DE3885468T2 - Mittel zur verringerung des lipidperoxidgehaltes. - Google Patents
Mittel zur verringerung des lipidperoxidgehaltes.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Lipidperoxid verringerdes Mittel mit Lactobacterium- und Hefezellen als wirksame Bestandteile. Sie betrifft insbesondere ein Lipidperoxid verringerdes Mittel, das als wirksamen Bestandteil Mikroorganismuszellen der Gattung Enterococcus, Lactobacillus, und/oder Saccharomyces enthält. In dieser Beschreibung bezeichnet der Begriff "Lipidperoxid" im allgemeinen Peroxide von Lipiden wie Peroxide von Linolensäure, Ölsäure oder Arachidonsäure.
- Es ist bekannt, daß in Lebensmitteln enthaltene Lipidperoxide die Membran des Verdauungstrakts zerstören und daß einige absorbiert werden und verschiedenartige Wirkung haben. Es wurde berichtet, daß beispielsweise bei der Bildung von Lipidperoxiden in Zellwänden, die große Mengen ungesättigter Fettsäuren im Zellkörper enthalten, diese eine Verringerung der Aktivität verschiedener Enzyme, Zerstörung der Membraneigenschaften, beispielsweise erleiden rote Blutzellen leicht eine Hämolyse oder die Venenwände verhärten, und das Auftreten morphologischer Änderungen in verschiedenen Geweben bewirken. Es wird angenommen, daß diese verschiedenen sich überlappenden Phänomene in der Praxis zu einer Verhärtung der Arterien, einem Abfall der Enzymwirkung, Retinopathie, Katarakten, Diabetes und anderen altersbedingten Funktionsabfällen führen.
- Derzeit werden zur Umgehung und Bewirkung der Heilung solcher Symptome in erster Linie Tocopherol, Ascorbinsäure und andere Antioxidantien eingesetzt. Diese werden jedoch selbst extrem leicht oxidiert, und es tritt das Problem des Aufrechterhaltens ihrer Wirkung auf. Sind sie darüber hinaus Lebensmittelzusatzstoffe, ist deren Aufnahme alleine nicht erwünscht.
- Unter Beachtung dieser Tatsachen wurde festgestellt, daß verschiedene Arten von Lactobacterium und Hefe eine signifikante Verringerung der Lipidperoxide zeigen.
- Demzufolge ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein zur Verringerung von Lipidperoxiden in Lebensmitteln und im Verdauungstrakt fähiges Bakterienzellen-Produkt bereitzustellen. Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Bakterienzellen-Produktes, welches im trockenen Zustand über einen langen Zeitraum wirksam bleibt, ohne daß eine Schwächung der Reduzierung von Lipidperoxid beobachtet wird. Es ist weiterhin Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Bakterienzellen-Produkt bereitzustellen, welches alleine oder selbst als Lebensmittel aufgenommen werden kann.
- Diese Ziele werden mit einem Lipidperoxid verringernden Mittel erreicht, daß als wirksamen Bestandteil wenigstens eine Substanz enthält, ausgewählt aus lebendigen Zellen, toten Zellen und einem unlöslichen Bestandteil davon, erhalten aus Enterococcus faecium AD 1060 (FERM BP-1926), Lactobacillus salivarius AD 003 (FERM BP-1927), E. faecalis AD 9001 (FERM BP-297) oder Saccharomyces cerevisiae 155-77 (FERM BP-1928).
- Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen neuen Bakterienstamm mit einer Lipidperoxid verringernden Wirkung, der wenigstens ein Stamm, ausgewählt aus Enterococcus faecium AO 1060 (FERM BP-1926), Lactobacillus salivarius AD 0003 (FERM BP-1927) und Saccharomyces cerevisiae 155-77 (FERM BP-1928), ist.
- Das erfindungsgemäße Lipidperoxid verringernde Mittel kann darüber hinaus einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten und kann in getrockneter, zur Lagerung geeigneter, Form bereitgestellt werden.
