DE1673307B1

DE1673307B1 - Teststreifen aus saugfaehigem Material zur schnellen Erkennung fuer von Mikroorganismen gebildetem Acetylmethylcarbinol

Info

Publication number: DE1673307B1
Application number: DE1966W0040751
Authority: DE
Inventors: Heller Charles Irwin; Evans George Leonard; Schwartz Benjamin Sam
Original assignee: Warner Lambert Pharmaceutical Co
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 1965-01-22
Filing date: 1966-01-19
Publication date: 1972-02-03
Also published as: GB1086791A; US3341427A; DK118486B; DE1673307C2

Description

System von 7 g Pepton, 5 g Dextrose und 5 g K₂HPO₄ zuziehen vermag, beispielsweise Filterpapier, Filz, oder von 7 g Polypepton, 5 g Dextrose und 5 g poröse Keramikstreifen, gewebte oder verfilzte Glas-Kaliumphosphat, bestehen. Diese Nährmedien, von fasern u. dgl.

denen das erstere bevorzugt wird, weisen einen hohen Das saugfähige Material wird normalerweise in

Glukoseanteil auf, da eine optimale Reaktion (nur) 5 schmale Streifen zerschnitten, damit es sich leichter

dann stattfindet, wenn das Stoffwechselprodukt der in kleine Flaschen oder sonstige Behälter verpacken

Glukose, Acetylmethylcarbinol, im Reaktionsmedium und bei Bedarf daraus entnehmen läßt,
reichlich vorhanden ist. Beim praktischen Gebrauch bringt man das mit

Als Argininsalz verwendet man vorzugsweise das dem Kulturmedium imprägnierte Teststreifenende mit

Monohydrochlorid, kann aber auch dessen Di- oder io einer Suspension einer in einem Teströhrchen ent-

Trihydrochlorid oder andere saure Salze, wie z. B. haltenen Reinkultur des unbekannten Bakteriums

das Nitrat, benutzen. in Kontakt und unterwirft dann Röhrchen und

An Stelle des bevorzugten Natriumsalzes der Brenz- Streifen einer 4- bis 5stündigen, gemeinsamen Inku-

traubensäure kann man auch deren Lithiumsalz oder bation bei 37 C Die Bakteriensuspension braucht für

andere Salze verwenden. 15 diesen Test nicht auf einem Spezialmedium gewachsen

Bezüglich der 1-Naphtholsulfonsäure arbeitet man oder langzeitig inkubiert zu sein, wenngleich auch

vorzugsweise mit dem Natriumsalz der 1-Naphthol- in glukosereichem Medium, wie etwa Gehirn-Herz-

8-sulfonsäure. Man kann aber auch Salze anderer Infusionsagar, gewachsene Zellen reaktionsfreudiger

Sulfonsäuren, wie etwa sind. Nach erfolgter Inkubation wird der Streifen

20 herausgenommen, und in das Röhrchen werden

Natrium-l-naphthol-5-sulfonat, einige Tropfen 40%iger Alkalihydroxidlösung ein-

Kalium-l-naphthol-2-sulfonat, gegeben. Dann steckt man den Streifen erneut, und

Dinatrium-l-naphthol-3,6-disulfonat, _zwar so tief in das Röhrchen hinein, daß seine Rea-

Natrium-l-naphthol-4-sulfonat, genzienzone mit der alkalibehandelten Suspension

benutzen. 25 in Kontakt kommt.

Die die Nährmedium- und Reagenzienzone tren- Man kann statt dessen die Entwicklung der Färbung

nende hydrophobe Sperrsubstanz besteht beispiels- auch so durchführen, daß man nach erfolgter Inku-

weise aus einem Lack. bation einige Tropfen der Alkalihydroxidlösung in

Wie in der Zeichnung schematisch dargestellt ist, das Teströhrchen eingibt, ohne dabei die Reaktions-

enthält der aus saugfähigem Material bestehende 30 zone des Teststreifens zu befeuchten. Nach vorsich-

Teststreifen gemäß der Erfindung an seinem einen tigern Durchmischen des ganzen Systems läßt man

