gelatine, Stärke, Glycerin und Medium Nr. 1, wie im Beispiel 2 bereitet. Man erhielt eine hydratisierte, frei fließende, granulare Vaccine, die nach Abfüllung in weichwandige Kapseln bei der Gewebskulturtitration eine Wirksamkeit aufwies, die ähnlich derjenigen des Beispiels 2 war.
  • Beispiel 7 Eine Poliomyelitis-Virus-Vaccine vom Typ III (Fox-Stamm) von wirksamem Titer wurde gemäß der Verfahrensweise und unter Verwendung derselben Bestandteile und Mengen mit Ausnahme des Virus selbst, d. h. von Gelatine, Glycerin, Stärke und Medium Nr. 2, wie im Beispiel 3 bereitet. Man erhielt eine hydratisierte, frei fließende, granulare Vaccine, die in hartwandige Kapseln abgefüllt wurde. Bei der Gewebskulturtitration zeigte diese Vaccine eine dem Beispiel 3 ähnliche Wirksamkeit.

Claims (3)

  1. PATENTANSPRUCHE : 1. Verfahren zur Herstellung einer stabilen, oral anwendbaren Poliomyelitis-Vaccine, die geeignet zur Kapselabfiillung ist, dadurch gekennzeichnet, daß man eine flüssige Suspension eines abgeschwächten, nichtpathogenen Poliomyelitis-Virus und gemahlene, nicht hydratisierte Gelatine mit einer Teilchengröße entsprechend einer lichten Maschenweite von ungefähr 0, 105 bis 2, 00tmm im Gewichtsverhältnis Gelatine zu Virussuspension von 10 : 1 bis 1 : 4 bei ungefähr-5 bis +20° C miteinander mischt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestandteile bei 0 bis 10° C, vorzugsweise bei 3 bis 5° C, und vorzugsweise unter Schütteln miteinander vermischt werden.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Gelatine eine Teilchengröße entsprechend einer lichten Maschenweite von 0, 149 bis 0, 250 mm besitzt und in kleinen Anteilen unter Schütteln zu der flüssigen Virussuspension zugefügt wird.
    In Betracht gezogene Druckschriften : Deutsche Patentschrift Nr. 956 975.
DEA29391A 1957-05-29 1958-05-02 Verfahren zur Herstellung einer stabilen, oral anwendbaren Poliomyelitis-Vaccine Pending DE1081605B (de)

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