- Chemical Abstracts 96 (1982) 118634v und JP-A-62 103 023 betreffen Superoxiddismutase, welches Radikale von Superoxidanionen, "-O&sub2;", zerstört. Im Gegensatz dazu werden erfindungsgemäß Lipidperoxid verringernde Mittel bereitgestellt, die auf "-O&sub2;" wirken. Unter Berücksichtigung der hohen Spezifizierung von Enzymen kann die Tatsache, daß ein Stamm Superoxiddismutase enthält, keinen Hinweis darauf geben, daß dieser Stamm eine Reduzierung von Lipidperoxid bewirkt.
- Figur 1 zeigt eine graphische Darstellung der Ergebnisse des Beispieles 1, worin die Ordinate die Zellkonzentration (mg/ml) und die Abzisse die Verringerung von LPO (%) zeigt.
- Figur 2 ist ein Fließdiagramm des Verfahrens von Beispiel 2.
- Wie oben festgestellt wurde, kann das erfindungsgemäße Lipidperoxid verringernde Mittel aus einem oder mehreren Mikroorganismen, die in der folgenden Tebelle 1 aufgelistet sind, hergestellt werden. Tabelle 1 Stamm Hinterlegungsnummer Enterococcus faecium AD 1060 Enterococcus faecalis AD 9001 Lactobacillus salivarius AD 0003 Saccharomyces cerevisiae 155-77
- Die Stämme Nr. 1, Nr. 3 und Nr. 4 der Tabelle 1 wurden am 13. Juni 1987 bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1 chome Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken, 305, JAPAN), inländisch hinterlegt (Hinterlegungsnummern sind mit FERM-P bezeichnet) und am 29. Juni 1988 zur FRI als internationalen Hinterlegungsbehörde nach dem Budapester Vertrag überführt wurden (Hinterlegungsnummern sind mit FERM-BP bezeichnet). Der Stamm Nr. 2 wurde inländisch beim FRI am 15. Juli 1982 hinterlegt und in das internationale System am 31. Mai 1983 überführt.
- Die allgemeinen mikrobiologischen Merkmale der erfindungsgemäßen Mikroorganismen sind dieselben wie die der bekannten Mikroorganismen, die zur identischen Klasse gehören. Das bedeutet, daß die allgemeinen mikrobiologischen Eigenschaften, Kultivierungsverfahren und andere Eigenschaften denen entsprechen, die in den folgenden Aufsätzen beschrieben sind:
- 1) Bergey's Manual of Determinative, Bacteriology, 8th ed., 490 - 509 (1974)
- 2) Int. J. Syst. Bact. 16, 114 (1966)
- 3) Poupard, J. A., Husain, I. and Norris, R.F.: Bacteriol. Rev. 37, 136 - 165 (1973)
- 4) Mituoka, T. Jpn. J. Bacteriol. 24, 261 - 280 (1969)
- 5) Nogeikagaku Jikken Sho (Handbook of Experiments in Agricultural Chemistry), Vol. 2 (1964), edited by Agricultural Chemistry Class, Agricultural Department, Kyoto University
- 6) Microbiol. Immunol. 25 (3), 257 - 269 (1981)
- 7) J. Clin. Pathol. 33 53 - 57 (1980)
- 8) J. General Microbiol., 128 713 - 720 (1982)
- 9) Applied Microbiol., 23 (6) 1131 - 1139 (1972)
- 10) Mitsuoka, T., Rinsho to Saikin (Clinical Medicine and Microorganism), 2 (3), (197)55 - (235)93, 1975
- 11) T. Watanabe, H. Shimohashi, Y. Kawai, M. Muti: 25 (3), 257 - 269, 1981
- 12) R.H. Deibel, D.E. Lake, C.F. Nieven. Jr: J. Bacteriol. 86, 1275 - 1282, 1963
- Typische mikrobiologische Eigenschaften der in Tabelle 1 aufgelisteten Stämme werden in Tabelle 2 bis 5 zusammengefaßt. Tabelle 2 Enterococcus faecium AD 1060 (FERM BP-1926) Gram-Färbung Catalase (in Gegenwart von gekochtem Blut) Wachstum bei Wachstum in NaCl Wachstum in 40 % Galleflüssigkeit Wachstum in 1/4000 Tellursäure Wachstum in 0,1 % Methylenblau-Milch Fermentation von Kohlenhydrat Arabinose Glycerol Raffinose Sorbit Lactose Melezitose Inulin Aesulin Ammoniakbildung aus Arginin Hydrolyse von Hippursäure Tabelle 3 Lactobacillus salivarius AD 0003 (FERM BP-1927) Gestalt Gram-Färbung Gasbildung aus Glucose Wachstum bei Fermentation von Kohlenhydrat Arabinose Xylose Rhamnose Ribose Mannose Galactose Saccharose Maltose Cellobiose Lactose Trehalose Melibiose Raffinose Melezitose Dextrinstärke Bacillus Mannit Sorbit Aesculin Salicin Amygdalin Tabelle 4 Saccharomyces cerevisiae 155-77 (FERM BP-1928) Gestalt Ausbreitung Sporogenese Fermentation Glucuse Fructose Mannose Galactose Saccharose Maltose Lactose Raffinose Gefällte Hefe Hefekreislauf Theca Verflüssigung von Gelatine Sulfatanabolismus eiförmig Keimung Tabelle 5 Enterococcus faecalis AD 9001 (FERM BP-297) Zellforum Gram-Färbung Hämolyse sphärisch Wachstum bei Wärmewiderstandsfähigkeit bei 60 ºC, 30 Minuten Wachstum im Medium mit pH 9,6 Reduktionsfähigkeit für Methylenblau Verflüssigung von Gelatine Wachstum in 6,5 % NaCl enthaltenden Medium Wachstum in 40 % Galle enthaltenden Medium Bildung von Ammoniak Hydrolyse von Hippursäure Wachstum in tellurhaltigen Medium Wachstum in TTC* enthaltenden Medium Säurebildung aus Kohlenstoffquelle Glucose Aesculin Inulin Lactose Glycerol Arabinose Melezitose Sorbit Serum (Antigengruppe) (* 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid)
- Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen werden wie folgt hergestellt:
- Ein Rogosabrühe-Medium, das weiter unten erläutert wird (im Falle von Lactobacterium, d. h. Mikroorganismen, die zur Gattung Enterococcus und Lactobacillus gehören) oder ein Medium in Form einer Brühe, die 0,2 % Ammoniumsulfat, 0,2 % Hefeextrakt, 2 % Glucose und 0,1 % Pepton (im Falle von Hefe, d. h. Microorganismen, die zur Gattung Saccharomyces gehören) wird mit Mikroorganismen beimpft und unter Schütteln bei 37 ºC 16 bis 24 Stunden im Falle der ersteren oder bei 30 ºC 24 bis 48 Stunden im Falle der letzteren kultiviert. Die Mikroorganismen werden durch Zentrifugation (1000 g, 10 Minuten) geerntet, in gereinigtem Wasser (1/100 Volumen des Mediums) suspendiert und anschließend durch Zentrifugation gewaschen. Die gewaschenen Mikroorganismen können als lebensfähige Zellen verwendet werden. Alternativ können durch 10 minütiges Erwärmen auf 121 ºC und anschließendes Trocknen (Gefriertrocknung oder Wärmetrocknung) abgetötete Zellen eingesetzt werden. Es kann darüber hinaus ein unlöslicher Bestandteil verwendet werden, der durch Zentrifugieren der toten Zellen hergestellt werden kann. Zusammensetzung des Rogosabrühe-Mediums Trypticase Hefeextrakt Tryptose Natriumacetat Triammoniumcitrat Tween 80 Glucose L-Cysteinhydrochlorid Salzlösung (*) Destilliertes Wasser (pH 7, Hitzesterilisation bei 121 ºC, 15 Minuten) (*) Salzlösung: Destilliertes Wasser
- Das Screening des erfindungsgemäß eingesetzten Lactobacteriums wird in Übereinstimmung mit dem von Watanabe, T., et al., Studies on streptococci, 1. Distribution of fecal streptococci in man. Microbiol. Immunol. 25 257 - 269 (1981) offenbarten Verfahren vorgenommen. Das bedeutet, daß, wie in dieser Literatur erwähnt, die Reces von gesunden Erwachsenen auf einen KMN- oder LBS- Agar aufgetragen und bei 37 ºC 48 bis 72 Stunden lang unter aeroben Bedingungen kultiviert werden. Die gebildeten Kolonien wurden gezählt und zufällig isoliert. Im Hinblick auf die Kolonietypen, Katalaseaktivität (negativ) und Gram- Färbung (positiv), wurden Kokken und Bazillen isoliert. Die Isolate wurden durch Untersuchung der physiologischen, biochemischen und serologischen Eigenschaften identifiziert und klassifiziert.
