DE2212573B2 - Prüfmittel zur halbquantitativen Bestimmung oder Unterscheidungsuntersuchung der in einer Flüssigkeit enthaltenen Mikroorganismen - Google Patents

Description

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oder Unterscheidungsuntersuchung der in einer Flüs- um halbquantitative Bestimmungen durchführen zu

sigkeit enthaltenen Mikroorganismen, bestehend aus können. So kann, wenn es bekannt ist, daß die Ma-

einer absorbierenden Matrix, die mit einem Nähr- trix 11 ein bestimmtes Volumen der Probe, z. B.

medium imprägniert ist, welches ein Testreagens ent- 0,2 cm³, absorbieren kann, die Konzentration der

hält, wobei die Matrix gegebenenfalls an einem Hai- 5 Mikroorganismen in der Probe, wie später näher

ter befestigt ist und sich gegebenenfalls in einem erläutert wird, leicht bestimmt werden,

verschließbaren Behälter befindet, das dadurch ge- Es ist verständlich, daß beim Rehydratisieren der

kennzeichnet ist, daß es zusätzlich ein eine Loka'ti- saugfähigen Matrix 11 in einer flüssigen Probe ein

sierung der gebildeten Kolonien in der Matrix er- spezifisches Volumen der Probe durch die Matrix 11

möglichendes Fixiermittel in Konzentrationen von io absorbiert wird und die in der absorbierten Probe

ungefähr 0,1 bis ungefähr 5,0 Gewichtsprozent ent- vorhandenen Mikroorganismen ebenfalls durch die

hält. Matrix 11 absorbiert werden. Auf diese Weise wird

Das erfindungsgemäße Prüfmittel kann in einem die Matrix 11 beimpft. Wenn die beimpfte Matrix

verschließbaren Behälter inkubiert werden. Das Ma- 11, die mit einem geeigneten Nährmedium imprä-

trixmaterial ist am besten Filterpapier. Es kann ein 15 gniert ist, inkubiert wird, werden die Mikroorganis-

Griff und Behälter als integraler Bestandteil des Prüf- men gezüchtet und bilden Kolonien,

mittels vorgesehen sein. Im Rahmen dieser Beschreibung bedeutet der

Durch das Suspensionsmittel werden ein Aus- Ausdruck »Mikroorganismen« die allgemeine Gruppe laugen des imprägnierten Materials während des Ein- von Mikroorganismen, umfassend Hefen, andere tauchens verhindert und eine Lokalisierung der ge- »ο Pilze oder Bakterien, die in der zu untersuchenden bildeten Kolonien in der Matrix und damit ein Aus- Probe vorhanden sind. Der Ausdruck »Kolonie« bezählen der Kolonien ermöglicht. zeichnet den Mikroorganismus nach dem Züchten.

Bei der Anwendung wird die imprägnierte Ma- Der Ausdruck »Koloniestellen« bezeichnet die Stel-

trix kurz in die Flüssigkeit eingetaucht oder auf an- len einer Kolonie, wie sie auf der Matrix 11 beob-

dere Weise mit ihr gesättigt, um die Matrix, die ein as achtet wird und ist im Rahmen dieser Beschreibung

bekanntes Volumen der Probe absorbiert, zu be- gleichbedeutend mit dem Ausdruck Kolonie,

impfen. Je nach dem verwendeten Nährmedium und Das Nährmedium kann irgendein übliches Me-

dem Reagens kann eine halbquantitative oder Unter- dium oder eine Modifikation eines solchen Mediums

Scheidungsuntersuchung durchgeführt werden. Ahn- sein, von dem bekannt ist, daß es eine geeignete Um-

lich kann eine Anzahl von Prüfmitteln, von denen 30 gebung für die gewählte Untersuchung darstellt,

jedes ein unterschiedliches Medium und Reagens ent- Wenn eine Untersoheidungsuntersuchung durchge-

hält, beimpft werden, und es können sowohl halb- führt werden soll, wird ein Nährmedium gewählt,

quantitative als auch Unterscheidungsuntersuchun- von dem bekannt ist, daß es in Gegenwart einiger

gen gleichzeitig durchgeführt werden. Es hat sich Mikroorganismen eine positive Reaktion ergibt, in

außerdem gezeigt, daß zuverlässige Ergebnisse bei 35 Gegenwart anderer Mikroorganismen jedoch nicht,

halbquantitativen oder Unterscheidungsuntersuchun- Beispiele für geeignete Medien für diesen Zweck

gen in weniger als 12 Stunden erhalten werden sind: Christensen's Medium (Journal of Bacteriology,

können. 42:461), von dem bekannt ist, daß es mit Proteus-

Duroh das direkte Beimpfen mit der nicht ver- Arten eine positive Reaktion ergibt, aber eine nega-

