DE2755037A1

DE2755037A1 - Pulverfoermiges mittel, enthaltend lebensfaehige zellen von bifidobacterium

Info

Publication number: DE2755037A1
Application number: DE19772755037
Authority: DE
Inventors: Katsuhiro Ogasa
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1977-12-09
Filing date: 1977-12-09
Publication date: 1979-06-13
Also published as: NL190226B; NL7713630A; NL190226C; DE2755037C2; BE861717A; GB1582068A

Description

Die Erfindung bezieht sich allgemein auf ein pulverförmiges Mittel, welches getrocknete lebensfähige Zellen von Mikroorganismen des Genus Bifidobacterium (nachstehend auch kurz als Bifidobakterienzellen bezeichnet) enthält und zur oralen Verabreichung bestimmt ist, um eine günstige Beschaffenheit der Darmflora herzustellen oder aufrechtzuerhalten.

Insbesondere betrifft die Erfindung ein pulverförmiges Mittel, das lebensfähige Bifidobakterienzellen enthält und das hohe Überlebensrate während langer Lagerzeit besitzt.

Es ist gut bekannt, daß Bifidobacterium normalerweise im menschlichen Darm vorkommt und einen der nützlichen Mikroorganismen darstellt.

Es ist ferner bekannt, daß die orale Verabreichung einer Zubereitung, die lebensfähige Bifidobakterienzellen enthält, ein wirksames Mittel zur Verhütung und Behandlung von Darmbeschwerden ist, insbesondere von Diarrhöe, Darmkatarrh, Dyspepsie, Konstipation und zur Substitutionstherapie von Darmbakterien (microbisme substitue) nach der Behandlung mit Antibiotika. Zu diesen Zwecken sind zahlreiche pulverförmige Mittel im Handel, die getrocknete lebensfähige Zellen von Bifidobacterium enthalten.

In den üblichen pulverförmigen Mitteln war Jedoch die Überlebensrate der Bifidobakterienzellen unbefriedigend niedrig und es stellte ein grundsätzliches Problem dar, die Überlebensrate der Zellen zu verbessern und zu ermöglichen, den lebensfähigen Anteil der Bifidobakterienzellen während einer gewünschten langen Lagerzeit bei einem bestimmten Wert zu halten.

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So liegt beispielsweise der Gehalt an lebensfähigen Bifidobakterienzellen in 1 g der pulverförraigen Produkte, die durch 12 Firmen in Japan vertrieben werden, und eines deutschen Produkts, das Milchpulver mit einem Gehalt an Bifidobakterienzellen und einem geringen Anteil an Lactulose enthält, im allgemeinen bei niederen Werten, wie 5 oder 6 χ 10 . Außerdem vermindert sich der lebensfähige Anteil der Zellen in diesen Produkten während der Lagerung rasch.

Unter diesen Umständen wurden bereits zahlreiche Versuche unternommen, die Lagerfähigkeit von Bifidobakterienzellen enthaltenen Produkten zu verbessern.

In einer Forschungsmitteilung von Ohta "Research for freezing and freeze drying Lactobacillus bifidus" in der japanischen Zeitschrift "Ochanomizu Igaku Zasshi" (Ochanomizu Medical Journal), Band 7, Nr. 11 (1959), Seiten 2967 bis 2975, wird über die Lebensfähigkeit von gefriergetrockneten Bifidobakterienzellen berichtet, die mit Hilfe verschiedener Trocknungsmethoden und Suspendiermittel hergestellt wurden.

In dieser Forschungsmitteilung wird berichtet, daß Natriumglutamat als Suspendiermedium zur Gefriertrocknung von Bifidobakterienzellen zu einer besseren Überlebensrate der Zellen führen kann, wenn gefriergetrocknete Bifidobakterienzellen bei 37°C gelagert werden, und daß als Zusatzstoffe danach Magermilch, lösliche Stärke und Saccharose folgten. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn Natriumglutamat in einer Konzentration von 3 Gew.-% verwendet wurde; die Überlebensrate in diesem besten Fall verminderte sich jedoch nach einer Lagerung von nur 2 Monaten auf 1 %.

Smiha berichtet in "Journal of Food Science", Band 39, (197A), Seiten 6A1 bis 6A2, daß eine 55 %ige Überlebensrate nach 2-monatiger Lagerung bei 30⁰C erhalten wurde, wenn Zellen von Lactobacillus bifidus (ältere wissenschaftliche Bezeichnung des Genus Bifidobacterium) dem Gefriertrocknen unter Verwendung von Magermilch mit dem Zusatz von Ascorbinsäure, Thioharnstoff und Ammonium-

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chlorid als Suspendiermittel unterworfen wurden. Dieser Wert ist um einiges höher, das mit Hilfe dieses Verfahrens hergestellte Produkt ist Jedoch nicht vorteilhaft, um es mit Hilfe des üblichen Verteilungssystems zu vertreiben, da der lebensfähige Anteil von Lactobacillus bifidus in diesem Produkt während längerer Lagerdauer von mehr als zwei Monaten offensichtlich rasch abfällt.

Wie vorstehend erläutert wurde, beeinträchtigt die Verminderung der Überlebensrate während der Lagerung weitgehend den Handelswert dieser pulverförmigen Produkte, da die Zellkonzentration von Bifidobakterienzellen während der Lagerung selbst dann abnahm, wenn die Produkte ursprünglich eine hohe Zelldichte bzw. Zellkonzentration hatten. Infolgedessen war üblichen Produkten, die lebensfähige Bifidobakterienzellen enthielten, Lactose, Stärke und dergleichen als Suspendiermedium zum Schutz der Zellen zugesetzt worden. Trotzdem erreichen jedoch die üblichen pulverförmigen Mittel, die bekannte Suspendiermedien enthalten, keine ausreichende Lebensfähigkeit für die Zellen. Diese Suspendiermedien haben daher nicht tatsächlich die Funktion des Schutzes der Zellen und wirken vielmehr nur zur Verdünnung der gefriergetrockneten Bifidobakterienzellen. Tatsächlich ist die Konzentration lebensfähiger Zellen von Bifidobakterien in den gegenwärtig im Handel befindlichen pulverförmigen Produkten sehr niedrig.

Bisher ist kein pulverförmiges Produkt bekannt, das getrocknete Bifidobakterienzellen enthält, welches befähigt ist, eine hohe Zellkonzentration an lebensfähigen Zellen während langer Lagerzeit beizubehalten.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein pulverförmiges Mittel zur Verfügung zu stellen, welches getrocknete lebensfähige Bifidobakterienzellen in hoher Zellkonzentration enthält und welches befähigt ist, eine höhere Überlebensrate der Zellen während langer Lagerzeit beizubehalten.

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Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, ein pulverförmiges Mittel, das getrocknete lebensfähige Bifidobakterienzellen enthält, zu schaffen, das geeignet ist, bei oraler Verabreichung eine Flora von Bifidobacterium im Intestinaltrakt aufzubauen.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein pulverförmiges Mittel, welches ein lebensfähige Zellen von Bifidobacterium enthaltendes Pulver und ein Lactulose enthaltendes Pulver umfaßt.

Das erfindungsgemäße Mittel wird dadurch hergestellt, daß ein lebensfähige Bifidobakterienzellen enthaltendes Pulver mit einem Lactulose enthaltendes Pulver homogen vermischt werden.

Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß durch Zumischen einer speziellen Menge eines Lactulose enthaltenden Pulvers, das zum überwiegenden Anteil aus Lactulose besteht, als Suspendiermittel zu einem lebensfähige Bifidobakterienzellen enthaltenden Pulver eine überraschende Wirkung zur Verbesserung der Überlebensrate der Zellen erreicht wird.

Das erfindungsgomäß vorliegende, Di f idobakterien:je Ilen enthaltende Pulver enthalt getrocknete Bifidobakterienzellen und Dispergiermedium, v/ie Magermilchpulver, Natriumglutamat, Gelatine, Lactose und dergleichen und enthält mindestens 20 χ 10 lebensfähige Bifidobakterienzellen in I g des Pulvers. Ein solches Pulver kann mit Hilfe üblicher Methoden hergestellt werden.

Das erfindun^sgemäß verv/endote Lactulose enthaltende Pulver enthält mindestens 55 Oev/.-?> Lactulose, bezogen auf den Gesamti'escstoffgehalt, und einen geringen Feuchtigkoitsanteil. Der verbleibende Feststoffanteil kann aus restlicher Lactose und Galactose bestehen, die aus dem Reaktionsgemisch für die Lactuloseherstellung eingebracht wurden.

Es ist erforderlich, daß das endgültige pulverförmige erfindungs-

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gemäße Produkt, welches durch homogenes Vermischen von 40 bis 70 Gew.-% des die lebensfähigen Bifidobakterienzellen enthaltenden Pulvers mit 60 bis 30 Gew.-% des Lactulose enthaltenden Pulvers hergestellt wurde, mindestens 8 χ 10 lebensfähige Bifidobakterienzellen in 1 g des Endprodukts, 28 bis 57 Gew.-% Lactulose und weniger als 2,5 Gew.-% Feuchtigkeit in dem Endprodukt aufweist.

Die Anmelderin konnte bestätigen, daß das erfindungsgemäße pulverförmige Gemisch eine verbesserte Überlebensrate der Bifidobakterienzellen nach relativ langer Lagerdauer zeigte und daß eine Verminderung der Überlebensrate der Zellen auch dann verhindert werden konnte, wenn die Lagerdauer noch verlängert wurde.

Für die Zwecke der Erfindung eignen sich als Stämme für die verwendeten Bifidobakterienzellen beliebige bekannte Stämme der Spezies des Genus Bifidobacterium, es wird jedoch bevorzugt, Stämme von Bifidobacterium adolescentis (insbesondere ATCC 15703 und andere), Bifidobacterium longum (ATCC 15707 und andere), Bifidobacterium bifidum (ATCC 11146 und andere) zu verwenden, also Stämme, die normalerweise im menschlichen Intestinaltrakt unabhängig vom Alter vorkommen.

Die erfindungsgemäßen pulverförmigen Gemische enthalten sowohl lebensfähige Bifidobakterienzellen, als auch Lactulose in hohen Konzentrationen.

Das erfindungsgemäße pulverförmige Gemisch ist durch homogenes Vermischen eines lebensfähige Bifidobakterienzellen enthaltenden Pulvers und eines Lactulose enthaltenden Pulvers zugänglich.

Das zur Herstellung des erfindungsgemäßen pulverförmigen Gemisches bzw. Mittels verwendete, Lactulose enthaltende Pulver ist mit Hilfe von bekannten Verfahren, beispielsweise durch Trocknen von Lactulose-Sirup, erhältlich.

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In der japanischen Patentschrift 874 954 (veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 2984/1977) wird erläutert, daß ein Lactulose-Sirup, der mehr als 80 Gew.-% Lactulose, bezogen auf den Gesamtfeststoffgehalt, enthält, durch Vermischen einer wässrigen Lösung von Lactose mit 2 bis 10 Gew.-% einer wässrigen Lösung von Natriumhydroxid, die 0,27 bis 0,54 Gew.-?S Natriumhydroxid, bezogen auf das Gewicht der Lactose, enthält, Erhitzen der erhaltenen Mischlösung auf eine Temperatur von 70 bis 130⁰C zur Isomerisierung der Lactose, wobei die Bildung von Nebenprodukten, wie Galactose und anderen Substanzen, möglichst unterdrückt wird, und anschließendes Konzentrieren der Reaktionsflüssigkeit unter Abtrennung von Lactose aus der Reaktionsflüssigkeit hergestellt werden kann (US-PS 3 816 174, BE-PS 783 690, FR-PS 72/18213, NL-PS 150 513 und DT-PS 2 224 680).

Ein Verfahren zur Herstellung eines Lactulosepulvers aus Lactulose-Sirup wird in der japanischen Patentschrift 778 564 (veröffentlichte japanische Patentanmeldung 49-44331) beschrieben (US-PS 3 716 408, BE-PS 774 451, FR-PS 71/38472, DT-PS 2 148 159, NL-PS 147 784 und GB-PS 1 318 494). Gemäß diesem Verfahren kann ein Lactulosepulver, das mehr als 55 Gew.-% Lactulose, bezogen auf den Feststoffgehalt, enthält, durch Vermischen einer wässrigen Lösung mit einem pH-Wert von weniger als 7,0, die mehr als 60 Gew.-56 Lactulose, bezogen auf den Gesamtfeststoff gehalt, enthält, mit einer wässrigen Lösung, die mehr als 0,3 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der Lactulose, eines gelösten Konnyaku-Pulvers enthält, und Trocknen des gebildeten Gemisches mit Hilfe einer üblichen Heißluft-Sprühtrocknungsvorrichtung, erhalten werden. Konnyaku-Pulver wird aus den Körnern einer perennierenden Pflanze "Araorphophalus konjac" der Araceae-Familie gewonnen und stellt überwiegend ein aus Mannan bestehendes Kohlenhydrat dar.

In der veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 52-21063 von Nagasawa et al wird außerdem erläutert, daß hochreines Lactulosepulver erhalten werden kann,indem Lactulose-Sirup auf Tem-

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peraturen zwischen -2O°C und -45°C gekühlt wird, einen Bereich, in welchem der Sirup nicht gefriert, und dann zur Herstellung von konzentriertem Sirup dem Gefriertrocknen unterworfen wird, und schließlich der konzentrierte Sirup durch Wärme getrocknet wird, bis eine getrocknete poröse Masse erhalten wird, und schließlich die poröse Masse unter wasserfreier Atmosphäre zu einem Pulver pulverisiert wird.

Diese Methoden eignen sich zur Herstellung von LactulosepuLver, welches mehr als 55 Gew.-5' LaotuLose enthüLt. Es Ist nun möglich geworden, hochreines Lactulosepulver, das einen Gehalt von 96 % erreicht, Industriell herzustellen und für die Zv/ecke der Erfindung Lst es wünschenswert, ein möglichst hochreines, Lactulose enthaltendes Pulver zu verwenden, so daß eine höhere UberLebensrate der Bifidobakterienzellen in dem Endprodukt erreicht wird.

Wie nachstehend beschrieben werden soll, liegt der Feuchtigkeitsgehalt des Endprodukts wünschenswert bei weniger als 2,5 Gew.-?j und aus diesem Grund ist es wünschenswert, daß der Feuchtigkeitsgehalt des Lactulosepulvers so niedrig wie möglich gehalten wird und vorzugsweise weniger als 0,7 % beträgt.

