KR20000058369A - 운동성이 있는 여러종류의 미생물을 동시에 검출할 수있는 멀티피펫 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 운동성이 있는 미생물을 동시에 검출할 수 있는 멀티피펫 장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 편모 내지 섬모를 가진 운동성이 있는 미생물들에 감염되어있다고 생각하는 조직을 배양하여, 검출하고자하는 미생물들에 반응하는 배지가 고화된 여러개의 피펫이 들어있는 스토마치 백(Stomacher bag)을 이용하여 검출하고자 하는 미생물들을 동시에 시각적으로 확인가능할 수 있게 한 방법 및 장치에 관한 것이다.

본 발명에 의한 운동성이 있는 미생물을 동시에 검출할 수 있는 멀티피펫장치는 스토마치백(stomacher bag)에 고화된 선택배지가 들어있는 유리피펫를 장착하여 2가지이상의 운동성이 있는 미생물을 동시에 시각적으로 검출할 수 있게 한 것을 특징으로 하여 2가지이상의 운동성이 있는 미생물을 동시에 검출할 수 있고 증균된 액체배지를 다시 다른 장치에 옮겨야하는 문제점을 해결할 수 있다.

Description

운동성이 있는 여러종류의 미생물을 동시에 검출할 수 있는 멀티피펫 장치{Multi-Pipette equipment for simultaneously Identifying Several Species of Motile Microorganisms}

본 발명은 운동성이 있는 미생물을 동시에 검출할 수 있는 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 편모 내지 섬모를 가진 운동성이 있는 미생물들에 오염되어있다고 생각하는 조직을 배양하여, 검출하고자하는 미생물들에 의해 발색반응하는 배지가 고화된 여러 개의 피펫이 들어있는 스토마치 백을 이용하여 검출하고자 하는 미생물들을 동시에 시각적으로 확인가능할 수 있게 키트에 관한 것이다.

종래 식품 또는 사료에 대한 미생물의 오염여부를 판단하기 위해서는, 대상 식품 또는 사료에 비해 미생물이 차지하는 비율이 낮으므로, 먼저 식품 또는 사료의 조직의 일부를 채취하여 증균배지에 배양하여 균수를 증가시키는 단계가 필수적으로 요구되었다.

구체적인 확인방법으로는, 첫째 직접 조직을 광학현미경이나 전자현미경으로 확인하는 방법이 있고, 둘째 오염이 의심스러운 조직을 파괴하여 전기영동 등으로 게놈(Genome)을 분리한 후 이를 혼성화시킨 후 서던 블라팅 또는 노던 블라팅으로 의심되는 미생물의 게놈과의 결합여부를 검사하여 미생물을 확인하는 방법이 있다. 셋째 미생물이 자기만의 고유한 단백질을 생성한다는 점을 이용하여 이에 결합하는 항체와 결합시킨 후 이를 다시 형광물질로 표지된 2차항체를 붙여 시각적으로 확인가능한 방법이 있고, 넷째 검출하고자 하는 미생물의 세포막단백질이나 미생물이 생성하는 단백질에 반응하는 배지를 이용하는 방법 등이 있다.

광학현미경이나 전자현미경에 의한 관찰방법은 미생물이 아주 작은 경우나 미생물의 특징이 없어 식별이 불가능한 경우에는 사용하지 못하는 단점이 있다.

서던 블라팅 또는 노던 블라팅의 방법은 여러공정을 거쳐야하는 번거로움과 방사성물질을 사용하기 때문에 위험을 내포하고 있다. 또한 상기의 실험에는 전문인력이 필요하고 고가장비가 필요하다.

항체를 이용하는 방법은 미생물 고유의 단백질의 여부를 검사하여야 하고, 그 특정 단백질에 반응하는 항체를 제조해야하는 불편함이 있다.

미생물에 반응하는 배지를 이용하는 방법은 퓽(Fung)과 크래프트(Kraft)가 살모넬라(Salmonella sp.)의 검출에 운동성 미생물용 선택배지와 생화학적 실험의 조합을 사용하여 멀티레이어 네펠로플라스크(multilayer nepheloflask)을 1970년에 고안하였다. 또한, 유(Yu)와 퓽(Fung)은 이용한 퓽-유 튜브(Fung-Yu tube)을 개발하여 리스테리아(Listeria sp.)의 검출을 용이하게 하였다. 최근(1999년)에 강(Kang) 과 퓽(Fung)은 10㎖ 피펫과 1㎖ 피펫을 이용하여 더블 피펫메소드 (Double-pipette(DP) method)를 고안한 바 있다.

이들의 방법은 신뢰성 있게 미생물의 검출을 조기에 시각적으로 판단할 수 있게하여 기존의 방법에 비해 진일보 되었으나, 미생물이 들어있는 식품 또는 사료유래 병원균을 동시에 분리할 수 없는 단점이 있다.