dünnten Probe erhält das Kulturmedium im wesent- 40 tive Reaktion mit anderen gramnegativen Organis-

lichen die gleiche Umgebung wie die Probe, und da- men, sowie Simmons Citrat, von dem bekannt ist,

durch wird die Zeit herabgesetzt, die normalerweise daß es zur Züchtung von Citrat verbrauchenden Or-

erforderlich ist, um die Mikroorganismen an eine ganismen, wie Arten von Klebsiella und Enterobac-

neue, wenn auch geeignete Umgebung anzupassen, ter geeignet ist, jedoch nicht zur Züchtung von sol-

und ihr Wachstum wird beschleunigt. 45 chen Organismen, die kein Citrat verbrauchen, wie

In der Zeichnung ist Escherichia coli.

Fig. 1 ein Aufriß eines erfindungsgemäßen Prüf- Das Reagens umfaßt am besten einen Indikator,

mittels, das sich in einem Behälter befindet; der als Reaktion auf eine erfolgreiche Züchtung der

F i g. 2 ist ein vergrößerter Teilschnitt des Prüf- Mikroorganismen eine Farbänderung in der Matrix

mittels der Fig. 1, das aus dem Behälter entfernt ist, 50 11 ergibt. Das Reagens kann in dem Nährmedium

entlang der Linie 2-2 der Fig. 1, und die enthalten sein und kann einen einfachen pH-Indi-

Fig. 3, 4, 5 und 6 sind Aufsichten auf das Prüf- kator, wie Phenolrot, umfassen, das üblicherweise im

mittel, die die Orte der Koloniebildung zeigen. Christensen's Medium enthalten ist. Dieser Indika-

In den Zeichnungen und besonders in F i g. 1 ist tor ändert sich von gelborange nach leuchtendrosa das erfindungsgemäße Prüfmittel allgemein als 10 55 in Gegenwart eines Mikroorganismus, wie von Probezeichnet. Das Prüfmittel 10 umfaßt allgemein eine teus-Arten, der den Harnstoff in der Zubereitung ababsorbierende Matrix 11, die sich an einem Griff 12 bauen kann. Ähnlich kann das Reagens einen Rebefindet und in einem verschließbaren Behälter 13 duktions-Oxidationsindikator umfassen, wie eine eingeschlossen sein kann. der verschiedenen Tetrazoliumverbindungen, z. B.

Die Matrix 11 besteht aus einem flachen saug- 60 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (farblos), das fähigen Material, wie einem absorbierenden Filter- durch die meisten Mikroorganismen während ihres papier od. ä., das mit einem geeigneten Nährmedium, Wachstums zu einem Formazan, z. B. Triphenylenthaltend ein Reagens und ein Suspensionsmittel, formazan (intensivrot) reduziert wird. Bei Herstelimprägniert ist. Die Matrix 11 kann durch Eintau- lung der Matrix 11 zur halbquantitativen Unterchen in die zu untersuchende Probe beimpft werden, 65 suchung wird am günstigsten Triphenyltetrazolium wobei es nicht nötig ist, die Probe abzumessen und/ als Indikator eingesetzt, da das reduzierte Produkt oder zu verdünnen. Daher muß die Matrix 11 eine Triphenyltetraformazan nicht nur eine leuchtend bekannte konstante Absorptionskapazität besitzen, sichtbare Farbe ergibt, sondern auch unlöslich ist.

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Diese Eigenschaft zusammen mit dem später näher von Druck den Behälter 13 durch einen Reibungs-

beschriebenen Suspensionsmittel erleichtert die BiI- Verschluß dicht schließen und dadurch besondere

dung getrennter und einzelner Koloniestellen. Verschlußvorrichtungen überflüssig machen. Der Be-

Die Zugabe eines Suspensionsmittels zu dem Im- hälter 13 ist am günstigsten aus einem klaren, trans-

prägniermittel ist notwendig, um ein Auslaugen des 5 parenten Material hergestellt, das es ermöglicht, die

löslichen Mediums und Reagenses aus der Matrix 11 Matrix 11 in dem Behälter 13 visuell zu beobachten

während des Eintauchens in eine Flüssigkeitsprobe und »abzulesen«, ohne daß der Beobachter oder

zu vermeiden und die Mikroorganismen in der Ma- das Laboratorium den gezüchteten Mikroorganis-

trix 11 nach dem Beimpfen an einer Stelle festzu- men ausgesetzt wird.

halten. Die Fähigkeit des Suspensionsmittels, die io Bei der Verwendung wird der Behälter 13 geöff-

