DE3783540T2

DE3783540T2 - Vorrichtungen und verfahren zur kultivierung und pruefung von mikroorganismen.

Info

Publication number: DE3783540T2
Application number: DE8787307641T
Authority: DE
Inventors: Roy Holbrook
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Oxoid Ltd
Priority date: 1986-08-28
Filing date: 1987-08-28
Publication date: 1993-07-22
Anticipated expiration: 2007-08-29
Also published as: EP0259116A3; EP0259116B1; CN87106707A; CA1290273C; AU7769887A; US5403741A; DE3783540D1; ES2053550T3; EP0259116A2; AU614936B2

Description

Diese Erfindung betrifft Vorrichtungen und Verfahren zur Kultivierung und Prüfung von Mikroorganismen. In besonderen Ausführungsformen betrifft sie Vorrichtungen und Verfahren, die zur Verwendung auf bewegliche Bakterien, z. B. Arten, Stämmen und Serotypen von Salmonella, Campylobacter, Listeria, Vibrio, Aeromonas oder Escherichia geeignet sind.
Diese Beispiele beweglicher Bakterien sind insbesondere wichtige Objekte von Kultivierungs- und Prüfverfahren, die der Überwachung der Lebensmittelhygiene, Umwelthygiene und -verschmutzung und klinischer Proben aufgrund ihrer pathogenen Natur bei Menschen und Tieren angepaßt sind.
Derzeitige Verfahren sind langwierig und mühsam, insbesondere beispielsweise solche Verfahren, die häufig zur Prüfung auf Salmonellenkontamination in Lebensmittelproben angewendet werden.
Ein Standardverfahren zur Prüfung auf Salmonellenkontamination, z. B. in einer Lebensmittelprobe, bedient sich der Schritte:
(a) Dispergieren einer 25 g Probe des zu prüfenden Lebensmittels oder des anderen Materials in 225 ml eines /Voranreicherungs.- oder /Resuszitations. (erneutes Anregungs-)mediums, das z. B. bakteriologisches Pepton umfaßt, und Inkubieren für bis zu einem Tag (z. B. bei 37ºC für 18 bis 24 h);
(b) Subkultivieren der Anfangskultur in jeweils eine von einer oder mehreren verschiedenen Formulierungen (z. B. zwei) eines /selektiven Anreichungs.-Mediums zur Unterdrückung des Wachstums anderer Mikroorganismen relativ zum Wachstum irgendwelcher vorliegender Salmonellen und Wachsenlassen dieser Anreichungskulturen durch Inkubation zur Bildung einer nachweisbaren Population von Salmonellen (falls vorhanden); (die geringste nachweisbare Populationsgröße kann sehr variabel sein, kann jedoch z. B. etwa 1000 Organismen pro ml in Abwesenheit anderer Kontaminanten betragen; andernfalls kann sie bis zu etwa eine Million Organismen pro ml oder mehr in Gegenwart einer schweren Kontamination mit anderen Organismen betragen);
(c) Verwenden der erhaltenen angereicherten Kulturen zur Bildung von Inokula für eine Reihe selektiver fester Differentialwachstumsmedien, gewöhnlich auf Agar, in Schalen, die die Identifizierung von Salmonellenkolonien - falls vorhanden - in der ursprünglichen Probe erlauben;
(d) Durchführen mindestens biochemischer und/oder immunologischer (Agglutinations)tests auf irgendwelchen provisorisch als Salmonellen identifizierten Kolonien zur Bestätigung oder Verneinung der Identifizierung.
Das gesamte Verfahren kann etwa eine Woche dauern.
Neuerdings sind verbesserte immunologische Testverfahren entwickelt worden, die die Teile (c) und (d) des Standardverfahrens ersetzen und die benötigte Gesamtzeit etwas verkürzen können.
Im Stand der Technik gibt es auch ein Verfahren, das zur Isolierung von Salmonellen durch ein selektives Motilitätssystem vorgeschlagen wurde (P.F. Stuart und H. Pivnick (1965), Applied Microbiology 13(3), Seiten 365-372). Dabei werden "halbfeste" Gelmedien verwendet, die in U-Röhrchen enthalten sind, von deren einem Seitenarm Bakterien nach Inokulation am anderen Seitenarm geerntet werden sollen, wobei eine Probe aus einer Voranreichungskultur als Inokulum an der Oberfläche des halbfesten Gels verwendet wird.
Eine weitere Technik, die von der Motilität der nachzuweisenden Organismen abhängt, ist in der USP 4 563 418 (Bio-Controls, Inc.) enthalten. Diese beschreibt eine Motilitäts-Immunoimmobilisationsmethode zur Feststellung beweglicher Organismen, wie Salmonellen, und beschreibt ein Motilitätsgefäß mit einer Öffnung an jedem Ende mit einer Kappe zum Bedecken jeder Endöffnung, das ein geliertes Motilitätsmedium enthält. Das System wird verwendet, indem man Antiseren zum Immobilisieren von Salmonellen mit dem gelierten Medium an einem Ende in Kontakt bring t und ein selektives Anreicherungsmedium, das ein chemotaktisches Anlockungsmittel, wie L-Serin, enthält, zusammen mit einem Inokulum der Organismen aus einer früheren selektiven Anreichungskultur mit dem gelierten Medium am anderen Ende in Kontakt bringt. Nach der Inkubation zeigt sich ein positives Ergebnis durch eine Bande immobilisierter Bakterien nahe dem Ende des Röhrchens, wo die Antiseren zugegeben wurden.
Ein weiterer Überblick und eine Beschreibung des Salmonellennachweises einschließlich des Themas einer Motilitätsanreichung wurde neuerdings von J.M. De Smedt, R.F. Bolderd&ijlig;k, H.P. Rappold und D. Lautenschlaeger (1986) J. Food Protection, Bd. 49 (7), Seiten 510-514, veröffentlicht und erwähnt Übertragungsinokula aus Voranreicherungskulturen zur Bildung von Spots auf der Oberfläche eines Rappaport-Vassiliadis-Brühe enthaltenden halbfesten Agars; nach 24-stündiger Inkubation wurden Proben von den Kanten der Gebiete, wo hingewanderte Bakterien scheinbar gewachsen waren, weiter subkultiviert und auf Vorliegen von Salmonellen getestet.
Die USP 3 704 204 (Armour & Co.) beschreibt einen Versuch zur Erzielung eines Schnelltests auf Salmonellen, veranschaulicht durch das Inkubieren von Fleisch- und Knochenmehlproben in Nährmedien, die selektive Inhibitormittel, repräsentiert durch Gallensalze, Desoxycholat, Lithiumchlorid und ein Acridinderivat (Acriflavin), enthalten, mit einem mit Bleiacetat gesättigten Baumwollbausch, der etwa 1 1/2 Inch oberhalb der Oberfläche des Mediums angeordnet ist; das Schwarzwerden des Bausches nach 24-stündiger Inkubation wurde als positives (verdächtiges) Ergebnis bewertet. Wie berichtet wurde, wurden durch diese Methode zahlreiche falsche Positiva, jedoch keine falschen Negativa erhalten.
Trotz dieser Anstrengungen besteht jedoch noch immer das Problem, dieses Verfahren zur Prüfung auf bewegliche Bakterien in bequemer Weise, insbesondere auch im Hinblick auf die früheren Kulturstadien, zu verkürzen.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Vorrichtungen und Verfahren zur Prüfung auf bewegliche Bakterien, die ein Prüfergebnis mit einem guten Verlaßlichkeitsstandard aus der Kultivierung einer Probe in einem einzigen Gefäß zulassen.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung bequemer Vorrichtungen und Verfahren zum selektiv angereicherten Kultivieren und Prüfen beweglicher Bakterien zur Vereinfachung und/oder Verminderung der vom Betreiber geforderten Handhabung von Proben und Kulturen.
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur selektiven Kultivierung beweglicher Bakterien bereit, das die Schritte umfaßt:
(a) Herstellen einer Probe eines des Gehaltes beweglicher Bakterien verdächtigten Materials zur bakteriologischen Inkubation;
(b) Einbringen dieses Materials in ein Kulturgefäß, das ein für die Resuszitation und das Wachstum beweglicher Bakterien geeignetes flüssiges Nährmedium enthält;
(c) Bereitstellen eines Trägers, der teilweise in das flüssige Nährmedium eintaucht, jedoch über die Oberfläche des flüssigen Nährmediums herausragt, wobei der Träger ein auf gebrachtes Nährmedium, ausgewählt aus Medien, die zum bakteriologisch selektiven Wachstum und Nachweis beweglicher Bakterien geeignet sind, enthält, wobei der Träger eine Öffnung unterhalb der Oberfläche des flüssigen Nährmediums zum Kontakt zwischen dem flüssigen Medium in dem Gefäß und dem auf gebrachten Medium in dem Träger aufweist, um so während der Kultivierung die Wanderung der beweglichen Bakterien aus der Flüssigkeit in das aufgebrachte Medium zuzulassen, und
