DE2634392A1

DE2634392A1 - Fliessfaehiges, sterilisierbares grundmedium und seine verwendung zur zuechtung und identifizierung von mikroorganismen

Info

Publication number: DE2634392A1
Application number: DE19762634392
Authority: DE
Inventors: Jean Buissiere
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1975-07-30
Filing date: 1976-07-30
Publication date: 1977-02-17
Also published as: FR2319709B1; DE2634392C2; US4218537A; BE844753A; NL7608427A; ES450835A1; FR2319709A1; OA05397A

Description

" Fließfähiges, sterilisierbares Grundmedium und seine Verwendung zur Züchtung und Identifizierung von Mikroorganismen"

Priorität: 30. 7. 1975, Frankreich, Nr. 75 23851

Die Erfindung betrifft ein neues Grundmedium, das insbesondere zur Herstellung von Nährböden für die verschiedensten Mikroorganismen dient und das zur Vermehrung der Mikroorganismen notwendigen Nährelemente bzw. Nährstoffe sowie gegebenenfalls verschiedene Substanzen, aufnehmen kann, deren Auswirkungen auf die Vermehrung man untersuchen will. Die Erfindung betrifft ferner die so hergestellten Nährböden.

Es ist bekannt, daß nicht alle Mikroorganismen, z.B. nicht alle Arten von Bakterien, sich auf den gleichen Nährböden entwickeln. Für jede Familie, Jede Gattung, mitunter sogar für sehr verwandte Arten sind zweckmäßig spezielle Nährböden zu verwenden. Desgleichen wird die Vermehrung ©ines speziellen Mikroorganismus durch verschiedenes, dea Nährböden zugesetzte

703807/0805 j

Substanzen entweder begünstigt oder aber gehemmt. Die Folge ist eine extreme Verschiedenartigkeit des Verhaltens der Mikroorganismen gegenüber den verschiedenen bekannten Nährböden. Die Folge ist ferner die Möglichkeit der Identifizierung von Familien, Gattungen, ja sogar von speziellen Arten von Mikroorganismen, oder der Nachprüfung bestimmter wesentlicher Eigenschaften dieser Mikroorganismen, bestimmte Nährstoffe in bestimmten Nährböden, gegebenenfalls in Anwesenheit bestimmter chemischer Substanzen oder biologischer Stoffe zu assimilieren.

Diese Identifizierungs- bzw. Kennzeichnungsmethoden sind häufig schwer durchzuführen, da die Grundmedien zur Herstellung der bekannten Nährböden sich nicht für eine systematische und genormte Durchführung sämtlicher notwendigen Versuche zur Identifizierung bzw. Kennzeichnung eignen.

Zu den grundlegenden Eigenschaften dieser Mikroorganismen gehört z.B. insbesondere die Fähigkeit, sich in Gegenwart oder Abwesenheit von Sauerstoff zu vermehren. Sauerstoff ist ein notwendiger Elektronen-Acceptor (Wasserstoff-Acceptor) für die obligaten Aerobier, während er andererseits ein Stoffwechselgift für die obligaten Anaerobier ist. Zwischen diesen beiden Extremen finden sich auch aero-anaerobe Bakterienfamilien, die sich sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von Sauerstoff entwickeln können (fakultative Aerobier und Anaerobier). In Jeder der vorerwähnten Kategorien unterscheidet man manchmal noch zwischen immobilen und mobilen Mikroorgani smen.

709807/0805

Bei den bekannten flüssigen oder festen Nährböden ist es nicht möglich, in einem einzigen Versuch schnell zwischen obligaten Aerobien oder Anaerobien und aero-anaeroben Mikroorganismen zu unterscheiden. Die Züchtung streng anaerober Mikroorganismen im flüssigen Nährmedium, selbst submers, ist nicht leicht, da der Sauerstoff in die Nährflüssigkeit diffundiert, sofern man nicht unter Ausschluß von Sauerstoff arbeitet. Außerdem ist es bei der Züchtung in flüssigen Nährböden, insbesondere in Gegenwart von Sauerstoff, nicht immer möglich, zwischen obligaten Aerobiern und aero-anaeroben Mikroorganismen zu unterscheiden, da sich die aeroben Mikroorganismen im gesamten flüssigen Nährboden entwickeln können. Bei Abwesenheit von Sauerstoff kann man ebenfalls nicht immer zwischen aeroanaeroben und obligat anaeroben Mikroorganismen unterscheiden, da auch die aero-anaeroben Mikroorganismen sich im gesamten flüssigen Nährboden entwickeln können.

