DE1958678B2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Gefäß zur Untersuchung des Wachstums und der Physiologie von Bakterien.
Es sind bereits Vorrichtungen bekannt, welche die Untersuchung der enzymatischen Aktivitäten von
Bakterien ermöglichen. Diese biochemischen Methoden untersuchen nur die bakteriellen Enzyme, und sie
verwenden zur Durchführung Bakterien, welche rieh
nicht entwickeln müssen, ja sogar zerkleinerte Bakterien, wobei der Wirkstoff dann die in den Zellen enthaltene,
enzymatisch wirkende, chemische Substanz ist. Diese beschriebenen Mikromethoden erlauben die
Messung der bakteriellen Entwicklung nicht, die wichtige, für ein vollständigeres Verständnis brauchbare
Hinweise liefert.
In der Tat ergibt die Beobachtung des Wachstums ergänzend«; Informationen, um festzustellen, daß unter
Bakterien, welche alle ein bestimmtes Abbauvermögen für Harnstoff beispielsweise besitzen, bestimmte
Btikterien sich zur Entwicklung mit Harnstoff begnügen, andere verschiedene Wachstumsfaktoren
benötigen (Vitamine, Aminosäuren), und darüber hinaus entwickeln sich bestimmte Bakterien bei Abwesenheit
von Sauerstoff, während andere die Anwesenheit vom Luftsauerstoff benötigen. Die Untersuchung
des Wachstums liefert daher mehr Informationen als du; enzymatische Methode.
Die bkeiinnten enzymatischen Methoden erfordern
andererseits eine große Anzahl von Bakterien, um eine ausreichende Enzymmenge zur Verfügung zu
stellen, um unter günstigen Bedingungen und schnell den Abbau der chemischen Produkte festzustellen; sie
benötigen daher vorangegangene Züchtungen; daraus ergibt sich ein Zeitverlust, der entsprechend den Bakterienarten
mehrere Tage betragen kann.
Die enzymatischen Methoden erfordern auch spezielle Reagenzien, was spezifische Meßmethoden für
"> fast jede dieser Reagenzien mit sich bringt; demgegenüber
ist die Bestimmung des Wachstums eine Erscheinung, die mit Hilfe ienes einzigen Meßgeräts
sichtbar gemacht werden kann, wie groß auch immer die Anzahl der verwendeten chemischen Peagenzien
sein sollte. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Vorteile der Methode mit Beobachtung des
Wachstums von Bakterien sich hinsichtlich der biochemischen Methoden durch eine größere Anzahl von
erhaltenen Informationen und eine besondere Ein-
!5 fachheit der Apparatur auszeichnet
Es sind bereits Verfahren zur Messung des bakteriellen Wachstums bekannt.
Diese Verfahren verwenden gewöhnlich zwei Arten
von/Züchtungsgefäßen, nämlich Petri-Schalen und Reagenzgläser, und sie bedienen sich zweier Arten
von Züchtungsmedien, nämlich der flüssigen Medien und der festen Medien, welche im Warmen flüssig sind
und sich beim Abkühlen verfestigen.
tungsmedien und Reagenzgläser für flüssige Medien verwendet.
' festen Mediums entwickeln, tun dies in Anwesenheit des Sauerstoffs der Luft, ihr Wachstum und ihre Phy-
i» sioiogie finden aerob start. Sie entwickeln sich an der
Oberfläche, wobei sie Anhäufungen oder Kolonien bilden.
Die Bakterien, die in einem flüssigen Medium gezüchtet werden, bilden keine Kolonien und verteilen
i> sich in dem Medium; diejenigen, welche sich an der
Oberfläche befinden, befinden sich in Aerobiose, und diejenigen, weiche sich von der Oberfläche entfernt
in der Tiefe des Rohres entwickeln, befinden sich in Anaerobiose. Sie sind dem atmosphärischen Sauerstoff
nicht ausgesetzt. Die Physiologie von Bakterien ist vollständig verschieden, je nachdem, ob sie sich
aerob oder anaerob vermehren.
Die Untersuchung der Vermehrung von Bakterien muß sich daher sowohl auf aerobes als auch auf anaerobes
Wachstum erstrecken, sowohl auf flüssiges Medium als auch auf festes Medium. Das allgemein
verwendete Gefäßmaterial besteht aus Glas, welches platzbeanspruchend und relativ kostspielig ist.