Mikroorganismen an einer Stelle festzuhalten und net und der sterile Halter 12 und die Matrix 11 dar-

dadurch die Bildung getrennter und einzelner KoIo- aus entnommen. Die Matrix 11 wird in die zu unter-

nien in und auf der Matrix 11 zu ermöglichen, ist suchende Flüssigkeitsprobe, wie eine Urin-, Milch-,

besonders wichtig zur Durchführung von halbquan- Wasser- od. ä. Probe eingetaucht, um die Matrix 11

titativen Untersuchungen. Das Suspensionsmittel wird 15 zu rehydratisieren und zu beimpfen. Die beimpfte

in der Zubereitung in Konzentrationen von ungefähr Matrix 11 und der daran befestigte Halter 12 wer-

0,1 bis ungefähr 5,0 Gewichtsprozent, am besten den aseptisch wieder in den Behälter 13 gegeben,

ungefähr 0,5 bis ungefähr 3,0 Gewichtsprozent, ver- und dieser wieder verschlossen und bei der optimalen

wendet. Temperatur, je nach dem vermuteten Mikroorganis-

Das Suspensionsmittel ist in einer wäßrigen Lö- 20 mus, mindestens 4 Stunden inkubiert. Nach der Insung löslich und bildet eine viskose kolloidale Sus- kubationszeit wird die Matrix 11 visuell beobachtet pension. Suspensionsmittel, die sich für diesen Zweck und die Ergebnisse der speziellen Untersuchung abentweder allein oder in Kombination miteinander als gelesen. Wenn die Untersuchung halbquantitativ ist, geeignet erwiesen haben, sind Kolloide, inerte Gum- wird das Auftreten von gefärbten Flecken, die Körnen, Karrag-eene, Alginate und verschiedene Poly- 25 loniestellen anzeigen, und deren Dichte beobachtet, saccharide und Polypeptide. wie später näher beschrieben wird. Wenn es sich

Die Matrix 11 wird zunächst imprägniert und an- um eine Unterscheidungsuntersuchung handelt, wird

schließend getrocknet. Da bei einer hohen Tempera- die Farbe der Matrix beobachtet, die ein Hinweis ist

tür einige der Nährstoffe und Testsubstanzen, die in für eine positive oder negative Züchtung. Wenn die

der Matrix 11 imprägniert sind, angegriffen werden 30 Ergebnisse der Untersuchung bekannt sind, kann

können, hat es sich gezeigt, daß ein Trocknen der das Prüfungsmittel 10 sterilisiert und verworfen wer-

imprägnierten Matrix in einem Vakuum oder Luft- den. Es hat sich jedoch gezeigt, daß die Sterilisierung

stromofen bei ungefähr 40 bis 6O⁰C innerhalb von die meisten in der Matrix 11 auf Grund der Züch-

I bis 3 Stunden besonders günstig ist. tung der Mikroorganismen aufgetretenen Farbände-Um ein bequemes integrales Prüfmittel 10 herzu- 35 rungen nicht angreift und das Prüfmittel 10 oder nur

stellen, wird die getrocknete imprägnierte Matrix 11 die Matrix 11, wenn gewünscht, als dauerhafter

an einem Halter oder Griff 12 befestigt. Der Halter Nachweis aufbewahrt werden kann.

12 ist ein längliches Teil, am günstigsten aus einem Es ist für den Fachmann verständlich, daß die

steifen unlöslichen Material, wie einem Streifen aus meisten Ergebnisse der Konzentrationsuntersuchun-

Polyäthylenterephthalat od. ä. Da die Matrix 11 40 gen ausgedrückt werden in Zehnerpotenzen, um die

mehr zu mikrobiologischen als zu chemischen Zwek- relative Konzentration der Mikroorganismen in

ken geeignet ist, muß besonders darauf geachtet einem cm³ der Probe anzugeben. Das ist verständlich

werden, daß die Matrix 11 an dem Halter 12 mit mit Hinweis auf die F i g. 3 bis 6, wobei die KoIo-

einem mikrobiologisch inerten Klebemittel befestigt niestellen, wie sie auf der Matrix 11 bei verschiede-

wird. Bestimmte doppelseitige Klebebänder haben 45 nen Konzentrationen auftreten, angegeben sind. Die

sich für diesen Zweck als geeignet erwiesen. Es hat Koloniestellen 23 α und 23 b in den F i g. 3 bzw. 4

sich auch gezeigt, daß die Matrix 11 leicht an dem können leicht gezählt werden, während in F i g. 5

Halter 12 durch eine Bindung befestigt werden kann, und 6 die Vielzahl der Koloniestellen 23 c und 23 d

ohne daß die Matrix 11 oder das darin imprägnierte so groß ist, daß eine genaue Abzählung sehr schwie-