Die flüssigen Nährböden sind zwar leicht herzustellen, beispielsweise durch Auflösen oder Suspendieren der Nährstoffe oder der Substanzen, deren Verwertung untersucht werden soll, und sind ebenso leicht mit den zu untersuchenden Mikroorganismen bzw. Bakterien zu beimpfen. Wie vorstehend beschrieben, genügt die Verwendung flüssiger Nährböden nicht immer zur Kennzeichnung und/oder Identifizierung. Deshalb werden im bakteriologischen Laboratorium gewöhnlich noch immer feste Nährböden benutzt, trotz der hierbei auftretenden Schwierigkeiten. Die streng aeroben Mikroorganismen entwickeln sich nämlich nur an der Oberfläche der festen Nährböden, während

709807/0805

die obligat anaeroben Mikroorganismen sich in der Tiefe des festen Nährbodens vermehren. Auf diese Weise kann man obligat aerobe von aero-anaeroben Mikroorganismen unterscheiden.

Die festen Nährböden müssen verschiedene Bedingungen erfüllen. Sie sollen im wesentlichen biologisch nicht abbaubar und gegenüber Bakterienkulturen inert sein. Sie müssen ferner transparent sein und sich bei relativ niedrigen Temperaturen verflüssigen lassen, um das Beimpfen mit den zu züchtenden Stämmen der Mikroorganismen zu erleichtern, gleichzeitig bei diesen Temperaturen jedoch nicht verflüssigbar sein.

Zur Zeit entsprechen nur Agar-Gele (Gelose-Gele) diesen anscheinend widersprüchlichen Bedingungen. Die festen Agar-Gele, die mindestens 10 g, und im allgemeinen etwa 20 g Agar pro Liter Wasser enthalten, lassen sich beim Erwärmen auf Temperaturen von etwa 100⁰C verflüssigen. Diese Gele bleiben bei den üblichen Züchtungstemperatüren von Mikroorganismen fest. Nach der Verflüssigung bleiben diese Gele Jedoch bis zu einer Temperatur von etwa 35 bis 40°C flüssig. Dies gestattet ein Beimpfen der Gele ohne Gefahr der Abtötung der Mikroorganismen, bevor das Gel wieder fest, elastisch und transparent geworden ist. Auf Grund der vorgenannten Schwierigkeiten werden nur in Ausnahmefällen andere spezielle Geliermittel verwendet, z.B. Kieselsäure, deren Gele jedoch sehr schwer herzustellen sind.

In der Praxis war es also bisher erforderlich, das Gelose-Gel zunächst bei erhöhter Temperatur zu verflüssigen und an-

709807/0805 ^J

schließend wieder unter "bestimmten Bedingungen abzukühlen. Außerdem verhindert die Verflüssigung bei hohen Temperaturen eine Untersuchung der Auswirkung wärmeempfindlicher Verbindungen (Vitamine, Aminosäuren, bestimmte Makromoleküle) auf das Wachstum von Mikroorganismen. Die erforderliche Verflüssigung bei erhöhten Temperaturen erschwert bisweilen auch die Verwendung von Gefäßen aus Kunststoff.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Grundmedium zu schaffen, das die herkömmlichen flüssigen und festen Nährbödem ersetzen kann, also gleichzeitig die Eigenschaft von festen und flüssigen Nährböden besitzt, dessen Handhabung einfach ist und keine Wärmebehandlung zur Verflüssigung erfordert.

Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem Befund, daß das Wachstum obligat aerober Mikroorganismen in einer Flüssigkeit durch Erhöhung der Viskosität dieser Flüssigkeit ziemlich rasch unterbunden werden kann, durch Zugabe einer die Viskosität erhöhenden Verbindung in bestimmten Mengen, wobei eine ausreichende Fließfähigkeit der Flüssigkeit aufrechterhalten bleiben soll, damit eine Sedimentation der Mikroorganismen, auch der immobilen Mikroorganismen, auf Grund der Schwerkraft wie in einem echten flüssigen Medium möglich ist.

Die Flüssigkeit wird also auf eine bestimmte Viskosität eingestellt, so daß die obligat aeroben Mikroorganismen nur an oder nahe der Oberfläche sieh vemeiiren-

709807/0805

-D-

Dieses Phänomen beruht vermutlich darauf, daß infolge der Erhöhung der Viskosität der Flüssigkeit der Sauerstoff weniger leicht in das flüssige Medium diffundiert. Auf Grund der verminderten Diffusion des Sauerstoffs in die Flüssigkeit können sich umgekehrt die obligaten Anaerobier, die sich unter dem Einfluß der Schwerkraft in dieser Flüssigkeit ablagern, in der Tiefe der Flüssigkeit vermehren.

Das Grundmedium der Erfindung kann also als ein Medium definiert werden, dessen Viskosität so bemessen ist, daß sich obligate Aerobier, auch mobile Mikroorganismen, nur an oder nahe der Oberfläche des Mediums vermehren. Die Viskosität des Mediums soll aber dessen Fließfähigkeit nicht derart beeinträchtigen, daß sich die Mikroorganismen nicht auf Grund der Schwerkraft ablagern und sich folglich in der Tiefe vermehren, sofern es sich um obligat anaerobe Mikroorganismen handelt.

Das Grundmedium kann also als ein Medium mit solcher Viskosität definiert werden, daß die Diffusionsfähigkeit des Sauerstoffs genügend herabgesetzt ist, um die Vermehrung der überimpften obligat aeroben Mikroorganismen nur an oder nahe der Oberfläche des Mediums zu ermöglichen.

Wie sich aus dem Vorstehenden ergibt, müssen die betreffenden Grundmedien bzw. die erfindungsgemäß verwendeten Viskositätserhöher sterilisierbar, inert gegenüber Mikroorganismen und im wesentlichen nicht biologisch abbaubar, d.h. durch die Mikroorganismen nicht assimilierbar sein, zumindest während der

709807/0805

Dauer, die zur Durchführung und Aufrechterhaltung der normal vollzogenen Kulturen erforderlich ist, insbesondere bei der Identifizierung bzw. Kennzeichnung der Mikroorganismen der betreffenden Gattung.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Grundraedium gemäß der Erfindung ein wäßriges, homogenes, transparentes Medium, das einen Viskositätserhöher enthält, der den vorstehend angegebenen Bedingungen entspricht und in entsprechender Menge verwendet worden ist, um dem Grundmedium die erforderliche Viskosität zu verleihen.

Die Viskosität des Grundmediums der Erfindung beträgt im allgemeinen etwa 50 bis 250 Centipoise. Die optimalen Viskositätswerte liegen in der Größenordnung von 100 bis 200 cP. Falls das Grundmedium thixotrope Eigenschaften aufweist, ist der betreffende Viskositätswert derjenige des im Ruhezustand befindlichen Mediums; wird die Messung jedoch unverzüglich nach dem Rühren des Grundmediums vorgenommen, kann der gemessene Wert um mehrere Zehnerstellen (Centipoise) niedriger liegen.

Der Viskositätserhöher, der dem Grundmedium diese Viskosität verleiht, kann in Form einer Lösung oder Suspension in Wasser vorliegen. Seine Konzentration hängt von seiner Art ab. Er muß die Sterilisation des Grundmediums ohne Schädigung nach den üblichen Methoden, wie Erhitzen im Autoklaven oder Ultrafiltration, zulassen. Er muß seine gegenüber den Mikroorganismen inerten Eigenschaften auch in wäßriger Lösung oder Suspen-

709807/0805 J

sion beibehalten. Der Viskositätserhöher soll also das Wachstum von Mikroorganismen, insbesondere von Bakterien, nicht beeinträchtigen.