Die für die Zwecke der Erfindung verwendeten Stämme von Bifldobacterlum können beliebige bekannte Stämme von Spezies des Genus Bifidobacterlum (gemäß Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, ü. Auflage, herausgegeben von R.E. Buchanan & ΓΙ. E. Glbbones, S. 669 - 676, 1974, The Williams & WiIkins Co., Baltimore, USA)seln, vorzugsweise werden jedoch ein oder mehrere Stumme von B. adolescent is (ν/le ATCC 15703 und andere), B. longum (ATCC 15707 und andere) und B. blfidum (ATCC 11146 und andere) angewendet, d.h. Stämme, die normalerweise im menschlichen Darmtrakt unabhängig vom Alter vorhanden sind.

Diese Stämme sind in dem "Catalogue of Strains, Eleventh Edition (1974), The American Type Culture Collection" aufgeführt und von

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dieser Hinterlegungsstelle erhältlich.

Zur Herstellung der Bifidobakterienzellen können beliebige bekannte Fermentationsmethoden und Kulturmedien angewendet werden; gut geeignet ist besonders das Kulturmedium, welches durch Nagasawa et al in der veröffentlichten japanischen Patentanmeldung 50-89587 beschrieben ist, da Mikrobenstamme des Genus Bifidobacterium besonders gut in diesem Kulturmedium wachsen und es besonders wirtschaftlich ist. Dieses Kulturmedium enthüLt Maisquellwasser und FischLeber als Stickstoffquellen, Lactose, anorganische Salze und Cystin als Grundnnhrstoffe sowie weitere Zusätze von Reiskieleextrakt oder Extrakte verschiedener Getreide keime.

Das H-KuIturmedium nach Yuka Hara et al, welches Fleischextrakt, Ilefeextrakt, KH₂PO^, K₀IIPO^, CH_vC00IIa, Lactose und Cystin enthäLt und einen pH-V/ert von 6,8 hat, v/ird ebenfalls bevorzugt, da es leicht hersteLLbar Ist (JournaL of Japaneso Society of Food and nutrition, VoL. 18, Πο.1 (1965), S. 10).

Nach der Vermehrung können die DIfidobakterlenzeLLen durch Zentrifugieren des Kulturmediums gewonnen werden. DLe gewonnenen ZeLLen werden dann In sterilisierter Lsotonischer NatriumchLorLdlösung suspendiert, deren Menge der Menge des KuLturmedlums gleich 1st, und zur Entfernung des KuLturmedlums und von MetaboLLten und anderen Verunreinigungen, die an den Oberflächen der· ZeLlen haften, gewaschen und schließlich wieder durch Zentrifugieren der Lösung gewonnen.

Gewöhnlich werden aus I 1 des Kulturmediums etwa 6 bis 7 g der feuchten Zellen erhalten und diese feuchten Zellen enthalten 60 bis 80 χ 10^ BifLdobakterienzellen pro 1 g. Die feuchten Zellen werden dann in einer Menge von 60 g feuchter Zellen pro 1 1 der Lösung in einer sterilisierten wässrigen Lösung suspendiert, die k Gew.-% Magermilch, 1 Gew.-^ Natriumglutamat, 0,4 Gew.-% Gelati-

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ne, 5 Gew.-/j Saccharose als Suspendiermittel enthält. Dann wird die Lösung gefriergetrocknet und mit Hilfe üblicher Methoden unter Bildung eines Pulvers pulverisiert. Das so erhaltene, getrocknete Bifidobakterienzellen enthaltende Pulver besteht aus etwa 74 Gew.-% des Suspendiermittels, etwa 22 Ge\i.-% der getrockneten Zellen, 4 Ge\J.-% oder weniger Feuchtigkeit und enthält in 1 g des
zellen.

1 g des Pulvers mindestens 20 χ 10 lebensfähige Bifidobakterien-

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Mindestens 20 χ 10 der lebensfähigen Zellen in 1 g des getrocknete Bifidobakterienzellen enthaltenden Pulvers sind erforderlich, um die gewünschte hohe Zellkonzentration der Bifidobakterienzellen in den als Endprodukt erhaltenen pulverförmigen Mitteln zu gewährleisten. Der Feuchtigkeitsgehalt des getrocknete Bifidobakterienzellen enthaltenden Pulvers beträgt gewöhnlich etwa 2,0 bis 4,0 Gew.-Yo; es ist jedoch wünschenswert, daß diese Feuchtigkeit so niedrig wie möglich ist, damit die Überlebensrate der Zellen in dem Gemisch erhöht wird.

Das so erhaltene, getrocknete Bifidobakterienzellen enthaltende Fulver und das Lactulose enthaltende Pulver werden mit Hilfe eines V-Hischers in einer feuchtigkeitsarmen Atmosphäre in einem Verhältnis von 40 bis 70 Gew.-% des Bifidobakterienzellen enthaltenden Pulvers und 60 bis 30 Gew.-So des Lactulose enthaltenden Pulvers vermischt. Das so erhaltene pulver!"örmige Gsmisch enthält etwa 23 bis 57 Gew.-'a Laotulose und hat einen Feuchtigkeitsgehalt von höchstens 2,5 Gew.-^c;<j oder weniger und in 1 g des pulverförmiger. Gemisches liegen mindestens 8 κ 10 lebensfähige Bifidobakterienzellen vor. Es ist erforderlich, das pulverförmige Mittel an einem kühlen und dunklen Ort aufzubewahren, da das Gemisch hohe Hygroskopizität hat. Das pulverförmige Mittel kann luftdicht verpackt oder in Kapseln gefüllt und danach luftdicht verpackt werden, bevor es vertrieben wird.

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Bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Mittels zur Verbesserung, wie der Herstellung oder Aufrechterhaltung der Darmflora, beträgt die geeignete Dosis des erfindungsgemäßen pulverförmiges Mittels 1 bis 1,5 g für Kleinkinder, 1,5 bis 3 g für Kinder und 3 bis 6 g für Erv/achsene pro Tag.

Wie vorstehend erwähnt ist, wird die Überlebensrate der Bifidobakterienzellen in dem erfindungsgemäßen pulverförmigen Gemisch durch das Zumischen des Lactulose enthaltenden Pulvers sehr stark erhöht und das pulverförmige Gemisch oder Mittel kann lebensfähige Bifidobakterienzellen in derart hohen Konzentrationen, wie etwa dem 10 -fachen der Konzentration der üblichen Produkte enthalten, die mit Hilfe eines Dispergiermediums verdünnt sind.

Wenn das Verhältnis von Lactulosegehalt zu Bifidobakterienzellen-Gehalt in dem pulverförmigen Gemisch vermindert wird, so wird die Überlebensrate der Zellen vermindert, und es wurde gefunden, daß der Lactulosegehalt wünschenswert mehr als 28 Gew.-?6, bezogen auf das Endprodukt, beträgt. Es wurde außerdem gefunden, daß bei einer zu starken Erhöhung dieses Verhältnisses die Überlebensrate der Zellen etwas vermindert wird und daß darüber hinaus durch das Lactulosepulver die Hygroskopizität des pulverförmigen Mittels erhöht wird, wodurch wiederum eine Agglomerationsneigung des pulverförmigen Mittels bzw. Gemisches verursacht wird. Wie aus den nachstehend beschriebenen Beispielen ersichtlich ist, wurde festgestellt, daß der Lactulosegehalt des pulverförmigen Mittels wünschenswert weniger als 57 Gew.-% beträgt. Wenn der Feuchtigkeitsgehalt des pulverförmigen Gemisches auf mehr als 2,8 Gew.-?S erhöht wird, wird die Überlebensrate der Zellen rasch vermindert und es ist daher praktisch wichtig, den Feuchtigkeitsgehalt bei 2,5 Gew«-?6 oder weniger zu halten.