Ende eine mit einer wäßrigen Lösung eines Nähr- die Reaktionszone mit der Suspension in Kontakt

mediums imprägnierte Nährmediumzone. Um ein kommen. Das Vorliegen von AMC äußert sich in

Wandern des Nährmediums aus der Nährmedium- einer Purpurrot-Kirschrot-Färbung, die insbesondere

zone zu verhindern, ist neben der Nährmediumzone 35 in der Auswanderungszone ziemlich ausgeprägt ist

eine Sperrzone aus einem hydrophoben Material, und nach etwa 5 bis 30 Minuten erscheint.
z. B. einem Lack oder einem handelsüblichen Chrom- Die besonderen Vorteile von Teststreifen gemäß

komplex der Formel der Erfindung liegen in ihrer leichten Handhabung

sowie ihrer im Vergleich zu üblichen Diagnosever-

40 fahren weit kürzeren Inkubationszeit und weit größe-

C17H35 _ren Empfindlichkeit.

I Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher

,C veranschaulichen.

0 O ₄₅ Beispiel

1 I A. Reagenzienlösung

QjCt CrCl₂ Man löst 2,65 g L-Arginin in etwa 100 ml Wasser

\ / und setzt der Lösung unter Umrühren 3,3 g Natrium-

I l-naphthol-8-sulfonat zu.

H ⁵° B. Nährmedium

Man löst unter schwachem Erwärmen 7 g wasserangeordnet, freies Pepton, 5 g wasserfreie Dextrose, 5 g wasser-

Auf der anderen Seite der Sperrzone wird durch freies K₂HPO₁, 15 g Natriumpyruvat und 37,5 g Applizieren einer Lösung von z. B. 2 bis 3 Gewichts- 55 D-Glukose in 150 ml destilliertem Wasser rückstandsprozent L-Argininmonohydrochlorid und etwa 3 bis los auf.

4 Gewichtsprozent Natrium-l-naphthol-8-sulfonat in _c Herstellung des Teststreifens

destilliertem Wasser die Reagenzienzone ausgebildet.

Vorzugsweise beträgt in einer solchen Reagenzien- Zunächst werden auf das saugfähige Material zwei

zone das Gewichtsverhältnis Argininsalz zu Naphthol- 60 Sperrzonen aufgebracht, die das Auswandern der sulfonsäuresalz etwa 1,0 zu etwa 1,2. Jenseits der anschließend aufzubringenden, wäßrigen Lösungen Reagenzienzone kann noch, wie aus der Figur her- verhindern sollen. Diese Sperrzonen werden beispielsvorgeht, ene weitere Sperrzone vorgesehen sein, um weise auf einem handelsüblichen Filtrierpapier durch ein zu starkes Auswandern der Reagenzien bzw. bei Aufstreichen einer Lacklösimg (z. B. auf die in der positivem Test eine zu starke Diffusion der Farbzone 65 Zeichnung angegebenen Stellen), die einen wasserzu verhindern. undurchlässigen, filmbildenden Überzug ergibt, her-

AIs saugfähiges Material ist jedes Material geeignet, gestellt. Nachdem die Lackschichten getrocknet sind, das durch Kapillarwirkung eine Flüssigkeit hoch- werden die in der geschilderten Weise hergestellten

Lösungen A und B (auf die aus der Zeichnung ersichtlichen Stellen des streifenförmigen Materials) appliziert und trocknen gelassen.

D. Benutzung des Teststreifens

Eine oder zwei Ösen eines zu identifizierenden Bakteriums, das man vorher auf schrägem Agarnährmedium wachsen ließ, werden in 0,4 ml isotonischer Salzlösung suspendiert. In das diese Suspension enthaltende Röhrchen taucht man einen in der geschilderten Weise hergestellten Teststreifen so weit ein, daß seine untere oder Nährmediumzone in die Suspension eintaucht: Teststreifen nebst Bakteriumsuspension werden dann etwa 4 bis 5 Stunden lang bei 37° C inkubiert. Nach der Inkubationsperiode wird der Papierstreifen herausgenommen, worauf in das Teströhrchen 2 Tropfen einer 40gewichtsprozentigen wäßrigen Kaliumhydroxidlösung eingebracht werden. Dann wird die alkalisch gemachte Bakteriumsuspension mit der Reagenzienzone des Teststreifens in Berührung gebracht. Statt dessen kann man den Teststreifen auch nach erfolgter Inkubation im Röhrchen belassen und bei der tropfenweisen Zugabe