(d) Inkubieren der Probe und der Nährmedien zum Wachsenlassen irgendwelcher beweglicher Bakterien, die in der Probe in dem flüssigen Medium vorhanden sind, und während der Kultivierung Wandernlassen dieser beweglichen Bakterien in das aufgebrachte Medium und Wachsenlassen dieser beweglichen Bakterien darin.
In einigen Ausführungsformen des Verfahrens kann der Träger auch eine Öffnung oberhalb der Oberfläche des flüssigen Nährmediums haben, und das aufgebrachte Nährmedium kann eine Übertragungsfläche aufweisen, die einer Übertragung einer Probe dieser Bakterien nach deren Wanderung in das auf gebrachte Medium und Wachsenlassen und Wanderung durch dieses hindurch zugänglich ist, und das Verfahren kann den weiteren Schritt der Übertragung der beweglichen Bakterien von der Übertragungsfläche des aufgebrachten Mediums nach Wachsenlassen der Bakterien in und durch das aufgebrachte Medium umfassen.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine Vorrichtung zur selektiven Kultivierung beweglicher Bakterien bereitgestellt, die umfaßt:
(a) ein Kulturgefäß, das ein zur Resuszitation und zum Wachstum beweglicher Bakterien geeignetes flüssiges Nährmedium enthält, und
(b) einen Träger, der teilweise in das flüssige Nährmedium eintaucht und über die Oberfläche des flüssigen Nährmediums herausragt, wobei der Träger ein aufgebrachtes Nährmedium enthält, das aus Medien ausgewählt ist, die zum bakteriologisch selektiven Wachstum und zum Nachweis beweglicher Bakterien geeignet sind, wobei der Träger eine Öffnung unterhalb der Oberfläche des flüssigen Nährmediums zum Kontakt zwischen dem flüssigen Medium im Gefäß und dem auf gebrachten Medium im Träger aufweist, um so während der Kultivierung der Bakterien eine Wanderung der beweglichen Bakterien aus der Flüssigkeit in das aufgebrachte Medium zuzulassen.
Die Erfindung ermöglicht somit die Kultivierung, Selektion, Anreicherung und, in vielen Beispielen, auch den Nachweis von Mikroorganismen, z. B. beweglichen Bakterien. Die Erfindung kann per se bekannte Formen eines flüssigen Mediums zur Resuszitation und zum Wachstum des nachzuweisenden Mikroorganismus verwenden und schließt die Bereitstellung trockener Bestandteile zur Bildung eines solchen Mediums nach Rehydratisierung mit Wasser oder mit einem geeigneten Hauptkulturmedium ein. In ähnlicher Weise können per se bekannte Formen eines auf gebrachten selektiven Anreichungsmediums, das für die nachzuweisenden Mikroorganismen selektiv ist, und/oder Indikatormedien zum Nachweis des Vorliegens und Wachstums der nachzuweisenden Mikroorganismen und deren Varianten einschließlich trockenerer Präparate zur Bildung eines solchen auf gebrachten Mediums nach Rehydratisierung mit Wasser oder mit einem geeigneten Hauptkulturmedium verwendet werden.
Von der Erfindung werden auch Träger der auf gebrachten Medien bereitgestellt, die die im folgenden beschriebenen Merkmale aufweisen und zur Verwendung in den hier beschriebenen Kultivierungsverfahren geeignet sind.
Bei der Anwendung der Erfindung sind das Kulturgefäß und das aufgebrachte Medium so angeordnet, daß sich das selektive Anreichungs- und/oder Nachweismedium in einer Zone oder einem Behälter in Kontakt mit dem Resuszitations- und Wachstumsmedium befindet, wodurch beim Gebrauch die zu testenden Mikroorganismen wachsen und während der Kultivierung selbst vorzugsweise in das Anreicherungsmedium wandern können und nicht durch manuelle Inokulation übertragen zu werden brauchen.
In dieser Beschreibung bedeutet "aufgebrachtes Medium" ein flüssiges Wachstumsmedium, das (z. B. in durchsetzter Weise) in einem solchen Maß mit einem Gel oder festen Material assoziiert ist, daß eine Konvektion im wesentlichen verhindert wird, die beweglichen Organismen jedoch nicht an einem Hindurchwandern gehindert werden, noch (im entsprechenden Fall) nicht-bewegliche Organismen an einem Hindurchwachsen gehindert werden. Diese Bedingung wird z. B. durch ein ein Gelierungsmittel einschließendes Medium oder durch ein flüssiges Medium erfüllt, das z. B. durch ein festes Netz- oder Rahmenwerk so weitgehend gehalten wird, daß eine Konvektion im wesentlichen verhindert wird. Geeignete Beispiele von Trägern sind, ohne Einschränkung, schwache Gelmaterialien, die per se zur Anreicherung beweglicher Bakterien bekannten "schwabbeligen" Gele und faseriges leitendes Material, z. B. Filterpapiere und Nylon- oder Polyamid- oder Polyesterfilter, insbesondere Faltenfilter, die sehr enge Längskanäle definieren, die ein flüssiges oder halbfestes Gel enthalten, entlang welchen Mikroorganismen wachsen oder durch ihre eigenen beweglichen Eigenschaften wandern können, oder poröse Polymerfilter.
Selektive Medien und Anreicherungsmedien werden als Kulturmedien verstanden, die selektiv inbihierende Mittel enthalten, die ausgewählt sind, um das Wachstum der meisten anderen Mikroorganismen außer dem nachzuweisenden Mikroorganismus zu verhindern oder zu vermindern, während sie schlimmstenfalls nur schwach inhibierend oder vorzugsweise neutral oder stimulierend auf das Wachstum des gesuchten Mikroorganismus wirken. Beispiele derartiger Mittel und ihre Dosierung sind im Stand der Technik bekannt und bilden nicht diese Erfindung. Im Fall von Salmonellen schließen bekannte selektive Mittel Gallensalze, Acridinderivate und bestimmte andere Bestandteile der im folgenden beschriebenen Medien, z. B. Farbstoffe, wie Brilliantgrün, ein.
Die in dieser Erfindung verwendeten flüssigen Resuszitations-/Wachstums- Medien können von selektiven Inhibitoren frei sein. Für den Salmonellentest sind selektive Inhibitoren, wie Malachitgrün, von Vorteil. Die Resuszitations-/Wachstums-Medien sollten in den meisten Fällen von chemotaktischen Anlockungsmitteln frei sein, so daß bekannte chemotaktische Anlockungsmittel, wie L-Serin, falls sie im auf gebrachten Medium gewünscht werden, wirksam mitverwendet werden können, um so die (Selbst)übertragung der beweglichen Mikroorganismen vom flüssigen Resuszitationsmedium in das aufgebrachte selektive und/oder Nachweismedium zu verstärken.
Erfindungsgemäß kann eine Lebensmittel- oder andere Probe der Kultivierungsvorrichtung zugegeben werden, um nach einem einzigen Inkubationsschritt eine angereicherte Kultur irgendeines der nachzuweisenden Mikroorganismen (falls vorhanden) zu produzieren.
Einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß man durch ihre Anwendung eine Kultivierungsvorrichtung bereitstellen kann, die die Bildung einer angemessen dichten und angereicherten Kultur einer beweglichen Bakterienspezies, wie Salmonellen, auf der Grundlage einer einzigen, mit einer Lebensmittelprobe inokulierten Kultivierungsvorrichtung erlaubt.
Durch die Erfindung wird auch ein entsprechendes Verfahren für die selektive Anreicherungskultivierung von Mikroorganismen, z. B. Bakterien, insbesondere z. B. beweglicher Bakterien, bereitgestellt, umfassend das Animpfen eines flüssigen Mediums zur Resuszitation und zum Wachstum des nachzuweisenden Mikroorganismus mit einer mazerierten Lebensmittel- oder anderen Probe, die des Gehaltes dieser Mikroorganismen verdächtigt wird, und die Resuszitation und das Wachsenlassen der gegebenenfalls vorliegenden Mikroorganismen im flüssigen Medium, in dem das flüssige Medium in flüssigem Kontakt mit einem auf gebrachten selektiven Anreicherungsmedium für diesen Mikroorganismus inkubiert wird, wodurch irgendwelche möglicherweise vorhandenen Organismen veranlaßt werden, während der Inkubation in das selektive Medium zu wachsen oder zu wandern, . wodurch am Ende dieser Inkubation eine selektiv angereicherte Kultur irgendeines in der Probe möglicherweise vorliegenden Mikroorganismus erhalten wird.
