DE3223715A1 - Verfahren und vorrichtung zum nachweis von kontaminanten - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum nachweis von kontaminanten

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DE3223715A1 DE19823223715 DE3223715A DE3223715A1 DE 3223715 A1 DE3223715 A1 DE 3223715A1 DE 19823223715 DE19823223715 DE 19823223715 DE 3223715 A DE3223715 A DE 3223715A DE 3223715 A1 DE3223715 A1 DE 3223715A1
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Annelore Dr.Dipl.-Biol. DDR 1100 Berlin Jährig
Artur DDR 8301 Burkhardswalde Kunz
Klaus Dipl.-Biol. DDR 1136 Berlin Laube
Werner Dr.Dipl.-Ing. DDR 1071 Berlin Schade
Martin DDR 6420 Neuhaus Schambach
Brigitte Dipl.-Ing. DDR 8046 Dresden Strobel
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Description

Anmelder:
VEB Pharmaglaswerk Heuhaus
DDH 6420 Heuhaus a«. Rwg»
Postfach 26
IPKi C 12 Q, 1/04
Verfahren und Vorrichtung zum Haehweis von Kontaminanten
Anwendungsgebiet der Erfindung:
Das erfindungsgemäße Verfahren und die Vorrichtung zum nachweis von Kontaminanten dienen sowohl der Probenahme aus der Flüssigkeit als auch der Kultivierung der in den Proben enthaltenen Mikroorganismen zur mikrobiologisch-hygienischen Kontrolle in Betrieben der Lebensmittelindustrie und ähnlicher Industriezweige«
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:
Zum Nachweis von Kontaminanten sind verschiedene Methoden bekannt, die zur Charakteristik der Keimbelastung eines Produktes oder eines Gerätebzw· Anlagenteiles eine Aussage erlauben· Grundsätzlich erfolgt jedoch der Nachweis in mehreren Arbeitsschritten· Die Entnahme eines bestimmten Probevolumens einer Flüssigkeit oder Suspension im Laboratorium erfolgt aus einem Behälter mittels eines sterilen Gerätes (z. B* Pipette), um mit entsprechenden Anteilen der Probe Kulturen auf geeigneten festen und/oder flüssigen Nährmedien anzulegen· Dieser Behälter kann z. B. eine Getränkeflasche oder ein Transportgefäß sein, in welches unter sterilen Bedingungen eine Probe außerhalb des Laboratoriums gefüllt wird» Eine Beurteilung der Probe mittels des mikroskopischen Bildes ist nur bei einer höheren Kontamination möglich· Durch die Anzahl der benötigten Geräte und den Kontakt mit der Umgebungsluft besteht das Risiko einer Sekundärkontamination.
Zur Haltbarkeitskontrolle z« B, von Getränken ist der Nachweis der Kontaminanten auch in sehr geringer Zahl wichtig. Zu diesem Zweck wird ein größeres Probevolumen über eine Membran filtriert und diese auf einen festen Nährboden gebracht·
Bei kulturellen Methoden kann jedoch ein befriedigendes Ergebnis frühestens nach drei- bis viertägiger Bebrütung festgestellt werden, da empfindliche Keime auf festem Nährboden langsamer wachsen als in Flüssigkeitskulturen· Letzteres gilt auch für das bekannte Koch'sehe Plattenverfahren·
Eine Anfärbung der von Membranfiltern zurückgehaltenen Mikroorganismen und ihre anschließende Auszählung und Charakterisierung mittels des Mikroskopes ist nur an gut ausgerüsteten Arbeitsplätzen möglich und erfordert eine entsprechende Qualifikation. Außerdem kann in direkter Auszählung nur bedingt zwischen vitalen und toten Keimen unterschieden werden.
Ein wesentlicher Nachteil herkömmlicher Methoden besteht weiterhin darin, daß außer dem Kontaminationsgrad nicht gleichzeitig auch charakteristische Eigenschaften der Kontamonationsorganismen (Gasbildung, Gäraktivität, Säurebildung, Wachstum unter anaeroben Bedingungen) bestimmt werden können·
Für Keime, die in der Lebensmittelindustrie und in ähnlichen Industriezweigen Bedeutung besitzen, ist der gleichzeitige Nachweis einer Fähigkeit, unter aeroben Bedingungen Gas und Säure zu bilden sowie unter
anaeroben Bedingungen wachsen zu könneηt besonders wichtig. ° Λ ^-° ' ' Nach herkömmlicher Verfahrensweise wird die Gasbildung entweder quaXi" tativ nachgewiesen oder es wird eine gesonderte Kultivierungsapparatur (z. B. Garröhrchen) benötigt· Die herkömmlichen Verfahren belasten die im Laboratorium Beschäftigten mit der Bareitstellung sterilisierter Geräte und der Nährmedienbereitstellung. Dadurch werden kleinere Arbeitsstätten höher belastet.