Außerdem ist es erforderlich, 100 bis 150 ecm Züch-
■)0 tungsmedium zu verwenden. Das Gefäß muß ande rerseits
wiederverwendbar sein und erfordert daher Arbeiten zur Reinigung und zur Unterhaltung.
Wenn man das Wachstum von Bakterien untersuchen will, die dem Einfluß von 160 verschiedenen
chemischen Stoffen ausgesetzt sind, dann erfordert der Versuch in diesem Fall 160 Reagenzgläser und
darüber hinaus 160 Petri-Schalen pro Stamm, was gleichzeitige Untersuchungen von mehreren Dutzend
Stämmen undurchführbar macht. Demgegenüber ermöglicht es die Erfindung, daß 160 Gefäße ausreichen,
die infolge ihrer kleinen Abmessungen nur eine Fläche von ungefähr 30 cm X 12 cm einnehmen.
Ziel der Erfindung ist ein Gefäß, welches die Sichtbarmachung
des Wachstums von Bakterien gestattet, wobei nur eine kleine Anzahl von Bakterien verwendet
wird, d. h. wobei keine vorangehende Züchtung erforderlich ist.
richtung gemäß Anspruch 1 erreicht. Bezüglich von
Merkmalen bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung
wird auf die Unteransprüche verwiesen.
Die Erfindung wird durch die folgende Beschreibung verdeutlicht, wobei verschiedene Ausführungsformen
der Erfindung mit Bezug auf die Zeichnung erläutert werden. Es zeigt
Fig. 1 eine erste Ausführungsform des Gefäßes gemäß der Erfindung in perspektivischer Wiedergabe,
Fig. 3 eine Reihe dieser Gefäße auf einem Band für kontinuierliche Analyse,
Fig. 4eine Variante, bei der das Gefäß kreisförmig
ist,
Fig. 5 eine Platte, weiche eine größere Anzahl dieser
Gefäße für eine Serienanalyse trägt,
Fig. 6 und 7 perspektivische Ansichten zweier anderer Ausführungsformen der erfindungsgemäßen
Gefäße.
Aus Fig. 1 ist ersichtlich, daß das Gefäß 1 sich hauptsächlich aus zwei Abschnitten zusammensetzt:
einem Abschnitt 2, der sich gegen die freie Luft weit
öffnet und einen reichlichen Gasaustausdi ermöglicht,
und einem Abschnitt 3, dessen Oberfläche mit einem Film aus durchsichtigem Kunststoffmateria! bedeckt
ist, wodurch jeder Gasaustausch mit dem Außenmedium verhindert wird. Dieser Abschnitt 3 in Form eines
Rohres muß in einer waagerechten Lage verwendet werden, um den Gasaustausch zwischen dem
Abschnitt 3 und der Atmosphäre maximrJ herabzusetzen.
Diese zwei Abschnitte besitzen einen gemeinsamen Boden und stehen über eine öffnung 4 in Verbindung;
dies ersieht man am besten aus der Fig. 2. Das Gefäß ist auf einer Platte aus Kunststoffmaterial 5
aufgesetzt, auf welcher man eine Folie anordnen kann, weiche eine Reihe von Eelementen 6, 6', 6" (siehe
Fig. S) aus durchsichtigem Kunststoff material aufweisen, die die Seitenwände des Gefäßes ebenso wie
den Oberteil des Abschnitts 3 darstellen. Auf dem Boden de* beiden miteinander in Verbindung stehenden
Abschnitte 2 und 3 wird eine Schicht 8 angebracht, welche das chemische Reagenz, welches untersucht
werden soll, dispergiert in einer Schutzsubstanz enthält. Dieser Stoff kann in dem einen oder
dem anderen der beiden Abschnitte 2 und 3 oder in beiden bei ihrer Herstellung angebracht und mit ihnen
aufbewahrt werden.