- Das erfindungsgemäße Lipidperoxid verringernde Mittel enthält die oben erwähnten lebensfähigen Zellen, toten allen oder unlöslichen Bestandteile und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger (beispielsweise Stärke, kristalline Cellulose, Calciumcarboxymethylcellulose).
- Das erfindungsgemäße Lipidperoxid verringernde Mittel kann durch peroale Verabreichung aufgenommen werden und seine Dosis beträgt für gewöhnlich etwa 0,1 bis etwa 50 mg/kg Körpergewicht (Einzeldosis). Das Mittel kann in Form von Pellets, Tabletten, Kügelchen oder ähnlichem aufgenommen werden.
- Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.
- Die in den folgenden Beispielen verwendeten Mikroorganismen wurden durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt. Lipidperoxid wurde gemäß den folgenden Verfahrensweisen hergestellt und gemessen.
- Linolsäure wurde mittels Autooxidations-Verfahren oder durch Oxidationsverfahren mit Photosensibilisatoren oxidiert, anschließend die Peroxide durch Dünnschichtchromatographie getrennt (Vergleichsmaterial für Lipidperoxide), Masashi Kaneda, Nobuo Ueda ed., Ishiyaku Shuppan KK, Agric. Biol. Chem. 35, S. 33 bis 39, 1971; supra, 45, S. 587 bis 593, 1981, "Hanyou Eisei Shikenho to Kaisetsu" (General Sanitary Test Methods and Analysis", Japan Academy of Pharmacology ed., Nanzando, S. 33, "Shishitsu Bunsekiho Nyumon" (Introduction of Lipid Analysis Methods), Yasuhiko Fujino, Gakkai Shuppan Center, S. 100).
- Die Bestimmung der Lipidperoxide wurde nach dem TBA (Thiobarbitursäure)- Verfahren durchgeführt ("Nihon Ronen Igaku Zasshi" (Japan Journal of Geriatrics), Chikayuki Naito, Ken Yamanaka, 15, S. 187 bis 191, 1978). Das Verfahren wird nachfolgend erläutert.
- (1) Bewirkung einer Reaktion zwischen den Zellen (gegbene Mengen) und Lipidperoxid (LPO)-Lösung (2 ml) in mit Glasstopfen ausgerüsteten Teströhrchen.
- (2) Hinzufügen von 3,0 ml 0,05N Chlorwasserstoffsäure zu der Reaktionslösung (1).
- (3) Hinzufügen von 3,0 ml 0,67 % TBA-Reagenz und Vermischen.
- (4) Versiegeln des Teströhrchens und 30 minütiges Erwärmen mit kochendem Wasser.
- (5) Plazieren in einem Tank mit eiskaltem Wasser zum schnellen Abkühlen auf Raumtemperatur.
- (6) Hinzufügen von 2,0 ml n-Butanol und Umfüllen des Extraktes.
- (7) Zentrifugieren (2500 upm, 10 Minuten), Abnahme der Butanolschicht (obere Schicht) und Durchführung einer colorimetrischen Messung bei 535 nm.
- Die verwendete Standardlösung war 10 nmol/ml Tetraethoxypropanmethanol- Lösung. Um Störungen des TBA-Reaktionsprodukts der Zellen selbst zu verhindern, wurden auch die Proben ohne Lipidperoxid gemessen. Der Wert minus dieses Wertes wird als TBA-Wert bezeichnet.