Desweiteren sind aus der Medizin zur Blutentnahme und weiteren Bearbeitung der Blutproben bestimmte Verfahren und Systeme bekannt» Nach den Patentschriften .,QS. ..35-.36.061 und DS-OS 2835101 besteht die Möglich-» keitt an Kanülensysteme,, die in die Vene der Patienten gestochen wurden» vorevakuierte Proberöhrchen-anzuschließen, die entweder als Behälter zum Probetransport dienen oder die als Gefäße für biochemische Reaktionen bzw. Kultivieru-hgsgefäße genutzt werden können» Bach DE-OS 2411651 wird innerhalb- des Blutentnahmesystems eine Gasbildung durch eine druckempfindlich©, gasundurchlässige Sperre angezeigt, eine Möglichkeit des Anschlusses zur Gasanalyse besteht.
Ein kombiniertes Blutentnahme- und Kultursystem zur Untersuchung von Bakteriämien nach DE-OS 3Q12O56 erlaubt die gleichzeitige Kultivierung auf festen und flüssigen Nahrmedien» wobei das Blut über ein Entnahmesystem mengendosiert, in ein mit Vakuum oder eine Gasfüllung versehenes Gefäß eines Blutkultursystems eingesaugt wirds dabei sowohl das flüssige Nährmedium als auch den festen Nährboden inokuliert. Ein pH-abhängiger Indikator macht die mit- dem Wachstum verbundene Säurebildung sichtbar·
Die Bebrütung erfolgt in Schräglage des Systems, wobei die Entnahmekanüle mit einem sterilen Plastomerstopfen verschlossen bleibt. Diese Systeme sind jedoch nicht für den Bereich der Lebensmittelindustrie anwendbar.
Ziel der Erfindung:
Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur mikrobiologischen Untersuchung von Produkten und Gerätschaften der Lebensmittelindustrie und. verwandter Zweige zu erarbeiten, denen die Nachteile der bisherigen Lösungen nicht anhaften und mit deren Hilfe quantitativ ein schneller,· kombinierter Nachweis des Kontaminationsgrades und wesentlicher Eigenschaften der Kontaminanten auch bei Einsatz als Einweggefäße, möglich ist.
Darlegung des Wesens der Erfindung: 3 Z Z3 / \
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, das die mikrobiologische Kontrolle sicherer gestaltet bei gleichzeitiger Senkung des Arbeits- und Zeitaufwandes sowie eine Vorrichtung zu schaffen, die alle notwendigen Punktionen der Probenahme und Kultivierung vereinigt, so daß bei Verwendung entsprechender flüssiger und/ oder fester Uährmedien ein Nachweis von Kontaminanten in Flüssigkeiten bzw· von in Flüssigkeiten mittels bekannter Methoden suspendierter Mikroorganismen möglich ist·
Das erfindungsgemäße Verfahren ist vorzugsweise zum Nachweis von Bakterien, Hefen und Schimmelpilzen geeignet, bei dem die flüssige Probe mengendosiert in ein mit Unterdruck und/oder einer speziellen Gasfüllung (z· B· CO t N?) versehenes kombiniertes Probenahmekultivierungsgefäß eingesaugt wird und dabei mit dem flüssigen Nährraedium vermischt wird·
In einem gesonderten Abschnitt der Vorrichtung können ein oder mehrere feste Nährmedien eingebracht sein, wodurch es möglich ist, daß die mit dem flüssigen Nahrmediura vermischte Probe gleichzeitig das flüssige und das feste bzw. die festen Nährmedien inokuliert.
Bei einer bestimmten Temperatur und vertikaler Stellung des Gefäßes erfolgt die Kultivierung der Mikroorganismen, deren Wachstum durch Trübung des flüssigen Nährmediums bzw» durch kolonie- oder rasenförmiges Wachstum auf festen Nährmedien erkennbar ist· Das Säurebildungsvermögeη der kontaminierenden Mikroorganismen wird sichtbar durch Farbänderung eines pH-abhängigen Indikatorsystemes, vorzugsweise Bromkresolgrün (3*·5*·3''·5*'-tetrabrom-m-kresolsulfonphthalein) oder Bromphenolblau (Tetrabromphenolsulfonphthalein)· Erfindungsgemäß ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß eine Gasbildung der Mikroorganismen nachgewiesen wird, indem das Gefäß in einem geeigneten Ständer in vertikaler Stellung mit der offenen Kanüle nach unten fixiert wird, so daß ein der Gasbildung adäquates Volumen der Nährmedium-Mikroorganismensuspension aus dem Gefäß verdrängt wird, das in einem kalibrierten, vorzugsweise sterilen, mit einem sterilen Kattestopfen verschlossenen !Röhrchen bestimmt wird·
Erfindungsgemäß ist das Verfahren außerdem dadurch gekennzeichnet, daß gleichzeitig nebeneinander charakteristische Eigenschaften der Kontaminationsorganismen, wie z. B. Keimgehalt, Gasbildung, Gäraktivi-
tat oder Säurebildung ermittelt werdenV Damit ist auch eine Prüfung der Gäraktivität der eingesetzten Produktionshefe mittels des Verfahrens möglich·
Für gesonderte Untersuchungen wird sowohl aus dem Auffangröhrchen als auch nach der Kultivierung entweder vom flüssigen und/oder festea Nährmedium eine Probe entnommen·
