DE2212573A1

DE2212573A1 - Pruefmittel zur Untersuchung einer Probe auf Mikroorganismen

Info

Publication number: DE2212573A1
Application number: DE19722212573
Authority: DE
Inventors: D G Altken; R Freake; B H Haden; L F Strenkoski
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1971-03-16
Filing date: 1972-03-15
Publication date: 1972-09-28
Also published as: AU468833B2; DK130425C; GB1365001A; AU3925772A; DE2212573C3; CH572096A5; ES400754A1; DE2212573B2; NO134009B; FR2130253A1; JPS5221075B1; FR2130253B1; BR7201424D0; NO134009C; CA955163A; NL7203068A; DK130425B; IT951072B; BE780652A; SE392910B

Description

betreffend:

Prüfmittel zur Untersuchung einer Probe auf Mikroorganismen.

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Prüfmittel zur. Untersuchung einer Flüssigkeit auf Mikroorganismen. Das Prüfmittel kann durch Eintauchen in die Probe beimpft werden und anschließend können Mikroorganismen durch Inkubieren in einem verschließbaren Behälter gezüchtet " werden. Das Prüfmittel umfaßt allgemein eine absorbierende Matrix, die mit einem Nährmedium, enthaltend ein Test-

(bzw. -Fixiermittel),^ , . reagens und exn Suspensxonsmittel/impragniert ist, wobei durch das Letztere ein Auslaugen des Mediums während des Eintauchens vermieden wird und die Kolonien der Mikroorganismen während der Züchtung an dem Ort festgehalten werden.

Untersuchungen von Flüssigkeiten auf das Vorhandensein von Mikroorganismen v/erden üblicherweise in der Medizin, in der Industrie und durch Behörden durchgeführt, um den Grad der mikrobiologischen Verunreinigung in verschieden3n

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Arten von Proben zu "bestimmen. Bei vielen derartigen Untersuchungen ist das Vorhandensein von Mikroorganismen häufig von zweitrangiger Bedeutung und es soll in erster Linie die Konzentration der Mikroorganismen in der Probe bestimmt werden. Z.B. wird die Diagnose der Bakteriuria bestimmt durch die Konzentration der in einer Urinprobe vorhandenen Mikroorganismen und nicht durch die bloße Gegenwart von Mikroorganismen. Ähnlich werden Milch-und Wasser-Proben nur dann als "verunreinigt" angesehen, wenn die in den Proben vorhandene Konzentration der Mikroorganismen über ein festgelegtes Maximum hinausgeht. Offensichtlich ist es, wenn die Konzentration an Mikroorganismen über einen festgelegten Standard hinausgeht, hilfreich und oft notwendig, den Mikroorganismus zu identifizieren, um eine Behandlung der Infektion möglichst zu beschleunigen oder die Ursache der Verunreinigung zu bestimmen und zu beheben.

Ein quantitatives Verfahren zur Bestimmung von Mikroorganismen umfaßt die Herstellung von Reihenverdünnungen einer abgemessenen Menge der Probe, Beimpfen eines Agar-ITährmediums mit einer abgemessenen Menge einer Verdünnung und ungefähr 24 Stunden langes Inkubieren des beimpften Mediums. Wenn die Probe verunreinigt ist, können einzelne Kolonien der gewachsenen Mikroorganismen visuell beobachtet und gezählt werden. Die Konzentration der Mikroorganismen pro cnrder Probe wird dann berechnet, indem man die Anzahl der Mikroorganismen-Kolonien mit der Verdünnung der Probe multipliziert. Die so gewachsenen einzelnen Kolonien stellen eine reine Quelle des Mikroorganismus dar, um die Mikroorganismen auf selektive! oder veränderlichen Medien au züchten und sie zu identifizieren. Diese Züchtung erfordert häufig eine erneute Inkubation von weiteren 24 h.

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Der diesem Verfahren anhaftende Nachteil besteht darin, daß man Reihenverdünnungen der Probe sowie ein Agar-Medium herstellen muß, -.' öle ~ lange Zeit/erforderllch ist um einen quantitativen Nachweis und eine Unterscheidung

und

zu erzielen / daß eine große Menge von sauberenund sterilisierten Laborgegenständen erforderlich ist.

Es wurde ein zweites Verfahren entwickelt, bei dem abgemessene Volumina einer Probe durch eine semipermeable Membran filtriert werden. Das Konzept dieses Verfahrens besteht darin, daß man eine Membran auswählt, die eine solche Porosität besitzt, daß die Mikroorganismen nicht durch die Membran hindurchgehen. Nach dem Filtrieren wird die Membran von dem Filter entfernt und neben ein Agar-Nährmedium gebracht, wobei die darin enthaltenen Nährstoffe durch die Membran hindurchdiffundieren können. Bei der Inkubation wachsen die Mikroorganismen auf der Membran und werden anschließend beobachtet und gezählt, wie bei dem oben beschriebenen Verfahren.