Der Viskositätserhöher kann das bisher als Geliermittel für feste Nährböden verwendete Agar (Gelose) sein. Die Konzentration der Gelose beträgt vorzugsweise etwa 1,2 bis 1,6 g/Liter. Eine Konzentration von 1,4 g/Liter führt zu einer Viskosität des Grundmediums in der Größenordnung von 100 cP. In allen Fällen ist die Agarkonzentration beträchtlich geringer als die herkömmlicherweise für die Herstellung der festen Nährböden verwendeten Konzentrationen.

Gemäß anderen Ausführungsformen kann der Viskositätserhöher auch eine natürlich vorkommende oder synthetische makromolekulare Verbindung sein, sofern sie die vorgenannten Bedingungen erfüllt. Beispiele sind lösliche Cellulosederivate, wie Carboxymethylcellulose, obwohl sie in bestimmten Fällen durch bestimmte Bakterien etwas abgebaut werden. Beispiele für synthetische makromolekulare Verbindungen sind Polyacrylamide und Vinylpolymere, wie Polyvinylalkohol oder Polyvinylpyrrolidon. Die Konzentration dieser Verbindungen hängt von ihrer Art und ihrem Molekulargewicht ab. Man erhält z.B. ein Grundmedium mit geeigneter Viskosität bei Verwendung von Polyacrylamid-Gel in einer Menge von 5 g/Liter. Im Gegensatz zu Agar, dessen Zusammensetzung Schwankungen unterworfen ist, sind die synthetischen Viskositätserhöher von gleichbleibender Qualität.

709807/0805

Das Grundmedium der Erfindung eignet sich zur Herstellung von Nährböden für Mikroorganismen, insbesondere Bakterien. Überraschenderweise besitzt das Grundraedium gleichzeitig die Eigenschaften und Verhaltensweisen gegenüber dem Wachstum von Bakterien von flüssigen und festen Medien, so daß man das erfindungsgemäße Grundmedium als "universelles Medium" ansehen kann.

Das Grundmedium der Erfindung ist somit ein viskoses Medium, das sich durch Anwesenheit eines Viskositätserhöhers von den klassischen flüssigen Medien unterscheidet, die nicht merklich viskoser sind als Wasser. Die Viskosität des Grundmediums ist Jedoch so niedrig, daß es ebenso leicht zu handhaben und einzusetzen ist wie Wasser. Es ist immer gebrauchsfertig, ohne daß eine spezielle Wärmebehandlung nötig wäre; es ist fließfähig und leicht umzugießen. Das Grundmedium ist leicht mit Mikroorganismen zu beimpfen, die sich darin vor oder nach der Entwicklung durch Rühren oder Schütteln gleichmäßig verteilen lassen. Die verschiedensten Nährböden lassen sich aus dem Grundmedium durch Zusatz von beispielsweise Nährstoffen oder Antibiotika herstellen.

Mit dem Grundmedium der Erfindung lassen sich Mikroorganismen, wie Bakterien, durch die Art ihres Wachstums identifizieren, aber ohne die Nachteile, die bei kombinierter Anwendung verschiedener flüssiger und fester Nährböden auftreten. Beispielsweise verhält sich das Grundmedium bei der Kultur von aeroben und anaeroben Bakterien wie ein fester Nährboden, so

709807/080S ^J

daß die Bakterien im Nährboden aufgrund der verminderten Diffusion von Gasen nicht mit Sauerstoff in Berührung kommen. Das Verhalten des Grundmediums der Erfindung ähnelt dagegen hinsichtlich der Verteilung der Bakterien den flüssigen Nährböden. Selbst die immobilen Bakterien können sich allein auf Grund der Schwerkraft am Boden des Grundmediums ablagern, die obligat aeroben Bakterien können sich dort aber nicht vermehren. Bei den obligaten Aerobiern, selbst den mobilen Bakterien, erfolgt also eine Vermehrung an oder nahe der Oberfläche, bei den Aero-anaerobLam eine Entwicklung an der Oberfläche und in der Tiefe und bei den obligat anaeroben Bakterien eine Entwicklung nur in der Tiefe des Grundmediums.