- Die Konzentration (C) der Lipidperoxide (nmol/ml) wird durch folgende Gleichung ermittelt:
- C = Absorbtion der Proben/Absorption der Standardlösung x 10 (nmol/ml)
- In den folgenden Beispielen wurde künstlicher Darmsaft durch Hinzufügen von 250 ml 0,2M Kaliumdihydrogenphosphat und 118 ml 0,2N Natriumhydroxid zu gereinigtem Wasser und Einstellen des ganzen auf 1000 ml hergestellt.
- 1, 5, 10, 15 und 20 mg-Mengen von heißwasser-behandelten gefriergetrockneten Zellen von Enterococcus faecium AD 1060 (FERM BP-1926) wurden in 2 ml Anteilen künstlichen Darmsaftes mit einer Lipidperoxid-Konzentration von 125, 250 und 500 ug/ml suspendiert, um Versuchslösungen mit Zellkonzentrationen von 0,5, 2,5, 5,0, 7,5 und 10,0 mg/ml herzustellen.
- In Übereinstimmung mit dem oben genannten Bestimmungsverfahren wurde die Geschwindigkeit der Verringerung der Lipidperoxide ermittelt. Die Ergebnisse, wie sie in Tabelle (6) und Fig. 1 dargestellt sind, zeigen eine wirksame Verringerung der Lipidperoxide. Tabelle 6 Zellkonzentration Lipidperoxidkonzentration
- 10, 30, 50 und 100 mg Mengen von mit heißem Wasser behandelten und gefriergetrockneten Zellen von Enterococcus faecium AD 1060 (FERM BP-1926) wurden in 1 g Mengen von Dressing suspendiert, bei Raumtemperatur eine Stunde stehen gelassen und dann die LPO-Verringerung unter Verwendung des TBA-Verfahrens bestimmt.
- Das in diesem Beispiel verwendete TBA-Verfahren ist in Fig. 2 gezeigt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 aufgelistet. Wie in Tabelle 7 gezeigt ist, wurde eine Verringerung von 90,2 % bei Zugabe von 100 mg Zellen beobachtet. Tabelle 7 Zellen (mg) TBA-Wert (nmol) Verringerung (%)
- Zur Untersuchung der Wirkungen des erfindungsgemäßen Lipidperoxid verringernden Mittels im Verdauungstrakt wurden Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin und Rindergallenpulver zu erwärmten und gefriergetrockneten toten Zellen von Enterococcus faecium AD 1060 (FERM BP-1926) (nachfolgend als wärmegetrocknete tote Zellen bezeichnet) gegeben, um deren Fähigkeit zur Verringerung von Lipidperoxiden zu studieren. Ein weiterer Versuch wurde mit unlöslichen Anteilen von wärmegetöteten Zellen durchgeführt, von denen angenommen wird, daß sie insbesondere große Mengen des wirksamen Bestandteiles des erfindungsgemäßen Mittels enthalten. Als Kontrolle wurde die Verringerung der unbehandelten wärmegetöteten Zellen ermittelt und mit 100 festgelegt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.
- 1) 0,1 mg Pepsin (hergestellt von Wako Junyaku Kogyosha) wurde in 2 ml 0,1M Citratpuffer (pH 2,5) gelöst und 20 mg wärmegetötete Zellen darin suspendiert und bei 37 ºC vier Stunden lang behandelt. Dazu wurden 1000 ug Lipidperoxid gegeben und eine Stunde später die Menge an Lipidperoxid nach dem TBA-Verfahren gemessen. Eine Probe wurde in der gleichen Weise hergestellt, jedoch ohne Hinzufügung der Zellen, und als Kontrolle verwendet, um die Verringerung der Lipidperoxide (A) zu ermitteln. (A) wurde geteilt durch die Geschwindigkeit der Verringerung der Lipidperoxide (B) in einer künstlichen Darmflüssigkeit aus 20 mg unbehandelter wärmegetöteter Zellen und 1000 ug Lipidperoxid und dann mit 100 multipliziert.