Während das zuletzt beschriebene Verfahren in bestimmten Beziehungen eine Verbesserung gegenüber dem ersten Verfahren darstellt, ist ein Filtrieren notwendig und es ist außerdem notwendig, die Filtervorrichtung zu reinigen und erneut zu stealisieren. Außerdem ist es auch notwendig, die Probe vor dem Filtrieren abzumessen, was wiederum zusätzliche Zeit und weitere Vorrichtungen erfordert.

Das erfindungsgemäße Prüfmittel umfaßt eine saugfähige Matrix, die mit einem Nährmedium, enthaltend Testreagentien und einem Suspensionsmittel imprägniert ist. Bei der Anwendung wird die imprägnierte Matrix kurz in die Flüssigkeit eingetaucht oder auf andere Weise mit ihr gesättigt, um die Matrix

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die ein bekanntes Volumen der Probe absorbiert, zu beimpfen. Je nach dem verwendeten Nährmedium und dem Reagens kann eine halbquantitative oder Unterscheidungsuntersuchung durchgeführt werden. Ähnlich kann eine Anzahl von Prüfmitteln, von denen jedes ein unterschiedliches Medium und Reagens enthält, beimpft v/erden und es können sowohl halb quantitative als auch Unterscheidungsuntersuchungen gleichzeitig durchgeführt' werden. Es hat sich außerdem gezeigt, daß zuverlässige Ergebnisse bei halbquantitativen oder Unterscheidungsuntersuchungen in weniger als 12 Stunden erhalten werden können.

Es ist ein Prüfmitel bekannt, bei dem eine mit einem Nährmedium imprägnierte Matrix direkt in die zu analysierende Probe getaucht-wird. Dieses Prüfmittel ist in der US -PS 2 904- 4-74- beschrieben und umfaßt allgemein einen Papierstreifen, der mit einem Nährmedium, enthaltend eine Testsubstanz, imprägniert ist. Der Streifen besitzt einen getrennten Handgriff und eine Hülle, in der der Streifen zur Inkubation eingeschlossen wird.

Die oben angegebene Vorrichtung besitzt die folgenden Nachteile: (1) V/erden die löslichen Nährstoffe und Testsubstanzen während des Eintauchens des Prüfmittels in die Probe ausgelaugt, (2) neigen die nach dem Eintauchen in dem Streifen verbleibenden löslichen Substanzen aufgrund der Schwerkraft dazu, in den unteren Teil des Streifens zu wandern und (3.) v/erden die beweglichen Mikroorganismen nicht an einen Ort festgehalten und es bilden sich daher keine einzelnen Kolonien oder Stellen, die zum halbquantitativen nachweis notwendig sind.

Diese Nachteile werden dadurch vermieden, daß man zu dem Prüf-

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mittel ein Suspensionsmittel zugibt. Das erfindungsgemäße Prüfmittel kann so direkt mit der Probe beimpft werden und es ist dabei nicht nötig, die Probe zuerst abzumessen und/oder zu verdünnen. Durch das direkte Beimpfen mit der nicht verdünnten Probe erhält das Kulturmedium im wesentlichen die gleiche Umgebung wie die Probe und dadurch wird die Zeit herabgesetzt, die normalerweise erforderlich ist, um die Mikroorganismen an eine neue, wenn auch geeignete Umgebung anzupassen und dadurch wird ihr Wachstum beschleunigt. Durch ein Prüfmittel zur Durchführung von Unterscheidungsuntersuchungen, das direkt mit der Probe beimpft werden kann, ist es möglich, halbquantitative und Unterscheidungsuntersuchungen gleichzeitig durchzuführen.

Die Erfindung betrifft ein Prüfmittel zur Untersuchung einer Probe auf Mikroorganismen, das durch Eintauchen in eine Flüssigkeitsprobe beimpft und in einem verschließbaren Behälter inkubiert werden kann, umfassend eine Matrix aus einem saugfähigen Material, vorzugsweise Filterparie?·¹; die imprägniert ist mit einem üblichen TTährmedium, enthaltend geeignete Keagentien und ein Suspensionsmittel, das ein Auslaugen des imprägnierten Materials während des Eintauchens verhindert und eine Lokalisierung der gebildeten Kolonien in der Matrix ermöglicht. Es kann ein Griff und Behälter als integraler Bestandteil des Prüfmittels vorgesehen sein.

Es ist Aufgabe der vorliegendenE_rbindung, ein Prüfmittel zur Untersuchung einer Probe auf Mikroorganismen herzustellen, auf dem die Mikroorganismen gezüchtet v/erden können und das durch Eintauchen in eine flüssige Probe beimpft v/erden kann und das ein einfaches und zuverlässiges

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Prüfmittel zur Bestimmung der Konzentration von in einer Flüssigkeitsprobe enthaltenen Mikroorganismen darstellt, ohne daß die Probe abgemessen oder verdünnt werden muß und mit Hilfe dessen es möglich ist, in einer Probe die verschiedenen Mikroorganismen zu unterscheiden bzw. zu bestimmen. Dabei sollen nicht zu viele Laborgeräte benötigt werden, die gereinigt und sterilisiert werden müssen, und die Zeit zum Kachweis und zur Bestimmung der Mikroorganismen soll verhältnismäßig kurz sein, d.h. das Prüfmittel soll einfach, wirtschaftlich, leiche verfügbar und zuverlässig sein.