Zur Identifizierung eines Bakterientyps unter den drei vorgenannten Typen wird ein aus dem Grundmedium der Erfindung und aus Nährstoffen bestehender Nährboden mit einer Kultur der Bakterien beimpft und inkubiert. Sodann wird bestimmt, wo sich die Bakterien konzentriert haben, beispielsweise durch visueles Beobachten, oder automatisch, z.B. mit Hilfe eines Densitometers oder eines Spektrophotometers. Das Grundmedium der Erfindung hat den Vorteil, daß es durch Aufbringen eines einzigen Tropfens einer Mikroorganismensuspension auf seine Oberfläche beimpft werden kann. Es eignet sich gut zur Reihenuntersuchung. Es eignet sich ebenso gut für die schwierigere Identifizierung von Mikroorganismen, wobei man Verbindungen eingreifen läßt, welche die Wachstumse^igenschaften der Mikroorganismen, insbesondere die Art oder die Geschwindigkeit des Wachstums, modifizieren können. Diese Verbindungen können

709807/0805 _i

chemischer oder biologischer Natur sein. Diese Verbindungen wirken mehr oder weniger selektiv auf bestimmte Bakterienarten wachsturasfördernd oder -hemmend. Beispiele für diese Verbindungen sind Antibiotika oder Stoffe, die Sauerstoff in gebundener Form enthalten und die durch bestimmte Bakterienarten verwendet werden können. Außerdem können diese Verbindungen in unterschiedlicher Konzentration eingesetzt werden. Das Grundmedium der Erfindung hat den weiteren Vorteil, daß es die quantitative Bestimmung des Wachstums der Mikroorganismen erleichtert. Diese Bestimmung kann durch Nephelometrie erfolgen. Die Art der Bestimmung ist von der Art des Wachstums der untersuchten Mikroorganismen unabhängig. Das viskose Kulturmedium wird gerührt oder geschüttelt, um die Mikroorganismen, die sich an der Oberfläche vermehrt haben, zu suspendieren. Die nephelometrieehe Bestimmung kann also auf aerobe und anaerobe Mikroorganismen angewendet werden.

Das Grundmedium der Erfindung läßt sich in allen Gefäßen einsetzen, die nicht von Mikroorganismen angegriffen werden, insbesondere in Gefäßen aus transparenten Kunststoffen, deren

Verwendung häufig viel praktischer ist als äie Verwendung von Glasgefäßen.

Die Erfindung betrifft auch die Nährböden, die aus dem Grundmedium und zugesetzten Nährstoffen oder Substanzen, deren Auswirkung auf das Wachstum der Mikroorganismen untersucht werden soll, bestehen.

"709807/080S

Die Erfindung betrifft insbesondere Nährböden, die im Grundmedium die wichtigsten Bestandteile der klassischen Nährböden enthalten. Sie sind damit äußerst vielseitig anwendbar. Zu den wesentlichen Bestandteilen zählen anorganische oder organische Stickstoffquellen, Kohlenstoff- und Energiequellen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Wasser wird mit Agar (Gelose DIFCO) in einer Konzentration von 1,4 g/Liter versetzt. Das erhaltene Grundmedium kann nach der Sterilisation durch wesentliche Nährstoffe, wie Peptone aus Fleisch, vervollständigt werden. Das Medium wird sodann in gleichen Volumina in eine Reihe von Röhrchen oder Küvetten gegeben. Man kann Reagenzröhrchen aus Glas verwenden, doch ist die Anwendung von transparenten Kunststoffröhrchen von Vorteil> die nach der Verwendung vernichtet werden und so bemessen sind, daß sie eine wirtschaftliche Anwendung des Mediums zulassen. Vorteilhafterweise verwendet man Röhrchen, bei denen das Größenverhältnis von Grundfläche zu Höhe 1 : 2 bis 1 : 3 beträgt. Man bringt z.B. 2 ml Medium in ein Röhrchen mit einer

2
Grundfläche von 1 cm . Dann beträgt die Höhe 2 cm.

Sodann werden in die verschiedenen Röhrchen die Verbindungen gegeben, deren Wirkungen untersucht werden sollen. Auf die Oberfläche des Mediums in jedem Röhrchen wird ein Tropfen der zu untersuchenden Bakteriensuspension gebracht.