Von der Erfindung werden auch Materialien für die oben beschriebene selektiven Anreicherungskulivierung bereitgestellt, die einen Satz vorbereiteter Reagenzien und Träger einschließlich trockener vorbereiteter Reagenzien umfassen, die mit Wasser oder einem Hauptkulturmedium rehydratisiert werden können, um Vorrichtungen und deren die aufgebrachten Medien tragenden Einsätze bereitzustellen, wie oben beschrieben. Derartige Materialien werden vorzugsweise in Form verschweißter trockener steriler Packungen verteilt, um bei Bedarf zur Verwendung geöffnet und rehydratisiert zu werden.
In einer Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das halbfeste oder anderweitig aufgebrachte selektive Anreichungs- und/ oder Nachweismedium in einem zweiten Behälter oder einer zweiten Zone des Kultivierungsbehälters enthalten, damit eine Probe der angereicherten Kultur aus dem selektiven Anreichungs- und/oder Nachweismedium am Ende der Kultivierungsdauer in bequemer Weise abgezogen werden kann.
Das selektive Anreicherungs- und/oder Nachweismedium im zweiten Behälter kann, falls gewünscht, vom flüssigen Medium im ersten Behälter durch eine tragende Trennvorrichtung, z. B. ein Maschenwerk, einen Filter oder eine poröse Membran oder eine andere Trennvorrichtung, getrennt sein, vorausgesetzt, jede derartige Trennvorrichtung ist so beschaffen, daß sie den Durchgang beweglicher Bakterien zuläßt. Geeignete Porengrößen sind mindestens in der Größenordnung von etwa 5 bis 10 Mikrometern - größere Poren sind zulässig und vorteilhaft. Ein geeignetes poröses Polymermaterial ist z. B. "Porex" ®, wie es von Porex Technologies Inc. verkauft wird, und ein derzeit bevorzugtes Beispiel eines solchen Materials ist ein als Porex cat.X4898 erhältliches feinteiliges, poröses, hydrophiles DBS Polymer einer Porengröße von 15 bis 45 Mikrometern, z. B. als 1/8 Inch dicke Folie erhältlich, die zu Scheiben geeigneter Größe geschnitten werden kann.
In einer bequemen Anordnung wird z. B. eine Zone des flüssigen Mediums mit dem halbfesten selektiven Anreichungs- oder Nachweismedium in Kontakt belassen, z. B. durch leichte Synärese eines Gels, das im halbfesten Anreicherungsmedium eingeschlossen ist, um einen bequemen Testpunkt zu ergeben, der über eine Testöffnung des zweiten Behälters oder der Behälterzone zum Testen zugänglich ist. Dies kann die Extraktions von Proben der angereicherten Kultur in flüssiger Form erleichtern, die der Entnahme von Proben einer halbfesten Kultur vorzuziehen ist.
Falls gewünscht, kann die Vorrichtung gemäß der Erfindung mit mehr als zwei Zonen des Kulturmediums versehen sein, die in Reihe angeordnet sind, so daß irgendwelche beweglichen Bakterien, die von der Inokulationszone des flüssigen Mediums zum Testpunkt wandern, mehr als zwei Zonen des Kulturmediums durchqueren müssen. Diese Anordnung kann z. B. mit einem Sekundärröhrchen zusammengeschlossen werden, das aufgebrachte selektive Anreichungs- und/oder Nachweismedien enthält. Ein solches Röhrchen kann z. B. ein offenes oberes und unteres Ende aufweisen und in das flüssige Resuszitations-Kultivierungsmedium eintauchen, wodurch ein flüssiger Kontakt zwischen dem flüssigen Medium und den aufgebrachten Medien innerhalb des Röhrchens über eine makroporöse Membran oder ein Filter oder eine andere Trennvorrichtung am unteren Ende des Röhrchens herbeigeführt wird, die von den Organismen durchquert werden kann, und das eine Vielzahl von Gelschichten oder anderen auf gebrachten Schichten von Anreichungsmedien mit einem Testpunkt, der vom offenen oberen Teil des Röhrchens zugänglich ist, oder einen anderen bequemen Testpunkt enthält.
Die Vorrichtung kann erfindungsgemäß verwendet werden, indem man (a) eine des Gehaltes beweglicher Bakterien verdächtigte Materialprobe in die Zone des flüssigen Kulturmediums, jedoch nicht in die Zone(n) der Anreicherungsmedien animpft (dies kann z. B. durch Zerkleinern oder anderweitiges Dispergieren der Probe mit dem und in das flüssige Kulturmedium erfolgen), (b) die Kulturmedien inkubiert, damit die beweglichen Bakterien (falls vorhanden) sich vermehren und in die Zone(n) der Anreicherungsmedien wandern können, und (c) eine angereicherte, bewegliche Bakterien enthaltende Kultur (falls irgendwelche im Inokulum vorlagen) aus der Zone oder einer der Zonen des Anreichungsmediums untersucht.
Eine weitere Ausführungsform einer Kultivierungsvorrichtung gemäß der Erfindung umfaßt zwei oder mehrere Zonen halbfester oder anderweitig aufgebrachter selektiver und/oder Nachweismedien, die parallel angeordnet sind, so daß die gesuchten Organismen, z. B. bewegliche Bakterien, aus der Inokulationszone des flüssigen Mediums in jede parallele Zone, die jeweils ein oder mehrere halbfeste oder aufgebrachte Selektive/Nachweis-Medien umfaßt, wachsen oder wandern können. Dies kann z. B. mit Sekundärröhrchen erreicht werden, die in ein flüssiges Kulturmedium eintauchen und einen Kontakt zwischen dem flüssigen Medien und den auf gebrachten Medien über eine mikroporöse Membran, einen Filter oder andere Trennvorrichtung am unteren Ende jedes Röhrchens ergeben und einen von einem offenen oberen Teil jedes Röhrchens zugänglichen Testpunkt aufweisen.
Diese und andere Ausführungsformen bieten den Vorteil, daß zwei oder mehrere Formen der selektiven Anreicherungs- und/oder Nachweiskultur für bewegliche Bakterien in einem einzigen Kultivierungsgefäß gleichzeitig und in vielen Fällen ohne Manipulierung nach den anfänglichen Inokulation durchgeführt werden können.
Die Probe der anreicherten Kultur kann dann nach irgendeiner geeigneten Methode, z. B. durch mikrobiologische Kultivierung, biochemische, immunologische oder mikroskopische Testverfahren, auf das Vorliegen der nachzuweisenden Organismen, z. B. auf bewegliche Bakterien, untersucht werden.
Eine bevorzugte Form der erfindungsgemäßen Materialien und entsprechend der erfindungsgemäßen Vorrichtungen umfaßt einen an beiden Enden offenen röhrchenformigen Träger, der ein auf gebrachtes selektives Anreichungsmedium oder trockene Materialien, die zur Bildung dieses Mediums rehydratisiert werden sollen, trägt. Das aufgebrachte Medium in Form eines Gels oder einer Flüssigkeit kann dann im röhrchenförmigen Träger durch ein geeignetes poröses Sicherungselement festgehalten werden, um den Durchgang der Mikroorganismen zu erlauben. Das Sicherungselement kann im Fall eines flüssigen Mediums z. B. in Form eines relativ engen Faltenfilters aus Papier oder Kunststoffmaterial vorliegen, der ausreichend enge Längskanäle freiläßt, um jede wesentliche Konvektion durch das Material zu verhindern, das Wachstum oder den beweglichen Durchgang der nachzuweisenden Mikroorganismen jedoch zuzulassen. Es hat sich als möglich erwiesen, Faltenfilter der Art einzusetzen, die üblicherweise zur Herstellung der Filter von Filterzigaretten verwendet werden.
Der röhrchenförmige Träger kann bequemerweise zylindrisch sein, dies ist jedoch nicht entscheidend, und es können Formen anderen Querschnittes verwendet werden. Ein "röhrchenförmiger Träger" schließt jede Form mit offenem Boden und offenem oberem Ende oder einem oberen Ende ein, das mit anderen Vorrichtungen oder einem Material kommuniziert, in welche bewegliche Bakterien zum weiteren Nachweis wandern können. In einer üblichen Ausführungsform kann der röhrchenförmige Träger aus einem wasserundurchlässigen Kunststoffmaterial bestehen und eine oder viele Zonen ähnlicher oder unterschiedlicher selektiver Anreicherung und wahlweise auch diagnostische Medien enthalten, die für die nachzuweisenden Mikroorganismen geeignet und in Reihe angeordnet sind, so daß eine Kultur der Organismen auf dem Weg von einem Ende zum anderen Ende des röhrchenförmigen Trägers jede Zone durchqueren muß.
Vorzugsweise weist der röhrchenförmige Träger an seinem offenen Ende, das von dem offenen Ende entfernt ist, welches beim Gebrauch das erneute Anregungsmedium kontaktiert, freie Flüssigkeit oder ein poröses Material auf, aus dem eine Probe freier Flüssigkeit gegebenenfalls zwecks zusätzlicher diagnostischer oder Kultivierungsverfahren (z. B. durch Auspressen des Röhrchens) leicht als Probe der angereicherten Kultur extrahiert werden kann. Wenn es im röhrchenförmigen Träger mehr als ein aufgebrachtes Medium gibt, kann es zweckmäßig sein, eine Entlüftung für eine oder mehrere der Kammern, die oben nicht offen sind, vorzusehen, damit z. B. Stoffwechselgase oder Luft während der Rehydratisierung entweichen können.