In der beiliegenden Zeichnung ist

Fig. 1 ein Aufriß eines erfindungs^eaäßen Prüfmittels, das sich in einem Behälter befindet;

Ji'ig. 2 ist ein vergrößerter Teilschnitt des _ \ifmittels der n'ig. 1, IaE aus äem Bc-iiäxuer entfernt ist. entlang der Linie 2- 2 der Fig. 1 und die

i'ig. 3, 4,

5 und 6 sind Aufsichten auf das Prüfmittel, die die Orte der Kolonienbildung 2

In den Zeichnungen und besonders in Fig. 1 ist das erfindungsgemäße Prüfmittel allgemein als 10 bezeichnet. Bas Prüfmittel 10 umfaßt allgemein eine absorbierende Matrix 11, die sich an einem Griff 12 befindet und in einem verschließbaren Behälter 13 eingeschlossen sein kann.

Die Matrix 11 besteht aus einem flachen saugfa:\igen Material, wie einem absorbierenden !Filterpapier- o.ä-, das mit

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einem geeigneten Nährmedium, enthaltend ein Reagens und ein Suspensionsmittel imprägniert ist. Die Matrix 11 kann durch Eintauchen in die zu untersuchende Probe beimpft werden, wobei es nicht nötig ist, die Probe abzumessen und/oder zu verdünnen. Daher muß die Matrix 11 eine bekannte konstante Absorptionskapazität besitzen, um halbqiantitative Bestimmungen durchführen zu können. So kann, wenn es bekannt ist, daß die Matrix 11 ein bestimmtes Volumen der Probe, z.B. 0,2 cnr absorbieren kann., die Konzentration der Mikroorganismen in der Probe, wie später näher erläutert wird, leicht bestimmt werden.

Es ist verständlich, daß beim Eehydratisieren der saugfähiger. Matrix 11 in einer flüssigen Probe ein spezifisches Volumen der Probe durch die Matrix 11 absorbiert w-i-rd und die in der absorbierten Probe vorhandenen Mikroorganismen ebenfalls durch die Matrix 11 absorbiert werden. Auf diese Weise wird die.Matrix 11 beimpft. Wenn die beimpfte Matrix 11, die mit einem geeigneten Hährmedium imprägniert ist, inkubiert wird, werden die Mikroorganismen gezüchtet und bilden Kolonien.

Im Rahmen dieser Beschreibung bedeutet der Ausdruck "MikroorganBmen" die allgemeine Gruppe von Mikroorganismen, umfassend Hefen, andere Pilze oder Bakterien, die in der zu untersuchenden Probe vorhanden sind. Der Ausdruck "Kolonie" bezeichnet den Mikroorganismus nach dem Züchten. Der Ausdruck "Koloniestellen" bezeichnet die Stellen einer Kolonie, wie sie auf der Matrix 11 beobachtet wird und ist im Rahmen dieser Beschreibung gleichbedeutend mit dem Ausdruck Kolonie.

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Das Nährmedium kann irgend ein übliches Medium oder eine Modifikation eines solchen Mediums sein, von dem bekannt ist, daß es eine geeignete Umgebung für die gewählte Untersuchung darstellt. Wenn eine halbquantitative Untersuchung durchgeführt werden soll, kann ein Nährmedium, wie Bacto Brain Heart Infusion der Difco Laboratories, Detroit, Michigan verwendet werden. Wenn eine Unterscheidungsuntersuchung durchgeführt werden soll, wird ein Nährmedium gewählt, von dem bekannt ist, daß es in Gegenwart einiger Mikroorganismen eine positive Reaktion ergibt, in Gegenwart anderer Mikroorganismen jedoch nicht. Beispiele für geeignete Medien für diesen Zweck sind: Ghristensen's Medium (Journal of Bacteriology, 42:461), von -dem bekannt ist, daß es mit Proteus-Arten eine positive Reaktion ergibt, aber eine negative Reaktion mit anderen gramnegativen Organismen, sowie Simmons Gitrat, von dem bekannt ist, daß es zur Züchtung von Citrat verbrauchenden Organismen, wie Arten von Klebsieila und Enterobacter geeignet ist, jedoch nicht zur Züchtung von solchen Organismen, die kein Citrat verbrauchen, wie Escherichia coli..

