DE1958678C3 - Gefäß zur Untersuchung des Wachstums und der Physiologie von Bakterien - Google Patents

Gefäß zur Untersuchung des Wachstums und der Physiologie von Bakterien

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Description

Die Erfindung betrifft ein Gefäß zur Untersuchung des Wachstums und der Physiologie von Bakterien.
Es sind bereits Vorrichtungen bekannt, welche die Untersuchung der enzymatischen Aktivitäten von Bakterien ermöglichen. Diese biochemischen Methoden untersuchen nur die bakteriellen Enzyme, und sie verwenden zur Durchführung Bakterien, welche sich nicht entwickeln müssen, ja sogar zerkleinerte Bakterien, wobei der Wirkstoff dann die in den Zellen enthaltene, enzymatisch wirkende, chemische Substanz ist. Diese beschriebenen Mikromethoden erlauben die Messung der bakteriellen Entwicklung nicht, die wichtige, für ein vollständigeres Verständnis brauchbaie Hinweise liefert.
In der Tat ergibt die Beobachtung des Wachstums ergänzende Informationen, um festzustellen, daß unter Bakterien, welche alle ein bestimmtes Abbauvermögen für Harnstoff beispielsweise besitzen, bestimmte Bakterien sich zur Entwicklung mit Harnstoff begnügen, andere verschiedene Wachstumsfaktoren benötigen (Vitamine, Aminosäuren), und darüber hinaus entwickeln sich bestimmte Bakterien bei Abwesenheit von Sauerstoff, während andere die Anwesenheit von Luftsauerstoff benötigen. Die Untersuchung des Wachstums liefert daher mehr Informationen als die enzymatische Methode.
Die bkeannten enzymatischen Methoden erfordern andererseits eine große Anzahl von Bakterien, um eine ausreichende Enzymmenge zur Verfügung zu stellen, um unter günstigen Bedingungen und schnell den Abbau der chemischen Produkte festzusteller; sie benötigen daher vorangegangene Züchtungen; daraus ergibt sich ein Zeitverlust, der entsprechend den Bakterienarten mehrere Tage betragen kann.
Die enzymatischen Methoden erfordern auch spezielle Reagenzien, was spezifische Meßmethoden für fast jede dieser Reagenzien mit sich bringt; demgegenüber ist die Bestimmung des Wachstums eine Erscheinung, die mit Hilfe ienes einzigen Meßgeräts sichtbar gemacht werden kann, wie groß auch immer die Anzahl der verwendeten chemischen Reagenzien sein sollte. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Vorteile der Methode mit Beobachtung des Wachstums von Bakterien sich hinsichtlich der biochemischen Methoden durch eine größere Anzahl von erhaltenen Informationen und eine besondere Einfachheit der Apparatur auszeichnet.
Es sind bereits Verfahren zur Messung des bakteriellen Wachstums bekannt.
Diese Verfahren verwenden gewöhnlich zwei Arten von Züchtungsgefäßen, nämlich Petri-Schalen und Reagenzgläser, und sie bedienen sich zweier Arten von Züchtungsmedien, nämlich der flüssigen Medien und der festen Medien, welche im Warmen flüssig sind und sich beim Abkühlen verfestigen.
Petri-Schalen werden besonders für feste Züchtungsmedien und Reagenzgläser für flüssige Medien verwendet.
Die Bakterien, die sich auf der Oberfläche eines festen Mediums entwickeln, tun dies in Anwesenheit des Sauerstoffs der Luft, ihr Wachstum und ihre Physiologie finden aerob statt. Sie entwickeln sich an der Oberfläche, wobei sie Anhäufungen oder Kolonien bilden.
Die Bakterien, die in einem flüssigen Medium gezüchtet werden, bilden keine Kolonien und verteilen sich in dem Medium; diejenigen, welche sich an der Oberfläche befinden, befinden sich in Aerobiose, und diejenigen, welche sich von der Oberfläche entfernt in der Tiefe des Rohres entwickeln, befinden sich in Anaerobiose. Sie sind dem atmosphärischen Sauerstoff nicht ausgesetzt. Die Physiologie von Bakterien ist vollständig verschieden, je nachdem, ob sie sich aerob oder anaerob vermehren.