Verständlicherweise ist es zur Herstellung der erfindungsgemäßen pulverförmigen Mischung notwendig, ein Bifidobakterienzellen in hoher Zellkonzentration enthaltendes Pulver und ein Lactulose in

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hoher Konzentration enthaltendes Pulver herzustellen.

Aus den Beispielen und den Ergebnissen der aufgeführten Vergleichsversuche wird klar, daß erfindungsgemäß ein pulverförmiges Mittel zur Verfügung gestellt wird, welches lebensfähige Bifidobakterienzellen in hoher Zellkonzentration enthält und welches aufgrund der Zumischung des Lactulose enthaltenden Pulvers eine ausgezeichnete Überlebensrate der Zellen aufweist. Dieses Mittel ist daher äußerst wirksam zur Einstellung einer günstigen Beschaffenheit der Intestinalflora im Vergleich mit den Vergleichsproben, in denen das Lactulose enthaltende Pulver durch übliche Dispergiermedien (wie Stärke und Lactose) ersetzt ist.

Beisniel 1

Ein Lactulose enthaltendes Pulver wurde nach der gleichen Methode wie in Beispiel 1 der JA-PS 770 564 hergestellt. 3 kg einer wässrigen Lösung von Lactose mit einem pH-V/ert von 6,5, die 53,3 Gew.-^ Lactulose, 8,2 Gew.-ji Galactose, 6,3 Gew.-J« Lactose, 31,1 Gew.-^ V/asser und 0,6 Gew.-?i andere Bestandteile enthielt, wurde hergestellt. Auf 1,5 1 V/asser wurden 7,3 g (0,5 Gew.-Dj, bezogen auf den Lactulosegehalt der wässrigen Lösung) eines handelsüblichen Konnyaku-Fulvers (jsnahlenes PuLver aus der Fukujhina Präielztur Japan) unter Rühren zugesetzt, danach glsichmäßig quollen jolassen und mit Hilfe eines 100 I-Iaschen-Filtürtuches (!!aschenweita 0,149 mm) filtriert, um unlösliche Bestandteile zu entfernen. Das Filtrat wurde zu den vorstshend erhaltenen 3 kg oinur wässrigen Lactuloselösun^ zugesetzt und danach gut eingemischt. Die erhaltene Mischlösung hatte eine Viskosität von 140 Centipoise bei 20 C (gemessen mit Hilfe eines Viskonoters des B-Typs der Tokyo Keiki Co., Ltd. nach dem üblichen Verfahren). Dio Mischlösun- vnirde auf 45 C erhitzt und danach mit Hilfe eines Sprühtrockners (Produkt der Anhydro Co.) getrocknet, \*obei die Eintrittstenperatur der Heißluft 170°C, die Austritt3tsmperatur 90⁰C und die Unxire-

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hungsgeschwindigkeit des Zerstäubers 9000 Upm betrugen. Dabei wurden 1,75 kg eines weißen Pulvers erhalten. Das Pulver enthielt 70,2 Gew.-% Lactulose, 0,51 Gc\t.-% Feuchtigkeit und war freifliessend und leicht lör,Lieh in Wasser.

Ein Bifidobakterienzelien enthaltendes FYilver wurde mit Hilfe

des nachstehend beschriebenen Verfahrens hergestellt (das auch als

Methode A bezeichnet wird).

Zur Herstellung eines Kulturmediums wurden in 10 1 Wasser 3,0 Gew.-% Fischleber, 2,0 Gevf.-°/o Maisquellwasser, 2,0 Gew.-?s Lactose, 0,1 Gew.-% KH₂PO^, 0,1 Gew.-% K₂HPO^, 0,5 Gew.-% Natriumacetat und 0,04 Gew.-% 1-Cystin gelöst und der pH-Wert der wässrigen Lösung wurde dann durch Zugabe einer 1 η wässrigen Lösung von Natriumhydroxid auf 6,0 eingestellt. Die Lösung wurde dann in einem Autoklaven 15 Minuten bei 121°C sterilisiert und abgekühlt. Eine Starterkultur von Bifidobacterium longum (ATCC 15707) wurde in einer Konzentration von 4 % dem Kulturmedium zugesetzt und durch Rühren gleichförmig eingemischt. Dann wurde die Fermentation anaerob in eLnem Jar-Fermenter unter Einleiten von gasförmigem Kohlendioxid 12 Stunden bei 37°C durchgeführt. Während dieser Fermentation wurden etwa 20 Gew.-% einer wässrigen Lösung von CaCO, dem Kulturmedium zugesetzt, um dessen pH-Wert auf etwa einzustellen.

Das Kulturmedium wurde dann auf 5°C gekühlt und zentrifugiert (10 000 Upm), um die dar* in suspendierten Bif idobakterienzellen zu gewinnen. Dies erfolgte mit Hilfe einer gekühlten, kontinuierlichen Hochgeschwindigkeitszentrifuge. Danach wurden die so gewonnenen Zellen wieder in 1000 ml sterilisierter und gekühlter (5 C) isotonischer Natriumchloridlösung suspendiert, um Verunreinigungen auszuwaschen, und die erneut gebildete Suspension wurde zentrifugiert (10 000 Upm), um die gewaschenen Bakterienzellen zu gewinnen.

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60 g der so erhaltenen feuchten Bifidobakterienzellen wurden erneut in 1 1 einer sterilisierten wässrigen Lösung eines Suspendiermittels suspendiert, die 40 g Saccharose, 15 g Mucin, 5 g Gelatine, 15 g Glutaminsäure und 15 g Asparaginsäure (Aminoberasteinsäure) enthielt und dann mit Hilfe eines üblichen Verfahrens gefriergetrocknet. Dabei wurden 96 g Bifidobakterienzellen in Form einer Pulvers erhalten, das 23,0 Gew.-96 der Zellen, 74,7 Gew.-% des Suspendiermittels und 2,4 Gew.-% Feuchtigkeit enthielt. Die Zahl der lebensfähigen Bifidobakterienzellen in 1 g des Pulvers betrug 36 χ 10

Schließlich wurden 90 g des Lactulose enthaltenden Pulvers und 90 g des so hergestellten Bifidobakterienzellen enthaltenden Pulvers mit Hilfe eines V-Mischers (Tokuju Seisakusho Co., Ltd.) in einem bei niederer Feuchtigkeit gehaltenen Raum homogen vermischt und etwa 180 g des so erhaltenen pulverförmigen Gemisches wurden in eine rote Flasche eingefüllt und nach dem luftdichten Verschließen wurde die Flasche an einem kühlen, dunklen Ort geringer Feuchtigkeit aufbewahrt. Das so erhaltene pulverförmige Gemisch enthielt 39 Gew.-?6 Lactulose und 1,46 Gew.-% Feuchtigkeit und die Anzahl der darin vorliegenden lebensfähigen Zellen

10 von Bifidobacterium betrug 18 χ 10 /g.

