DE2630405C3

DE2630405C3 - Durchführung mikrobiologischer Arbeiten

Info

Publication number: DE2630405C3
Application number: DE2630405A
Authority: DE
Inventors: Frank Edward Pittsford N.Y. Young (V.St.A.)
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1975-12-08
Filing date: 1976-07-06
Publication date: 1979-07-26
Also published as: IT1064135B; FR2355913B1; DE2630405B2; JPS5270016A; DE2630405A1; US3968010A; GB1524401A; AU504652B2; FR2355913A1; CA1050456A; JPS568582B2; AU1544576A

Description

HOCH₂ - (CHOH)_n - CH₂OH

in der /7=0 bis 5 ist, in einer solchen Konzentration, wie sie für das Züchten oder den Nachweis des speziell gewählten Mikroorganismus oder Mikroorganismusvariante und des gewählten Alkohols erforderlich ist, enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als mehrwertigen Alkohol Glycerin einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Rehydratisierungsflüssigkeit einsetzt, die den wasserlöslichen, mehrwertigen Alkohol in einer Konzentration von 1 bis 6% (Gew./Vol.) enthält.

Bei der Diagnose von durch Mikroben verursachten Erkrankungen bei Menschen und Tieren ist es häutig höchst erwünscht, den speziellen verursachenden Mikroorganismus zu bestimmen. Dies trifft vor allem s.u auf die Diagnose der Geschlechtskrankheiten Gonorrhoeae, die direkt verursacht wird durch eine Infektion mit dem Mikroorganismus Neisseria Gonorrhoeae. Auf der Suche nach spezifischen mikrobiologischen Identifikationstests sind zahlreiche Verfahren entwickelt worden, einschließlich der Anwendung kolorimetrischer Indikatoren und immunochemischer Indikatoren. Trot;:- dem beruht die übliche Diagnose bestimmter durch Mikroorganismen verursachter Erkrankungen noch auf mikrobiologischen Züchtungsverfahren.

Übliche mikrobiologische Verfahren, die angewandt werden zur Diagnose von durch Mikroben verursachten Erkrankungen, umfassen eine In-vitro-Züchtung einer Testprobe, die von dem zu untersuchenden Individuum (Mensch bzw. Tier) entnommen worden ist. Das angewandte Kulturmedium kann entweder imstande sein, das Wachstum eines breiten Spektrums von Mikroorganismen zu unterstützen oder selektiv dasjenige einer kleinen Anzahl von Mikroorganismen oder sogar eines einzelnen Mikroorganismusstammes. Im allgemeinen wird ein Allzweckmedium angewandt, um reine Kolonien aus einer Probe zu isolieren und sie anschließend chemisch oder biologisch zu analysieren, um pathologische Mikroorganismen in der Probe zu identifizieren. Wenn ein selektives Medium angewandt wird, weiß man, ob eine bestimmte Gruppe oder Art (Variante) der Mikroorganismen in der Probe vorhanden oder nicht vorhanden ist, aufgrund der Beobachtung von Wachstum oder Nicht-Wachstum. Es ist daher kritisch, für derartige mikrobiologische Verfahren entsprechende Züchtungsverfahren für solche Mikroorganismen zur Verfugung zu haben, die von pathologischer Bedeutung sind.

Zur Zeit besteht in klinischen Laboratorien ein großer Bedarf an schnelleren und bequemeren Verfahren und Mitteln zur Züchtung von Mikroorganismen. Klinische mikrobiologische Verfahren beruhen zur Zeit nahezu

ίο ausschließlich auf der Anwendung von gegossenen Agarplatten. Es ist bekannt, daß derartige Agarpiatten eine sehr kurze Lagerfähigkeit besitzen und außerordentlich mühsam in der Anwendung sind. Es sind einige synthetische Gele entwickelt worden als Ersatz für Agar als Grundsubstanz in den gegossenen Platten, sie haben sich jedoch weder als stabiler noch als einfacher in der Anwendung erwiesen. Erst in letzter Zeit sind Vorrichtungen zur Züchtung von Mikroorganismen entwickelt worden, die eine flächige Matrix oder ein absorbierendes Kissen umfassen, in die die Nährstoffe eingebaut sind und diese Vorrichtungen haben sich als geeigneter Ersatz für die mit Nachteilen behafteten Agarplatten erwiesen. Diese Vorrichtungen umfassen eine im wesentlichen trockene Matrix, in die mikrobio-