Die Untersuchung der Vermehrung von Bakterien muß sich daher sowohl auf aerobes als auch auf anaerobes Wachstum erstrecken, sowohl auf flüssiges Medium als auch auf festes Medium. Das allgemein verwendete Gefäßmaterial besteht aus Glas, welches platzbeanspruchend und relativ kostspielig ist. Außerdem ist es erforderlich, 100 bis 150 ecm Züchtungsmedium zu verwenden. Das Gefäß muß andererseits wiederverwendbar sein und erfordert daher Arbeiten zur Reinigung und zur Unterhaltung.
Wenn man das Wachstum von Bakterien untersuchen will, die dem Einfluß von 160 verschiedenen chemischen Stoffen ausgesetzt sind, dann erfordert der Versuch in diesem Fall 160 Reagenzgläser und darüber hinaus 160 Petri-Schalen pro Stamm, was gleichzeitige Untersuchungen von mehreren Dutzend Stämmen undurchführbar macht. Demgegenüber ermöglicht es die Erfindung, daß 160 Gefäße ausreichen, die infolge ihrer kleinen Abmessungen nur eine Fläche von ungefähr 30 cm x 12 cm einnehmen.
Ziel der Erfindung ist ein Gefäß, welches die Sichtbarmachung des Wachstums von Bakterien gestattet, wobei nur eine kleine Anzahl von Bakterien verwendet wird, d. h. wobei keine vorangehende Züchtung erforderlich ist.
Dieses Ziel wird erfindungsgemaü durch die Vor-
richtung gemäß Anspruch 1 erreicht. Bezüglich von Merkmalen bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung wird auf die Unteransprüche verwiesen.
Die Erfindung wird durch die folgende Beschreibung verdeutlicht, wobei verschiedene Ausführungsformen der Erfindung mit Bezug auf die Zeichnung erläutert werden. Es zeigt
Fig. 1 eine erste Ausführungsform des Gefäßes gemäß der Erfindung in perspektivischer Wiedergabe, Fig. 2 dasselbe Gefäß im Längsschnitt,
Fig. 3 eine Reihe dieser Gefäße auf einem Band für kontinuierliche Analyse,
Fig. 4 eine Variante, bei der das Gefäß kreisförmig ist,
Fig. 5 eine Platte, welche eine größere Anzahl dieser Gefäße für eine Serienanalyse trägt,
Fig. 6 und 7 perspektivische Ansichten zweier anderer Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Gefäße.
Aus Fig. 1 ist ersichtlich, daß das Gefäß 1 sich hauptsächlich aus zwei Abschnitten zusammensetzt: einem Abschnitt 2, der sich gegen die freie Luft weit öffnet und einen reichlichen Gasaustausch ermöglicht, und einem Abschnitt 3, dessen Oberfläche mit einem Film aus durchsichtigem Kunststoffmaterial bedeckt ist, wodurch jeder Gasaustausch mit dem Außenmedium verhindert wird. Dieser Abschnitt 3 in Form eines Rohres muß in einer waagerechten Lage verwendet werden, um den Gasaustausch zwischen dem Abschnitt 3 und der Atmosphäre maximal herabzusetzen.
Diese zwei Abschnitte besitzen einen gemeinsamen Boden und stehen über eine öffnung 4 in Verbindung; dies ersieht man am besten aus der Fig. 2. Das Gefäß ist auf einer Platte aus Kunststoffmaterial 5 aufgesetzt, aufweicher man eine Folie anordnen kann, welche eine Reihe von Eelementen 6, 6', 6" (siehe Fig. 5) aus durchsichtigem Kunststoff material aufweisen, die die Seitenwände des Gefäßes ebenso wie den Oberteil des Abschnitts 3 darstellen. Auf dem Boden der beiden miteinander in Verbindung stehenden Abschnitte 2 und 3 wird eine Schicht 8 angebracht, welche das chemische Reagenz, welches untersucht werden soll, dispergiert in einer Schutzsubstanz enthält. Dieser Stoff kann in dem einen oder dem anderen der beiden Abschnitte 2 und 3 oder in beiden bei ihrer Herstellung angebracht und mit ihnen aufbewahrt werden.