709807/0805 ^J

Beispiel 2

10 gleiche Röhrchen in einem Träger, die gleiche Volumina des Grundmediums und eine Nährsubstanz (Peptone aus Fleisch) enthalten, werden in den steigenden Konzentrationen von 5, 10, 20, 40, 60, 120 und 240 g/Liter Natriumchlorid versetzt. Diese Röhrchen werden dann mit Proben beimpft, die durch verschiedene Bakterienarten verunreinigt sind, beispielsweise Faeces oder verunreinigte Nahrungsmittel.

Nach 24stündiger Bebrütung hat sich nur die Natriumchlorid gegenüber resistenteste Art in den Röhrchen entwickelt, welche die stärksten NaCl-Konzentrationen enthalten. Auf diese Weise gelingt eine Isolierung dieser Bakterienart von allen anderen. Man kann sie an der Oberfläche und/oder in der Tiefe des Röhrchens entnehmen, je nachdem, wo die Vermehrung stattfand. Je nachdem, ob sich diese Art an der Oberfläche, in der Tiefe oder gleichzeitig an der Oberfläche und in der Tiefe vermehrt hat, kann man sie als eine aerobe, anaerobe oder aero-anaerobe Art identifizieren.

Tauscht man das Natriumchlorid gegen einen anderen Hemmstoff aus, so kann man auf gleiche Weise die gegenüber diesen Hemmstoff resistente Art herausfinden und in dem Röhrchen isolieren, in dem die Hemmstoffkonzentration am höchsten ist.

Falls die aus dem letzten Röhrchen entnommene Kultur noch mehrere Bakterienarten enthält, wird sie zum Beimpfen einer weiteren Reihe von Röhrchen oder vieler aufeinanderfolgender

7 09807/0805 j

Reihen von Röhrchen benutzt, welche verschiedene Hemmstoffe mit in jeder Reihe zunehmender Konzentration enthalten, um so diese Arten zu isolieren.

Man kann die Gesamtheit dieser Arbeitsgänge programmieren, ihre Durchführung automatisieren, die Resultate durch Photometrie aufzeichnen und die Informationen durch Rechner verarbeiten.

Beispiel 3

In ein Röhrchen mit den im Beispiel 1 angegebenen Proportionen bringt man 2 bis 3 ml eines wäßrigen Nährmediums, das 1,4 g/Liter Agar (Gelose DIFCO) und 1 g/Liter Kaliumnitrat enthält.

Ein Tropfen einer Suspension aus den zu analysierenden obligat aeroben Bakterien wird auf die Oberfläche des Nährmediums mit Hilfe einer Pipette aufgebracht. Die Bakterien setzen sich langsam im Nährmedium ab.

Während der Inkubation bei einer bestimmten Temperatur, z.B. 30⁰C, brauchen die Bakterien, welche den Sauerstoff des Kaliumnitrats verwerten können, keinen atmosphärischen Sauerstoff; sie können sich in der Tiefe des Nährmediums vermehren.

Die Bakterien, welche den Sauerstoff des Kaliumnitrats nicht verwerten , können sich nur an der Oberfläche in Kontakt mit dem Luftsauerstoff vermehren.

709807/0805

Man verfügt so über ein sehr einfaches Verfahren zum Nachweis der Fähigkeit einer obligat aeroben Bakterie, auch den Sauerstoff eines Nitrats zu nutzen. Damit läßt sich beispielsweise Pseudomonas aeruginosa, das sich in der Tiefe des Nährmediums vermehrt, von Pseudomonas putida unterscheiden, das sich nur an der Oberfläche vermehrt.