Beispiel 2

Gemäß der in dem Beispiel der veröffentlichten Japanischen Patentanmeldung Nr. 52-21063 beschriebenen Methode wurde ein Lactulose enthaltendes Pulver in folgender Weise hergestellt :

500 g Lactulose-Sirup, der aus 56 Gew.-% Lactulose, 7,0 Gew.-% Galactose, 4,0 Gew.-96 Lactose, 1,0 Gew.-96 anderen Bestandteilen und 32 Gew.-% Wasser bestand, wurde in einer Dicke von 5 mm in eine Schale in einer Stufen-Gefriertrocknungsvorrichtung gegossen und das Gefriertrocknen wurde unter einem Vakuum von 1 mm Hg bei -40°C begonnen. Etwa 2 Stunden später wurde die Temperatur in

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Gefriertrocknungsvorrichtung auf -3O°C eingestellt und danach im Verlauf von 4 Stunden allmählich auf 80⁰C erhöht, während das Vakuum allmählich auf 30 mm Hg vermindert wurde. Während dieser Zeit blähte sich der Sirup allmählich bis zu einer Höhe von 20 cm auf und bildete eine gleichförmige bienenwabenähnliche geschäumte Masse. Im Verlauf von 2 Stunden wurde die Temperatur allmählich auf 35⁰C eingestellt und danach wurde die Temperatur 16 Stunden bei diesem Wert gehalten, wobei 340 g einer getrockneten bienenwabenartigen Masse erhalten wurden. Während dieses Zeitraums wur-

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de das Vakuum von 6 χ 10 mm Hg auf 2 χ 10 mm Hg eingestellt. Die getrocknete Schaummasse wurde in einem feuchtigkeitsfreien Raum unter Bildung eines Pulvers pulverisiert. Das erhaltene Pulver war weiß und ausreichend f reif ließbar und enthielt 80,8 Gew.-?( Lactulose und 0,5 Gew.-% Feuchtigkeit.

Das Bifidobakterienzellen enthaltende Pulver wurde nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode gesondert hergestellt, mit der Abänderung, daß Bifidobacterium adolescentis (ATCC 15705) verwendet wurde (nachstehend als Methode B bezeichnet). Dabei wurden 92 g des Bifidobakterienzellen enthaltenden Pulvers hergestellt. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen betrug 287 x 10 /g und das Pulver enthielt 3,0 Gew.-% Feuchtigkeit, 74,6 Gew.-% Suspendiermittel und 22,4 Ge\f.-% der Bifidobakterienzellen.

40 g des vorstehend erhaltenen Lactulose enthaltenden Pulvers und 60 g des so gebildeten Bifidobakterienzellen enthaltenden Pulvers wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 homogen vermischt, wobei etwa 100 g des pulverförmigen Gemisches erhalten wurden. Die Anzahl an lebensfähigen Bifidobakterienzellen betrug 172 χ 10⁹/g und das Gemisch enthielt 32,3 Gew.-% Lactulose und 2,02 Gew.-% Feuchtigkeit.

Versuch 1

Ein Vergleichsversuch wurde zur Bestimmung des Zusammenhangs

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zwischen der Überlebensrate der Zellen und der Lagerzeit unter Anwendung verschiedener Lagerzeiten durchgeführt.

Die für den Versuch verwendeten Proben waren Bifidobakterienzellen enthaltende pulverförmige Produkte A, B und C, die von drei Firmen A, B und C im Handel erhältlich sind, ein Bifidobakterienzellen enthaltendes Pulver D als Vergleichsprobe, in welchem anstelle des erfindungsgemäßen Lactulose enthaltenden Pulvers ein übliches Dispergiermedium vorlag und die in den vorstehend erläuterten Beispielen 1 und 2 erhaltenen pulver formLgen Gemische.

Die bei dem Versuch verwendeten Produkte A bis C waren Produkte, die eine Wirkungsdauer von etwa 2,6 Monaten hatten, wie aus den auf ihren Packungen angegebenen Indikationen berechnet werden konnte. Wenn auch möglicherweise einige Monate vom Herstellungsdatum bis zum Verkaufsdatum dieser Produkte vergehen kann, wurden sie unter der Annahme für den Versuch verwendet, daß Herstellungsdatum und Verkaufsdatum das gleiche ist.

Jeweils 50 g der Produkte A bis C wurden in einem feuchtigkeitsfreien Raum in Fläschchen eingewogen und die Gefässe zugeschmolzen, um den Feuchtigkeitszutritt zu verhindern.

Die Vergleichsprobe D wurde hergestellt, indem ein GewLchtnteLl des nach Methode A erhaltenen Bifidobakterienzellen enthaltenden Pulvers mit 0,8 Gew.-Teil Stärke und 0,2 Gew.-Teil Lactose als Dispergiermittel vermischt wurde.

50 g der Vergleichsprobe D und der pulverförmigen GemLsche der Beispiele 1 und 2 wurden ebenfalls in die gleichen Flaschchen eingewogen (Fassungsvermögen 100 ml) und dann die Fläschchen zugeschmolzen, um den Feuchtigkeitszutritt zu verhindern.

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Alle sechs Proben wurden 6 Ilona te lang bei 20 C aufbewahrt und die Proben der Beispiele I und 2 wurden danach zusätzliche 6 Monate aufbewahrt.

Der Anteil der lebensfähigen Zellen in den Proben wurde mit Hilfe des nachstehend beschriebenen Verfahrens zu folgenden Zeitpunkten bestimmt : Unmittelbar nach der Herstellung (bei den Proben A bis C unmittelbar nach dem Kauf), nach 2-monatiger Lagerung, nach 4-raonatiger Lagerung und nach 6-monatiger Lagerung bei allen Proben und nach ]2-nonatiger Lagerung nur bei den Pro ben der Beispiele I und 2.

Die Überlebensrate der ZelLen wurde nach folgender Gleichung berechnet :

lebensfähiger Anteil nach

Uberlebensrate der ZaLlen (;'>) = .:c IC

lebensfähiger Anteil unmittelbar nach der Herstellung

Das Verfahren zur Bestimmung der Lebensfähigen Anteile wird folgendermaßen durchgeführt :

O en au abgewogene I ^-AnteLLc- Jeder Probe wurden in 9 nl stori-Lisierter iso tonischer Na triumchLoridlcisun;; gelöst. Jede dieser anfänglich erhaltenen Suspensionen wurde unter Verwendung von steril LsIe rt.^:)i- icotcnischer iIatriumciiiofLdliuiung i;i eiri'jr VordünnungssjrLu auf das K)"- bis IO"^y-fache verdünnt. I r.iL ,iociar d-3V verdünnten ilm-.n.Hir; ionon \;urdj zu 9 ml der. hnlluijs con il-i-'ul turnediu:ns ;ui.;::boti, wüLchos durch Z.uh dan vorstellend genannt ^:>n il-i'ul turmoctium jr

ibe von [),:■> :Ί Ajar :u nalton wor;l.:n v.'ar, und

homogen f?in~onischt, um -.!iny ondgiil t i ;o verdünnt η our.porinion ::u biidsn. Jeweils 13 mL dnv vordünntι·η Suspension ;/urdon La vier WLn bijrg-Rohre ;-e<:osr>an und anaerob 'r2 JJtundan lang bol ^7⁰C nacii ;:_;;r üblichen ."lethodü cobriitot. !fach der Iniiubiei'un;·; v.'ur-ion dia V.'inborg-Rohre, in denen ^O bis ;0ü ".olonisn ausgebildet -./aren, ausgewählt und ei ic "ol^nion wurdan je-ihlt. Die Werto des arithne-

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ORIGINAL INSPECTED

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tischen Mittels, die aus den für jede Probe erhaltenen Kolonienzahlen berechnet v/urden, wurden als Anzahl der lebensfähigen Zellen angesehen.
Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 1 aufgeführt.