Die Abmessungen der Vorrichtung sind im Vergleich zu üblicherweise in der Bakteriologie verwendeten Petri-Schalen und Reagenzgläsern in den Abmessungen reduziert. Sie erlauben die Untersuchung von Mengen an Züchtungsmedium, die ungefähr 50mal kleiner sind als diejenigen, welche bei bekannten Verfahren angewandt werden. Sie sind dennoch ausreichend, um die Handhabung der Vorrichtung zu erleichtern, und die Einführung der Reagenzien und der Bakterien kann ohne Schwierigkeif mittels Pasteuer-Pipetten oder mittels Spritzen erfolgen. Die von dem Abschnitt 2 und von dem Abschnitt 3 bedeckten Flächen sind am besten gleich groß, trotzdem können sie auch verschieden sein.
Sie reichen aus, Beobachtungen mit dem bloßen Auge ebenso wie mit Hilfe von Meßinstrumenten zu erlauben. ,
Das Flüssigkeitsvolumen, das in dem Abschnitt 2 enthalten sein kann, muß selbstverständlich größer sein als dasjenige, welches in dem Abschnitt 3 enthalten ist, zweckmäßig ist es die doppelte Menge. Die Höhe der im Abschnitt 2 enthaltenen Flüssigkeit liegt immer oberhalb des Niveaus der in dem Abschnitt 3 enthaltenen Flüssigkeit, derait, daß kein Gasaustausch zwischen dem Abschnitt 3 und dem Außenmedium stattfinden kann.
Beispielsweise kann das Volumen des bis auf 4 mm Höhe gefüllten Abschnitts 2 ungefähr 0,45 ecm betragen, und das Volumen des Abschnitts 3 ist 0,20 ecm. Die Gesamtkapazität des Gefäßes liegt somit unterhalb 1 ecm.
In der in Fig. 4 gezeigten Variante ist die Grundfläche der Einheit der beiden Abschnitte 2' und 3' kreisförmig; um den Gasaustausch zwischen dem Abschnitt 3'iind dem Äußeren zu vermeiden, wird die Öffnung 4 verkleinert, indem eine Einschnürung 10 hergestellt wird.
In diesem Fall wurde festgestellt, daß die Füllung des Abschnittes 3' des Gefäßes leichter ist als in dem in der Fig. 1 dargestellten Fall.
Die verwendeten Materialien werden aus chemisch inerten und durchsichtigen Kunststoffen Polystyrol, Polypropylen, Polyvinyl usw. ausgewählt, und man stellt getrennt aus einem Teil den Boden, welcher ι nicht notwendigerweise durchsichtig ist, und das Oberteil her, welches die Seitenwände und den abdekkenden Teil 7 des Abschnitts 3 umfaßt.
Dieses Oberteil, welches aus einer Kunststoff-Folie
in an sich bekannter Weise, wie beispielsweise durch
ι Saugverformung, geformt wurde, wird dann durch Verschmelzen oder Verkleben mit der Platte aus Kunststoffmaterial 5 vereinigt.
Das erhaltene Produkt wird bis zu seiner Verwendung in abgeschlossenen Umhüllungen steril gehalten, ι wobei das ganze auf diese Weise für mehrere Monate konserviert werden kann.
Wenn das Produkt in Form von Platten vorliegt, welche eine Reihe von Gefäßen, wie sie in der Fig. 3 und Fig. 5 gezeigt sind, aufweisen, trägt jedes der Gefäße eine Bezeichnung a, b, c, d, a', b', c', d\ weiche auf diese Weise die Bestimmung jeder Reaktion ermöglicht, welche in diesen abgeschlossenen Räumen stattfindet.
Die Fig. 6 und 7 zeigen zwei andere Ausführungsformen des Gefäßes. Sie unterscheiden sich von den in den Fig. 1 bis 5 dargestellten dadurch, daß die Fläche der Einfüllöffnung 11 bzw. 10 bei gleichem Volumen vergrößert ist.
Bei diesen Ausführungsformen wil! man dem Gefäß für ein bestimmtes Füllvolumen die größtmögliche Querabmessung geben, um das Füllen zu erleichtern und Luftblasen zu vermeiden. In der Praxis trifft dies zu, wenn dem Gefäß Querabmessungen (Linie ΑΆ") möglichst ähnlich den Längsabmessungen (Linie YY) gegeben werden.