Derzeit bevorzugte nicht beschränkende Beispiele von Medien zur Verwendung z. B. mit den beschriebenen und im folgenden veranschaulichten Testvorrichtungen werden wie folgt formuliert und verwendet.
(a) Medium 1 (ein zur Resuszitation und zum Wachstum von Salmonellen in einem Inkubationsröhrchen geeignetes Medium) kann zweckmäßigerweise in Aliquoten von ausreichend trockenem Pulver hergestellt werden, die nach Aufnahme in sterilem Wasser 225 ml der folgenden Zusammensetzung liefern:
Caseintrypton (Oxoid L42), 10 g/l; Natriumchlorid, 5 g/l; Dinatriumhydrogenphosphat 3,5 g/l; Kaliumdihydrogenphosphat 1,5 g/l; Malachitgrün (Merck, bakteriologische Qualität) 40 mg/l. Dieses Medium sollte nach Rekonstitution einen pH-Wert von etwa 7,2 haben.
Das Medium 1 wird zur Untersuchung von Proben bevorzugt, in welchen wenig oder keine Kontamination mit anderen Mikroben als solchen, die Salmonellen verwandt sind, erwartet wird, z. B. Milch- und Eiprodukte, wie Trockenmilch und Trockenei u. dgl.
Ein Alternativmedium 1a enthält zusätzlich 40 mg/l Novobiocin und 4 g/l (antibiotikumfreies) Nichtfett-Trockenmilchpulver. In einer zur Zeit wegen der Klarheit des erhaltenen Mediums bevorzugten Variante dieser Alternative werden anstelle des Milchpulvers 3,0 g/l Casein verwendet. Dieses Alternativmedium wird zum Testen von Produkten bevorzugt, in welchen eine starke Nicht-Salmonellen-Kontamination zu erwarten ist, z. B. Fleischprodukte.
(b) Medium 2 (LID) (selektives aufgebrachtes Medium mit Indikator für Wachstum und Übertragung beweglicher Salmonellen) umfaßt ein trockenes Pulver einer Zusammensetzung, die sich nach Rehydratisierung zur Bildung eines hochviskosen Mediums der folgenden, als "naß" bezeichneten Zusammensetzung eignet:
naß (g/l)
bakteriologisches Pepton (Oxoid L37) 10
Hefeextrakt (Oxoid L21) 6
Dextrose 2
L-Lysin 20
Eisen-III-ammoniumcitrat 1
Natriumthiosulfat 0,08
Natriumalginat (Alginate Industries/Kelco Manucol DMF) (oder vorzugsweise Xanthan, 3,75 g/l, anstelle von Alginat) 10
L-Serin 1
Natriumdesoxycholat 5
- (End-pH-Wert etwa 6,7) - Das Medium 2 kann als ein Aliquot trockenes Pulver in die untere Kammer eines Trägerröhrchens dosiert werden.
Eine derzeit bevorzugte Variante von Medium 2 (LID) enthält 3,75 g/l Xanthan und 1,25 g/l Lactose anstelle des Natriumalginates.
(c) Medium 3 (modifiziertes RV: basierend auf Rappaport-Vassiliadis Medium) ist ein alternatives selektives aufgebrachtes Medium mit einem Indikator für das Wachstum und die Übertragung beweglicher Salmonellen und umfaßt ein trockenes Pulver, das sich nach Rehydratisierung zur Bildung eines hochviskosen Mediums der folgenden "naß"-Zusammensetzung eignet:
naß (g/l
Sojapepton, neutralisiert (Oxoid L44) 5
Natriumchlorid 8
Kaliumdihydrogenphosphat 1,6
Magnesiumchlorid (wasserfrei) 18,7
Natriumalginat (Alginate Industries/Kelco Manucol DMF) 12,5
Serin 1
Malchitgrun (bakteriologische Qualität) 0,04
- (End-pH-Wert etwa 5,2) - Das Medium 3 ist hier auch zur Verwendung z. B. in der unteren Kammer eines röhrchenförmigen Trägers beabsichtigt.
(d) Medium 4 (BGD) (Brilliantgrün-Desoxycholat-Indikatormedium):
naß (g/l)
Lab Lemco Pulver (Oxoid) 5
bakteriologisches Pepton (Oxoid) 10
Hefeextrakt (Oxoid L21) 3
Lactose 10
Saccharose 10
Dinatriumhydrogenphosphat 1
Natriumdihydrogenphosphat 0,6
Phenolrot 0,09
Brilliantgrün 0,0047
L-Serin 1
Natriumdesoxycholat 5
Natriumalginat (Manucol DMF) (oder vorzugsweise Xanthangummi 1 g/l anstelle des Alginates) 10
- End-pH-Wert etwa 6,9) - Das Medium 4 ist zur Verwendung z. B. im oberen Teil eines röhrchenförmigen Trägers beabsichtigt.
(e) Medium 5 (LICNR) ("Lysin-Eisen-Cystin-Neutralrot"-Indikatormedium)
naß (g/l)
L-Lysin-monohydrochlorid 8
L-Lysin-dihydrochlorid 2
Trypton (Oxoid L42) 5
Hefeextrakt (Oxoid L21) 3
Lactose 5
Glucose 1
Salicin 1
Eisen-III-ammoniumcitrat 0,5
Natriumthiosulfat 0,1
L-Cystin 0,1
L-Serin 1
Natriumalginat (Manucol DMF) 7,5 bis 10
Neutralrot 0,025
- (End-pH-Wert etwa 6,2) - Dieses Medium ist hier auch zur Verwendung z. B. im oberen Teil eines röhrchenformigen Trägers beabsichtigt.
In einer geeigneten Weise zur Verwendung dieser Medien kann ein erstes selektives Indikatorröhrchen mit zwei Kammern in der unteren Kammer das Medium LID und in einer oberen Kammer das Medium BGD enthalten, und ein zweites paralleles konstruktionsmäßig gleiches selektives Indikatorröhrchen kann in der unteren Kammer das modifizierte RV-Medium und in der oberen Kammer das LICNR-Medium enthalten.
Ein zweckmäßiges generell es Merkmal dieser Beispiele von Medien besteht darin, daß ein oder mehrere selektive/Indikatormedien (schwach) geliert sind und eine chemotaktisch wirksame Menge Serin oder eines anderen bakteriologischen, chemotaktischen Anlockungsmittels enthalten, während das Resuszitations-/Wachstums-Medium flüssig ist und keinerlei zugefügtes Serin oder anderes derartiges Anlockungsmittel aufweist.
Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung werden mit Bezug- auf die beiliegenden Darstellungen weiter beschrieben, die als nicht einschränkendes Beispiel gegeben werden.
In den beigefügten nicht maßstabsgerechten schematischen Darstellungen bedeuten Fig. 1, 2, 3, 4 und 5 eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung nur als Beispiel.
Fig. 1 ist eine schematische perspektivische Ansicht einer Anordnungseinheit mikrobiologischer Untersuchungsvorrichtungen gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
Fig. 2 ist eine schematische perspektivische Ansicht einer einen Teil der Anordnung von Fig. 1 bildenden Untersuchungsvorrichtung.
Fig. 3 zeigt einen schematischen planen und horizontalen Teilschnitt durch die Vorrichtung von Fig. 2.
Fig. 4 zeigt eine schematische Seiten-Teilschnittansicht der Vorrichtung von Fig. 2, und Fig. 5 zeigt schematisch die Konstruktion eines röhrchenförmigen Trägers wie in Fig. 1.
Fig. 6 zeigt einen Schnitt einer Kultivierungsvorrichtung gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung, und Fig. 7 zeigt in schematischer Vorderansicht eine weitere alternative Form einer Kultivierungsvorrichtung.
Fig. 8 zeigt im Schnitt einen sterilen verschweißten Beutel, der einen trokkenen zylindrischen zu rehydratisierenden Träger enthält, der dann einen Teil der in Fig. 6 oder Fig. 7 gezeigten Vorrichtung bilden kann.
Fig. 9 und 10 zeigen in schematischem perspektivischem und vertikalem Schnitt Röhrchenträger, wie sie im wesentlichen in den früheren Darstellungen gezeigt wurden, die in einem schwimmfähigen Aufnahmebehälter gehalten werden.
Fig. 11 zeigt in schematischem Schnitt eine verbesserte Ausführungsform eines Röhrchenträgers zur Verwendung in Verbindung mit den hier beschriebenen Kultivierungsmethoden.
Falls nicht anders angegeben, können in dieser Beschreibung die erwähnten Kulturmedien und ihre Bestandteile diejenigen sein, die im Oxoid Manual, veröffentlicht von Oxoid Ltd, Wade Road, Basingstoke, Hampshire RG24 OPW (5. Aufl. 1982), und in den auf den neuesten Stand gebrachten Zusätzen beschrieben werden.
In Fig. 1 wird ein Aufnahmebehälter 1 in Form eines Drahtkorbes gezeigt, der eine Untersuchungsvorrichtung 2 aufnimmt, die äußerlich die Form eines wärmegeformten Kunststoffes mit Deckel hat. Der Aufnahmebehälter 1 kann eine Anordnung von Untersuchungsvorrichtungen wie Untersuchungsvorrichtung 2, in diesem Fall eine Reihe von Vorrichtungen, aufnehmen.