Das Reagens umfaßt vorzugsweise einen Indikator, der als Reaktion auf eine erfolgreiche Züchtung der Mikroorganismen eine Farbänderung in der Matrix 11 ergibt. Das Reagens kann in dem Nährmedium enthalten sein und kann einen einfachen pH-Indikator, wie Phenolrot, umfassen, das üblicherweise im Christensen's Medium enthalten ist. Dieser Indikator ändert sich von Gelb-orange nach leuchtend Rosa in Gegenwart eines Mikroorganismus, wie von Proteus-Arten, der den Harnstoff in der Zubereitung abbauen kann. Ähnlich kann das Reagens einen Reduktions-

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Oxidationsindikator umfassen, wie eine der verschiedenen Tetrazöliumverbindungen, z.B. 2,3j5-Triphenyltetrazoliumchlorid (farblos), das durch die meisten Mikroorganismen während ihres Wachstums zu einem Pormazan, z.B. Triphenylformazan (Intensiyrot) reduziert wird. Bei Herstellung der Matrix 11 zur halbquantitativen Untersuchung ist Triphenyltetrazolium als Indikator bevorzugt, da das reduzierte Produkt Triphenyltetraformazan, nicht nur eine leuchtend sichtbare Farbe ergibt, sondern auch unlöslich ist. Diese Eigenschaft zusammen mit dem später näher beschriebenen Suspensionsmittel erleichtert die Bildung getrennter und einzelner Koloniestellen.

"Die Zugabe eines Suspensionsmittels zu dem Imprägniermittel ist notwendig, um ein Auslaugen des löslichen Mediums und Reagenses aus der Matrix 11 während des Eintauchens in eine Flüssigkeitsprobe zu vermeiden und die Mikroorganismen in der Matrix 11 nach dem Beimpfen an einer Stelle festzuhalten. Die Fähigkeit des Suspensionsmittels, die Mikroorganismen an einer Stelle festzuhalten und dadurch die Bildung getrennter und einzelner Kolonien in und auf der Matrix 11 zu ermöglichen, ist besonders wichtig zur Durchführung von halbquantitativen Untersuchungen. Das Suspensionsmittel wird in der Zubereitung in Konzentrationen von ungefähr 0,1 bis ungefähr 5,0 Gew.-%, vorzugsweise ungefähr 0,5 bis ungefähr 3,0 Gew.-%, verwendet.

Das Suspensionsmittel ist in einer wäßrigen Lösung löslich und bildet eine viskose kolloidale Suspension. Suspensionsmittel, die sich für diesen Zweck entweder allein oder in Kombination miteinander als geeignet ervri.es en haben, sind

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- ίο -

Kolloide, inerte Guminen, Karrag-eene, Alginate und verschiedene Polysaccharide und Polypeptide.

Die Matrix 11 wird zunächst imprägniert und anschließend getrocknet. Da bei einer hohen Temperatur einige der Nährstoffe und Testsubstanzen, die in der Matrix 11 imprägniert sind, angegriffen werden können, hat es sich gezeigt, daß ein Trocknen der imprägnierten Matrix in einem Vakuum oder Luftstroiaofen bei ungefähr 40 bis 6 0°C innerhalb von 1 bis 3 Stunden besonders günstig ist.

Um ein bequemes integrales Prüfmittel 10 herzustellen, wird die getrocknete imprägnierte Matrix 11 an einem Halter oder Griff 12 befestigt. Der Halter 12 ist ein längliches Teil, vorzugsweise aus einem steifen unlöslichen Material, wie einem Streifen aus Polyäthylenterephthalat oder ähnlichem. Da die Matrix 11 mehr zu mikrobiologischen als zu cliejüisoiieü. Zwecken geeignet 1st, nuß besonders darauf geachtet werden, daß die Matrix 11 an dem Halter 12 mit einem mikrobiologisch inerten Klebemittel befestigt wird. Bestimmte doppelseitige· Klebebänder, wie Nr. 415 und 419 der 3H Company, Minneapolis, Minnesota, haben sich für diesen Zweck als geeignet erwiesen. Es hat sich auch gezeigt, daß die Matrix 11 leicht an dem Halter 12 durch eine Bindung befestigt werden kann, ohne daß die Matrix 11 oder das darin imprägnierte Medium oder das Reagens angegriffen, werden. Um das zu erleichtern, wird eine dünne Polyärriylenfolie 14 (Fig. 2) zwischen den Halter 12 und iie Matrix gelegt und ausreichend Wärme auf der Seite 1-Ξ des Halters 12, die der Matrix 11 abgewandt ist, angewandt, ui den Streifen zum Schmelzen zu bringen und die Matrix 11 ar. den Halter 12 zu binden.