Während der Verwendung solcher Gefäße im Verlauf bakteriologischer Analyse wird auf folgende Weise vorgegangen:
1. Man schneidet eine bestimmte Fläche aus der Platte aus Kunststoffmaterial 5, welche die Gefäße 1 trägt; in jedes der Gefäße wurden vorher die chemischen Substanzen, die zur Beobachtung des Wachstums der Bakterien dienen, in genau abgemessenen Mengen in chemisch inerten und in den in der Bakteriologie verwendeten Flüssigkeiten löslichen Substanzen mit hohem Molekulargewicht dispergiert eingebracht. Diese Substanzen mit hohem Molekulargewicht bilden ein
lösendes Mittel, welches genaue Abmessungen für das brauchbare, chemische Produkt gestatten; darüber hinaus bilden sie beim Trocknen Häutchen, welche den chemischen Stoff enthalten und seine gute Konservierung sicherstellen. "> Zum Zeitpunkt der Verwendung stellen diese löslichen Substanzen mit hohem Molekulargewichteine gute Dispersion der enthaltenen Stoffe sicher, selbst in dem Fall, in dem die chemischen Produkte selbst wenig löslich sind. Die chemi- m sehen, aktiven Substanzen können aus einer Reihe von Aminosäuren, Tryptophan, Phenylalanin, Lysin, Arginin bestehen.
Die in der Fig. 2 wiedergegebene Schicht 8 stellt
das Reagenz und das lösende Mittel nach der Trocknung dar.
2. In jedes horizontal angeordnete Gefäß Ί wird die gleiche Menge Verdünnungsflüssigkeit, beispielsweise 0,33 ml destilliertes Wasser oder 0,33 ml geschmolzener Nährboden eingeführt. 2u
3. In jedes der Gefäße 1 wird dann eine Bakteriensuspension in destilliertem Wasser eingeführt, welche 1000 Bakterien pro Liter enthält und wobei das eingeführte Volumen 0,05 ml beträgt. 2")
Nach mehreren Stunden Inkubierung bei einer bestimmten Temperatur (37°) wird die Trübung in jedem der beiden Abschnitte des Gefäßes gemessen, entweder mit dem bloßen Auge, wobei auf einen Trübungsmaßstab Bezug genommen wird, oder mit Hilfe eines Trübungsmessers.
5. Die erhaltenen Ergebnisse werden mit zuvor erhaltenen Ergebnissen verglichen, entweder mit Hilfe von Klassifizierungstabellen oder durch mathematische Auswertung der Information auf r> einem Rechner.
6. Zusätzlich werden die Wirkungen des Wachstums der Bakterien auf untersuchte(n), chemischein) Substanzen mit Hilfe von Reagenzien oder nach Entnahme des Züchtungsmediums, ■?» chemisch oder physikalische Trennung oder durch Chromatographie in der Gasphase untersucht.
Die folgenden Beispiele erläutern die Verwendung der Vorrichtung: ■»>
Beispiel 1: Es soll die Atmungsart einer
Bakteriensorte bestimmt werden
Das verwendete Material enthält als chemisches Produkt Fleischpepton in einer Verdünnung von -,<i 0,15% in 1% Polyacrylamid in destilliertem Wasser.
Die chemische Produkte werden auf den Boden der Abschnitte 2 und 3 gebracht und dann getrocknet.
Zum Zeitpunkt der Verwendung wird das Gefäß 1 mit destilliertem, sterilem Wasser gefüllt, und es wird ein Tropfen einer dünnen Suspension der zu untersuchenden Bakterien hinzugegeben. Gleicherweise kann man der größeren Einfachheit halber die Bakte- M riensuspension in das destillierte Wasser geben und mit der Mischung das Gefäß 1 auffüllen.
Im Moment der Ablesung wird die Opazität infolge der Vermehrung der Bakterien in den beiden Abschnitten bestimmt. Hieraus wird die Physiologie dei Atmung des Bakteriums abgeleitet:
Vollkommen aerobe Bakterien entwickeln siel· nicht in dem Abschnitt 3; aerob-anaerobe Bakterier entwickeln sich in den beiden Abschnitten 2 und 3 anaerobe Bakterien entwickeln sich nur im Abschnitt 3.