Fig. 2 zeigt in perspektivischer Teilschnittform ein Diagramm einer Untersuchungsvorrichtung 2 wie Untersuchungsvorrichtung 2 von Fig. 1. Die Untersuchungsvorrichtung 2 umfaßt einen wärmegeformten Kunststoffwannenkörper 3, der mit einem insgesamt geflanschten Deckel 4 und einer inneren entfernbaren Kunststoffabdeckung 5 versehen ist, die beim Gebrauch auf dem im Körper 3 als Auflage für die Abdeckung 5 gebildeten, vorstehenden Rand 6 aufliegt. In dem Beispiel hat der Kunststoffkörper 3 im wesentlichen durchsichtige Seitenwände und besteht tatsächlich insgesamt aus einem im wesentlichen durchsichtigen Kunststoffmaterial. Ein unterer Teil 7 des Vorrichtungskörpers 3 unter der Abdeckung 5 und dem Rand 6 ist als Inkubationsbehälter für ein mikrobielles Wachstumsmedium und eine im folgenden zu beschreibende Nachweisprobe ausgebildet. In einer zweckmäßigen Form ist Vorrichtung 2 so dimensioniert, daß sie bequem etwa 250 ml Flüssigkeit und Probe (zusammen mit einem bequemen Überkopffreiraum) unterhalb der inneren Abdeckung 5 aufnehmen kann.
In den Seitenwänden des Vorrichtungskörpers 3 sind Positionierungsräume 8 zur Aufnahme und zum Festhalten von Trägern für aufgebrachte mikrobiologische Medien ausgebildet. Vier dieser Positionierungsräume 8 sind in Fig. 2 dargestellt. Diese Positionierungsräume 8 können die Form halbzylindrischer Aussparungen annehmen, um röhrchenförmige Träger, wie einen als 9 in Fig. 2 dargestellten, aufzunehmen und festzuhalten. Der röhrchenförmige Träger 9 wird in der Vorrichtung von Fig. 2 durch die kombinierte Wirkung des Positionierungsraumes 8 in der flexiblen Seitenwand von Körper 3 und einer im wesentlichen halbrunden Aussparung wie Aussparung 10 in der inneren Abdeckung 5 an Ort und Stelle gehalten. Der Körper 3 und die Abdeckung 5, die leicht flexibel sind, erlauben ein leichtes Einsetzen und Entfernen der röhrchenförmigen Träger wie Träger 9. Bis zu vier derartige Träger können in jedem der Wannenkörper 3 untergebracht werden.
Weitere Einzelheiten der Konstruktion der Wannenkörper 3 und Deckel 4 und der inneren Abdeckungen 5 werden in Fig. 3 und 4 gezeigt.
Die Konstruktion des röhrchenförmigen Trägers 9 wird in Fig. 5 dargestellt.
Jeder röhrchenförmige Träger 9 (z. B. aus Polystyrol, das etwas flexibel sein kann) hat ein offenes oberes Ende und einen offenen Boden 11 und z. B. mindestens zwei poröse Trennelemente 12, 13 (z. B. aus einer hydrophilen porösen Polymerfolie von Porex DBS, wie hier beschrieben), die sein Inneres in eine Mehrzahl von Kammern 14, 15 teilen. Die oberste Kammer 15 kann offen oder durch ein weiteres poröses Trennelement bedeckt sein. Die Trennelemente werden selbstverständlich so angeordnet, daß die Träger in der hier beschriebenen Weise verwendet werden können, d. h. daß, wenn sie in ein flüssiges Medium eingetaucht werden, das flüssige Medium das innerhalb der Träger enthaltene Medium berühren kann; zu diesem Zweck befindet sich das unterste Trennelement normalerweise am oder nahe dem Boden des Röhrchens.
Geeignete Dimensionen für das Polystyrolröhrchen 9 und dessen Ausstattungen sind z. B.: innerer Durchmesser etwa 9 mm, Volumen der unteren Kammer (z. B. für das selektive Medium) etwa 1 ml, Höhe und Volumen des oberen Mediums etwa 8 mm und 0,6 ml, Gesamthöhe des Röhrchens etwa 65 mm.
Innerhalb jeder der genannten Kammern ist ein Kulturmedium enthalten, das für motile Bakterien selektiv ist und/oder das Wachstum motiler Bakterien darin anzeigen kann.
Geeignete Medien umfassen z. B. die oben beschriebenen. Serin ist eine besonders zweckmäßige Mediumkomponente, um die Medien für einige bewegliche Bakterien, z. B. Salmonellen und Escherichien, chemotaktisch attraktiv zu machen.
Das Material für die Trennelemente kann z. B. poröses Porex® Polymer, hergestellt von Porex Technologies Inc., insbesondere z. B. hydrophile DBS-Polymerfolie von etwa 1/8 Inch Dicke, sein, die zur Bildung von Scheiben von etwa 1 bis 3 mm, vorzugsweise mehr als 2 mm, Dicke geschnitten wird. Wo ein trockenes Medium verwendet und durch Kontakt mit Wasser rehydratisiert wird, kann es zu bevorzugen sein, den Polymerscheiben eine leichte Beschichtung von hydrophobem Material auf ihrer Unterseite (z. B. "Repelcote" ®) zu verleihen. Das Medium wird in Form eines trockenen Pulvers, das zur Bildung eines Gels rehydratisierbar ist, in die Kammern eingeführt. Lactose- und Alginatbestandteile (oder derzeit bevorzugt sind Xanthan- und Lactosebestandteile) in den oben genannten Medien begünstigen, zusammen mit der hydrophoben unteren Fläche der porösen Scheiben, wie festgestellt wurde, in bestimmten Fällen eine glatte Wasseraufnahme unter Bildung kontinuierlicher Gelmedien, die über mit wäßriger Flüssigkeit gefüllte poröse Trennelemente in den Röhrchen miteinander kommunizieren.
Die Röhrchen werden normalerweise mit trockenen gepulverten Komponenten der Medien hergestellt und in verschweißten, z. B. Folienpackungen, durch Röntgenbestrahlung sterilisiert.
Die Vorrichtung kann z. B. wie folgt verwendet werden.
Die Herstellung der Probe für die Inkubation kann bequemerweise erfolgen, indem man z. B. die Probe im Medium mittels einer Stomacher ® Homogenisiervorrichtung (erhältlich von Seward Surgical, UAC House, Blackfriars Road, London SE1) (oder ansonsten wie in der USP 3 819 158/GB 1 402 538 beschrieben) dispergiert.
Es kann zweckmäßig sein, Probe und Medium in Verhältnissen von etwa 25 g zu 225 ml zu verwenden. (Gemäß dem Schutzumfang der Erfindung können in diesem und anderen Fällen größere Mengen an Material verwendet werden, und eine Anzahl von Proben (z. B. bis zu etwa 10), z. B. Proben von jeweils etwa 25 g, kann zum Prüfen als einzige wirksame Probe in der hier beschriebenen Weise gepoolt und gemischt werden. Wenn sich eine gepoolte Probe als positiv erweist, richtet sich der Verdacht natürlich auf jede individuelle Quelle, aus der der Pool gebildet wurde, und weiteres Testen ist notwendig.)
Die Probe und das flüssige Nährmedium können dann zusammen mit einem oder mehreren Röhrchenträgern, die mit geeigneten oben beschriebenen Medien beladen sind, in das Kulturgefäß eingeführt werden, wobei die aufgebrachten Medien mit dem Medium im Kulturgefäß in Kontakt stehen. Die Röhrchenträger sind vorzugsweise so lokalisiert, daß ihre unteren Enden unter die Oberfläche des flüssigen Nährmediums tauchen, wobei ihre oberen Enden über den Flüssigkeitsspiegel herausragen.
Nach Inkubation, z. B. bei 37ºC oder bis zu 41.5ºC, z. B. für 18 bis 24 h oder, falls nötig, bis zu etwa 48 h, kann das Vorliegen von Salmonellen durch Schwarzwerden irgendeiner Zone mit Lysin-Eisen-Brühe und/oder Farbveränderung irgendeiner Zone der Brilliantgrün-Indikatorbrühe nach rot oder durch entsprechende Farbveränderung einer per se bekannten Art im Fall der verwendeten alternativen Indikatormedien, z. B. der hier beschriebenen Alternativen, nachgewiesen werden.
Eine flüssige Probe der angereicherten Salmonellenkultur kann, falls gewünscht, zur bestätigenden Kultivierung und/oder dem Prüfen aus dem oberen Ende 9, falls nötig durch leichtes Pressen des das aufgebrachte Medium enthaltenden biegsamen Röhrchen, entnommen werden, um Kulturflüssigkeit aus dem Gel oder einer anderen Form des aufgebrachten Mediums freizusetzen. Die Kultivierungsvorrichtung kann nach Wunsch länger inkubiert werden.
Nach einer geeigneten Kultivierungsdauer kann man, falls gewünscht, einen angemessenen Probentropfen der an der oberen Fläche der auf gebrachten Medien im Röhrchenträger lokalisierten Flüssigkeit als Probe entnehmen, die mit den nachzuweisenden beweglichen Bakterien angereichert ist. Wo eine Anordnung von Kulturgefäßen zum Prüfen einer Vielzahl von Proben aufgestellt ist, ist es im allgemeinen nur nötig, Proben zum weiteren Prüfen nur aus den Röhrchen zu entnehmen, die eine positive Indikatorreaktion zeigen. Erfindungsgemäß kann man Mittel zum weiteren Prüfen mitverwenden, um mit dem oberen Ende der selektive-/Indikatormedien enthaltenden Röhrchenträger zu kommunizieren.
