CN101423808B - Vbnc沙门氏菌的复苏液及其制备方法和复苏方法 - Google Patents

Abstract

本发明目公开了一种VBNC沙门氏菌的复苏液及其制备方法和复苏方法，复苏液是由血清1份、灭菌纯水1～3份组成，经混合搅拌混匀，用微孔滤器过滤除菌制得；将进入VBNC的沙门氏菌置于复苏液中，在热程控循环仪孔内，采取递增升温方式，热程控循环仪复苏升温与温育时间程序选自在5℃到37℃区间，温育时间为2min～1.5h；然后接种于SS液体培养基，并在气浴振荡摇床内，200～220r/min培养；本发明克服现有技术存在的用料多，取材不便等缺点，本发明仅仅采用一种材料，利用程序性升温，对处于VBNC近1年之久的沙门氏菌实现了复苏；不但所用原料较少，操作简便，而且复苏菌浓度在12h内就能达到10⁸个CFU/mL，各项复苏指标(时间、细菌数等)也较原有技术大幅度提高。

Description

VBNC沙门氏菌的复苏液及其制备方法和复苏方法

技术领域

本发明属生物技术领域，确切地说是“活的非可培养状态”沙门氏菌的复苏液及其制备方法和复苏方法。

背景技术

细菌活的非可培养状态(Viable but Non-culturable，VBNC)的复苏是指将不能培养的细菌恢复为可培养状态的过程，常被看作VBNC细菌鉴定、检测所用的最能客观评价VBNC的基本技术手段。目前，国内外用于VBNC沙门氏菌复苏的方法主要源自于Reissbrodt等人在2002年发表在Applied and Environmental Microbiology刊物上的一篇题为《Resuscitation ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium and Enterohemorrhagic Escherichia coli from the Viablebut Nonculturable State by Heat-Stable Enterobacterial Autoinducer》的文章。文中提及的VBNC沙门氏菌复苏所需主要材料为含有30％牛血清和50μmol/L去甲肾上腺素的SAPI培养基，基中SAPI培养基成份较为复杂，由6.25mmol/LNH₄NO₃，1.84mmol/L KH₂PO₄，3.35mmol/LKCl，1.01mmol/L MgSO₄，2.77mmol/L(pH＝7.5)葡萄糖等组成。主要复苏步骤如下：首先将SAPI培养基6000r/min，离心15min，上清液过滤除菌。然后将滤后的上清液涂于羊血琼脂平板上，37℃厌氧培养48h，以检测培养基中是否有杂菌污染。最后将可能含有10²～10³个CFU/mL浓度的VBNC沙门氏菌无菌接种于SAPI中，37℃厌氧培养至OD₆₂₀＝0.4时，细菌数量增多，浓度可接近10⁸个CFU/mL。通过此法可以使维持VBNC长达1年的细菌恢复为可培养状态。从总体上讲，该种方法复苏效果较好，但存在的缺点也较多。(1)复苏液所涉及的材料种类多，至少需要8种不同成份；(2)某些材料取材不便，如羊血需要新鲜采集，现采现用；(3)各种成份浓度配比需要足够精确，否则严重降低复苏效率，有时甚至使VBNC菌得不到复苏。

随着VBNC细菌研究领域的不断扩大和深入，原有复苏方法中存在的缺陷需要进一步得到克服和解决。

发明内容

本发明目的在于提供一种用料少、取材方便的VBNC沙门氏菌的复苏液。

它是由下列的重量份组成：血清1份、灭菌纯水1～3份。

所述的血清是指牛血清或胎牛血清，所述的灭菌纯水是选自经过高压蒸汽灭菌的纯净水、双蒸水或用微孔滤器除去水中杂质的普通蒸馏水。

优选为：血清1份、灭菌纯水2份。

本发明另一个目的是提供本发明VBNC沙门氏菌的复苏液制备方法

该方法包括：

血清和灭菌纯水，按所述的比例，混合搅拌混匀，然后用微孔滤器过滤除菌。

为了保证本发明VBNC沙门氏菌复苏液质量，需对其进行无菌检验，检验用按常规方法配制的SS琼脂平板，将过滤除菌的VBNC沙门氏菌复苏液均匀涂布于SS琼脂平板上，倒置于温箱中，37℃厌氧或需氧培养1～2天，无任何菌落生长，表明复苏液合格，分装，置于-20℃保存。