Bei aero-anaeroben Bakterien kann man nach dem gleichen Verfahren das Kaliumnitrat durch Kaliumchlorat ersetzen, dessen Wirkung umgekehrt ist. In diesem Fall'werden die Bakterien, welche den Sauerstoff des Chlorate verwerten, durch das dabei freigesetzte Chlor abgetötet. Die aero-anaeroben Bakterien, welche das Kaliumchlorat verwerten, vermehren sich folglich in der Tiefe, werden aber abgetötet, während jene Bakterien, die es nicht verwerten, sich normal vermehren.

Beispiel 4

Beispiel 2 wird mit Polyacrylamid in einer Konzentration von 5/1000 wiederholt. Es werden ähnliche Ergebnisse erhalten.

Beispiel 5

Ein Grundmedium mit 1,4 g/Liter Agar gemäß Beispiel 1 wird angewendet, um die Verwertung von Trehalose durch Hefen quantitativ zu untersuchen. Sofern die Hefe Trehalose nur in Gegenwart von Luftsauerstoff assimiliert, vermehrt sie sich ausschließlich an der Oberfläche. Im gegenteiligen Fall vermehrt sie sich in der Tiefe.

709807/0805

So vermehrt sich Candida albicans an der Oberfläche, während Candida tropicalis sich in der Tiefe vermehrt.

In beiden Fällen wurden die Kulturen homogen suspendiert, entweder durch einfaches mechanisches Rühren oder Schütteln, oder durch Rühren mittels einer Stahl- oder Nickelkugel, die mit Hilfe eines Magneten im Nährmedium bewegt wird. Die Vermehrung wird nephelometrisch gemessen.

Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Identifizierung oder zur Trennung von Mikroorganismen aus diese enthaltenden Gemischen auf Grund ihres Verhaltens gegenüber Sauerstoff unter bestimmten Bedingungen. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen oder ein Gemisch der Mikroorganismen auf ein in einem Röhrchen enthaltenes Grundmedium überimpft, wobei das Grundmedium unter anderem die zum Wachstum notwendigen Nährstoffe enthält und das Röhrchen so dimensioniert ist, daß unterhalb der mit dem Luftsauerstoff in Kontakt stehenden Oberfläche genügend sauerstofffreies Nährmedium zur Verfügung steht, damit sich dort obligat anaerobe Bakterien vermehren können. Man kann also nach der Inkubation die entwickelten Kulturen ernten, eventuell

Bereichen
auf verschiedenen des Kulturmediums, und hat so die Möglichkeit, verschiedene Arten von Mikroorganismen voneinander zu trennen.

Die Bedingungen, denen die Viskosität des Kulturmediums genügen muß, sind vorstehend definiert worden. Das Kulturmedium muß insbesondere die Sedimentation der auf seiner Ober-

709807/0805

fläche aufgebrachten Mikroorganismen ermöglichen. Die Sedimentation kann jedoch ziemlich langsam vor sich gehen.

Nach einem vorteilhaften zusätzlichen Merkmal des Verfahrens gemäß der Erfindung kann das Beimpfen mit Mikroorganismen oder einem Gemisch von Mikroorganismen über die ganze Höhe des Nährmediums mittels eines festen Elementes, insbesondere einer Kugel, erfolgen. Das Element hat eine größere Dichte als das Nährmedium. Die zu untersuchenden Mikroorganismen bzw. das Mikroorganismengemisch wurden vor dem Beimpfen auf das Element aufgebracht. Das feste Element, vorzugsweise eine Kugel, bildet also einen Träger, dessen Aufgabe es gleichzeitig ist, die in das Nährmedium eingeführten Mikroorganismen nach unten hin mitzunehmen und dadurch auf der Gesamtheit des "Weges des Elementes quer durch das Nährmedium eine Beimpfung herbeizuführen.

Natürlich muß die Kugel aus einem Material bestehen, das gegenüber den Mikroorganismen und dem Medium inert und gegebenenfalls porös ist. Es kann zum Beispiel aus Glas, Keramik oder aus einem inerten Kunststoff, oder einem inerten Metall bestehen.