Medium oder das Reagens angegriffen werden. Um 50 rig wäre. Da die Anzahl der Koloniestellen jedoch

das zu erleichtern, wird eine dünne Polyäthylenfolie nur relativ ist, kann die Konzentration der Mikro-

14 (F i g. 2) zwischen den Halter 12 und die Matrix Organismen pro cm³ visuell und leicht bestimmt wer-

II gelegt und ausreichend Wärme auf der Seite 16 den durch einen Vergleich der Dichte der auf der des Halters 12, die der Matrix 11 abgewandt ist, an- Matrix 11 auftretenden Kolonien mit einer Vergewandt, um den Streifen zum Schmelzen zu bringen 55 gleichstafel oder einem Standard.

und die Matrix 11 an den Halter 12 zu binden. Zur Illustration wird angenommen, daß jede der Die Matrix 11 (F i g. 1) und der daran befestigte Matrizes 11a und 11 b in den F i g. 3 bis 60,2 cm³ Halter 12 werden dann in einen dicht verschließbaren einer wäßrigen Probe absorbiert. Es kann leicht beBehälter 13 gegeben, sterilisiert und der Behälter 13 stimmt werden, daß die Anzahl und Dichte der Kodicht verschlossen. Allgemein hat sich jeder übliche 60 loniestellen 23a, die in Fig. 3 erkennbar sind, anBehälter 13 für diesen Zweck als geeignet erwiesen, zeigen, daß vier Koloniestellen 23 a in 0,2 cm³ der der wieder dicht verschlossen werden kann. Es hat Probe enthalten sind, was auf 20 Mikroorganismen sich gezeigt, daß eine Hülle aus Polyäthylen od. ä., in 1,0 cm³ der untersuchten Probe hinweist. Da die die an den Seiten 17 und 18 und dem Boden 19 ver- angegebenen Konzentrationen jedoch nur relativ sind, schweißt ist, für diesen Zweck geeignet ist. Das 65 wird diese Menge im allgemeinen bezeichnet als obere Ende 21 des Behälters 13 oder der Hülle ist 10¹ Mikroorganismen pro cm³. Das in der F i g. 4 am besten mit üblichen, ineinandergreifenden Ver- gezeigte Ergebnis würde ausgedrückt als 10- oder schlußrändern 22 versehen, die nach Anwendung ungefähr 100 Mikroorganismen pro cm³. In den

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Fig. 5 und 6 ist die Anzahl der Koloniestellen 23c Trübung (1 bis 5 · 10⁹ Zellen pro cm³). Es wurden und 23 d wesentlich vergrößert, und zu diesem Zweck lOfache Reihenverdünnungen jeder Kultur hergewird die Konzentration der Mikroorganismen in der stellt, wobei Salzlösung als Verdünnungsmittel verProbe durch die Dichte der Koloniestellen bestimmt. wendet wurde, um Serienverdünnungen von Bak-Die Fig. 5 zeigt 10³ oder ungefähr 1000 Mikro- 5 teriensuspensionen jeder Kultur in einer theoretischen Organismen pro cm³, und F i g. 6 würde ausgedrückt Menge von 10¹ bis 10⁷ Zellen pro cm³ zu erhalten,
als 10⁴ Mikroorganismen pro cm³. Konzentrationen .

von mehr als KP Mikroorganismen pro cm³ würden ^b) Untersuchung der Proben

auf der Matrix 11 im wesentlichen als Eigenfarbe Zur Untersuchung jeder der oben angegebenen

auftreten, wobei die Matrix 11 ein einheitlich gefärb- io verdünnten Proben wurde ein Prüfmittel, wie im

tes Aussehen bekommt. Beispiel 1 beschrieben, verwendet. Der Behälter

Das erfindungsgemäße Prüfmittel wird durch die wurde geöffnet und der Halter mit dem Papierstück

folgenden Beispiele näher erläutert. daraus entfernt. Die sterile, dehydratisierte Matrix

. -I₁ wurde in eine der verdünnten Proben getaucht, um

B e ι s ρ ι e 1 1 15 die Matrix bzw. das Filterpapierstück zu beimpfen

20,0 g Natriumalginat wurden zu 11 destilliertem und zu rehydratisieren. Das beimpfte Filterpapier

Wasser zugegeben, und es wurde gerührt, bis sich wurde mit dem Halter wieder in den Behälter gege-

alles gelöst hatte. Zu dieser Lösung wurde die fol- ben. Der Behälter wurde verschlossen, um eine De-

gende Zubereitung zugegeben. hydratisierung des Filterpapiers zu verhindern und

Kalbshirnaufguß 220 g ^{ao un}§^ef^hr }^{2 St} _f ^un^ ⁱⁿ /™ Inkubationskammer

Rinderherzaufguß 275 g gegeben die auf 37° C gehalten wurde. Die Platten

Pepton 11 ε wurden fur jede der einzelnen Verdünnungen ausDextrose 22e gezählt, um die darin enthaltenen Zellkonzentratio-

Natriumchlorid 5 5 2 ^{nen festzustellen} und um als Vergleich zu dienen,

Dinatriumphosphat '.'.'.'.'.Υ. 2/75 g *^{5 mit dem} f \^{auf dein p}™^fmittel beobachteten Ergeb-

Triphenyltetrazoliumchlorid 0,165 g nisse verglichen werden können.