본 발명의 목적은 상기와 같은 미생물에 반응하는 배지를 이용하는 방법이 가지는 2가지 이상의 운동성이 있는 미생물을 동시에 검출할 수 없는 문제점과, 증균된 액체배지를 다시 다른 장치에 옮겨야하는 문제점을 해결하고, 손쉽게 구할 수 있는 피펫을 이용하여 동시에 운동성이 있는 여러 종류의 미생물을 쉽게 시각적으로 검출할 수 있게 하는 키트를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 의한 키트의 일 예에 대한 구성도.

도 2는 본 발명의 키트의 일예의 사진.

도 3은 본 발명의 실시예1에 따른 색깔의 변화를 나타내는 사진.

도 4은 본 발명의 실시예2에 따른 색깔의 변화를 나타내는 사진.

도 5는 본 발명의 실시예3에 따른 색깔의 변화를 나타내는 사진.

(도면부호의 설명)

1...스토마치백 2...증균배지 3...피펫

4...선택배지 5...회수배지

본 발명에 의한 검출용 키트는, 검체 샘플이 혼합된 증균배지를 담을 수 있는 증균용기와; 하단내부에 선택배지가 고화상태로 각각 들어 있는 복수개의 피펫 또는 유리막대;로 구성되며, 상기 증균용기에 검체 샘플이 혼합된 증균배지가 분주된 경우 상기 피펫 또는 유리막대의 하단 일부분이 상기 배지에 잠기게 되는 미생물 검출 키트이다.

본 발명에 의한 검출용 키트에서 상기 각각의 피펫 또는 유리막대 내부의 고화된 선택배지의 상부에 회수배지가 추가로 분주하여 나중에 보다 정밀한 실험을 할 수 있게 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 상기 증균용기는 내부를 볼 수 있도록 투명하며 필요에 따라 밀폐가 가능한 것으로서, 정형화된 통일 수도 있고 비닐 종류인 것도 가능하다. 비닐 종류인 경우, 스토마치 백을 활용하는 것이 편리하다.

스토마치 백은 검채와 배지를 다루기 쉽고, 미생물을 쉽게 배양하기 위한 투명한 비닐이며 시중에서 구입할 수 있는 다양한 크기의 것을 사용할 수 있으므로 본 명세서에서는 스토마치 백을 중심으로 서술한다.

본 발명에 의한 키트에 사용되는 유리피펫 은필요에 따라 5㎖, 10㎖, 20㎖ 등 다양한 크기의 것을 사용할 수 있다. 본 발명에 사용되는 피펫의 대용으로 속이 빈 유리막대를 사용할 수 있으며, 피펫에이드를 사용하지 아니하고 일정 높이의 고화된 선택배지에 속이 빈 유리막대를 찔러 선택배지가 속이 빈 유리막대에 일정량 들어가게 한 후 유리막대의 표면을 가열하여 선택배지와 유리막대의 내면 사이의 부분인 두 부분의 간격을 제거할 수 있다.

본 발명에 사용되는 선택배지는 지금까지 여러가지가 밝혀졌으며, 예로서 리스테리아(Listeria spp.)에 대해서는 리스테리아 선택배지(LSM)가 있으며, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)에 대해서는 변형된(모든 탄소원이 제거된) 자일로스 리신 디카보실라제(Xylose Lysine Decaboxylase(MXLD;Difco))가 있고, 다른 미생물에 대해서도 많은 선택배지가 밝혀져 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것이 아니다.

〈실시예1〉

칸사스 주립대학의 식품미생물학 컬쳐 콜렉션(Food Microbiology Culture Collection)으로 구한 리스테리아 모노사이토진(Listeria monocytogenes(Scott A))와 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium(ATCC 13311)를 회수 배지(BHI broth)로 옮겨 37℃에서 24시간 동안 배양한 균을 사용하였다.

경쟁세균으로 사용된 대장균(Escherichia coli)과 스타필로코크스 아우레우스(Staphylococcus aureus)는 상기의 주립대학에서 얻어서 회수배지(BHI broth)에 보관하면서 사용하였다.

10㎖의 유리피펫과 증균용기로는 스토마치백을 사용하였다.

리스테리아 모노사이토진의 검출하기 위해 리스테리아 선택배지(LSM; Oxoid, Hampshire, UK)와 살모넬라 티피모리엄을 검출하기 위해 변형된(모든 탄소원이 제거된) 자일로스 리신 디카보실라제(Xylose Lysine Decaboxylase(MXLD;Difco))를 피펫바닥에서 1㎖씩 고화되도록 하였다.

피펫의 상부 구멍을 통하여 고화된 선택배지의 상부에 각각의 회수배지(BHI broth)에 1㎖씩 넣었다.