Die Abmessungen der Vorrichtung sind im Vergleich zu üblicherweise in der Bakteriologie verwendeten
Petri-Schalen und Reagenzgläsern in den Abmessungen reduziert. Sie erlauben die Untersuchung
von Mengen an Züchtungsmedium, die ungefähr 50mal kleiner sind als diejenigen, welche bei bekannten
Verfahren angewandt werden. Sie sind dennoch ausreichend, um die Handhabung der Vorrichtung zu
erleichtern, und die Einführung der Reagenzien und der Bakterien kann ohne Schwierigkeit mitteis Pasteuer-Pipetten
oder mittels Spritzen erfolgen. Die von dem Abschnitt 2 und von dem Abschnitt 3 bedeckten
Flächen sind am besten gleich groß, trotzdem können sie auch verschieden sein.
Sie reichen aus, Beobachtungen mit dem bloßen Auge ebenso wie mit Hilfe von Meßinstrumenten zu
erlauben.
Das Flüssigkeitsvolumen, das in dem Abschnitt 2 enthalten sein kann, muß selbstverständlich größesein
als dasjenige, wt'ches in dem Abschnitt 3 enthalten ist, zweckmäßig ist es die doppelte Menge. Die
Höhe der im Abschnitt 2 enthaltenen Flüssigkeit liegt immer oberhalb des Niveaus der in dem Abschnitt 3
enthaltenen Flüssigkeit, derart, daß kein Gasaustausch zwischen dem Abschnitt 3 und dem Außenmedium
stattfinden kann.
Beispielsweise kann das Volumen des bis auf 4 mm Höhe gefüllten Abschnitts 2 ungefähr 0,45 ecm betragen,
und das Volumen des Abschnitts 3 ist ίο 0,20 ecm. Die Gesamtkapazität des Gefäßes liegt somit
unterhalb 1 ecm.
In der in Fig. 4 gezeigten Variante ist die Grundfläche
der Einheit der beiden Abschnitte 2' und 3' kreisförmig;
um den Gasaus tausch zwischen dem Abschnitt is 3' und dem Äußeren zu vermeiden, wird die öffnung 4
verkleinert, indem eine Einschnürung 10 hergestellt wird.
In diesem Fall wurde festgestellt, daß die Füllung des Abschnittes 3' des Gefäßes leichter ist als in dem
in der Fig. 1 dargestellten Fall.
Die verwendeten Materialien, ^"erden aus chemisch
inerten und durchsichtigen Kunststoffen Polystyrol, Polypropylen, Polyvinyl usw. ausgewählt, und man
stellt getrennt aus einem Teil den Boden, welcher nicht notwendigerweise durchsichtig ist, und das
Oberteil her, welches die Seitenwände und den abdekkenden Teil 7 des Abschnitts 3 umfaßt.
in an sich bekannter Weise, wie beispielsweise durch
jo Saugverformung, geformt wurde, wird dann durch
Das erhaltene Produkt wird bis zu seiner Verwendung in abgeschlossenen Umhüllungen steril gehalten,
j-, wobei das ganze auf diese Weise für mehrere Monate konserviert werden kann.
Wenn das Produkt in Form von Platten vorliegt, welche eine Reihe von Gefäßen, wie sie in der Fig. 3
und Fig. 5 gezeigt sind, aufweisen, trägt jedes der Gefäße eine Bezeichnung a, b, c, d, a', b', c', d\ welche
auf diese Weise die Bestimmung jeder Reaktion ermöglicht, weiche in diesen abgeschlossenen Räumen
stattfindet.
Die Fig. 6 und 7 zeigen zwei andere Ausführungsformen
des Gefäßes. Sie unterscheiden sich von den in den Fig. 1 bis 5 dargestellten dadurch, daß die Fläche
der Einfüllöffnung 11 bzw. 10 bei gleichem Volumen vergrößert ist.
für ein bestimmtes Füllvolumen die größtmögliche
und Luftblasen zu vermeiden. In der Praxis trifft dies zu, wenn dem Gefäß Querabmessungen (Linie XX)
möglichst ähnlich den Längsabmessungen (Linie YY) gegeben werden.