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Die Matrix 11 (Fig. 1) und der daran "befestigte Halter werden dann in einen dicht verschließbaren Behälter 13 gegeben, sterilisiert und der Behälter 13 dicht verschlossen. Allgemein hat sich jeder übliche Behälter 13 für diesen Zweck als geeignet erwiesen, der wieder dicht verschlossen werden kann. Es hat sich gezeigt, daß eine Hülle aus Polyäthylen oder ähnlichem, die an den Seiten 17 und 18 und dem Boden 19 verschweißt ist, für diesen Zweck geeignet ist. Das obere Ende 21 des Behälters 13 oder der Hülle ist vorzugsweise mit üblichen, ineinandergreifenden Verschlußrmdern22 versehen, die nach Anwendung von Druck den Behälter 13 durch einen Reibungsverschluß dicht schließen und dadurch besondere Yerschlußvorrichtungen überflüssig machen. Der Behälter 13 ist vorzugsweise aus einem klaren, transparenten Material hergestellt, das es ermöglicht, die Matrix 11 in dem Behälter 13 visuell zu beobachten und "abzulesen", ohne daß der Beobachter oder das Laboratorium den gezüchteten Mikroorganismen ausgesetzt wird.

Bei der Verwendung wird der Behälter 13 geöffnet und der sterile Halter 12 und die Matrix 11 daraus entnommen. Die Matrix 11 wird in die zu- untersuchende Hüssigkeitsprobe, wie eine Urin-, Milch-, Wasser- oder ähnliche Probe eingetaucht, um die Matrix 11 zu rehydratisieren, und zu beimpfen. Die beimpfte Matrix 11 und der daran befestigte Halter 12 werden aseptisch wieder in den Behälter 13 gegeben, und dieser wieder verschlossen und bei der optimalen Temperatur, je nach dem vermuteten Mikroorganismus, mindestens 4 Stunden inkubiert. Die meisten Mikroorganismen werden günstigerweise bei Temperaturen von ungefähr 4· bis ungefähr 4-O⁰C und vorzugsweise von ungefähr 35 his ungefähr 39°C inkubiert. Nach der Inkubationszeit wird die

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Matrix 11 visuell beobachtet und die Ergebnisse der speziellen Untersuchung abgelesen. Wenn die Untersuchung halbquantitativ ist, wird das Auftreten von gefärbten Flecken, die Koloniestellen anzeigen, und deren Dichte beobachtet, wie später näher beschrieben wird. Wenn es sich um eine. Unterscheidungsuntersuchung handelt, wird die Farbe der Matrix beobachtet, die ein Hinweis ist für eine positive oder negative Züchtung. Wenn die Ergebnisse der Untersuchung bekannt sind, kann das Prüfungsmittel

10 steriLisiert und verworfen werden. Es hat sich jedoch gezeigt, daß die Sterilisierung die meisten in der Matrix

11 aufgrund der Züchtung der Mikroorganismen aufgetretenen Farbänderungen nicht angreift und das Prüfmittel 10 öder nur die Matrix 11, wenn gewünscht, als dauerhafter Nachweis aufbewahrt werden kann.

Es ist für den Fachmann verständlich, daß die meisten Ergebnisse der Konzentrationsuntersuchungen ausgedrückt werden in Zehnerpotenzen, um die relative Konzentration

■z
der Mikroorganismen in einem cur der Probe anzugeben.

Das ist verständlich mit Hinweis auf die Fig. 3 bis 6, wobei die Koloniestellen, wie sie auf der Matrix 11 bei verschiedenen Konzentrationen auftreten, angegeben sind. Die Koloniestellen 23a und 23b in den Fig. 3 bzw. 4- können leicht gezählt werden', während in Fig. 5 und 6 die Vielzahl der Koloniestellen 23c und 2Jd so groß ist, daü eine genaue Abzählung sehr schwierig wäre. Da die Anzahl der Koloniestellen jedoch nur relativ ist, kann die Konzentration der Mikroorganismen pro cm* visuell und leicht bestimmt werden durch einen Vergleich der Dichte der auf der Matrix 11 auftretenden Kolonien mit einer Vergleichstafel oder einem Standard.

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Zur Illustration wird angenommen, daß jede der Matrizes 11a bis 11b in den Fig. 3 bis 6 0,2 cnr einer wäßrigen Probe absorbiert. Es kann leicht bestimmt werden, daß die Anzahl und Dichte der Koloniestellen 2Ja, die in Pig. 3 erkennbar sind, anzeigt, daß vier Koloniestellen 23a in 0,2 cnr der Probe enthalten sind, was auf 20 Mikroorganismen in 1,0 cur der untersuchten Probe hinweist. Da die angegebenen Konzentrationen jedoch nur relativ sind, wird diese Menge im allgemeinen bezeichnet als 10 Mikroorganismen pro cm . Das in der Fig. 4- gezeigte Ergebnis würde ausgedrückt als 10 oder ungefähr 100 Mikroorganismen pro cm . In den Pig. 5 "und 6 ist die Anzahl der Koloniestellen 23c und 23d wesentlich vergrößert und zu diesem Zweck wird die Konzentration der Mikroorganismen in der Probe durch die Dichte der Koloniestellen bestimmt. Die Pig. 5 zeigt 10* oder ungefähr 1 000 Mikroorganismen

τ. h.

pro cnr und Pig. 6 würde ausgedrückt als 10 Mikroorganismen pro cm . Konzentrationen von mehr als 10·^ Mikroorganismen pro cm^y ^'irden auf der Matrix 11 im wesentlichen als Eigenfarbe auftreten, wobei die Matrix 11 ein einheitlich gefärbtes Aussehen bekommt*

Das erfindungsgemäße Prüfmittel wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

20,0 g Hatriumalginat wurden zu 1 1 destilliertem Wasser zugegeben und es wurde gerührt, bis sich alles gelöst hatte. Zu dieser Lösung wurde die folgende Zubereitung zugegeben.