Polyoxiäthylensorbitan- Nach der Inkubationszeit wurden die Prufmittel

monooleat . 0,1 cm³ (0,01 »/0) ^{aus dem} Inkubator entfernt und die Matrizes durch

den transparenten Behälter beobachtet. Die Reduk-

Die Bestandteile wurden gründlich vermischt, bis 30 tion des farblosen Triphenyltetrazoliums durch die sie in der Alginatlösung gelöst waren, wobei ein Mikroorganismen zu dem purpurfarbenen TriphenylpH-Wert von 7,4 entstand. tetraformazan war bei allen der inkubierten Papier-Stücke von Filterpapier wurden in die oben an- stücke sichtbar. Bei den Stücken, die mit Proben gegebene Lösung eingetaucht, bis sie gut gesättigt mit einer Zellkonzentration von weniger als 10⁵ waren und zwischen zwei dicht beieinander befestig- 35 Zellen pro cm³ beimpft worden waren, wurden einten Glasstäben hindurchgezogen, um überschüssige zelne definierte purpurfarbene Stellen, die Kolonie-Lösung zu entfernen und eine gleichmäßige Im- stellen anzeigten, beobachtet, deren Zahl mit der beprägnierung sicherzustellen. Die Stücke wurden dann kannten Konzentration der Testproben zunahm. Eine 2 Stunden in einem Luftstromofen bei ungefähr zusammenhängende purpurne Farbe wurde in allen 55°C getrocknet. Die dehydratisierten Papierstücke 40 Papierstücken beobachtet, die mit Proben mit einer wurden dann in kleine Stücke in der Größe von Konzentration von 10³ Zellen pro cm³ oder darüber 1 X 2 cm geschnitten, die gerade 0,2 cm³ Flüssigkeit beimpft worden waren.

absorbierten. Beim Vergleich der Anzahl der Stellen, die auf Halter für diese Stücke wurden hergestellt, indem den Papierstücken auftraten, mit den Zellkonzentraman Polyäthylenterephthalatfolien in Streifen von 45 tionen in den Proben, zeigte es sich, daß eine defiungefähr 1X6 cm zerschnitt. Um die Filterpapier- nierte und deutliche Beziehung vorhanden war. Es stücke an dem Halter zu befestigen, wurden sie auf wurde beobachtet, daß die Dichte oder Anzahl der einen federnden Tisch gelegt und eine dünne Poly- Stellen mit zunehmender Konzentration der Mikroäthylenfolie über jedes Papierstück gelegt. Die Strei- Organismen in der Probe zunahm,
fen wurden dann so auf die Folien gelegt, daß jedes 50 Wenn die Untersuchungen mit klinischen Urin-Papierstück sich an einem Ende jedes Streifens be- proben, frischen pasteurisierten Proben von Milch fand. Eine auf ungefähr 138,7° C erhitzte Platte (Grad A) und verunreinigten Milchproben durchgewurde ungefähr 5 Sekunden lang auf die Oberseite führt wurden, wurden im wesentlichen die gleichen der Streifen gebracht, um die Polyäthylenfolien zu Ergebnisse erhalten. Die Koloniestellen auf den Paschmelzen und die Filterpapierstücke an die Streifen 55 pierstücken entsprachen den Ergebnissen, die bei zu binden. Die Halter mit den daran befestigten Pa- einer Vergleichsauszählung auf Agar-Platten erhalpierstücken wurden dann in verschließbare trans- ten wurden.

parente Behälter gegeben und mit Äthylenoxid steri- Wenn andere übliche Suspensionsmittel, wie ver-

lisiert. schiedene Alginate, inerte Polysaccharidgummen,

B e i s ρ i e 1 2 60 lineare Polysaccharide, Karrag-eene und niedrige

Halbquantitative Untersuchung Konzentrationen von Agar an Stelle von Natrium-

alginat in der Zubereitung des Beispiels 1 verwendet

a) Herstellung der Proben wurden, wurden im wesentlichen die gleichen Ergeb-

Es wurden Proben hergestellt durch Züchtung von nisse erhalten, d. h., die Kolonien waren lokalisiert,

Kulturen von Escherichia coli, Proteus mirabilis, 65 und es war eine halbquantitative Bestimmung

Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, möglich.