ίο der Kaliumhydroxidlösung dafür sorgen, daß die Reagenzierizone unbefeuchtet bleibt. Dann schüttelt man das Röhrchen vorsichtig und läßt danach die Reagenzienzone mit der Suspension in Berührung kommen. Die Bildung von AMC äußert sich in der Ausbildung einer Rosa- bis Rotfärbung.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

1 2 hierbei im Laufe von 30 Minuten bis 4 Stunden zu Patentansprüche: einer Rosa- oder Rotfärbung. Eine weitere bekannte Modifikation ist das von

1. Teststreifen aus saugfähigem Material zur M. A. de Guzman, B. C. und A. J. Weil in schnellen Erkennung für von Mikroorganismen 5 »J. Bact«, 87 (1964), S. 234,235, beschriebene Bengebildetem Acetylmethylcarbinol, dadurchge- jaminson- Verfahren. Bei diesem Verfahren werden auf kennzeichnet, daß das saugfähige Material schief stehendem »Triple-Zucker-Eisen« (TZE)- Agarmit einer Nährmediumzone, die ein Pepton oder Nährboden gewachsene Isolate in 0,5 ml 0,5°/₀iger Polypepton, Dextrose und Kaliumphosphat, d-Glu- wäßriger Kreatininlösung suspendiert und dann mit kose und ein Brenztraubensäuresalz enthält, ferner io 1-Naphthol und 40°/₀iger Kalilauge versetzt. Eine mit einer Reagenzienzone, die ein saures Salz im Laufe von 5 Minuten auftretende Rosa- oder des L-Arginins und ein 1-Naphtholsulfonat ent- Rotfärbung deutet auf die Anwesenheit von AMC hin. hält, und mit einer die beiden vorstehend genann- Beide Bestimmungsverfahren sind jedoch mit zahlten Zonen trennenden hydrophoben Sperrzone reichen Nachteilen behaftet. Beim Barritt-Verfahren imprägniert ist. 15 hängt die Inkubationszeit vom Reagenzienvolumen

2. Teststreifen nach Anspruch 1, dadurch ge- ab und ist daher kritisch. Außerdem müssen zunächst kennzeichnet, daß die Nährmediumzone ein ge- in Spezialmedien Reinkulturen gezüchtet werden, pufferies System, das aus 7 g Pepton, 5 g Dextrose worauf erst die eigentliche Isolierung der erhaltenen und 5 g K₂HPO₄ besteht, d-Glukose und Natrium- Kultur stattfindet. Beim Benjaminson-Verfahren könpyruvat und die Reagenzienzone L-Argininmono- ao nen andererseits die Organismen nur dann direkt hydrochlorid und Natrium-l-naphthol-8-sulfonat von dem geneigten TZE-Agar-Nährboden entnomenthält. men werden, wenn sich Säure gebildet hat. Die Ver-

3. Teststreifen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch Wendung von Organismen von einem geneigten TZE-gekennzeichnet, daß er an der der Sperrzone Nährboden ist deshalb als vorteilhaft anzusehen, gegenüberliegenden Seite der Reagenzienzone eine 25 weil man sich dieses Mediums üblicherweise beim weitere hydrophobe Sperrzone aufweist. Trennungsgang für Enterobacteriaceen bedient. Wenn

4. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, sich jedoch auf diesem Nährboden keine Säure dadurch gekennzeichnet, daß die Nährmedium- gebildet hat, wird die Untersuchung auf diese Nichtzone etwa 5 bis etwa 25 Gewichtsteile eines ge- Lactose-Bildner unpraktisch. Infolgedessen ist dieser pufferten Systems, das aus 7 g Pepton, 5 g Dex- 30 Test in der Praxis auf die Aerobacter-Klebsiellatrose und 5 g K₂HPO₄ besteht, 5 bis etwa 25 Ge- Gruppe unter Ausschluß anderer AMC-Bildner bewichtsteile Natriumpyruvat und etwa 25 Gewichts- schränkt. Bei allen bakteriellen Infektionen kommt teile d-Glukose und die Reagenzienzone etwa es entscheidend auf die schnelle und genaue Identi-1 bis 5 Gewichtsteile Natrium-l-naphthol-8-sulfo- fizierung des infizierenden Mikroorganismus an, damit nat und an Stelle eines sauren Salzes des L-Argi- 35 sofort mit der richtigen Therapie begonnen werden nins 1 Gewichtsteil L-Arginin enthält. kann. Daher sind die geschilderten Diagnoseverfahren

offensichtlich unbrauchbar, wenn es auf eine schnelle Diagnose ankommt. Darüber hinaus wird die Eignung

der geschilderten Diagnoseverfahren zu schneller

40 Identifizierung auch dadurch beeinträchtigt, daß man verschiedene Speziaireagenzien herstellen muß.

Die Bildung und anschließende Erkennung von Der Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, Acetylmethylcarbinol (AMC) aus Glykolyseprodukten eine Möglichkeit zur schnellen Erkennung von durch gewisser Enterobacteriaceen-Vertreter bildet die Grund- Mikroorganismen gebildetem Acetylmethylcarbinol, lage des Voges-Proskauer- oder V-P-Tests. Dieser 45 d. h. ein Mittel zur raschen Unterscheidung von Test stellt ein bekanntes Laboratoriums-Diagnose- AMC-Bildnern von Nicht-AMC-Bildnern, zu schaffen, verfahren zur Unterscheidung und Identifizierung Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß dor verschiedenen, zu dieser Gruppe gehörenden sich die gestellte Aufgabe mit einem Teststreifen Organismen dar. Beispielsweise erzeugen zwei Orga- aus saugfähigem Material lösen läßt, welcher dadurch nismen dieser coliartigen Gruppe, nämlich Aero- 50 gekennzeichnet ist, daß das saugfähige Material mit bacter und Klebsiella, Acetylmethylcarbinol und einer Nährmediumzone, die ein Pepton oder Polylassen sich dadurch von den nicht Acetylmethyl- pepton, Dextrose und Kaliumphosphat, d-Glukose carbinol produzierenden Escherichia coli und Esche- und ein Brenztraubensäuresalz enthält, ferner mit richia freundii, unterscheiden. Die Durchführung einer Reagenzienzone, die ein saures Salz des L-Argidieses klassischen Tests oder seiner moderneren Ab- 55 nins und ein 1-Naphtholsulfonat enthält, und mit Wandlungen erfordern jedoch Inkubationszeiten, die einer die beiden vorstehend genannten Zonen trenzur Schnellidentifizierung dieser Organismen zu lang nenden hydrophoben Sperrzone imprägniert ist.
sind. Die besonders gut haltbaren Teststreifen gemäß

Ein bevorzugtes Erkennungsverfahren für AMC der Erfindung enthalten, mit Ausnahme des Alkaliist beispielsweise das in »J. Path.«, 42 (1936), S. 441 60 hydroxide, sämtliche Reagenzien für den V-P-Test bis 454, beschriebene Barritt-Verfahren. Hierbei wird zweckmäßigerweise in einer Menge, bezogen auf das der z. B. aus Stuhl, Blut oder Urin in Reinkultur Gewicht des Nährmediums, von 5 bis 25°/₀- Die isolierte, unbekannte Organismus 48 Stunden lang Glukosemenge soll hierbei zwecks Erzielung optiin einer Glukose-Pepton-Phosphatpuffer-Brühe wach- maler Ergebnisse vorzugsweise etwa 25 Gewichtssen gelassen, worauf 1 ml dieses Mediums mit 0,6 ml 65 prozent betragen.

5%iger 1-Naphthollösung in Alkohol und 0,2 ml Das zum Imprägnieren des saugfähigen Materials

40%iger Kalilauge versetzt wird. Sofern durch den dienende Nährmedium kann aus einem handels-Mikroorganismus AMC gebildet wurde, kommt es üblichen Nährmedium, z. B. aus einem gepufferten