2^ri logische Nährstoffe eingebaut sind und die viele Monate gelagert und dann bei der Anwendung zur Züchtung von Mikroorganismen rehydratisiert werden kann. Eine derartige Vorrichtung ist in der US-PS 38 81993 beschrieben.

jo Es hat sich gezeigt, daß derartige Vorrichtungen angepaßt werden können an die Züchtung einer Vielzahl von Mikroorganismen einschließlich ziemlich empfindlicher Mikroorganismen, d. h. solcher, die sehr sorgfältig geregelte Nährmedien und/oder Atmosphä-

D ren erfordern. Zum Beispiel ist in der US-PS 38 88 741 ein Mittel zum Züchten von Mikroorganismen beschrieben auf der Grundlage einer nährstoffhaltigen Matrix, das sehr gut geeignet ist zur Züchtung und zum Nachweis des empfindlichen Mikroorganismus Neisseria Gonorrhoeae.

Die bekannten, eine Matrix umfassenden Vorrichtungen zur Züchtung von Mikroorganismen sind jedoch noch nicht vollständig befriedigend zur Züchtung von osmotisch empfindlichen Mikroorganismen. Bei Vorrichtungen, die eine flächige Matrix umfassen, sind die wachsenden Mikroorganismen mehr oder weniger von einer Flüssigkeit umgeben und finden sich verteilt in dem gesamten Inneren der flächigen Matrix (z. B. einem saugfähigen Träger wie Stoff oder Filterpapier) im

in Gegensatz zu üblichen Agarplatten, bei denen der wachsende Mikroorganismus auf der Geloberfläche gehalten wird. Durch diesen kritischen Unterschied hat es sich gezeigt, daß es häufig nicht ausreicht, wenn man die Nährstoffbestandteile von dem Agarmedium in eine

's*; flächige Matrixstruktur einbaut, um eine Vorrichtung, umfassend eine flächige Matrix, zu erhalten, die einer speziellen üblichen Agarplatte entspricht. Ein Fall, wo diese Schwierigkeit auftritt, besteht in der Züchtung von osmotisch empfindlichen Mikroorganismen, besonders

bo von N. gonorrhoeae.

Es hat sich nun gezeigt, daß osmotisch empfindliche Mikroorganismen vorteilhaft gezüchtet werden können unter Anwendung einer Vorrichtung, umfassend eine mit Nährmedium imprägnierte flächige Matrix oder ein

t>5 absorbierendes Kissen, indem man der zur Rehydratisierung der im wesentlichen trockenen, Wasser absorbierenden flächigen Matrix angewandten Flüssigkeit einen bestimmten wasserlöslichen mehrwertigen

Alkohol zusetzt Die Rehydratisierung der trockenen flächigen Matrix bei der Anwendung wird entweder vor oder gleichzeitig mit dem Beimpfen der flächigen Matrix entweder mit den zu züchtenden Mikroorganismen oder mit einer Probe, von der vermutet wird, daß sie eine spezielle Art oder Variante vcp nachzuweisenden Mikroorganismen enthält, durchgeführt. Auf diese Weise ist der Mikroorganismus, wenn er mit der flächigen Matrix in Berührung kommt, schon in einer wäßrigen Umgebung dispergiert, die den schützenden mehrwertigen Alkohol enthält, oder es ist sichergestellt daß er in einer solchen Umgebung dispergiert wird.

Die Konzentration an mehrwertigem Alkohol in der Rehydratisationsflüssigkeit kann in weitem Bereich variieren, je nach dem speziellen gewählten mehrwerti- 1 -> gen Alkohol und dem speziellen Mikroorganismus oder der Mikroorganismusvariante, die gezüchtet oder nachgewiesen werden soll. Im allgemeinen ist der mehrwertige Alkohol jedoch in der Rehydratisationsflüssigkeit in einer Menge vorhanden, die ausreicht, um eine Konzentration zwischen 1 und 6, vorzugsweise 5% (Gew7Vol.) in der rehydratisierten beimpften flächigen Matrix zu erreichen. Daher enthält, wenn das Inokulum in einer nichtflüssigen Form vorliegt und daher die Verdünnung der Rehydratisierungsflüssigkeit in der rehydratisierten flächigen Matrix nicht von Bedeutung ist, die Rehydratisierungsflüssigkeit selbst zwischen 1 und 6% (GewVVol.) mehrwertigen Alkohol. Beachte in diesem Zusammenhang die Patentansprüche.