Beispiel 2:
Züchtung unter vollkommener Aerobiose
Die verwendungsbereite Vorrichtung enthält Na triumcitrat als Kohlenstoffquelle und eine in Polyvinylalkohol eingebaute Quelle für anorganischer Stickstoff; das ganze ist getrocknet.
Zum Zeitpunkt der Verwendung wird die Vorrichtung mit geschmolzenem 15%igen Nährboder (AgarAgar) gefüllt. Nach Gelierung wird ein Tropfer der zu untersuchenden Bakteriensuspension eingebracht. Wenn die Vermehrung stattgefunden hat, hai sich eine opake Schicht auf der Oberfläche des Nährbodens in dem Abschnit 2 gebildet. Unter Verwendung des gleichen Gefäßes bei flüssigem Medium können sich die Bakterien in dem Abschnitt 3 unc in dem Abschnitt 2 vermehren oder auch nicht.
Man kann zeigen, daß bestimmte Bakterienarter dasCitratin dem Abschnitt 3 in Anaerobiose fermentieren und es in dem Abschnitt 2 in Aerobiose oxydieren können. Andere Sorten oxydieren es nur. Dieselbe Anordnung ermöglicht die beiden gleichzeitigen Beobachtungen.
Beispiel 3:
Züchtung bei vollkommener Anaerobiose
Für diese Bakterien ist der Sauerstoff der Atmosphäre toxisch, sie sollen hiermit nicht in Kontak kommen. Die Kulturen entwickeln sich unter Stickstoff, Kohlendioxydgas oder Inertgas, sie werden mii einer Spritze aufgenommen.
Der chemische, aktive Stoff wird ausschließlich aul dem Boden des Abschnitts 3 angebracht.
Das Gefäß 1 wird mit sterilem Paraffinöl so weil gefüllt, daß der Abschnitt 3 gefüllt ist.
In den Abschnitt 3 wird mit Hilfe einer Spritze destilliertes, durch Auskochen von Luft befreites Wassei eingebracht. Das Wasser, welches schwerer als das Paraffinöl ist, nimmt das in dem Abschnitt 3 verfügbare Volumen vollständig ein und drängt das öl ir den Abschnitt 2 zurück. Das öl verschließt die öffnung des Abschnitts 3 und hält hier einen vollkomme nen anaeroben Zustand aufrecht. Dann werden die zu untersuchenden Bakterien mit Hilfe einer auf einei Spritze angebrachten Nadel eingeführt; durch dies« Arbeitsweise wird die Verwendung spezielle! Schränke für vollkommen anaerobe Bedingunger vermieden.
Die Messung der Trübung des Kulturmediums kam vorteilhafterweise durch optische Beobachtung durchgeführt werden, indem ein die Lösung durchquerender oder sich auf der Oberfläche der Lösunj reflektierender und auf eine Photozelle auffallende] Lichtstrahl verwendet wird.
Im Fall der Verwendung farbiger Reagenzien zvu Steuerung der Reaktion kann der Lichtstrahl monochromatisch oder bichromatisch sein.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Gefäß zur Untersuchung des Wachstums und der Physiologie von Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß es aus durchsichtigem Material bestehend gebildet ist und einen ersten, gegen Luft offenen und einen Becher bildenden Abschnitt (2) und einen zweiten, geschlossenen und mit dem ersten Abschnitt durch eine auf dem Boden des Gefäßes angebrachte öffnung (4) in Verbindung stehenden Abschnitt (3) umfaßt, wobei die Abmessungen im Vergleich zu üblicherweise verwendeten Petri-Schalen und Reagenzgläsern in bezug auf die zur Untersuchung erforderlichen Mengen an Züchtungsmedium reduziert sind.
2. Gefäß nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Boden des ersten Abschnitts länglich ist.
3. Gefäß nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gesamtvolumen unter 1 ecm ist.
4. Gefäß nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es im Inneren chemische Substanzen, die aus den Gruppen der zur Beobachtung des Wachstums von Bakterien dienenden Stoffen ausgewählt sind, in Form einer auf dem Boden abgelagerten, trockenen Schicht enthält.
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