In Fig. 6 wird eine alternative Vorrichtung gezeigt, die eine Kulturflasche 1 zeigt, die das Medium 2 aus bakteriologischem Pepton und Wasser enthält, das als Resuszitations- und Wachstumsmedium wirkt und darin eine geeignete Menge des auf Mikroorganismen zu prüfenden Lebensmittels oder anderen Materials enthält. Dieses Beispiel richtet sich auf das Prüfen der Probe auf Kontamination mit Salmonellen. Herstellung und Inkubation der Probe können in diesem Fall im wesentlichen so sein, wie es mit Bezug auf Fig. 1 bis 5 beschrieben wurde.
Die Kulturflasche 1 enthält ebenfalls einen Trägereinsatz 3, der eine zweite Zone des hier durch Flasche 1 gebildeten Kulturbehältors bildet, wobei die zweite Zone in Bezug zur Öffnung des Kulturbehälters fixiert sein kann; in diesem Beispiel trägt der Einsatz 3 ein oder mehrere für Salmonellen selektive Anreichungs- und/oder Indikatormedien in aufgebrachter Form, so daß die Organismen in den Trägereinsatz 3 und das Medium darin wandern können und durch die darin befindlichen Nährmedien selektiv angereichert und/oder angezeigt werden, während gleichzeitig der Durchgang oder das Wachstum anderer Organismen dort nicht begünstigt wird.
Der Trägereinsatz 3 umfaßt ein biegsames, wasserundurchlassiges Plastikröhrchen, das von der Öffnung 5 der Kulturflasche 1 herabgehängt und montiert und mit einem porösen bakteriologischen Pfropf 6 verschlossen ist. Das Röhrchen 4 hat offene obere und untere Enden und in diesem Beispiel auch eine Anzahl seitlicher Öffnungen oberhalb des Flüssigkeitsspiegels für den Luftaustausch.
Innerhalb des Röhrchens 4 befinden sich drei Mediumszonen, die jeweils durch einen dicht gepackten Faltenfilter ähnlich der Art, wie sie zur Herstellung von Filtern für, Filterzigaretten verwendet wird, gehalten werden. Die Faltenfilter ergeben längliche enge Kanäle, die im wesentlichen parallel zur Achse des Röhrchens 4 verlaufen. Jeder der drei Faltenfilter 7, 8 und 9 bildet einen innerhalb des Röhrchens 4 gehaltenen Pfropf. Die Filter berühren einander oder berühren sich fast. Die Filter 7 und 9 sind Papierfilter, die mit den unten beschriebenen Medien imprägniert sind. Das Filter 8 besteht aus Papier oder Kunststoffmaterial und enthält Flüssigkeit, die mit irgendwelchen Bestandteilen der Medien eingeflossen ist, die es aufnehmen kann, wenn die Anordnung des Röhrchens 4 mit den Filtern 7, 8 und 9 aus dem trockenen imprägnierten Zustand mit Wasser oder mit Nährmedium rehydratisiert wurde.
Der Propf 7 ist in diesem Beispiel aus trockenem, mit Bestandteilen imprägniertem Material zur Bildung von Lysin-Eisen-Brühe rehydratisiert. (Agar, Xanthan oder ein anderer gelierender normalerweise in einer solchen Brühe mitverwendeter Bestandteil kann vorliegen oder fehlen.) Der Pfropf 9 wird in diesem Beispiel aus trockenem Material mit Bestandteilen zur Bildung von Brilliantgrün-Indikatorbrühe rehydratisiert. Ein gelierender Bestandteil kann vorliegen oder fehlen.
Das Röhrchen 4 und seine Filterpfropfe 7, 8 und 9 darin können vor dem Gebrauch durch etwa 5 min langes Befeuchten mit sterilem destilliertem Wasser rehydratisiert und anschließend aseptisch in Flasche 1 überführt und in die in Fig. 1 gezeigte Position eingesetzt werden.
Der Gebrauch dieser Vorrichtung ebenso wie die Verwendung anderer Ausführungsformen von Vorrichtungen und Verfahren gemäß der Erfindung bedeutet, daß die Anzahl von Subkultivierungen oder zusätzlichen Testmanipulationen auf die (möglichst wenigen) Flaschen verringert werden kann, die in einer Flaschenanordnung positive Anzeichen zeigen, die aus verschiedenen verdächtigen Proben stammen. Die Vorrichtung, ebenso wie viele alternative Formen der Erfindung, erlaubt auch die Erzielung eines schnellen Ergebnisses Kulturprüfung.
In Fig. 7 werden (nicht maßstabsgerechte) Anordnungen gezeigt die denen von Fig 1. mit den folgenden Ausnahmen analog sind.
Anstelle der Flasche 1 ist ein flexibler Kunststoffbeutel 21 vorgesehen, der hauptsächlich aus zwei Folien besteht, die an ihrem Rand 22 zur Bildung eines Beutels hitzeverschweißt sind, um ein Kultivierungsmedium zur Resuszitation und zum Wachstum der Mikroorganismen zu bilden. Eine Klappe 23 bedeckt die Öffnung, die durch die rückwärtige Folie des Beutels und den oberen Rand einer Vorderfolie 23a gebildet wird. Der Beutel kann beim Gebrauch durch zwei Halterungen 24, 25 und durch eine sich zwischen den beiden Halterungen erstreckende Versteifung aufgehängt werden. Eine weitere hitzeverschweißte Naht 26 teilt den Beutel in eine Hauptkammer und eine Seitentasche 27 zum Aufnehmen und Festhalten eines undurchlässigen flexiblen Kunststoffröhrchens 4, das oben und unten offen ist und selektive Anreichungs- und/oder Indikatormedien im wesentlichen wie für Fig. 6 beschrieben aufweist. Die Seitentasche 27 steht unten mit der Hauptkammer für das Kulturmedium, von dem die Oberfläche als 28 dargestellt ist, in Verbindung, weil sich die Naht 26 nicht völlig bis zum Boden des Beutels erstreckt.
Das Röhrchen 4 und sein Inhalt sind analog den für Fig. 6 beschriebenen, wobei es jedoch 5 Pfropfe enthält, die aus gepacktem Faltenfiltermaterial bestehen.
Der unterste Propf wird aus einem mit den Bestandteilen imprägnierten Trokkenpräparat zur Bildung einer doppelt-starken Lysin-Eisen-Brühe (neben unnötigen gelierenden Bestandteilen) rehydratisiert, so daß man eine ausreichende Farbreaktion erhalten kann, selbst wenn ein Teil dieser Brühe in die Masse des Wachstums- und Resuszitationsmediums auslaugt. Der mittlere Pfropf enthält (vor dem Rehydratisieren) Bestandteile zur Bildung einer einfach starken Lysin-Eisen-Brühe, und der oberste Propf enthält (vor der Rehydratisierung) Bestandteile zur Bildung einer Brilliantgrün-Indikatorbrühe. In einem geeigneten Beispiel können die Gesamtlänge aller fünf Pfropfe etwa 2 Inches und ihr Durchmesser etwa 1/4 Inch betragen.
Die Verwendung der Vorrichtung kann, mutatis mutandis, wie für Fig. 7 beschrieben erfolgen.
In Fig. 8 wird eine sterile verschweißte Trockenpackung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung gezeigt, die aus einer Kunststoffumhüllung 31 besteht, die dehydratisierte Materialien zur Bildung des Röhrchens 4 und darin aufgebrachte Medien wie oben beschrieben enthält. Die getrockneten (z. B. Papier-)Propfe können durch Trocknen geeigneter Materialmengen hergestellt werden, um die oben angegebenen Medien auf dem Pfropfmaterial zu bilden, bevor dieses gefaltet und verpackt wird, z. B. im Vakuum bei 60ºC. Die Materialien können nach dem Trocknen, Falten, Verpacken in das Röhrchen 4 und Verschweißem in der Umhüllung 31 durch gamma-Bestrahlung bei 0,5 Mrad (kGrays) sterilisiert werden. Nach Wunsch können mehrere Einsätze in jeder Umhüllung 31, falls angebracht, zusammen mit jeder gewünschten Menge an Trockenmittel verpackt werden.
Eine wichtige Änderung bezüglich der für Fig. 6 bis 8 beschriebenen Röhrcheneinsätze besteht in der Verwendung von auf Gel auf gebrachten halbfesten Medien, die durch poröse, z. B. makroporöse, Trennelemente, wie sie z. B. in Verbindung mit Fig. 1 bis 5 beschrieben werden, begrenzt werden. Diese können wie für Fig. 8 beschrieben trocken verpackt werden.
Ein geeignetes Einsatzröhrchen (in den Zeichnungen nicht gezeigt) enthält geliertes Medium auf der Basis von Bestandteilen wie in Oxoid®, Wismutsulfitbrühe (3,016 g %) mit Natriumcholat (0,2 g %) Natriumdesoxycholat (0,6 g %), Novobiocin (0,04 g %) und Xanthan (0,4 g %). Diese Mischung kultiviert selektiv Salmonellen und wird im Fall eines positiven Ergebnisses schwarz. Das Gel kann im Röhrchen durch eine poröse Filtermembran festgehalten werden, die über dem unteren Ende des Röhrchens fixiert ist. Eine solche Membran kann selbstverständlich auch in Verbindung mit den Ausführungsformen, die Faltenfilterträger verwenden, eingesetzt werden.