Aufgrund der derzeit verfügbaren Informationen w wird angenommen, daß der mehrwertige Alkohol eilte Schutzwirkung ausübt aufgrund seiner Fähigkeit, den osmotischen Druck, der auf den Mikroorganismus durch die wäßrige Umgebung ausgeübt wird, auszugleichen. Außerdem haben sich die mehrwertigen Alkohole, die r> benetzend wirken, als besonders geeignet erwiesen, da sie die Feuchtigkeit in der rehydratisierten flächigen Matrix weiter stabilisieren und zurückhalten. Ein weiterer Vorteil der Anwendung einer Rehydratisierungsflüssigkeit, enthaltend einen mehrwertigen Aiko- -ίο hol, besonders Glycerin, besteht darin, daß eine Entfernung der Kolonien von der Matrix nach der Inkubation leichter und genauer reproduzierbar erreicht werden kann, als wenn kein derartiger mehrwertiger Alkohol in der Rehydratisierungsflüssigkeit enthal- 4; ten ist. Eine leichte Entfernung der entstandenen Kolonien ist besonders günstig, wenn eine weitere Züchtung oder Analyse durchgeführt werden soll, wie bei Tests zur Untersuchung der Empfindlichkeit gegen Antimikroben-Mittel (Antibiotika) oder für Bestäti- ~>o gungs- bzw. Identifizierungstests.

Mittel bzw. Vorrichtungen zur Züchtung von Mikroorganismen umfassen 1) eine im wesentlichen trockene Wasser absorbierende flächige Matrix, in die ausreichend mikrobiologisches Nährmedium eingebaut ^γ>ϊ ist, um das Wachstum der gewünschten Art oder Arten von Mikroorganismen zu unterhalten, und 2) ein Volumen einer wäßrigen Flüssigkeit, enthaltend einen wasserlöslichen mehrwertigen Alkohol, die als Rehydratisierungsflüssigkeit dient. Die flächige Matrix kann mit t><> Vorrichtungen zum Festhalten und/oder Umschließen versehen sein und eine integrale Anordnung bilden, die geeignet ist zur Züchtung verschiedener Arten von Mikroorganismen unter verschiedenen Atmosphären. Derartige Vorrichtungen zur Züchtung und die erfin- <v> dungsgemäße Rehydratisierungsflüssigkeit können auch mit verschiedenen Indikatorvorrichtungen kombiniert werden, um Analyseneinheiten zu erhalten, die geeignet sind zur Identifizierung einer vermuteten speziellen Art oder Variante von Mikroorganismen.

In den Figuren zeigt F i g. 1 eine auseinandergezogene perspektivische Ansicht einer bevorzugten Form zum Züchten von Mikroorganismen, Fig.2 einen Längsschnitt durch die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung in nichtauseinandergezogener Form entlang der Linie 2-2 und F i g. 3 eine perspektivische Ansicht eini r solchen Anordnung, umfassend die in F i g. 1 angegebene Vorrichtung, eine ein Gas entwickelnde Tablette und eine nur angedeutete Umhüllung.

Die erfindungsgemäß verwendeten mehrwertigen Alkohole umfassen die Glykole, besonders solche mit einem Gerüst von 2 bis 7 Kohlenstoffatomen und die Verbindungen der allgemeinen Formel

HOCH₂-(CHOH)_n-CH₂OH,

wobei η O bis 5 ist.

Geeignete Glykole mit einem Gerüst von 2 bis 6 Kohlenstoffatomen umfassen Äthylenglykol, das bevorzugt ist Propylenglykol, Trimethylenglykol, a-Butylenglykol, 0-ButyIenglykol, 1,3-Butandiol, Tetramethylenglykol, Isobutylenglykol, 1,5-Pentandiol, 3-Methyl-l,3-butandiol, Pinacol und 2-Methyl-2,4-pentandiol. Geeignete Verbindungen der oben angegebenen allgemeinen Formel umfassen Glycerin (n=l), was besonders bevorzugt ist, Erythrit (n=2), Adonit und Arabit (n=3). Sorbit und Manit (n=4) und Perseit (n = 5). Es ist auch zu bemerken, daß auch Äthylenglykol als Verbindung der oben angegebenen allgemeinen Formel angesehen werden kann, wobei /J=O ist. Der mehrwertige Alkohol ist wasserlöslich und nicht bakterizid und vorzugsweise in reinem Zustand eine leicht bis mäßig viskose Flüssigkeit. Solche mehrwertigen Alkohole, die als feuchtigkeitsspendende Mittel geeignet sind, wie Äthylenglykol und Glycerin, haben den zusätzlichen Vorteil, daß sie die Feuchtigkeit in der rehydratisierten nährstoffhaltigen flächigen Matrix stabilisieren und festhalten.