本发明又一个目的是提供VBNC沙门氏菌的复苏方法。

该方法包括：

(1)将进入VBNC的沙门氏菌，用灭菌生理盐水清洗，6000～8000r/min离心3～5min，弃上清；

(2)将步骤(1)菌体沉淀物和本发明VBNC沙门氏菌的复苏液混匀，置于热程控循环仪孔内，采取递增升温方式，热程控循环仪复苏升温与温育时间程序选自在5℃到37℃区间，温育时间为2min～1.5h；

(3)将菌体沉淀物倒入适于沙门氏菌液体培养基中培养；

步骤(3)所述的培养基为SS液体培养基，并在气浴振荡摇床内，200～220r/min，培养8～48h。

步骤(2)所述的热程控循环仪复苏升温与温育时间程序，是从5℃开始直到36℃，每个整数温度热处理2min，37℃热处理1h。

所述的热程控循环仪复苏升温与温育时间程序，为5℃温育20～30min，10℃温育20～30min，10℃温育20～30min，25℃温育20～30min，37℃温育1～1.5h。

所述的热程控循环仪复苏升温与温育时间程序，为15℃温育20～30min，25℃温育1～1.5h，37℃温育1～1.5h。

所述的热程控循环仪复苏升温与温育时间程序，为25℃温育1～1.5h，37℃温育1～1.5h。

采用本发明复苏后的沙门氏菌，取10μl均匀涂布于SS琼脂平板上，倒置于温箱中，37℃厌氧或需氧培养18～24h。按菌落计数法记录复苏后细菌数量，并与诱导进入VBNC前的细菌数量比较，结果相差10²～10³个CFU/mL，均表示复苏成功。采用16sRNA鉴定方法，比较正常状态和复苏后沙门氏菌16sRNA同源序列，为同一株菌。

本发明克服现有技术存在的用料多，取材不便等缺点，解决了细菌VBNC检测及研究领域中的技术难题，本发明仅仅采用一种材料，利用程序性升温，自行建立了一套复苏方法，对处于VBNC近1年之久的沙门氏菌实现了复苏。不但所用原料较少，操作简便，而且复苏菌浓度在12h内就能达到10⁸个CFU/mL，各项复苏指标(时间、细菌数等)也较原有技术大幅度提高。

具体实施方式

实施例1：VBNC鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准株(S578)的制备

取可培养菌数为10⁶～10⁷个CFU/mL的鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准株(S578)菌液1mL至无菌离心管中，8000r/min离心3min，弃上清，然后用灭菌生理盐水充分洗涤菌体沉淀2次，每次均8000r/min，离心2min，弃上清，然后将菌体沉淀接于VBNC诱导液中，于4℃需氧条件培养，定期计量可培养菌数，活菌数与总菌数，待可培养菌数为零时，证明沙门氏菌进入VBNC。

实施例2：VBNC沙门氏菌的复苏液制备及检验

将牛血清和双蒸水(经高压蒸汽灭菌处理)，按1∶1～3比例轻轻搅拌混匀，然后用微孔滤器过滤除菌；得复苏液；

按常规方法配制SS琼脂平板，将过滤除菌的血清均匀涂布于SS琼脂平板上，倒置于温箱中，37℃厌氧或需氧培养1～2天，无任何菌落生长，表明复苏液合格；

复苏液分装，置于-20℃备用。

实施例3：VBNC沙门氏菌复苏

取实施例1进入VBNC的细菌2mL，8000r/min离心5min，弃上清，用灭菌生理盐水清洗菌体，8000r/min离心5min，弃上清，沉淀2次，最后将菌体沉淀物溶于300μl按牛血清和灭菌纯水1∶3配制的复苏液中，用微量加样器吹吸混匀，置于热程控循环仪孔内，按表1中程序1设定的温度与时间，对细菌进行热作用；热处理后，将菌液倒入SS液体培养基中，无需厌氧培养，放入气浴振荡摇床内，220r/min，培养12h；