In einer alternativen Ausführungsform, auch in diesem Fall für Salmonellen, kann die Vorrichtung zur Aufnahme eines selektiven Anreichungsmediums in Form eines Geles in flüssigem Kontakt mit einem Resuszitations- und Wachstumsmedium ein offenes thermoplastisches Röhrchen von etwa 1 Inch Durchmesser an seinem offenen unteren Ende aufweisen, das sich auf etwa 1/4 Inch Durchmesser an seinem offenen oberen Ende verengt und eine Gesamthöhe von etwa 1 inch hat. Eine feine Nylonmaschenmembran wird mit Klebstoff um die Kante der unteren Öffnung geklebt. Ein geeignetes Netz für diese und andere Ausführungsformen, ist ein solches von 10 Mikrometern Größe der Öffnungen mit 190 Maschen pro cm, hergestellt aus Nylonfaden von 42 Mikrometern Durchmesser, wobei das Netz eine Wasserdurchlässigkeit in der Größenordnung von 80 l/m²/s hat (kommerziell als Simonyl HD10 ® verfügbar); diese Vorrichtung kann auf die Fläche eines Resuszitations-/Wachstumsmediums aufgebracht sein oder auf dieser schweben und ein oben beschriebenes selektives Anreichungsmedium enthalten. Die obere Öffnung kann als Untersuchungsöffnung verwendet werden.
Weitere Anordnungen, um Röhrchenträger, wie sie z. B. oben in einem Resuszitationskultivierungsmedium beschrieben werden, entsprechend zu plazieren, werden als Diagramm in Fig. 9 und 10 gezeigt; diese zeigen zwei Röhrchenträger 91 im wesentlichen wie in den früheren Darstellungen gezeigt, die als entfernbare Druckpassung in Löchern in einem schwimmfähigen Aufnahmebehälter 92 aufgenommen werden. Der Aufnahmebehälter 92 umfaßt eine Platform 93 mit Löchern zum Einsetzen der Röhrchen 91. Die Platform 93 besteht vorzugsweise aus einem weißen (starren) Kunststoffolienmaterial zum leichten Besichtigen des Zustandes der Medien innerhalb der Röhrchen 91. Ringsum und unterhalb von Platform 93 ist eine schwimmfähige Einfassung festgemacht, die mit Luft oder Schaum oder einem anderen schwimmfähigen Material gefüllt und luftdicht ist, wenn sie auf Luftflotation basiert. Jedes Trägerröhrchen enthält ein unteres (95) und ein oberes (96) Trennelement aus porösem hydrophilem Polymer und ein unteres aufgebracht es selektives Medium 97 und ein oberes aufgebrachtes Indikatormedium 98. Am Ende der Kultivierungsdauer können Proben von den unteren Flächen 99 des oberen Mediums entnommen werden.
Beim Gebrauch können die Medien in den Röhrchen durch Kontakt mit Wasser rehydratisiert und die Röhrchen können in die Löcher in Platform 93 hineingedrückt werden. Dann schwimmt die Anordnung in einem mit einer Testprobe inokulierten und inkubierten Resuszitationsmedium. Diese Anordnung erlaubt es, daß Form und Größe des äußeren Kulturgefäßes innerhalb weiter Grenzen variiert werden können, um verschiedene Größen einer Resuszitationskultur aufzunehmen.
Eine verbesserte Ausführungsform eines Röhrchenträgers zur Verwendung in Verbindung mit den hier beschriebenen Kultivierungsverfahren wird in Fig. 11 gezeigt. Ein durch Spritzguß geformtes Kunststoffröhrchen 111 wird mit unteren und oberen Trennelementen 112 und 113 aus einem oben beschriebenen porösen hydrophilen Polymer zur Ausbildung einer unteren Kammer 114 und einer oberen Kammer 115 versehen, die beim Gebrauch das jeweilige selektive Medium und Indikatormedium enthalten. Im allgemeinen ist dieser Röhrchenträger in Kammer 114 und 115 mit oben beschriebenen Trockenbestandteilen versehen und wird als verschweißte sterile Packung verteilt. Die untere Kammer 114 berührt das Trennelement 113 oben und öffnet sich auch in eine Seitenbohrung 116-117, die in der Wand des Röhrchens 111 ausgebildet ist. Die Seitenbohrung 116-117 verläuft nach oben über die Kammer 115 hinaus und öffnet sich erneut in die Hauptbohrung des Röhrchens 111, um eine Entlüftung für die Kammer 114 zu bilden. Ihre Öffnung wird vor Gebrauch mit einem Kolben 118 verschlossen, der in verschließender Weise in das Röhrchen 111 oberhalb von Kammer 115 eingreift. Durch diese Ausführungsform kann Wasser zur Rehydratisierung schnell durch das untere Trennelement 112 angesaugt werden, indem man den Kolben 118 durch den Handgriff 119 nach oben zieht, um die gelierten Medien in Kammer 114 und 115 zu rehydratisieren. Der Kolben 118 wird nach seinem Gebauch vollständig entfernt und verworfen, und der erhaltene rehydratisierte Röhrchenträger kann in ähnlicher Weise wie die oben beschriebenen einfacheren Röhrchenträger verwendet werden, die normalerweise durch einfaches Eintauchen in Wasser rehydratisiert werden können. Diese Anordnung kann das Ansetzen einer Anreicherungskultur gemaß der Erfindung beschleunigen, und beim Gebrauch kann die Entlüftung 116-117 die Verläßlichkeit der Mikrobenübertragung von der unteren in die obere Kammer durch Entlüften von irgendwelchem Stoffwechselgas verbessern.
Andere Mikroorganismen können in der Kultur unter Verwendung von auf gebrachten Anreichungs- und/oder Indikatormedien in Kontakt mit den erfindungsgemäß angegebenen Resuszitations-/Wachstumsmedium durch geeigneten Austausch der entsprechenden Medien resuszititert (erneut angeregt) und angereichert werden. So kann z. B. Campylobacter angereichert und nachgewiesen werden, indem man z. B. Bestandteile für "Preston"-selektives Medium (gegebenenfalls unter Weglassen von Agar oder Ersetzen desselben durch ein anderes Gelierungsmittel, wie Xanthan mit Lactose) in Propf 7 einer Version der in Fig. 6 und 8 gezeigten Einsätze und ein geeignetes bekanntes Indikatormedium in Pfropf 9 mitverwendet.
Eine zweckmäßige Modifikation an den Resuszitations-/Wachstumsmedien ist die Zugabe einer geringen Menge eines Antischaummittels, z. B. 0,2 ml Amylalkohol in 225 ml Medium.
Obgleich dies nicht notwendig ist, kann man erfindungsgemäß einen Teil des mit einer Probe angeimpften Resuszitations-/Wachstumsmediums z. B. nach einer Inkubationsperiode beiseitenehmen und nur einen Teil des gesamten Kulturvolumens zum Kontakt mit den auf gebrachten Wachstumsmedien verwenden. Daher kann Schritt (c) in Anspruch 1 wahlweise durchgeführt werden, nachdem ein Teil der Kultur abgetrennt wurde und nachdem der Rest mit dem auf gebrachten Medium oder den aufgebrachten Medien zur weiteren Inkubation und Kultivierung damit in Berührung gebracht wurde, und Schritt (d) kann modifiziert werden, um nur einen Teil der durch Inkubation einer Probe und des Resuszitations-/Wachstumsmedium produzierten Kultur zu inkubieren, damit bewegliche Bakterien in das aufgebrachte Medium wandern können. Bei dieser Modifikation des Verfahrens ist es nicht nötig, jedoch möglich, den abgetrennten Anteil der Resuszitations-/Wachstumskultur mit weiterem Medium zu verdünnen.
Derzeit bevorzugen die Erfinder bezüglich der aufgebrachten Medien für den Salmonellennachweis die Kombination von modifiziertem RV-Medium (unten - in direktem Kontakt mit der Resuszitations-/Wachstumskultur) und LICNR-Medium (oben, in Kontakt mit dem RV-Medium) in einem einzigen Röhren, wie oben beschrieben. Der untere Teil des Röhrchens kann, falls gewünscht, maskiert sein, um die Indikatorreaktion im oberen Teil besser sichtbar zu machen.
Wo das verbesserte Kolbenverfahren von Fig. 11 zum Rehydratisieren der Röhrchen der aufgebrachten Medien angewendet wird, besteht keine Notwendigkeit für die wasserabstoßende Beschichtung mit "Repelcote", die oben für andere Fälle als hilfreich beschrieben wurde. Auch wenn die aufgebrachten, in Röhrchenträgern enthaltenen Medien rehydratisiert worden sind, z. B. mit sterilem Wasser, kann es manchmal hilfreich sein, sie gründlich zu bewegen, z. B. unter Verwendung einer "Whirlimixers"®.
Erfindungsgemäß kann man mehrere oder viele Röhrcheneinsätze analog zu Röhrchen 4 und seinem Inhalt oder andere Träger selektiver Anreichungsmedien in eine Einzelprobe des mit einer zu testenden Probe inokulierten Resuszitations- und Wachstumsmediums einsetzen.
So kann man auf verschiedene mögliche Mikroorganismen gleichzeitig, z. B. im gleichen Gefäß, testen.
Die Erfindung ist vielen Modifikationen und Abänderungen zugänglich, die für den fachmännischen Leser offensichtlich sind, und die vorliegende Offenbarung erstreckt sich auf den Gebrauch aller Kombinationen und Unterkombinationen der hier und in den beigefügten Darstellungen und Ansprüchen beschriebenen Merkmale.