Der mehrwertige Alkohol kann in einer wäßrigen Flüssigkeit enthalten sein, die angewandt wird, um die flächige Matrix zu rehydratisieren vor oder gleichzeitig mit dem Beimpfen der flächigen Matrix mit dem Mikroorganismus oder der zu untersuchenden Probe oder er kann enthalten sein in einer wäßrigen Flüssigkeit, die selbst als Impfmedium dient, indem sie ebenfalls den Mikroorganismus oder die zu untersuchende Probe enthält. Im ersten Falle wird die Beimpfung erreicht, indem man die Matrix mit einem Inokulum in Berührung bringt wie einem isolierten Mikroorganismus oder einer Kolonie davon, einer Brühe oder wäßrigen Suspension von Mikroorganismen, einer flüssigen zu untersuchenden Probe wie Urin oder Serum, einem Abstrich oder einer Probe in einer öse usw. Im zweiten Falle wird das wie oben beschriebene Inokulum zu der Rehydratisationsflüssigkeit zugegeben, wodurch man eine gleichzeitige Rehydratisierung und Beimpfung der flüssigen Matrix durch Kontakt mit dieser Flüssigkeit erreicht.

Das mikrobiologische Nährmedium, das in der flächigen Matrix eingebaut ist, z. B. durch Imprägnieren oder Adsorption, umfaßt die üblichen Substanzen, die aktiv zur Erhaltung der Lebensfähigkeit und des Wachstums des gewünschten Mikroorganismus beitragen. Substanzen, die das Wachstum unerwünschter Mikroorganismen hemmen oder verzögern, können ebenfalls in der flächigen Matrix enthalten sein. Die mit Nährmedium imprägnierte flächige Matrix kann ein

Allzweckmedium enthalten, das imstande ist, ein weites Spektrum von Mikroorganismen wachsen zu lassen, oder sie kann ein selektives Medium enthalten, dann, wenn das Kulturmedium und die Vorrichtung angewandt werden zum Nachweis eines speziellen Typs oder einer Art von Mikroorganismen. Ein Beispiel für ein selektives Medium ist das allgemein als Thayer-Martin-Medium bekannte Medium, das für N. gonorrhoeae selektiv ist.

Die Vorrichtung zum Züchten von Mikroorganismen ergibt zusammen mit einem Indikatorkissen, in das ein Indikator eingebaut ist, der mit einer Gruppe oder Art von Mikroorganismen reagieren kann, ein bequemes Mittel zur Identifizierung von in einer Probe vermuteten Mikroorganismen. Der Indikator kann mit dem Mikroorganismus reagieren oder mit einem Stoffwechselprodukt oder einer anderen Substanz, die von dem Mikroorganismus freigesetzt wird. Tetrazoliumsalze und pH-empfindliche Reagentien sind Beispiele für Indikatoren, die für diesen Zweck geeignet sind. Es ist bekannt, daß N. gonorrhoeae-Mikroorganismen ein extra-celluläres Oxidaseenzym enthalten, das speziell mit bestimmten Indikatoren reagieren kann, die üblicherweise als Cytochromoxidase-Indikatoren bekannt sind. Daher sind derartige Indikatoren erfindungsgemäß geeignet, wenn N. gonorrhoeae-Organismen nachgewiesen werden sollen. Beispiele für diese Indikatoren sind

p-Aminodimethylanilin,

Dimethylphenylendiamin,

Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethyl-p-phenylendiamin-

dihydrochlorid,

Dimethyl-p-phenylendiamin-oxalat
und ein Gemisch von
Dimethylphenylendiamin und
a-Naphthol.