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TABELLE 1
Lebensfähigkeit_der_in_den_Proben_vorliegenden__Zellen

Proben	Lagerung	lebensfähi ger Anteil	unmittelbar nach der Herstellung	nach 2 Mo naten	nach 4 Mo naten	nach 6 Mo naten	nach 12 Mo naten
		UberleSens- rate (%)	76x1O⁵	32x1O⁵	10x10⁵	12x1O⁵	^^
A	lebensfähi ger Anteil	100	42,1	13,2	15,8	^^
B	überleb en's- rate (#)	122x1O⁵	22x1O⁵	13x1O⁵	7x10⁵	^^
C	lebensfähi ger Anteil	100	18,0	10,7	5,7	^"
D	uberlebens- rate (%)	200x1O⁴	48x1O⁴	30x1O⁴	28x1O⁴	130x1O⁹
Beisp. 1	lebensfähi ger Anteil	100	24,0	15,0	14,0	72,2
Beisp. 2	überleb" ins - rate (%)	175x1O⁹	102x1O⁹	73x1O⁹	71x1O⁹	118x1O⁹
lebensfähi ger Anteil	100	58,3	41,7	40,6	68,6
UberleSens- rate (%)	180x1O⁹	152x1O⁹	150x1O⁹	147x1O⁹
lebensfähi ger Anteil	100	84,4	83,3	81,7
Überlebens rate (⁰A)	172x1O⁹	147x1O⁹	143x1O⁹	141x10⁹
100	85,5	83,1	82,0

275bO37

Anmerkung_2 Der lebensfähige Anteil bedeutet die Anzahl der

lebensfähigen Bifidobakterienzellen in 1 g jeder der Proben.

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, war die Überlebensrate der Zellen nach 6-monatiger Lagerung bei den handelsüblichen, Bifidobakterienzellen enthaltenden Pulvern (Proben A bis C) außerordentlich niedrig.

Die Überlebensrate der Zellen in Probe D ist im Vergleich mit der der Proben A bis C ziemlich gut, jedoch wesentlich schlechter als bei den Proben aus den Beispielen 1 und 2 gemäß der Erfindung.

Versuch 2

Ein Versuch wurde durchgeführt, um den Einfluß des Verhältnisses von Lactulose enthaltendem Pulver zu dem Bakterienzellen enthaltenden Pulver (nachstehend als L/B-Verhältnis bezeichnet) auf die Überlebensrate der Zellen zu überprüfen.

Ein Lactulose enthaltendes Pulver, das 95,5 Gew.-?£ Lactulose, bezogen auf den Feststoffgehalt und 0,6 Gew.-% Feuchtigkeit enthielt, wurde gemäß Beispiel 4 der JA-PS 778 564 in der Weise hergestellt, daß 29,4 g (0,5 %_t bezogen auf den Lactulosegehalt)handelsübliches Konnyaku-Pulver (gemahlenes Pulver aus der Fukushima Präfektur Japan) unter Rühren in 4,5 1 Wasser gegeben wurde, um gleichförmiges Quellen zu ermöglichen, und danach mit Hilfe eines 100 Maschen-Filtertuches (Maschenweite 0,149 mm) filtriert wurde, um unlösliche Bestandteile zu entfernen, und das Filtrat zu 3 kg einer wässrigen Lactuloselösung mit einem pH-Wert von 6,4 gegeben wurde, die 68,0 Gew.-% Lactulose, 1,2 Gew.-?£ Galactose, 0,1 Gew.-% Lactose, 30,0 Gew.-96 Wasser und 0,7 Gew.-% andere Bestandteile enthielt, die durch Epimerisierung von Lactose und anschließende Oxydation der als Nebenprodukt gebildeten Aldose erhalten worden war. Dieses Lactulose enthaltende Pulver wurde mit dem nach Methode A

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2 7 b b O 3 7

hergestellten, Bifidobakterienzellen enthaltenden Pulver in verschiedenen L/B-Verhältnissen vermischt, die in Tabelle 2 gezeigt sind. Dabei wurden 9 Proben der pulverförraigen Geraische erhalten, die nach der gleichen Methode wie in Versuch 1 der Prüfung der Lebern fähigkeit der Zellen unterworfen wurden. Der Lactulosegehalt und der Feuchtigkeitsgehalt der Proben wurde mit Hilfe der Methode
nach Sweeley (Journal of the American Chemical Society, Vol. 85 (1963), S.2497) und mit Hilfe der üblichen Methode bestimmt. Die bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

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co

<0 00

O UJ

CJ

TABELLE 2
Uberlebensrate_der_Zellen_in_2ulyerförmigen_^

Probe, Nr.	prozen tualer Anteil des Lactulose enthalten den Pulvers in der Probe	prozen tualer Anteil des B-Zellen enthalten den Pulvers in der Probe	Lactulose- gehalt der Probe {%)	Feuchtig keitsge halt der Probe 00	Anteil der lebens fähigen B-Zellen in der Probe	nach 6 Mo naten La gerung	Uberle bensrate der Zellen nach 6 Mo naten L- gerung (*)
1	70	30	66,9	1,14	unmittelbar nach Her stellung	77x1O⁹	71,3
2	65	35	62,1	1,22	108x1O⁹	96x1O⁹	77,4
3	62,8	37,2	60,0	1,27	124x1O⁹	106x1O⁹	79,7
.4	60	40	57,3	1,30	133x1O⁹	119x1O⁹	82,6
5	50	50	47,8	1,50	144x1O⁹	147x1O⁹	81,7
6	40	60	38,2	1,69	180x1O⁹	173x1O⁹	80,5
7	30	70	28,7	1,86	215x1O⁹	202x1O⁹	80,2
8	25	75	23,9	1,95	252x1O⁹	162x1O⁹	59,3
9	20	80	19,1	2,03	273x1O⁹	121x10⁹	42,2
287x1O⁹

Anmerkung_£

Der lebensfähige Anteil bedeutet die Anzahl der lebensfähigen Bifidobakterienzellen in 1 g jeder der Proben.

ro

cn er.

CJ

2 7 5 b Ü 3 7

Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, zeigten die Proben 1 bis 7, die mehr als 28,7 Gew.-% Lactulose enthielten, nach 6-monatiger Lagerung eine höhere Überlebensrate der Zellen. Wenn das L/B-Verhältnis jedoch auf einen gewissen Wert erhöht wird, wie in den Proben 1 bis 3, neigen die pulverförmigen Gemische wegen der Hygroskopizität des Lactulosepulvers zum Agglomerieren, wenn auch die Uberlebensraten nicht sehr vermindert werden.