取复苏后细菌10μl均匀涂布于SS琼脂平板上，倒置于温箱中，37℃厌氧培养24h；按菌落计数法记录复苏后细菌数量，与诱导进入VBNC前的细菌数量比较，结果见表2。

复苏后菌液采用16sRNA鉴定方法，比较正常状态和复苏后鸡白痢沙门氏菌CVCC57816sRNA同源序列，结果见SEQ ID NO.1、2。

表1热程控循环仪编制复苏升温与温育时间程序

表2复苏前后鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准株数量比较

实施例4：VBNC沙门氏菌复苏

取实施例1进入VBNC的细菌2mL，8000r/min离心5min，弃上清，用灭菌生理盐水清洗菌体，8000r/min离心5min，弃上清，沉淀2次，最后将菌体沉淀溶于300μl按牛血清和灭菌纯水1∶1配制的复苏液中，用微量加样器吹吸混匀，置于热程控循环仪孔内，按表1中程序2设定的温度与时间，对细菌进行热作用；热处理后，将菌液倒入SS液体培养基中，无需厌氧培养，放入气浴振荡摇床内，200r/min，培养8h；

取复苏后细菌10μl均匀涂布于SS琼脂平板上，倒置于温箱中，37℃厌氧培养18h；按菌落计数法记录复苏后细菌数量，与诱导进入VBNC前的细菌数量比较，结果见表3。

复苏后菌液采用16sRNA鉴定方法，比较正常状态和复苏后鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准珠16sRNA同源序列，结果见SEQ ID NO.1、2。

表3复苏前后鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准株数量比较

实施例5 VBNC沙门氏菌复苏

取实施例1进入VBNC的细菌2mL，6000r/min离心5min，弃上清，用灭菌生理盐水清洗菌体，8000r/min离心5min，弃上清，沉淀2次，最后将菌体沉淀溶于300μl按牛血清和灭菌纯水1∶2配制的复苏液中，用微量加样器吹吸混匀，置于热程控循环仪孔内，按表1中程序3设定的温度与时间，对细菌进行热作用；热处理后，将菌液倒入SS液体培养基中，无需厌氧培养，放入气浴振荡摇床内，220r/min，培养12h；

取复苏后细菌10μl均匀涂布于SS琼脂平板上，倒置于温箱中，37℃厌氧培养18h；按菌落计数法记录复苏后细菌数量，与诱导进入VBNC前的细菌数量比较，结果见表4。

复苏后菌液采用16sRNA鉴定方法，比较正常状态和复苏后鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准珠16sRNA同源序列，结果见SEQ ID NO.1、2。

表4复苏前后鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准株数量比较

实施例6：VBNC沙门氏菌复苏

取实施例1进入VBNC的细菌2mL，8000r/min离心5min，弃上清，用灭菌生理盐水清洗菌体，8000r/min离心5min，弃上清，沉淀2次，最后将菌体沉淀溶于300μl按牛血清和灭菌纯水1∶2配制的复苏液中，用微量加样器吹吸混匀，置于热程控循环仪孔内，按表1中程序4设定的温度与时间，对细菌进行热作用；热处理后，将菌液倒入SS液体培养基中，无需厌氧培养，放入气浴振荡摇床内，220r/min，培养12h；

取复苏后细菌10μl均匀涂布于SS琼脂平板上，倒置于温箱中，37℃厌氧培养24h；按菌落计数法记录复苏后细菌数量，与诱导进入VBNC前的细菌数量比较，结果见表2。

复苏后菌液采用16sRNA鉴定方法，比较正常状态和复苏后鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准珠16sRNA同源序列，结果见SEQ ID NO.1、2。