An diesem Punkt soll auf die Zeichnungen verwiesen werden, um eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Vorrichtung 30 zur Züchtung von Mikroorganismen zu erläutern. Die Fig. 1 und 2 zeigen eine Vorrichtung zur Züchtung von Mikroorganismen, umfassend ein rechteckiges Grund- oder Behälterteil 10 und ein damit zusammenwirkendes bzw. übergreifendes rechteckiges Deckteil 21. Das Grundtei! 10 besitzt einen rechteckigen plattenförmigen Boden 11, der in einem Endbereich eine nach oben stehende, im Rechteck umlaufende Wand 12 bildet Die Wand 12 besitzt eine ebene Oberseite, die im allgemeinen mit dem Boden 11 parallel ist und eine äußere, im allgemeinen senkrechte Seite 18, die sich vom Boden nach der Oberseite etwas nach innen neigt wie in den Zeichnungen angegeben. Das Unterteil 11 bildet auch eine nach oben stehende Querward 19 mit einer Oberseite 20, die sich unterhalb der Oberseite 17 (der Wand 12) befindet und im allgemeinen mit dieser parallel ist Die Wände 12 und 19 bilden abgegrenzte rechteckige Vertiefungen 13 und 14. Nährstoffhaltige flächige Matrizes oder Kissen 15 und 16 befinden sich in den Vertiefungen 13 bzw. 14.

Der Deckel 21 besitzt einen umlaufenden rechteckigen nach unten ragenden Rand 22, der teleskopartig über den oberen Teil der äußeren Seite 18 der Wand 12 übergreift In dem Deckel 21 sind Schlitze 24 und 25 vorgesehen, im allgemeinen in der Nähe der gegenüberliegenden Enden, um einen Fluß von einer umgebenden Gasatmosphäre in die Kammer und aus ihr heraus zu ermöglichen, die gebildet wird, wenn der Deckel 21 auf das Unterteil 10 aufgesetzt ist, wie in den Fig. 2 und 3 angegeben. Der Deckel 21 besitzt auch eine »Nase« 23. um die Entfernung des Deckels 21 von dem Unterteil 10 zu erleichtern.

Das Unterteil 10 und der Deckel 21 können aus irgendeinem geeigneten Material hergestellt werden, wobei organo-plastische Materialien bevorzugt sind. Zum Beispiel kann das Unterteil 10 aus einem verhältnismäßig starren organo-plastischen Material wie Polystyrol hergestellt sein, und der Deckel 2! kann aus einem verhältnismäßig flexibleren organo-plasüschen Material wie Polyäthylen bestehen. Wenn der Deckel 21 sich auf dem Unterteil 10 befindet, wie in Fig. 3 angegeben, ergeben der Deckel und das Unterteil eine mit Öffnungen versehene Kammer, enthaltend die nährmediumhaltigen Kissen 15 und 16.

Im folgenden wird ein Verfahren beschrieben, bei dem eine zu untersuchende Probe unter einer mit einem Gas angereicherten Atmosphäre gezüchtet wird. Der Deckel 21 und das Unterteil 10 sind auseinandergezogen, und ein Volumen einer wäßrigen Rehydratisicrungsflüssigkeit, enthaltend einen mehrwertigen Alkohol wie Glycerin, wird auf die Kissen 15 bzw. 16 aufgetropft. Jedes der Kissen 15 und 16 wird dann durch kräftiges Ausstreichen des Abstrichs über die Oberfläche der Kissen 15 und 16 beimpft. Der Deckel 21 wird auf das Unterteil 10, wie in Fig.3 gezeigt, aufgesetzt und die ganze Vorrichtung in eine verschließbare Hülle, wie die in F i g. 3 angegebene Hülle 26, gegeben, die ein

i<> Beutel aus Aluminiumfolie sein kann. Eine gasentwikkelnde Tablette 27, wie eine kohlendioxidentwickelnde Tablette, umfassend Natriumcarbonat und Citronensäure, wird ebenfalls in die Hülle 26 gegeben, die dann dicht verschlossen und in einen Inkubator gegeben wird.

η Nach einer vorher bestimmten Inkubationszeit wird die Vorrichtung 30 aus dem Beutel entnommen und der Deckel 21 mit Hilfe der Nase entfernt. Die Oberfläche des nährmediumhaltigen Kissens 15 wird dann fest und augenblicklich mit der Oberfläche eines Indikatorkissens in Berührung gebracht, das mit einem Reagens imprägniert ist, das mit dem nachzuweisenden Mikroorganismus reagiert und eine sichtbare Veränderung ergibt. Das verbleibende Kissen 16 kann für weitere Untersuchungen oder Analysen der gewachsenen

4) Kultur verwendet werden, oder es kann eine weitere Zeit inkubiert werden, indem man die Vorrichtung 30 in den Beutel 26 gibt und die gesamte Anordnung erneut in den Inkubator legt.