Während der Verwendung solcher Cefäße im Verlauf bakteriologischer Analyse wird auf folgende
Weise vorgegangen:
1. Man schneidet eine bestimmte Fläche aus der bo Platte aus Kunststoffmaterial 5, welche die Gefäße
1 trägt; in jedes der Gefäße wurden vorher die chemischen Substanzen, die zur Beobachtung
des Wachstums der Bakterien dienen, in genau abgemessenen Mengen in chemisch inerten und
in den in der Bakteriologie verwendeten Flüssigkeiten löslichen Substanzen mit hohem Molekulargewicht
dispergiert eingebracht. Diese Substanzen mit hohem Molekulargewicht bilden ein
lösendes Mittel, welches genaue Abmessungen für das brauchbare, chemische Produkt gestatten;
darüber hinaus bilden sie beim Trocknen Häutchen, welche den chemischen Stoff enthalten
und seine gute Konservierung sicherstellen. >
Zum Zettpunkt der Verwendung stellen diese löslichen Substanzen mit hohem Molekulargewicht
eine gute Dispersion der enthaltenen Stoffe sicher, selbst in dem Fall, in dem die chemischen
Produkte selbst wenig löslich sind. Die chemisehen, aktiven Substanzen können aus einer
Reihe von Aminosäuren, Tryptophan, Phenylalanin, Lysin, Arginin bestehen.
Die in der Fig. 2 wiedergegebene Schicht 8 stellt
Die in der Fig. 2 wiedergegebene Schicht 8 stellt
das Reagenz und das lösende Mittel nach der Trock- ι >
nung dar.
2. In jedes horizontal angeordnete Gefäß 1 wird die gleiche Menge Verdünnungsflüssigkeit, beispielsweise
ö,33 mi destilliertes Wasser oder 0,33 ml geschmolzener Nährboden eingeführt. -»
3. In jedes der Gefäße 1 wird dann eine Bakteriensuspension in destilliertem Wasser eingeführt,
welche 1000 Bakterien pro Liter enthält und wobei das eingeführte Volumen 0,05 ml beträgt.
4. Nach mehreren Stunden Inkubierung bei einer bestimmten Temperatur (37°) wird die Trübung
in jedem der beiden Abschnitte des Gefäßes gemessen, entweder mit dem bloßen Auge, wobei
auf einen Trübungsmaßstab Bezug genommen sn wird, oder mit Hilfe eines Trübungsmessers.
5. Die erhaltenen Ergebnisse werden mit zuvor erhaltenen Ergebnissen verglichen, entweder mit
Hilfe von Klassifizierungstabellen oder durch mathematische Auswertung der Information auf r»
einem Rechner.
6. Zusätzlich werden die Wirkungen des Wachstums der Bakterien auf untersuchte^), chemischein)
Substanzen mit Hilfe von Reagenzien oder nach Entnahme des Züchtungsmediums, m
chemisch oder physikalische Trennung oder durch Chromatographie in der Gasphase untersucht.
Die folgenden Beispiele erläutern die Verwendung der Vorrichtung: 4-,
Beispiel 1: Es soll die Atmungsart einer
Bakteriensorte bestimmt werden
Bakteriensorte bestimmt werden
Das verwendete Material enthält als chemisches Produkt Fleischpepton in einer Verdünnung von v>
0.15% in 1% Polyacrylamid in destilliertem Wasser.
Die chemische Produkte werden auf den Boden der Abschnitte 2 und 3 gebracht und dann getrocknet.
Zum Zeitpunkt der Verwendung wird das Gefäß 1 mit destilliertem, sterilem Wasser gefüllt, und es wird
ein Tropfen einer dünnen Suspension der zu untersuchenden Bakterien hinzugegeben. Gleicherweise
kann man der größeren Einfachheit halber die Bakte- bo
riensuspension in das destillierte Wasser geben und mit der Mischung das Gefäß 1 auffüllen.
Im Moment der Ablesung wird die Opazität infolge der Vermehrung der Bakterien in den beiden Abschnitten
bestimmt. Hieraus wird die Physiologie der Atmung des Bakteriums abgeleitet:
Vollkommen aerobe Bakterien entwickeln sich nicht in dem Abschnitt 3; aerob-anaerobe Bakterien
entwickeln sich in den beiden Abschnitten 2 und 3; anaerobe Bakterien entwickeln sich nur im Abschnitt
3.