Claims

1. Verfahren zur selektiven Kultivierung beweglicher Bakterien, umfassend die Schritte:

(a) Herstellen einer Materialprobe, von der vermutet wird, bewegliche Bakterien zu enthalten, zur bakteriologischen Inkubation,

(b) Einbringen dieses Materials in ein Kulturgefäß, das ein zur Resuszitation und zum Wachstum beweglicher Bakterien geeignetes flüssiges Nährmedium enthält,

(c) Bereitstellen mindestens eines Trägers, der teilweise in das flüssige Nährmedium eintaucht, jedoch über eine Oberfläche des flüssigen Nährmediums herausragt, wobei der Träger ein aufgebrachtes Nährmedium, ausgewählt aus Medien, die zum bakteriologisch selektiven Wachstum und Nachweis beweglicher Bakterien geeignet sind, enthält, der Träger eine Öffnung unterhalb der Oberfläche des flüssigen Nährmediums zum Kontakt zwischen dem flüssigen Medium im Gefäß und dem durch den Träger aufgenommenen, aufgebrachten Medium aufweist, wodurch während der Kultivierung eine Wanderung beweglicher Bakterien aus der Flüssigkeit in das aufgebrachte Medium ermöglicht wird, und

(d) Inkubieren der Probe und der Nährmedien, um irgendwelche in der Probe im flüssigen Medium vorliegende bewegliche Bakterien wachsen zu lassen und um diese beweglichen Bakterien während der Kultivierung aus der Flüssigkeit in das auf gebrachte Medium wandern und sie darin wachsen zu lassen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Träger ferner eine Öffnung oberhalb der Oberfläche des flüssigen Nährmediums aufweist und das aufgebrachte Nährmedium eine Übertragungsoberfläche hat, die zur Übertragung einer Probe der Bakterien nach ihrer Wanderung in das aufgebrachte Medium und Wachstum und Wandern durch es hindurch zugänglich ist,

wobei das Verfahren den weiteren Schritt der Übertragung der beweglichen Bakterien von der Übertragungsoberfläche des aufgebrachten Mediums umfaßt, nachdem diese Bakterien in dem und durch das aufgebrachte Medium gewachsen sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin ein Träger mit mindestens zwei auf gebrachten Medien in Reihe verwendet wird, wobei das erste der aufgebrachten Medien mit dem flüssigen Medium in Kontakt steht und das zweite der aufgebrachten Medien mit dem ersten auf gebrachten Medium in Kontakt steht, wodurch während der Kultivierung bewegliche Bakterien aus dem flüssigen Medium nacheinander durch das erste und zweite aufgebrachte Medium wandern können.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin ein Träger verwendet wird, der in Kontakt mit dem flüssigen Medium ein aufgebrachtes, für die zu kultivierenden Bakterien selektives Medium und in Reihe in Kontakt mit dem selektiven Medium ein Indikatormedium für die zu kultivierenden Bakterien enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin ein selektives Medium, ausgewählt aus geliertem Lysin-Eisen-Medium und geliertem modifiziertem Rappaport-Vassiliadis-Medium, und ein Indikatormedium, ausgewählt aus Brilliantgrün-Desoxycholat-Medium und Lysin-Eisen-Cystin-Neutralrot-Medium die zur selektiven Anreicherungskultivierung und zum Nachweis von Salmonellen geeignet sind, verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin mehr als ein Träger, der jeweils ein aufgebrachtes selektives Medium und/oder Indikatormedium in Kontakt mit dem flüssigen Nährmedium aufweist, verwendet wird.

7. Vorrichtung zur selektiven Kultivierung beweglicher Bakterien, die umfaßt:

(a) ein Kulturgefäß, das ein zur Resuszitation und zum Wachstum beweglicher Bakterien geeignetes flüssiges Nährmedium enthält,

(b) einen Träger, der teilweise in das flüssige Nährmedium eintaucht und über eine Oberfläche des flüssigen Nährmediums herausragt, wobei der Träger ein aufgebrachtes Nährmedium, ausgewählt aus Medien, die zum bakteriologisch selektiven Wachstum und Nachweis beweglicher Bakterien geeignet sind, enthält, der Träger eine Öffnung unterhalb der Oberfläche des flüssigen Nährmediums zum Kontakt zwischen dem flüssigen Medium im Gefäß und dem auf gebrachten Medium in Träger aufweist, wodurch während der Kultivierung der Bakterien die Wanderung der beweglichen Bakterien von der Flüssigkeit in das aufgebrachte Medium ermöglicht wird.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, worin der Träger zwei durch tragende poröse oder mit Öffnungen versehene Trennelemente getrennte Kammern aufweist, wobei beide Kammern ein erstes und zweites der selektiven Medien und/oder Indikatormedien enthalten.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, worin das Trennelement ein poröses Polymer mit einer Porengröße über 10 Mikrometer umfaßt, wodurch bewegliche Bakterien durch dieses hindurchgehen können.

10. Vorrichtung nach Anspruch 7, worin das Medium ein geliertes Medium ist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, worin die Medien in Form trockener Bestandteile in sterilen, verschweißten Packungen vorliegen, die zur Bildung dieser Medien in einer für die Kultivierung fertigen Form rehydratisierbar sind.

12. Vorrichtung nach Anspruch 7, worin das Kulturgefäß Mittel, ausgewählt aus Taschen, Greifausbildungen und Schwimmelementen, umfaßt, um den Träger so zu montieren, daß er beim Gebrauch teilweise in das flüssige Kulturmedium eintaucht.

13. Vorrichtung nach Anspruch 9 und 11, worin der Träger in Form eines Röhrchens mit einem darin enthaltenen entfernbaren Spritzenstempel vorliegt, um wäßrige Flüssigkeit zur Rehydratisierung der trockenen Bestandteile anzusaugen, und das eine Entlüftung zur Gasfreisetzung aus der ersten (unteren) Kammer während der Kultivierung hat.

14. Bakteriologischer Träger, enthaltend Materialien für mindestens ein Nährmedium zur selektiven Anreicherungskultivierung beweglicher Bakterien,

wobei dieser Träger ein Röhrchen mit einer ersten Öffnung und einer zweiten Öffnung im Abstand zur ersten Öffnung umfaßt, das Materialien zur Bildung eines aufgebrachten Mediums benachbart zur ersten Öffnung enthält,

wobei das Medium aus Medien ausgewählt ist, die zum bakteriologisch selektiven Wachstum und zum Nachweis beweglicher Bakterien geeignet sind,

wobei das Röhrchen und das aufgebrachte Medium so eingerichtet sind, daß der Träger angeordnet werden kann, um teilweise in das flüssige Nährmedium einzutauchen und über die Oberfläche des flüssigen Nährmediums herauszuragen, wobei das flüssige Nährmedium mit dem aufgebrachten Medium im Träger in Kontakt steht, um so während der Kultivierung der Bakterien die Wanderung beweglicher Bakterien von der Flüssigkeit in das aufgebrachte Medium zuzulassen, wobei das aufgebrachte Medium ein aufgebrachtes Medium ist, das mit einem porösen oder mit Öffnungen versehenen zur ersten Öffnung benachbarten Trennelement in Kontakt steht.

15. Bakteriologischer Träger nach Anspruch 14, der Materialien für mindestens zwei aufgebrachte Medien enthält, die jeweils aus Medien ausgewählt sind, die zum bakteriologisch selektiven Wachstum und Nachweis beweglicher Bakterien geeignet sind, wobei ein erstes dieser Medien ein aufgebrachtes Medium ist, das mit einem porösen oder mit Öffnungen versehenen zur ersten Öffnung benachbarten Trennelement in Kontakt steht, und ein zweites dieser Medien ein aufgebrachtes Medium ist, das mit einem zweiten porösen oder mit Öffnungen versehenen Trennelement zwischen dem ersten Medium und der zweiten Öffnung in Kontakt steht.