Das oben angegebene Verfahren kann auch durchgeführt werden mit Hilfe einer alternativen Form der Vorrichtung 30, bei der ein kohlendioxidentwickelndes Kissen der in der US-PS 38 88 741 beschriebenen Art, anstelle des mit Nährmedium imprägnierten Kissens 15 oder 16, angewandt wird. Bei der zuletzt genannten

5ί Form des Prüfmittels werden die öffnungen 25 und 24 in dem Deckel 21 weggelassen. Bei der Anwendung wird das nährstoffhaltige Kissen wie oben beimpft und der keine Öffnungen aufweisende Deckel auf das Unterteil 10 aufgesetzt. Die gesamte Anordnung wird dann unter geeignete Inkubationsbedingungen gebracht Eine Vorrichtung dieser Art ist in der US-PS 38 88 741 näher beschrieben.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen ist geeignet zur Züchtung und/oder zum Nachweis einer großen Vielzahl von Mikroorganismen, die eine gewisse osmotische Empfindlichkeit besitzen. Beispiele für derartige Mikroorganismen sind solche der Art Neisseria, besonders N. menineitidis und

N. gonorrhoeae. Die Züchtung und der Nachweis eier osmotisch empfindlichen Mikroorganismen N. gonorrhoeae mil Hilfe von nährmediumimprägnierten flächigen Matrizes, konnte durch das erfindungsgemäße Verfahren besonders vereinfacht werden.

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert:

Beispiel

A. Herstellung des Mittels
zur Züchtung von Mikroorganismen

Kissen zur Züchtung von Mikroorganismen, die selektiv sind für N. gonorrhoeae, wurden folgendermaßen hergestellt:

1. 100 ml einer wäßrigen Lösung, die als Lösung A bezeichnet wurde, wurde hergestellt und enthielt die folgenden Bestandteile:

Proteose-Pepton Nr. 3	6,0 g
wasserlösliche Stärke	0,2 g
Dikaliumphosphat	0,8 g
Monokaliumphosphat	0,2 g
Natriumchlorid	1.0 g

Die Lösung wurde auf einer heißen Platte mit Magnetrührer zum Sieden erhitzt und dann ungefähr 15 Minuten bei ungefähr 121°C in einem Autoklav dampf-slerilisiert. Die sterilisierte Lösung wurde auf ungefähr 45⁰C abgekühlt und anschließend 6 ml Isovitalex angereicherte Lösung zugegeben.

2. Eine zweite Lösung, die als Lösung B bezeichnet wurde, wurde folgendermaßen hergestellt: Zu 2 g handelsüblichem Hämoglobin wurden 100 ml kaltes Wasser gegeben. Die entstehende Hämoglobinlösung wurde auf einer mit Magnetrührer versehenen Platte zum Sieden erhitzt und filtriert. Das Filtrat wurde ungefähr 15 Minuten bei ungefähr 121⁰C im Autoklav dampf-sterilisiert.

3. Die Lösungen A und B wurden zusammengegeben und die folgenden Antibiotika zugegeben, in Mengen, die ausreichen, um die angegebenen Konzentrationen in der entstehenden Lösung zu erhalten:

Vancomycin	4 mg/ml
Natriumcolistimethat	40 mg/ml
Amphotericin B	5 mg/ml
Trimethoprim	5 mg/ml

4. Ein Blatt S und S Filterpapier 470 wurde mit der in Stufe 3 erhaltenen Lösung imprägniert und 2 bis 3 Stunden in einem Luftofen bei ungefähr 35° C getrocknet. Es wurden rechteckige Kissen 15 und 16 aus dem trockenen, mit Nährmedium imprägnierten Blatt ausgeschnitten, die in den Vertiefungen 13 und 14 des Unterteils 10 der Vorrichtung 30, wie in Fig. 1 und 2 gezeigt, paßten. Es wurde jeweils ein Kissen in die Vertiefungen 13 und 14 jeder der Vorrichtungen 30 gepreßt Der mit Öffnungen versehene Deckel 21 wurde dann auf jedes Unterteil 10 aufgebracht und die gesamte Vorrichtung durch Gamma-Strahlung sterilisiert.