상기의 선택배지와 회수배지를 분주한 두 개의 10㎖ 피펫을 함께 붙여서 멀티피펫(Multi-pipette(MP))을 만들고 225㎖의 멸균된 증균배지(BHI broth)가 들어 있는 스토마치백에 피펫의 하부가 잠기도록 설치하였다. 이때의 피펫내부의 색깔은 도 2와 같다.

대장균과 스타필로코크스 아우레우스을 경쟁세균으로 하여 목표세균인 리스테리아 모노사이토진 각각을 증균배지(BHI broth)내에서 35℃에서 24시간 배양한 후, 목표세균인 리스테리아 모노사이토진를 경쟁세균 대비 10^-3으로 균수(고수준의 대장균과 스타필로코크스 아우레우스(대략 6.0~7.0 logCFU/㎖) 및 저수준의 목표세균인 리스테리아 모노사이토진(대략 3.0~4.0logCFU/㎖))로 하여, 25㎖의 병원균 혼합물을 증균배지가 들어 있는 스토마치 백에 접종하였다.

35℃에서 24시간 배양한 후 10㎖ 피펫의 선택배지 부분에서의 색변화를 관찰하였다. 그 결과, 리스테리아 선택배지(LSM agar 배지)는 도3과 같이 배지의 색을 무색에서 흑색으로 변화되었으나, 살모넬라 티피모리엄을 검출하기 위한 선택배지(MXLD배지)는 변하지 아니하였다.

상기 결과는 대장균이 MXLD 배지로 이동하여 배지의 색을 노란색으로 변화시켰고, 리스테리아 모노사이토진은 스토마치백 내에서 증식하면서 리스테리아 선택배지(LSM agar 배지)의 내부로 이동한 것을 알 수 있다.

〈실시예2〉

상기의 대장균과 스타필로코크스 아우레우스을 경쟁세균으로, 살모넬라 티피모리엄를 목표세균으로 하여 상기 실시예1과 같은 방법에 의하여 증균시키고, 동일한 균수로 맞추어, 멀티피펫이 들어 있는 상기의 스토마치백에 접종하였다. 이 때의 피펫내부의 배지의 색깔은 도 4와 같다.

35℃에서 24시간 배양한 후 10㎖ 피펫의 선택배지 부분에서의 색변화를 관찰한 결과, 도 4와 같이 MXLD 배지의 색은 노란색으로 변화하였으나 리스테리아 선택배지(LSM agar 배지)의 색은 흑색으로 변하지 않았다.

이러한 결과는 살모넬라 티피모리엄은 스토마치백 내에서 증식하고 MXLD 배지의 내부로 이동한 것을 알 수 있다.

〈실시예3〉

상기의 대장균과 스타필로코크스 아우레우스을 경쟁세균으로, 대장균과 살모넬라 티피모리엄를 목표세균으로 하여 동일한 방법에 의하여 증균시키고, 동일한 균수로 맞추어, 멀티피펫이 들어 있는 상기의 스토마치백에 접종하였다. 이때의 피펫내부의 배지의 색깔은 도 5와 같다.

35℃에서 24시간 배양한 후 10㎖ 피펫의 선택배지 부분에서의 색변화를 관찰한 바, 도 4와 같이 리스테리아 선택배지(LSM agar 배지)의 색과 MXLD 배지의 색은 노란색으로 변화하였다.

실시예3의 결과는 리스테리아 모노사이토진은 스토마치백 내에서 증식하고 리스테리아 선택배지의 내부로 이동하였고, 살모넬라 티피모리엄은 스토마치백 내에서 증식하고 MXLD 배지의 내부로 이동한 것을 알 수 있다.

이상과 같이 본 발명인 운동성이 있는 미생물을 동시에 검출할 수 있는 멀티피펫장치는 스토마치백에 고화된 선택배지가 들어있는 유리피펫를 장착하여 2가지이상의 운동성이 있는 미생물을 동시에 검출할 수 있고 증균된 액체배지를 다시 다른 장치에 옮겨야하는 문제점을 해결할 수 있다.

Claims (2)

1. 검체 샘플이 혼합된 증균배지를 담을 수 있는 증균용기와;

   하단내부에 선택배지가 고화상태로 각각 들어 있는 복수개의 피펫 또는 유리막대;로 구성되며,

   상기 증균용기에 검체 샘플이 혼합된 증균배지가 분주된 경우 상기 피펫 또는 유리막대의 하단 일부분이 상기 배지에 잠기게 되는 것을 특징으로 하는 미생물 검출 키트.
2. 제1항에 있어서, 상기 각각의 피펫 또는 유리막대 내부의 고화된 선택배지의 상부에 회수배지가 추가로 분주되는 것을 특징으로 하는 미생물 검출 키트.