- 2) Die oben genannte Pepsinbehandlung wurde vier Stunden lang vorgenommen und das Zentrifugieren durchgeführt, um den unlöslichen Anteil zu sammeln. Dazu wurden 10 ml destilliertes Wasser gegeben und anschließend ein Kreislauf von Resuspendierung und Zentrifugieren zweimal wiederholt, um den unlöslichen Anteil zu waschen. Dieser wurde gefriergetrocknet (die gleichen Ergebnisse wurden wie bei den bei 80 ºC wärmegetöteten Zellen erhalten) und dann 2 ml eines künstlichen Darmsaftes aus 1000 ug Lipidperoxid hinzugegeben. Nach einer Stunde wurde die Menge der Lipidperoxide nach dem TBA-Verfahren gemessen und die Geschwindigkeit der Verringerung der Lipidperoxide (C) ermittelt. (C) wurde durch das oben genannte (B) und mit geteilt und mit 100 multipliziert.
- Mengen von 0,1 mg Trypsin und Chymotrypsin (hergestellt von Wako Junyaku Kogyosha) wurden in 2 ml Anteilen 0,1M Phosphatpuffer (pH 7,5) gelöst und die Geschwindigkeit der Verringerung der Lipidperoxide durch das gleiche Verfahren wie bei der Pepsinbehandlung ermittelt.
- 20 mg wärmegetötete Zellen wurden in 100 ml Wasser suspendiert, bei 60 ºC 10 Stunden gehalten, anschließend zentrifugiert, um den unlöslichen Anteil zu sammeln und dann die Verringerung der Lipidperoxide nach dem Pepsin-Behandlungsverfahren 2 ermittelt.
- Die eingesetzte pulverisierte Rindergalle war Ox-Gall von Difco Co. und zu dem künstlichen Darmsaft in Verhältnissen von 0, 0,05, 0,10, 0,15 und 0,50 % zum Versuch hinzugegeben. Tabelle 8 Verringerung von Lipidperoxiden (%) Unbehandelte wärmegetötete Zellen Pepsin-Behandlung Trypsin-Behandlung Chymotrypsin-Behandlung Unlöslicher Anteil von wärmegetrockneten toten Zellen Zugabe von Rindergalle
- Die Verringerung (%) von Lipidperoxiden wurde wie in den vorhergehenden Beispielen für künstlichen Darmsaft (2 ml) gemessen, der 500 ug Lipidperoxid und 20 mg tote Zellen enthält, die durch Behandlung lebensfähiger Zellen der in Tabelle 9 aufgelisteten Mikroorganismen mit heißem Wasser und Gefriertrocknung hergestellt worden waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9 Name des Stammes Hinterlegungs-Nr. Lipidperoxid-Verringerung (%) Enterococcus faecium AD1060 Enterococcus faecalis AD9001 Lactobacillus salivaris Saccharomyces cerevisiae
Claims (4)
1. Lipidperoxid verringerndes Mittel aus wenigestens einer Substanz,
ausgewählt aus lebensfähigen Zellen, toten Zellen und einem unlöslichen
Bestandteil davon als wirksamen Bestandteil, erhalten aus Enterococcus faecium AD 1060
(FERM BP-1926), Lactobacillus salivarius AD 0003 (FERM BP-1927), E. faecalis
AD 9001 (FERM BP-297) oder Saccharomyces cerevisiae 155-77 (FERM BP-1928).
2. Lipidperoxid verringerndes Mittel nach Anspruch 1, das zusätzlich
einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.
3. Lipidperoxid verringerndes Mittel nach Anspruch 1, in getrockneter,
zur Lagerung geeigneter Form.
4. Ein neuer Zellstamm mit Lipidperoxid verringernder Wirkung, der
ausgewählt ist aus Enterococcus faecium AD 1060 (FERM BP-1926), Lactobacillus
salivarius AD 0003 (FERM BP-1927) und Saccharomyces cerevisiae 155-77 (FERM
BP-1928).
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