B. Wirkung von 5% Glycerin

in der Rehydratisierungsflüssigkeit

auf das Wachstum von N. gonorrhoeae

Die Wirkung von Kissen, die mit einer 5°/oigen (Gew./Vol.) Glycerinlösung rehydratisiert worden waren, im Vergleich zu solchen Kissen, die mit destilliertem Wasser rehydratisiert waren, wurde bestimmt, wobei als

in inokulum wäßrige Suspensionen vier verschiedener Varianten von N. gonorrhoeae angewandt wurden. Eine Variante wurde erhalten aus klinischen Proben und die anderen drei wurden erhalten von dem Center for Disease Control, Atlanta, Georgia, und identifiziert durch CDC Nr. 115,116 bzw. 117.

Es wurde eine Versuchsreihe für jede der vier Varianten von Mikroorganismen hergestellt, wobei jede Reihe zwei oder mehr Versuche umfaßte. Jeder Versuch umfaßte eine gleiche Anzahl von (a) Vergleichsagarplat-

2(i ten, enthaltend übliche Thayer-Martin-Medien, die nach dem in Public Health Reports 82, Seite 361 (1967) beschriebenen Verfahren hergestellt waren, (b) Kissen in Vorrichtungen 30, entsprechend Teil A oben, die mit destilliertem Wasser rehydratisiert worden waren, und

(c) Kissen in Vorrichtungen 30, wie oben in Teil A hergestellt, die mit einer 5%igen (Gew./Vol.) Glycerinlösung rehydratisiert worden war. Jede Platte und jedes Kissen bei jedem Versuch wurde mit 0,1 ml einer Kulturbrühen-Suspension der jeweiligen Variante von

j« N. gonorrhoeae beimpft, die entsprechend in der Versuchsreihe vorgesehen war. Die Menge an N. gonorrhoeae in der Suspension variierte von einem Versuch zum anderen, um eine Untersuchung der Wirksamkeit der Kissen bei verschiedenen Gehalten an

r> Inokulum zu ermöglichen. Alle Platten und Kissen in den vier Versuchsreihen wurden folgendermaßen über Nacht unter Kohlendioxidatmosphäre inkubiert. Die Platten wurden in einen Kohlendioxidinkubator gegeben. Jede der Vorrichtungen 30, bei der sich der Deckel

ίο 21 auf dem Unterteil 10 befand, wurde in einen Aluminiumfolienbeutel 26 zusammen mit einer kohlendioxidfreisetzenden Tablette 27 gegeben. Die Beutel 26 wurden dann dicht verschlossen und in einen üblichen Inkubator gelegt.

Nach der Inkubationszeit wurden die Kolonien auf jeder Platte gezählt und die Anzahl der Kolonien notiert. Die Notierung »TNTC« wurde in den Fällen angewandt, wo die Anzahl der Kolonien zu groß war, als daß man sie zählen konnte. Die Oberfläche jedes der

so Kissen wurde dann fest und kurz mit der Oberfläche eines Cytochromoxidase-Indikatorkissens in Kontakt gebracht, nach dem in der US-PS 38 88 761 beschriebenen Verfahren (Beispiel 4, Teil A). Die Wirksamkeit der Kissen wurde dann entsprechend dem folgenden Code bewertet: Kissen, die zu keiner sichtbaren Farbreaktion führten, erhielten die Bewertung 0, Kissen, die 1 bis 5 einzelne purpurfarbene Kolonien zeigten, erhielten Bewertungen entsprechend der Zahl der beobachteten Kolonien und Kissen, die eine sichtbare Reaktion

bo zeigten, die über 5 einzelne Kolonien hinausging, erhielten eine Bewertung zwischen 6 und 20, auf der Grundlage einer willkürlich gewählten Eichkarte, bestehend aus 2 Blöcken. Ein Block stellt eine große Anzahl einzelner beobachtbarer Koloniestellen dar und wird bezeichnet als Code »10«, der andere Block bezeichnet eine zusammenfließende purpurne Verfärbung und wird als Code »20« bezeichnet. Die Farbreaktionen zwischen diesen Reaktionsblöcken

werden zur Codierung interpoliert. Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben und zeigen, daß das Vorhandensein von Glycerin in der Rehydratisierungsfiüssigkeit die Reproduzierbarkeit der mit den Kissen erzielten Versuchsergebnisse wesentlich verbessert.