Staphylococcus aureus und Streptococcus faecalis in Wenn die Untersuchungen wiederholt wurden mit

Hirn-Herz-Infusionsbrühen bis zu einer maximalen einem Prüfmittel, das entsprechend Beispiel 1 herge-

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stellt worden war, wobei jedoch kein Suspensions- Diese Zubereitung wurde gründlich vermischt und mittel verwendet wurde, wurde beobachtet, daß die in der Lösung gelöst. Mit dieser Lösung wurde FiI-Papierstücke nach der Inkubation bei allen Konzen- terpapier imprägniert, und das Verfahren zur Hertrationen eine zusammenhängende rosa oder pur- stellung von Prüfmitteln, wie im Beispiel 1 beschriepurne Farbe besaßen. Es zeigte sich, daß so eine 5 ben, wurde wiederholt.

halbquantitative Bestimmung der verdünnten Pro- Die so hergestellten Papierstücke wurden in allen

ben nicht möglich war, wenn kein Suspensionsmittel Konzentrationen der drei zu untersuchenden Proben

vorhanden war, da die Mikroorganismen nicht an des Beispiels 3 beimpft und ungefähr 12 Stunden bei

der Stelle festgehalten wurden. 37° C inkubiert.

B e' η' e 1 3 ¹⁰ *^^{e m}^ ^a^^en Konzentrationen der Testproben,

^p enthaltend Enterobacter aerogenes, beimpften Pa-

Unterscheidungsuntersuchung pierstücke änderten ihre Farbe von einem zusammen-

20 g Natriumalginat wurden zu 11 destilliertem hängenden blassen Grün zu einem zusammenhängen-

Wasser zugefügt, um entsprechend dem Verfahren den leuchtenden Blau, was das Vorhandensein von

im Beispiel 1 eine Lösung herzustellen. Zu dieser 15 Enterobacterarten anzeigte. Die mit den Proben,

Lösung wurde ein modifiziertes Christensen's Me- enthaltend Proteus mirabilis und Escherichia coli,

dium der folgenden Zusammensetzung zugegeben. imprägnierten Papierstücke behielten ihre blaßgrüne

Pepton 1,00g ^Farbe· Beispiels

Glucose 1,00g ^ .Beispiels

NaCl 5,00 g Unterscheidungsuntersuchung

KH PO 2 00 2

„ ² *, 2000 ^'^ 8 ^emes linearen Polysaccharids wurden zu 11

ρ^arns.° Ο!2 destilliertem Wasser gegeben, um eine Lösung her-

eno ro , g zustellen. Zu dieser Lösung wurde ein modifiziertes

Polyoxiathylensorbitanmonooleat 0,1 cm3 ^ ^.^ _EMB._{Medium def} ^g _folgenden Zusammen-

Die Zubereitung wurde gründlich mit der Na- setzung zugegeben und gerührt, bis es gründlich ge-

triumalginatlösung vermischt, bis sie gelöst war. Mit mischt und gelöst war:
dieser Lösung wurde Filterpapier entsprechend dem

im Beispiel 1 angegebenen Verfahren imprägniert. Pepton 10,0 g

Die imprägnierten Papierstücke wurden ungefähr 30 Lactose 10,0 g

2 Stunden in einem Vakuumofen bei 40° C getrock- Dikaliumphosphat 2,0 g

net. Die dehydratisierten imprägnierten Papiere Eosin Y 4,0 g

wurden, wie im Beispiel 1 beschrieben, in kleine Methylenblau 0,650 g

Stücke zerschnitten, auf Haltern befestigt, in Behäl- Polyoxiäthylensorbitanmonooleat 0,1 cm³
ter gegeben und sterilisiert. 35

Die Halter und die Papierstücke wurden anschlie- Entsprechend Beispiel 1 wurde Filterpapier mit

ßend aus den Behältern entfernt und mit allen im der entstehenden Lösung imprägniert, und es wur-

Beispiel 2 a beschriebenen Verdünnungsproben, ent- den Prüfmittel hergestellt.

haltend Proteus mirabilis, Enterobacter aerogenes Die Papierstücke wurden in alle Konzentrationen

und Escherichia coli beimpft und ungefähr 12 Stun- 40 der im Beispiel 3 beschriebenen Proben getaucht,

den bei 36° C inkubiert. Eine zusammenhängende Es wurde beobachtet, daß die mit Proben, enthaltend

rosa Farbe wurde auf den Papierstücken beobachtet, Escherichia coli, beimpften Papierstücke einen cha-

die mit allen Konzentrationen der Verdünnung der rakteristischen grünen metallischen Glanz besaßen.