Beispiel 2:
Züchtung unter vollkommener Aerobiose
Züchtung unter vollkommener Aerobiose
Die verwendungsbereite Vorrichtung enthält Natriumcitrat
als Kohlenstoffquelle und eine in Polyvinylalkohol eingebaute Quelle für anorganischen
Stickstoff; das ganze ist getrocknet.
Zum Zeitpunkt der Verwendung wird die Vorrichtung mit geschmolzenem 15%igen Nährboden
(AgarAgar) gefüllt. Nach Gelierung wird ein Tropfen der zu untersuchenden Bakteriensuspension eingebrachi.
Wenn die Vermein ung siaiigeiuiiucii iiai, i'iät
sich eine opake Schicht auf der Oberfläche des Nährbodens in dem Abschnit 2 gebildet. Unter Verwendung
des gleichen Gefäßes bei flüssigem Medium können sich die Bakterien in dem Abschnitt 3 und
in dem Abschnitt 2 vermehren oder auch nicht.
Man kann zeigen, daß bestimmte Bakterienarten das Citrat in dem Abschnitt 3 in Anaerobiose fermentieren
und es in dem Abschnitt 2 in Aerobiose oxydieren köi.'iien. Andere Sorten oxydieren es nur. Dieselbe
Anordnung ermöglicht die beiden gleichzeitigen Beobachtungen.
Beispiel 3:
Züchtung bei vollkommener Anaerobios«:
Züchtung bei vollkommener Anaerobios«:
Für diese Bakterien ist der Sauerstoff der Atmosphäre toxisch, sie sollen hiermit nicht in Kontakt
kommen. Die Kulturen entwickeln sich unter Stickstoff, Kohlendioxydgas oder Inertgas, sie werden mit
einer Spritze aufgenommen.
Der chemische, aktive Stoff wird ausschließlich auf dem Boden des Abschnitts 3 angebracht.
Das Gefäß 1 wird mit sterilem Paraffinöl so weit gefüllt, daß der Abschnitt 3 gefüllt ist.
In den Abschnitt 3 wird mit Hilfe einer Spritze destilliertes, durch Auskochen von Luft befreites V/asser
eingebracht. Das Wasser, welches schwerer als das Paraffinöl ist, nimmt das in dem Abschnitt 3 verfügbare
Volumen vollständig ein und drängt das öl in den Abschnitt 2 zurück. Das öl verschließt die öffnung
des Abschnitts 3 und hält hier einen vollkommenen anaeroben Zustand aufrecht. Dann werden die
zu untersuchenden Bakterien mit Hilfe einer au einer
Spritze angebrachten Nadel eingeführt; durch diese Arbeitsweise wird die Verwendung spezieller
Schränke für vollkommen anaerobe Bedingunger vermieden.
Die Messung der Trübung des Kulturmediums kann vorteilhafterweise durch optische Beobachtung
durchgeführt werden, indem ein die Lösung durchquerender oder sich auf der Oberfläche der Lösung
reflektierender und auf eine Photozelle auffallendei
Lichtstrahl verwendet wird.
Im Fall der Verwendung farbiger Reagenzien zui
Steuerung der Reaktion kann der Lichtstrahl monochromatisch oder bichromatisch sein.
Claims (4)
1. Gefäß zur Untersuchung des Wachstums und
der Physiologie von Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß es aus durchsichtigen) Material
beistehend gebildet ist und einen ersten, gegen Luft offenen und einen Becher bildenden Abschnitt
(2) und einen zweiten, geschlossenen und mit dem ersten Abschnitt durch eine auf dem Boden
des Gefäßes angebrachte Öffnung (4) in Verbindung stehenden Abschnitt (3) umfaßt, wobei
die Abmessungen im Vergleich zu üblicherweise verwendeten Petri-Schalen und Reagenzgläsern in
bezug auf die zur Untersuchung erforderlichen Mengen an Züchtungsmedium reduziert sind.
2. Gefäß nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Boden des ersten Abschnitts
länglich ist.
3. Gefäß nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnetdaß das Gesamtvolumen unter 1 ixm ist.
4. Gefäß nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es im Inneren chemische
Substanzen, die aus den Gruppen der zur Beobachtung des Wachstums von Bakterien dienenden
Stoffen ausgewählt sind, in Form einer auf dem Boden abgelagerten, Trockenen Schicht enthält.
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