Tabelle 1

Mikroorganismus
(N. gonorrhoeae)

Plattenauszählung des
Inokulums

Gesamtzahl
der Versuche Visuelle Ergebnisse bei Anwendung rehydratisierter Kissen

Klinisches Isolat TNTC

TNTC

200

10

CDCNr. 115

TNTC

500

kein Glycerin

Anzahl der
Versuche

Reaktion

CDCNr. 116	TNTC	6	4 1
	1000	6	1 3 2
	150	6	1 1 4
CDCNr. 117	1000	6	1 2 1 2
	100	6	3 1 2

20 10

5 15«)

1 10

5 1 0

10

0 10

15 10

5 15·*)

4 10

15 10

5% Glycerin

Anzahl der Versuche

Reaktion

10

20

15

15 5

(Mittel von Flecken/Kissen)

15

15 10

10 4

20

15**)

10 5

20

15

10

*) Zwei Kissen fehlten.
··) Ein Kissen fehlte.

C. Wirkung verschiedener Gehalte an Glycerin in der Rehydratisationsflüssigkeit auf das Wachstum

von N. gonorrhoeae

Es wurden zwei Versuchsreihen durchgeführt, ähnlich wie in Teil B oben beschrieben, wobei N. gonorrhoeae CDC Nr. 116 und eine andere Variante von N. gonorrhoeae verwendet wurden, die erhalten wurde von dem Center for Desease Control und bezeichnet ist als CDClIl. Der einzige signifikante Unterschied zwischen den beiden Versuchsreihen in Teil C und denen in Teil B bestand darin, daß die Inokulumsuspension 4%

(Gew/Vol.) Glycerin und 3% Trypticase Sojabrühe-Nährmedium (erhältlich von BBL) enthielt Außerdem wurden bei jedem Versuch 4 Gruppen von Kissen angewandt und nicht 2, wobei jedes mit einer anderen der folgenden Flüssigkeiten rehydratisiert wurde: destilliertes Wasser, wäßrige 5%ige Glycennlösung, wäßrige 7,5%ige Glycerinlösung und wäßrige 10%ige Glycennlösung. Nach dem Beimpfen mit der glycerin-

haltigen Suspension enthielten die 4 Gruppen von Kissen aufgrund des Verdünnungsfaktors die folgenden Konzentrationen an Glycerin: 1%, 4,75%, 6,6% bzw. 8,5%. Die Ergebnisse sind in Tabelle !! angegeben und

Tabelle I!

zeigen, daß Glycerinjjehalte über 6% in den rehydratisierten beimpften Kissen eine nachteilige Wirkung auf das Wachstum von N. gonorrhoeae ausüben.

Mikro	Plattenaus	Gesamt	°/h Glycerin in dem rehydratisierten beimpften Kissen	Reak	4,75%	Reak	6,6%	Reak	8,5%	Reak
organismus	zählung	zahl der		tion	Anzahl	tion	Anzahl	tion	Anzahl	tion
(N. gonorrhoeae)	des I T^ **1 l· 11 11 I i>1 C	Versuche	1%		der		der		der
	inoKUiurns		Anzahl	20	Versuche	15	Versuche	0	Versuche	0
			der	15	10	10	10	0	10	0
			Versuche	10	10	10	10	0	10	0
CDCNr. 116	TNTC	10	i0	7	1	7	10		10
	TNTC	IO	10	5	5	4
	120-185	10	5	20	2	20		15		0
			4		10		2	10	10
			1				2	5
CDCNr. Ill	TNTC	10	10	15		15	6	10		0
				4	10		5	5	10
							1	4
	TNTC	10	8				2	0
			2	15		15	2	3		0
				10	9	10	2	0	10
				zu 2 Blatt	1	Zeichnungen	8
	86-164	10	9
			1

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Züchtung und zum Nachweis von osmotisch empfindlichen Mikroorganismen durch Rehydratisieren einer im wesentlichen trockenen, wasserabsorbierenden, nährstoffhaltigen Matrix durch Zusammenbringen mit einer wäßrigen Flüssigkeit, gleichzeitiges oder anschließendes Zusammenbringen dieser Matrix mit dem Mikroorganismus oder der zu untersuchenden Probe, in der der Mikroorganismus vermutet wird, und anschließendes Inkubieren der mit der rehydratisierten Matrix in Kontakt stehenden Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Rehydratisierungsflüssigkeit einsetzt, die einen wasserlöslichen, mehrwertigen Alkohol der allgemeinen Formel