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Kalbshirnaufguß 220 g

Kinderherzaufguß 275 g

Proteoselepton ' 11 g

Dextrose 2,2 g

Natriumchlorid 5j5 g

Dinatriumphosphat 2,75 g

Triphenyltetrazoliumchlorid 0,165 g

Polysorbat 80 0,1 cm^ (0,01%)

Die Bestandteile iirurden gründlich vermischt, bis sie in der Alginatlösung gelöst waren, wobei ein pH-Wert von 7,4- entstand.

Stücke von Filterpapier ("Schleicher und Schuell Nr. 470") wurden in die oben angegebene Lösung eingetaucht bis sie gut gesättigt waren und zwischen zwei dicht beieinander befestigten Glassüäben hindurchgezogen, um überschüssige Lösung zu entfernen und eine gleichmäßige Imprägnierung sicherzustellen. Die Stücke wurden dann 2 Stunden in einem LuftstrciEofen bei ungefähr- 55 C getrocknet. Die dehydratisierten Papierstücke wurden dann in kleine Stücke in der Größe von 1 χ 2 cm geschnitten, die gerade 0,2 cnr Flüssigkeit absorbierten.

Halter für diese Stücke wurden hergestellt, indem man Polyäthylenterephthalatfolien in Streifen von ungefähr 1 χ 6 cm zerschnitt. Um die Filterpapierstücke an dem Halter zu befestigen, wurden sie auf einen federnden Tisch gelegt und eine dünne Polyäthylenfolie 'über jedes Papierstück gelegt. Die Streifen wurden dann so auf die Folien gelegt, daß jedes Papierstück sich an einem Ende jedes Streifens befand. Eine auf ungefähr 138,7°C (280°F) er-

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hitzte Platte wurde ungefähr 5 sec lang auf die Oberseite der Streifen gebracht, um die Polyäthylenfolien zu schmelzen und die Eilterpapi3rstücke an die Streifen zu binden. Die Halter mit den daran befestigten Papierstücken wurden dann in verschließbare transparente Behälter gegeben und mit Äthylenoxid sterilisiert.

Beispiel 2 Halbquantitative Untersuchung

a) Herstellung der Proben

Es wurden Proben hergestellt durch Züchtung von Kulturen von Bscherichia. coli, Proteus mirabilis, Enterobacte:: aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Streptococcus faecalis in Hirn-Herz-Infusionsbrühen bis zu einer maximalen Trübung (1 bis 5 x 10 Zellen pro cnr). Es wurden 1Ofache Reihenverdünnungen jeder Kultur hergestellt, wobei Salzlösung als Verdünnungsmittel verwendet wurde, um Serienverdünnungen von Bakteriensusp ensionen jeder Kultur in einer theoretischen Menge von 10' bis 10' Zellen pro cnr zu erhalten.

b) Untersuchung der Proben

Zur Untersuchung jeder der oben angegebenen verdünnten Proben wurde ein Prüfmittel, wie in Beispiel 1 beschrieben, verwendet. Der Behälter wurde geöffnet und der Halter mit dem Papierstück daraus entfernt. Die sterile, dehydratisierte Matrix wurde in eine der verdünnten Proben getaucht, um die Matrix bzw. das Filterpapierstück zu beimpfen und zu rehydratisieren. Das beimpfte Filterpapier

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wurde mit dem Halter wieder in den Behälter gegeben. Der Behälter wurde verschlossen, um eine Dehydratisierung des Filterpapiers zu verhindern und ungefähr 12 Stunden in eine Inkubationskammer gegeben, die auf 37⁰C gehalten wurde. Die Platten wurden für jede der einzelnen Verdünnungen ausgezählt, um die darin enthaltenen Zellkonzentrationen festzustellen und um als Vergleich zu dienen, mit dem die auf dem Prüfmittel beobachteten Ergebnisse verglichen ·werden können.