Wenn dagegen das L/B-Verhältnis auf einen gewissen Wert vermindert wird, wie in den Proben 8 und 9, wird die Überlebensrate vermindert und die Menge des Lactulose enthaltenden Pulvers als Suspendiermittel wird verringert.

Es wurde demnach gefunden, daß die erfindungsgemäßen pulverförmigen Gemische vorzugsweise durch Vermischen von 40 bis 70 Gew.-% des gefriergetrocknete Bifidobakterienzellen enthaltenden Pulvers mit 60 bis 30 Gew.-% des Lactulose enthaltenden Pulvers hergestellt werden und daß der Lactulosegehalt der pulverförmigen Gemische vorzugsweise so eingestellt wird, daß er in einem Bereich von 28 bis 57 Gew.-% liegt.

Versuch 3

Ein Versuch wurde durchgeführt, um den Einfluß des Feuchtigkeitsgehaltes des erfindungsgemäßen pulverförraigen Mittels auf die Überlebensrate festzustellen.

6 Proben der pulverförmigen Gemische wurden hergestellt, indem das in Versuch 2 verwendete Lactulose enthaltende Pulver (95,5 Gew.-% Lactulose, bezogen auf den Feststoffgehalt, 0,6 Gew.-% Feuchtigkeit) mit einem Bifidobakterienzellen enthaltenden Pulver, das nach Verfahren A hergestellt wurde, jedoch unterschiedliche Feuchtigkeitsgehalte hatte, vermischt wurde.

Diese Proben wurden dem Test der Lebensfähigkeit der Zellen nach dem gleichen Verfahren wie in Versuch 2 unterworfen. Die Ergeb-

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2 7 S b Ü 3 7

- 25 nisse dieses Tests sind in der nachstehenden Tabelle 3 gezeigt,

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TABELLE

co ο co

Probe Nr.	Feuchxig- keixsgenalx des E-Zellen enxhalxenden Pulvers (SS)	Feuchxig- keixsgehalx des Gemisches · (%)	Anxeil der lebensfähigen B-Zellen in der Probe	nach 6 Monaten Lagerung	Überlebens- raxe der Zellen nach 6 Monaten Lagerung
1	5,62	3,13	unnixxelbar nach der Hersxellung	9x10⁹	7,4
2	5,03	2,83	122x1O⁹	68x1O⁹	44,4
3	4,42	2,51	153x10^S	145x1O⁹	79,7
4	3,75	2,16	1S2x10⁹	149x1O⁹	81,9
5	2,40	1,49	182x1O⁹	137x1O⁹	80,6
6	2,0β	1,33	170x1O⁹	148x1O⁹	83,6
177x1O⁹

Anmerkune_£ Der Anxeil der lebensfähigen Zellen gibx die Anzahl der lebensfähigen Bifidobakxerienzellen in 1 g jeder der Proben an.

cn cn C

Wie aus Tabelle 3 klar ersichtlich ist, wurde die Überlebensrate beträchtlich verringert, wenn die pulverförmigen Gemische mehr als 2,51 Gew.-% Feuchtigkeit enthielten, und die Uberlebensrate war außerordentlich stark vermindert, wenn der Feuchtigkeitsgehalt oberhalb von 3 Gew.-% lag.

Es kann festgestellt werden, daß die Proben, deren Feuchtigkeitsgehalt weniger als 2,50 betrug,nach 6-monatiger Lagerung eine hohe Überlebensrate von mehr als 80 % zeigten. Es ist demnach wesentlich, daß der Feuchtigkeitsgehalt der pulverförmigen Mittel weniger als 2,50 Gew.-96 beträgt.

Versuch 4

Um die Wirksamkeit des erfindungsgemäß hergestellten Mittels zum Einstellen einer günstigen Beschaffenheit der Darmflora zu prüfen, wurde nachstehender Versuch durchgeführt, wobei das pulverförmige Mittel gemäß Beispiel 1 der Erfindung, das pulverförmige Gemisch der Probe D gemäß Versuch 1 und das Gemisch gemäß Probe A in Versuch 1 verwendet wurden.

Für den Versuch wurden 6 Patienten herangezogen, welchen zur Behandlung von Darmstörungen Antibiotika verabreicht worden waren. Das Alter und Geschlecht der Patienten sind in Tabelle 4 aufgeführt. In sämtlichen Stühlen der Patienten wurden lebensfähige Anteile an Bifidobakterienzellen von weniger als 10 pro g des Stuhls festgestellt. Wie in Tabelle 4 gezeigt ist, wurden die Patienten in 3 Gruppen eingeteilt und 2 g Jeder Probe wurden den Patienten 3 mal täglich zu festgelegten Zeiten während 7 aufeinanderfolgender Tage -verabreicht.

3 Tage und 7 Tage nach Beginn der Behandlung wurden die Stühle der 6 Patienten aufgefangen und 1 g Jeder Stuhlprobe wurde in 9 ml sterilisierter isotonischer Natriumchloridlösung suspendiert.

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Mit jeder dieser ursprünglichen Suspensionen wurde unter Verwendung von sterilisierter isotonischer Natriumchloridlösung eine Verdünnungsserie durch Verdünnung auf das 10- bis 10 -fache durchgeführt. 1/10 ml der Verdünnung wurde auf eine Agarplatte eines Η-Kulturmediums mit zugesetztem Penicillin und Agar im Verhältnis von 0,1 IE bzw. 0,015 g pro 1 ml des Kulturmediums gegeben und mit einem L-förmigen Glasstab gleichmäßig ausgebreitet. Die Kolonien der Bifidobakterienzellen wurden nach 72-stündiger anaerober Inkubation bei 37°C mit Hilfe der Stahlwolle-Methode bestimmt (Azuma et al, Japanese Journal of Bacteriology, Vol. 17 (1962), S. 802-806). Diese Methode ist eine Modifizierung der Methode nach Parker, die in Australian Journal of Experimental Biology, Vol. 33 (1955), S. 33-38 beschrieben ist.

Der Grund für den Penicillinzusatz zu dem Η-Kulturmedium liegt darin, daß das Wachstum anderer Bakterien als der des Genus Bifidobacterium auf der Agarplatte gehemmt wurde. Die bei diesem Versuch erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.

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TABELLE 4 Wirk^g_yon_Bifidobakterienzellen_enthalt

co O CO 00 (SJ

O U)

Patient Nr.	Proben	Anteil der lebensfähigen E-Zellen/g des pulverförmigen Mittels	Alter und Geschlecht des Patienten	Geschlecht	nach 3 Tagen *	nach 7 Tagen *
1	pulverförmiges Mit tel gemäß Beispiel 1 der Erfindung	180x10⁹/g	Alter	υ	38x1O^y	28x1O^1ü
2	pulverförmiges Mit tel gemäß Probe D in Versuch 1	175x10^S/g	27		29x1O^ö	10x10^IU
3	pulverförmiges Mit tel gemäß Probe A in Versuch 1	1x10⁷/g **	45	Q	10x10⁵	19x1O⁹
4	23	υ	<10*	72x1O⁸ j
5	48		<10⁵	<10⁵
6	28	O	<10>	71x1O⁶
23

ro

* Anteil der lebensfähigen rifidobakterienzellen/g

** Der Anteil der lebensfähigen B-Zellen in dem pulverförmigen Mittel der Probe A wurde den Dosierungsangaben entnommen

cn er c:

275bÜ37

Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist, betrugen die lebensfähigen Anteile der Bifidobakterienzelien in den Stühlen der Patienten (Nr. 1 und Nr. 2), die mit dem erfindungsgemäßen pulverförmigen Mittel behandelt worden waren, nur 3 Tage nach Beginn der Behandlung bereits 30 χ 10 /g bzw. 29x10 /g und v/aren am 7. Tag nach der Behandlung auf 28x1O¹°/g bzw. 10x10¹⁰/g erhöht. Das erfindungsgemäße pulverförmige Mittel führt daher zum überwiegenden Vorliegen von Bifidobakterienzelien in der Darraflora der Patienten, da die Gesaratzahl der Bakterienzellen in der Darmfli
hatte.