表5复苏前后鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准株数量比较

SEQUENCE LISTING

<110>吉林农业大学

<120>VBNC沙门氏菌的复苏液及其制备方法和复苏方法

<160>2

<210>1

<211>1106

<212>RNA

<213>复苏后鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准株16sRNA序列

<400>1

GGCAAACAAT CCAAGTGGTA GCGCCCTCCC GAAGGTTAAG CTACCTACTT CTTTTGCAAC    60

CCACTCCCAT GGTGTGACGG GCGGTGTGTA CAAGGCCCGG GAACGTATTC ACCGTGGCAT   120

TCTGATCCAC GATTACTAGC GATTCCGACT TCATGGAGTC GAGTTGCAGA CTCCAATCCG   180

GACTACGACG CACTTTATGA GGTCCGCTTG CTCTCGCGAG GTCGCTTCTC TTTGTATGCG   240

CCATTGTAGC ACGTGTGTAG CCCTGGTCGT AAGGGCCATG ATGACTTGAC GTCATCCCCA   300

CCTTCCTCCA GTTTATCACT GGCAGTCTCC TTTGAGTTCC CGACCTAATC GCTGGCAACA   360

AAGGATAAGG GTTGCGCTCG TTGCGGGACT TAACCCAACA TTTCACAACA CGAGCTGACG   420

ACAGCCATGC AGCACCTGTC TCACAGTTCC CGAAGGCACA AATCCATCTC TGGATTCTTC   480

TGTGGATGTC AAGACCAGGT AAGGTTCTTC GCGTTGCATC GAATTAAACC ACATACTCCA   540

CCGCTTGTGC GGGCCCCCGT CAATTCATTT GAGTTTTAAC CTTGCGGCCG TACTCCCCAG   600

GCGGTCTACT TAACGCGTTA GCTCCGGAAG CCACGCCTCA AGGGCACAAC CTCCAAGTAG   660

ACATCGTTTA CGGCGTGGAC TACCAGGGTA TCTAATCCTG TTTGCTCCCC ACGCTTTCGC   720

ACCTGAGCGT CAGTCTTTGT CCAGGGGGCC GCCTTCGCCA CCGGTATTCC TCCAGATCTC   780

TACGCATTTC ACCGCTACAC CTGGAATTCT ACCCCCCTCT ACAAGACTCA AGCCTGCCAG   840

TTTCGAATGC AGTTCCCAGG GTTGAGCCCG GGGATTTCAC ATCCGACTTG ACAGACCGCC   900

TGCGTGCGCT TTACGCCCAG TAATTTCCGA TTAACGCTTG CACCCTCCGT ATTACCGCGG   960

TCTGCTGGCA CGAGTTAGCC GGTGCTTCTT CTGCGGGTAA CGTCATTTGC TGCAGTTATT  1020

AACCACAACA CCTTCTTCCC GCTGAAAGGT ACTTTACATC CCGTAGGCCT TCTTTCATAC  1080

GAGCGTATGG TTGCATCAGG CTGGCC                                       1106

<210>2

<211>1447

<212>RNA

<213>正常状态鸡白痢沙门氏菌CVCC578标准株16sRNA序列

<400>2

GCGCTAGGGC GGCAGCTACA CATGCAAGTC GAACGGTAAC AGGAAGCAGC TTGCTGCTTT     60

GCTGACGAGT GGCGGACGGG TGAGTAATGT CTGGGAAACT GCCTGATGGA GGGGGATAAC    120

TACTGGAAAC GGTGGCTAAT ACCGCATAAC GTCGCAAGAC CAAAGAGGGG GACCTTCGGG    180

CCTCTTGCCA TCAGATGTGC CCAGATGGGA TTAGCTTGTT GGTGAGGTAA CGGCTCACCA    240

AGGCGACGAT CCCTAGCTGG TCTGAGAGGA TGACCAGCCA CACTGGAACT GAGACACGGT    300

CCAGACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTGGGGA ATATTGCACA ATGGGCGCAA GCCTGATGCA    360