Proben, enthaltend Proteus mirabilis, beimpft waren. Die Prüfmittel, die mit den Proben, enthaltend En-

Keine Änderung trat auf bei den Papierstücken, die 45 terobacter aerogenes und Proteus mirabilis, beimpft

mit Proben, enthaltend Enterobacter aerogenes und worden waren, behielten eine dunkle violette Farbe

Escherichia coli, beimpft worden waren. und zeigten keinerlei Glanz.

B e i s D i e 1 4 Obwohl die Beschreibung und die Bespiele in

erster Linie ein Prüfmittel, umfassend eine an einem

Unterscheidungsuntersuchung ₅₀ Halter befestigte Matrix, das sich in einem Behälter

20 g Natriumalginat wurden zu 11 destilliertem befindet, betreffen, bezieht sich die Erfindung auch

Wasser zugegeben und entsprechend Beispiel 1 eine auf die Herstellung der imprägnierten Matrix allein.

Lösung hergestellt. Zu dieser Lösung wurde ein mo- Zum Beispiel können übliche Laborgeräte, wie Zan-

difiziertes Simmons'-Citratmedium der folgenden Zu- gen, Pinzetten und Objektträgerhüllen an Stelle des

sammensetzung zugegeben: 55 Halters 12 bzw .des Behälters 13 verwendet werden.

Die sterile dehydratisierte Matrix kann mit der Pin-

NH₄H₂PO₄ 1,0 g zette gehalten und in die zu untersuchenden Proben

NaCl 5,0 g getaucht und anschließend in einen Objektträger-

MgSO₁ 0,20 g behälter gegeben und inkubiert werden. Die imprä-

K₂HPO₄ 1,00 g 60 gnierte Matrix 11 kann gegebenenfalls auch durch

Natriumeitrat 2,00 g Zugabe eines abgemessenen Volumens der Probe

Bromthymolblau 0,80 g direkt auf die Matrix rehydratisiert und beimpft wer-

Polyoxiäthylensorbitanmonooleat 0,1 g den statt durch Eintauchen, wie oben beschrieben.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1 2

derlichen Medien zu züchten und sie zu identifizieren.

Patentanspruch: Diese Züchtung erfordert häufig eine erneute Inkubation von weiteren 24 Stunden.

Prüfmittel zur halbquantitativen Bestimmung Dieses Verfahren besitzt den Nachteil, daß man

oder Unterscheidungsuntersuchung der in einer 5 Reihenverdünnungen der Probe sowie ein Agar-Me-

Flüssigkeit enthaltenen Mikroorganismen, be- dium herstellen muß, eine lange Zeit erforderlich ist,

stehend aus einer absorbierenden Matrix, die mit um einen quantitativen Nachweis und eine Unter-

einem Nährmedium imprägniert ist, welches ein scheidung zu erzielen, und daß eine große Menge

Testreagens enthält, wobei die Matrix gegebenen- von sauberen und sterilisierten Laborgeräten erfor-

falls an einem Halter befestigt ist und sich ge- ίο derlich ist.

gebenenfalls in einem verschließbaren Behälter Bei einem anderen Verfahren werden abgemessene befindet, dadurch gekennzeichnet, Volumina einer Probe durch eine semipermeable daß es zusätzlich ein eine Lokalisierung der ge- Membran filtriert. Dabei wird die Membran so ausbildeten Kolonien in der Matrix ermöglichendes gewählt, daß die Mikroorganismen nicht hindurch-Fixiermittel in Konzentrationen von ungefähr 15 gehen. Nach dem Filtrieren wird die Membran von 0,1 bis ungefähr 5,0 Gewichtsprozent enthält. dem Filter entfernt und auf ein Agar-Nährmedium

gebracht, wobei die darin enthaltenen Nährstoffe durch die Membran hindurchdiffundieren können.

Bei der Inkubation wachsen die Mikroorganismen auf

30 der Membran und werden anschließend beobachtet und gezählt, wie bei dem oben beschriebenen Ver-

Die Erfindung betrifft Prüf mittel zur halbquantita- fahren.

tiven Bestimmung der in einer Flüssigkeit enthaltenen Während das zuletzt beschriebene Verfahren in beMikroorganismen, bestehend aus einer absorbieren- stimmten Beziehungen eine Verbesserung gegenüber den Matrix, die mit einem Nährmedium imprägniert 35 dem ersten Verfahren darstellt, ist ein Filtrieren und ist, welches ein Testreagens enthält, wobei die Matrix somit ein Reinigen und erneutes Sterilisieren der FiI-gegebenenfalls an einem Halter befestigt ist und sich tervorrichtung sowie ein Abmessen der Probe vor gegebenenfalls in einem verschließbaren Behälter be- dem Filtrieren notwendig, was zusätzliche Zeit und findet. weitere Vorrichtungen erfordert.