Nach der Inkubationszeit wurden die Prüfmittel aus dem Inkubator entfernt und die Matrizes durch den transparenten Behälter beobachtet. Die Reduktion des farblosen Triphenyltetrazoliums durch die Mikroorganismen zu dem purpurfarbenen Triphenyltetraformazan war bei allen der inkubierten Papierstücke sichtbar. Bei den Stücken, die mit Proben mit einer Zellkonzentration von weniger als 1Cr Zellen pro cnr beimpft worden waren, wurden einzelne definierte purpurfarbene Stellen, die Koloniestellen anzeigten, beobachtet, deren Zahl mit der bekannten Konzentration der Testproben zunahm. Eine zusammenhängende purpurne Farbe wurde in allen Papierstücken beobachtet, die mit Proben mit einer Konzentration von 1CK Zellen pro cm oder darüber beimpft worden waren.

Beim Vergleich der Anzahl der Stellen, die auf den Papierstücken auftreten mit den Zellkonzentrationen in den Proben, zeigte es sich, da3 eine definierte und deutliche Beziehung vorhanden war. Es wurde beobachtet, daß die Dichte oder Anzahl der Stellen mit zunehmender Konzentration der Mikroorganismen in der Probe zunahm.

Wenn die Untersuchungen mit klinischen Urinproben, frischen pasteurisierten Proben von Milch (Grad A) und

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verunreinigten Milchproben durchgeführt wurden, wurden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten. Die Koloniestellen auf den Papierstücken entsprachen den Ergebnissen, die bei einer Vergleichsauszählung auf Agar-Platten erhalten wurden.

Wenn andere übliche Suspensionsmittel, wie verschiedene Alginate, inerte Polysaccharidgummen, lineare Polysaccharide Karrag-sene und niedrige Konzentrationen von Agar anstelle von Natriumalginat in der Zubereitung des Beispiels 1 verwendet wurden, wurden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten, d.h. die Kolonien waren lokalisiert und es war eine halbquantitative Bestimmung möglich.

Wenn die Untersuchungen wiederholt wurden mit einem Prüfmittel, das entsprechend Beispiel 1 hergestellt worden war, wobei jedoch kein Suspensionsmittel verwendet wurde, wurde beobachtet, daß die Papierstücke nach der Inkubation bei eilen Konzentrationen eine zusammenhängende rosa oder purpurne I'arbe besaßen. Es zeigte sich, daß so eine halbquantitative Bestimmung der verdünnten Proben nicht möglich war, wenn ke'in Suspensionsmittel vorhanden war, da die Mikroorganismen nicht an der Stelle festgehalten wurden.

Beispiel 3

Unterscheidungsuntersuchung

20 g Natriumalginat wurden zu 1 1 destilliertem Wasser zugefügt, um entsprechend dem Verfahren in Beispiel 1 eine Lösung herzustellen. Zu dieser Lösung wurde ein modifiziertes

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1,00	S
1,00	g
5,00	g
2,00	g
20,00	ε
0,12	ε
0,1	cnr

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Christensen* s Medium der folgenden Zusammensetzung zugegeben.

Pepton Glucose KaCl

EH₂PO₄

Harnstoff Phenolrot Polysorbat 80

Die Zubereitung wurde gründlich mit der Natriumalginatlösung vermischt, bis sie gelöst war. Mit dieser Lösung wurde Filterpapier (S. & S Hr. 470) entsprechend dem in Beispiel 1 angegebenen Verfahren imprägniert. Die imprägnierten Papierstücke wurden ungefähr 2 Stunden in einem Vakuumofen bei 40°C getrocknet. Die dehydratisieren imprägnierten Papiere wurden wie im Beispiel 1 beschrieben, in kleine Stücke zerschnitten, auf Haltern befestigt, in Behälter gegeben und sterilisiert.

Die Halter und die Papierstücke wurden anschließend aus den Behältern entfernt und mit allen im Beispiel 2a beschriebenen Verdünnungsproben, enthaltend Proteus mirabilis, Enterobacter aerogenes und Escherichia coli beimpft und ungefähr 12 h bei 56⁰C inkubiert. Eine zusammenhängende rosa Farbe wurde auf den Papierstücken beobachtet, die mit allen Konzentrationen der Verdünnung der Proben enthaltend Proteus mirabilis, beimpft waren. Keine Änderung trat auf bei den Papierstücken, die mit Proben, enthaltend Enterobacter aerogenes und Escherichia coli beimpft worden waren.

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Beispiel 4-Unterscheidungsuntersuchung

20 g Natriuiaalginat wurden zu 1 1 destilliertem Wasser zugegeben und entsprechend Beispiel 1 eine Lösung hergestellt. Zu dieser Lösung wurde ein modifiziertes Simmons¹· Citratmedium der folgenden Zusammensetzung zugegeben:

₄₂₄ 1,0g

NaCl 5,0 g

MgSO₄ 0,20 g

K₂HPO₄ 1,00 g

Natriumeitrat 2,00 g

BromthjOHolblau 0,80 g

Polysorbat 80 0,1 g

Diese Zubereitung wurde gründlich vermischt und in der Lösung gelöst. Mit dieser Lösung wurde Filterpapier (S & S Kr. 470) imprägniert und das Verfahren zur Herstellung von Prüfmitteln, wie im Beispiel 1 beschrieben, wurde wiederholt.