Die Verwendung einer Kugel gestattet nicht nur ein sehr rasches Beimpfen des Nährmediums mit den zu untersuchenden Mikroorganismen, sondern durch die Anwesenheit der Kugel am Boden des Röhrchens wird sichergestellt, daß die' Beimpfung tatsächlich durchgeführt worden ist, insbesondere, daß die zu untersuchenden Mikroorganismen nicht an den Röhrchenwänden unterhalb

_J 709807/0805

des oberen Niveaus des Nährmediums kleben geblieben sind. Dies kann vorkommen, wenn die Mikroorganismen mittels eines mit einer Pipette auf die Wände des Röhrchens aufgebrachten Wassertropfens eingeführt werden.

709807/0805

Claims

- 19 Patentansprüche

1. Fließfähiges, sterilisierbares, gegenüber Mikroorganismen inertes und im wesentlichen biologisch nicht abbaubares Grundmedium, dadurch gekennzeichnet, daß es eine solche Viskosität aufweist, daß obligat aerobe, auch mobile Mikroorganismen sich nur an oder nahe der Oberfläche des Grundmediums vermehren und die Sedimentation der Mikroorganismen auf Grund der Schwerkraft nicht verhindert wird.

2. Grundmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine solche Viskosität aufweist, daß die Diffusionsfähigkeit des Luftsauerstoffs so herabgesetzt ist, daß sich obligat aerobe Mikroorganismen nur auf oder nahe der Oberfläche des Grundmediums vermehren können.

3. Grundmedium nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem wäßrigen, homogenen, transparenten Medium besteht, das einen sterilisierbaren Viskositätserhöher enthält, der gegenüber Mikroorganismen inert und im wesentlichen biologisch nicht abbaubar ist.

4. Grundmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß es eine Viskosität von etwa 50 bis 250 cP, vorzugsweise von etwa 100 bis 200 cP besitzt.

5. Grundmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Viskositätserhöher Agar ist.

709807/0805 ^J

6. Grundmedium nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Agar-Konzentration etwa 1,2 bis 1,6 g/Liter, vorzugsweise 1,4 g/Liter, beträgt.

7. Grundmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Viskositätserhöher aus mindestens einer synthetischen makromolekularen Verbindung besteht.

8. Grundmedium nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die synthetische makromolekulare Verbindung ein Polyacrylamid oder Vinylpolymer, insbesondere Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon, oder ein lösliches Cellulosepolymer oder dessen Derivat ist.

9. Medium zur Züchtung von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen aus einem Grundmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 8 besteht, das Nährstoffen und gegebenenfalls zur Modifizierung der Wachstumsmerkmale der Mikroorganismen geeignete Substanzen enthält.

10. Verfahren zur Identifizierung oder Trennung von Mikroorganismen aus diese enthaltenden Gemischen auf Grund ihres Verhaltens gegenüber Sauerstoff unter bestimmten Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen bzw. das Mikroorganismengemisch in ein Grundmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 9t das die zur Vermehrung notwendigen Nährstoffe enthält, überimpft, und zwar in das Innere eines Röhrchens oder einer analogen Vorrichtung auf ein Niveau, das ausreicht,

709807/0805

um unterhalb der Oberfläche des Nährmediums einen Bereich einzustellen, der ausreichend vom Luftsauerstoff isoliert ist, damit obligat anaerobe Mikroorganismen sich dort vermehren können, und um im Bedarfsfall nach der Inkubation die in den verschiedenen Bereichen des Kulturmediums vermehrten Kulturen zu ernten. ;^v

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Beimpfen über die gesamte Höhe des Nährmediums mittels eines festen, inerten Elementes, insbesondere einer Kugel erfolgt, wobei das Element eine größere Dichte als das Nährmedium hat, und daß die in das Nährmedium einzuführenden Mikroorganismen bzw. das Mikroorganismengemisch vorher auf das Element aufgebracht worden sind.

709807/080S