Untersuchungen von Flüssigkeiten auf das Vorhan- 30 Aus der US-PS 2 904 474 ist ein Prüfmittel be-

densein von Mikroorganismen werden üblicherweise kannt, bei dem eine mit einem Nährmedium imprä-

in der Medizin, in der Industrie und durch Behörden gnierte Matrix direkt in die zu analysierende Probe

durchgeführt, um den Grad der mikrobiologischen getaucht wird. Dieses Prüfmittel umfaßt allgemein

Verunreinigung in verschiedenen Arten von Proben einen Papierstreifen, der mit einem Nährmedium,

zu bestimmen. Bei vielen derartigen Untersuchungen 35 enthaltend eine Testsubstanz, imprägniert ist. Der

ist das Vorhandensein von Mikroorganismen häufig Streifen besitzt einen getrennten Handgriff und eine

von zweitrangiger Bedeutung, und es soll in erster Hülle, in der der Streifen zur Inkubation eingeschlos-

Linie die Konzentration der Mikroorganismen in der sen wird.

Probe bestimmt werden. Zum Beispiel wird die Dia- Bei der oben angegebenen Vorrichtung werden die gnose der Bakteriuria gestellt durch die Konzentra- 40 löslichen Nährstoffe und Testsubstanzen während des tion der in einer Urinprobe vorhandenen Mikro- Eintauchens des Prüfmittels in die Probe ausgelaugt; Organismen und nicht durch die bloße Gegenwart von außerdem neigen die nach dem Eintauchen in dem Mikroorganismen. Ähnlich werden Milch- und Was- Streifen verbleibenden löslichen Substanzen auf ser-Proben nur dann als »verunreinigt« angesehen, Grund der Schwerkraft dazu, in den unteren Teil des wenn die in den Proben vorhandene Konzentration 45 Streifens zu wandern, und ferner werden die bewegder Mikroorganismen über ein festgelegtes Maximum liehen Mikroorganismen nicht an einem Ort festhinausgeht. Offensichtlich ist es, wenn die Konzen- gehalten, und es bilden sich daher keine einzelnen tration an Mikroorganismen über einen festgelegten Kolonien oder Stellen, die ausgezählt werden können. Standard hinausgeht, hilfreich und oft notwendig, den Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mikroorganismus zu identifizieren, um eine Behänd- 50 Prüfmittel zur Untersuchung einer Probe auf Mikrolung der Infektion möglichst zu beschleunigen oder Organismen herzustellen, auf dem die Mikroorganisdie Ursache der Verunreinigung zu bestimmen und zu men gezüchtet werden können und das durch Einbeheben, tauchen in eine flüssige Probe beimpft werden kann Ein quantitatives Verfahren zur Bestimmung von und das ein einfaches und zuverlässiges Prüfmittel Mikroorganismen umfaßt die Herstellung von Rei- 55 zur Bestimmung der Konzentration von in einer Flüshenverdünnungen einer abgemessenen Menge der sigkeitsprobe enthaltenen Mikroorganismen darstellt, Probe, Beimpfen eines Agar-Nährmediums mit einer ohne daß die Probe abgemessen oder verdünnt werabgemessenen Menge einer Verdünnung und unge- den muß und mit Hilfe dessen es möglich ist, in fähr 24 Stunden langes Inkubieren des beimpften einer Probe die verschiedenen Mikroorganismen zu Mediums. Wenn die Probe verunreinigt ist, können 60 unterscheiden bzw. zu bestimmen. Dabei sollen nicht einzelne Kolonien der gewachsenen Mikroorganismen zu viele Laborgeräte benötigt werden, die gereinigt visuell beobachtet und gezählt werden. Die Konzen- und sterilisiert werden müssen, und die Zeit zum tration der Mikroorganismen pro cm³ der Probe wird Nachweis und zur Bestimmung der Mikroorganismen dann berechnet, indem man die Anzahl der Mikro- soll verhältnismäßig kurz sein, d. h., das Prüfmittel organismen-Kolonien mit der Verdünnung der Probe 85 soll einfach, wirtschaftlich, leicht verfügbar und'zumultipliziert. Die so gewachsenen einzelnen Kolonien verlässig sein.

stellen eine reine Quelle des Mikroorganismus dar, Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch

um die Mikroorganismen auf selektiven oder verän- ein Prüfmittel zur halbquantitativen Bestimmung