GCCATGcCGC GTGTATGAAG AAGGCCTTCG GGTTGTAAAG TACTTTCAGC GGGGAGGAAG    420

GTGTTGTGGT TAATAACCGC AGCAATTGAC GTTACCCGCA GAAGAAGCAC CGGCTAACTC    480

CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGGAGGGT GCAAGCGTTA ATCGGAATTA CTGGGCGTAA    540

AGCGCACGCA GGCGGTCTGT CAAGTCGGAT GTGAAATCCC CGGGCTCAAC CTGGGAACTG    600

CATTCGAAAC TGGCAGGCTT GAGTCTTGTA GAGGGGGGTA GAATTCCAGG TGTAGCGGTG    660

AAATGCGTAG AGATCTGGAG GAATACCGGT GGCGAAGGCG GCCCCCTGGA CAAAGACTGA    720

CGCTCAGGTG CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCACGCCGT    780

AAACGATGTC TACTTGGAGG TTGTGCCCTT GAGGCGTGGC TTCCGGAGCT AACGCGTTAA    840

GTAGACCGCC TGGGGAGTAC GGCCGCAAGG TTAAAACTCA AATGAATTGA CGGGGGCCCG    900

CACAAGCGGT GGAGTATGTG GTTTAATTCG ATGCAACGCG AAGAACCTTA CCTGGTCTTG    960

ACATCCACAG AAGAATCCAG AGATGGATTT GTGCCTTCGG GAACTGTGAG ACAGGTGCTG   1020

CATGGCTGTC GTCAGCTCGT GTTGTGAAAT GTTGGGTTAA GTCCCGCAAC GAGCGCAACC   1080

CTTATCCTTT GTTGCCAGCG ATTAGGTCGG GAACTCAAAG GAGACTGCCA GTGATAAACT   1140

GGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAGTCATC ATGGCCCTTA CGACCAGGGC TACACACGTG   1200

CTACAATGGC GCATACAAAG AGAAGCGACC TCGCGAGAGC AAGCGGACCT CATAAAGTGC   1260

GTCGTAGTCC GGATTGGAGT CTGCAACTCG ACTCCATGAA GTCGGAATCG CTAGTAATCG   1320

TGGATCAGAA TGCCACGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACACCA   1380

TGGGAGTGGG TTGCAAAAGA AGTAGGTAGC TTAACCTTCG GGAGGGCGCT ACCACTTTGA   1440

TCTTGCG                                                             1447

Claims (5)

1.VBNC沙门氏菌的复苏方法，该方法包括：

(1)将进入VBNC的沙门氏菌，用灭菌生理盐水清洗，6000～8000r/min离心3～5min，弃上清；

(2)将步骤(1)菌体沉淀物和VBNC沙门氏菌的复苏液混匀，置于热程控循环仪孔内，采取递增升温方式，热程控循环仪复苏升温与温育时间程序选自在5℃到37℃区间，温育时间为2min～1.5h；

所述的VBNC沙门氏菌的复苏液是按牛血清或胎牛血清1重量份和灭菌纯水1～3重量份，搅拌混匀，然后用微孔滤器过滤除菌；

(3)将菌体沉淀物倒入SS液体培养基中，并在气浴振荡摇床内，200～220r/min，培养8～48h。

2.根据权利要求1所述VBNC沙门氏菌的复苏方法，其特征在于：步骤(2)所述的热程控循环仪复苏升温与温育时间程序，是从5℃开始直到36℃，每个整数温度热处理2min，37℃热处理1h。

3.根据权利要求1所述VBNC沙门氏菌的复苏方法，其特征在于：所述的热程控循环仪复苏升温与温育时间程序，为5℃温育20～30min，10℃温育20～30min，15℃温育20～30min，25℃温育20～30min，37℃温育1～1.5h。

4.根据权利要求1所述VBNC沙门氏菌的复苏方法，其特征在于：所述的热程控循环仪复苏升温与温育时间程序，为15℃温育20～30min，25℃温育1～1.5h，37℃温育1～1.5h。

5.根据权利要求1所述VBNC沙门氏菌的复苏方法，其特征在于：所述的热程控循环仪复苏升温与温育时间程序，为25℃温育1～1.5h，37℃温育1～1.5h。