Darmflora etwa einen Wert von 10⁹ bis 10 pro 1 g des Stuhls

In den Stühlen der Patienten (Nr. 5 und Nr. 6), die mit dem pulverförmigen Mittel gemäß Probe A behandelt worden waren, waren die lebensfähigen Anteile der Bifidobakterienzelien nicht erhöht und in einem Fall (5) wurde auch 7 Tage nach Beginn der Behandlung ein Wert der lebensfähigen Bifidobakterienzelien von weniger als 10 pro 1 g des Stuhls festgestellt. In dem anderen Fall (6) wurde ein lebensfähiger Anteil an Bifidobakterienzellen entsprechend einem Wert von 10 /g am 7. Tag nach Beginn der Behandlung beobachtet, ein so niederer Wert des lebensfähigen Zellanteils kann jedoch nicht als Kennzeichen für die Einstellung eines günstigen Zustands der Darmflora angesehen werden.

Im Fall der Patienten (Ilr. 3 und Nr. h), die mit dem pulverförmigen Mittel gemäß Probe D behandelt worden waren, wurden selbst 7 Tage nacli Beginn der Behandlung lebensfähige Anteile der Bifidobakterienzelien von nur 19x10 /g bzw. 72x10 /g beobachtet, obv/ohl diese V/erte den Werten der Patienten (Fälle 1 und 2) ziemlich nahe kamen, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen pulverförmigen Mittel behandelt worden waren, war doch bei Verabreichung dieses Mittels das Wachstum und die Ansiedelung von Bifidobakterienzellen im Darm im Vergleich mit den Fällen 1 und 2 sichtlich verzögert.
Es ist daher offensichtlich, daß merkliche Unterschiede im Hin-

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blick auf das Wachstum und die Ansiedelung von Bifidobakterienzellen im Intestinaltrakt zwischen den Patienten, die mit Probe D behandelt wurden, und den Patienten bestehen, die mit dem erfindungsgemäßen pulverförmigen Mittel behandelt wurden, obwohl in allen Fällen fast die gleichen Mengen an Bifidobakterienzellen verabreicht wurden. Es ist daher klar ersichtlich, daß das erfindungsgemäße pulverförmige Mittel, das ein Bifidobakterienzellen enthaltendes Pulver und ein Lactulose enthaltendes Pulver umfaßt, ausgezeichnete Wirksamkeit zum Aufbau einer günstigen Beschaffenheit der Darmflora zeigt.

Wie vorstehend erwähnt wurde, zeigt das erfindungsgemäße pulverförmige Mittel eine ausgezeichnete hohe Überlebensrate der Bifidobakterienzellen während der Lagerung und kann diese hohe Überlebensrate der Zellen während beträchtlich langer Dauer beibehalten. Darüber hinaus ist offensichtlich, daß es eine ausgezeichnete Wirkung zum Aufbau eines günstigen Zustands der Darmflora hat.

Die vorstehenden Versuche machen deutlich, daß das erfindungsgemäße pulverförmige Mittel wirksam zum Einstellen einer günstigen Beschaffenheit der Darmflora ist, da es die Menge der Fäulnisbakterien im menschlichen Darm vermindert. Es kann daher zur Behandlung der Konstipation aufgrund der Erhöhung des lebensfähigen Anteils von Bifidobakterienzellen nach der Verabreichung angewendet werden und ist außerdem wirksam zur Behandlung der portosystemischen Encephalopathie, aufgrund einer Verminderung der Ammoniumkonzentration im Blut durch Zurückdrängen der Resorption von gasförmigem Ammoniak, welches durch den Abbau des Proteins im Darmtrakt gebildet wurde.

Für den Fachmann ist ersichtlich, daß die vorstehend beschriebenen speziellen Ausführungsformen der Erfindung zahlreichen Modifizierungen und Abänderungen zugänglich sind, ohne daß von der Erfindung abgewichen wird.

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Claims

27b5037 SCHIFF ν. FÜNER STRE. H U SChÜBtL-HüPF EBBINGHAUS FINCK MARIAHtLFPLATZ 2 Λ 3, MÖNCHEN 9O POSTADRESSE: POSTFACH 95Ο16Ο, D-8OOO MÖNCHEN 95 KARL LUOWIQ SCHIFF DIPL. CHEM. OR. ALEXANDER v. FÜNER OIP1.4NG, PETER STREML DIPL. CHEM. DR. URSULA SCHÜBEL-HOPF DfPL. INO. DIETER EBBINQHAUS OR. INQ. DIETER FINCK TELEFON (Ο8Θ) 482Ο64 TELEX 6-33565 AURO O TELEGRAMME AUROMARCPAT MÜNCHEN MORINAGA MILK INDUSTRY CO., LTD. 9. Dezember 1977 DA-K1874 Pulverförmiges Mittel, enthaltend lebensfähige Zellen von Bifidobacterium PATENTANSPRÜCHE

1. Pulverförmiges Mittel, enthaltend 20 bis 57 Gew.-% Lactulose, .veniger als 2,5 Gew.-% Feuchtigkeit und mindestens O χ 10¹⁰ ge-

friergetrocknete Zellen von Mikroorganismen des Genus Bifidobacterium in 1 g des Mittels mit verbesserter Beibehaltung der Lebensfähigkeit der Zellen während der Lagerung, dadurch gekennzeichnet , daß es aus

a) 40 bis 70 Gew.-% eines pulverförmigen Geraisches, das min-

11

destens 2 χ 10 Zellen eines Mikroorganismus des Genus Bifidobacterium in 1 g des Gemisches sowie ein Suspendiermittel enthält,

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b) 60 bis 30 Gew.-;4 eines pulverförmigen Bestandteils besteht, der mindestens 55 Gew.-?o Lactulose und zum restlichen Anteil Lactose und Galactose, die aus dem Reaktionsgemisch der Lactuloseherstellung stammen, enthält.

2. Pulverförmiges Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß es als Mikroorganismenzellen Zellen eines Stammes von Difidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum oder Gemische solcher Mikroorganismen enthält.

3. Pulverförmiges Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e kennzeichne t , daß es aus 74 Gew.-Jj Suspendiermittel, etwa 22 Gew.-^S gefriergetrockneter lebensfähiger Zellen eines Mikroorganismus des Genus Bif idobacterium und etwa 4 Gevr.-% Feuchtigkeit besteht.

4. Pulverförmiges Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennze Lehnet , daß das Suspendiermittel aus etwa 20 Gew.-?) Magermilchpulver, etwa 7 Gew.-?a Natriumglutamat, etwa 3 Gew.-/j Gelatine und etwa 56 Gew.-/o Saccharose besteht.

ORIGINAL

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