Die so hergestellten Papierstücke vnirden in allen Konzentrationen der drei zu untersuchenden Proben des Beispiels beimpft und imgexähr 12 h bei $7°0 inkubiert.

Die nit allen Konzentrationen der Testproben, enthaltend Enterobacter aerogenes beimpften Papierstücke änderten ihre Parbe von einem zusammenhängenden blassen Grün zu einem zusammenhängenden leuchtenden Blau, was das Vorhandensein von Znterobaeterarten anzeigte. Die mit den Proben,

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enthaltend Proteus mirabilis und Escherichia coli imprägnierten Papierstücke behielten ihre blaß-grüne Farbe.

Beispiel 5

Unterscheidungsuntersuchung

20,0 g eines linearen Polysaccharids (Kelzan der Kelco Laboratories, San Diego, Kalifornien) wurden zu 1 1 destilliertem Wasser gegeben, um eine Lösung herzustellen. Zu dieser Lösung wurde ein modifiziertes Levine EMB-Medium der folgenden Zusammensetzung zugegeben und gerührt,bis es gründlich gemischt und gelöst war:

Pepton 10,0 g

Lactose 10,0 g

Dikaliumphosphat 2,0 g

Eosin I 4-,Og

Methylenblau 0,650 g

Polysorbat 80 0,1 cm^

Entsprechend Beispiel 1- wurde Filterpapier (S & S Nr. 470) mit der entstehenden Lösung imprägniert und es wurden Prüfmittel hergestellt.

Die Papierstücke wurden in alle Konzentrationen der in Beispiel 3 beschriebenen Proben getaucht. Es wurde beobacht.et, daß die mit Proben, enthaltend Escherichia coli, beimpften Papierstücke einen charakteristischen grünen metallischen Glanz besaßen.; Die Prüfmittel, die mit den Proben, enthaltend Enterobacter aerogenes und Proteus mirabilis,beimpft worden waren, behielten eine dunkle violette Farbe und zeigten keinerlei Glanz.

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Obwohl die Beschreibung und die Beispiele in erster Linie

ein Prüfmittel, umfassend eine an einem Halter befestigte Matrix, das sich in einem Behälter befindet, betreffen, bezieht sich die Erfindung auch auf die Herstellung der imprägnierten Matrix allein. Z.B. können übliche Laborgeräte, wie Zangen, Pinzetten und Objektträgerhüllen anstelle des Halters 12 bzw. des Behälters 13 .verwandet werden. Die sterile dehydratisierte. Matrix kann mit der Pinzette gehalten und in die zu untersuchenden Proben getaucht und anschließend in einen Objektträgerbehälter gegeben und inkubiert werden. Die imprägnierte Matrix 11 kann gegebenenfalls auch durch Zugabe eines abgemessenen Yolumens der Probe direkt auf die Matrix rehydratisiert und beimpft werden statt durch Eintauchen, wie oben beschrieben.

Es ist für den Fachmann auch klar, daß das Prüfmittel zum Nachweis und zur Bestimmung von Mikroorganismen in anderen Proben als Flüssigkeiten verwendet werden kann. Bei einer derartigen - Anwendung wird die Matrix 11 mit sterilem Wasser oder ähnlichem rehydratisiert und durch Berührung mit der "festen" zu untersuchenden Probe beimpft.

PATENTANSPRÜCHE:

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

1) Ivüfmittel zur Untersuchung einer Probe auf Mikroorganismen, umfassend eine absorbierende Matrix, die mit einem Nährmedium imprägniert ist, enthaltend ein Reagens, die gegebenenfalls an einem Halter befestigt ist und sich gegebenenfalls in einem verschließbaren Behälter befindet, dadurch gekennzeichnet , daß es zusätzlich, ein Suspensionsmittel bzw. ein Fixiermittel enthält.

2) Prüfmittel nach Anspruch 1, dadurch gekenRzei zeichnet , daß die absorbierdende Matrix aus einem flachen saugfähigem Material besteht.

3) Prüfmittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß das saugfähige Material eine bekannte Absorbtionskapazität besitzt.

4) Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet , daß das Reagens einen Farbindikator, vorzugsweise Triphenyltetrazoliumchlorid,enthält.

5) Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß das Suspensionsmittel eine lösliche Substanz umfaßt, die in wäßriger Lösung eine viskose kolloidale Suspension bildet.

6) Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 5, dadurch g e k e η η zeichne.t , daß das Suspensionsmittel ein Kolloid, Karrageen, inerter Gummi, Polysaccharid und/oder Alginat ist.

7) Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 6, dadurch ge— -2]

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kennzeichnet , daß das Suspensionsmittel Natriumalginat oder ein lineares Polysaccharid

8) Prüfmittel nach Anspruch A bis 7, dadurch gekennzeichnet _} daß der Behälter transparent ist und/oder einen ineinandergreifenden Verschluß besitzt.

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