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Kanüle des Probenahme-Kultivierungsgerätes gleichzeitig als Ansaugstutzen für die zu untersuchende Flüssigkeit und als Auslaufstutzen für die bei der Gasbildung verdrängte Nährmedium-Keimsuspension ausgebildet ist, vorzugsweise einen Durchmesser*; 3 mm besitzt und über einen sterilen Stopfen in einem graduierten Meßgefäß stehend gehalten wird® Außerdem ist die Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, daß das Gefäß für ein oder mehrere feste Nährmedien außerhalb des Gefäßes für das flüssige Nährmedium, vorzugsweise als abgeteiltes Gefäß neben dem vakuum- oder gasgefüllten Raum, angeordnet und mit einer Halterung für das feste Nährraedium versehen ist.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Vorrichtung bestehen darin, daß es die Erfindung ermöglicht, einen gleichzeitigen Nachweis von gasbildenden und säurebildenden Mikroorganismen darzustellen· Gegenüber dem bekannten vorgeschlagenen Verfahren wird sie dadurch mit Vorteil in der Gärungs- und Getränkeindustrie sowie ähnlichen Industriezweigen angewendet·
Entgegen bekannter Vorrichtungen ist das Anbringen einer gesonderten Gasentnahmevorrichtung nicht notwendig, da die Gasbildung infolge des Austretens des Nährmediums durch den Probenahmestutzen angezeigt wird·
Gegenüber bekannter Verfahren können im Falle des Vorliegens gäraktiver Hefen bereits während des Bebrütens Proben zur weiteren Untersuchung entnommen werden·
Das System ist nicht nur zum Nachweis von Kontaminationskeimen» sondern auch zur Feststellung der'-Gäraktivität von Produktionshefen geeignet·
Der Körper für das feste Nährmedium ist außerhalb des Gerätes angebracht· Nach entsprechender Inokulation des festen Hährmediums wird der Nährboden stehend bebrütet« Eine KoIοniebildung ist somit sofort erkennbar« Ein weiterer Vorteil dieses Gerätes ist, daß gegenüber herkömmlichen Verfahren und Methoden kaum,eine Kontamination des Probematerials auf™
-6«
treten kann, da die zu untersuchenden Medien durch direkte Entnahme z. B. durch Durchstechen von Membranen zwecks Probenahme erfolgt·
Ausführungsbeispiel:
Das erfindungsgemäße Verfahren und die Vorrichtung sollen nachfolgend an Anwendungsbeispielen dargestellt und erläutert werden· Es zeigen:
Fig. 1 ein Schaubild über die Gasbildung der Keime in einem Erfrischungsgetränk,
Fig· 2 ein Schaubild über die Gasbildung der Keime in einem Limonadengrundstoff,
Fig. 3 die erfindungsgemäße Vorrichtung für verschiedene Anwendungsmöglichkeiten:
a offenes Gefäßsystem mit Kolben für flüssiges Nährmedium b offenes Gefäßsystem mit Kolben für flüssiges und festes Hährmediura
Fig· 4 a geschlossenes Gefäßsystem für flüssiges Nährmedium b geschlossenes Gefäßsystem für flüssiges und festes Nahrmedium·
Bei gleichzeitigem Nachweis von gärenden und säurebildenden Organismen in einem Erfrischungsgetränk muß vor der Untersuchung auf Kontaminanten das Getränk, wie es allgemein bei mikrobiologischen Untersuchungen üblich ist, entkohlensäuert werden·
Die Untersuchungsprobe wird mit steriler Indikatorlösung versetzt, dabei findet der auch im Fährmedium des Entnahme- und Kultivierungssysteras eingesetzte Indikator Anwendung· Der Probe wird soviel sterile n-Natronlauge zugefügt, bis die Farbe des Indikators umgeschlagen ist, da die vorhandene Säure weitgehend neutralisiert worden ist· Der Ansaugstutzen des Entnahme- und Kultivierungsgerätes wird in die zu untersuchende Probe getaucht und die Verbindung zum Nährmediumbehälter hergestellt, der in ihm befindliche Unterdruck bewirkt ein Einströmen der Untersuchungsflüssigkeit in das Nährmedium· Das beimpfte Gerät wird vorsichtig geschwenkt, um eine innige Vermischung von Probe und Nährmedium zu sichern· Anschließend wird das beimpfte Gerät in vertikale Stellung gebracht und nach Abtropfenlassen von eventuellen Resttropfen mit dem offenen Ansaugstutzen nach unten auf ein leeres steriles, mit einem sterilen Wattestopfen verschlossenes kalibriertes Meßgefäß gesetzt, wobei der Stutzen durch den Wattestopfen
hindurchgeht· - £ -
Die komplette Vorrichtung wird in einem Ständer stehend bei 30 C bebrütet·
Als Probe- und Entnahmesystem dient die in Figur 3 dargestellte Form der erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei der Auslaufstutzen modifiziert ist und die Möglichkeit des Ansatzes eines kalibrierten graduierten Meßgefäßes für auslaufende Kährraedium-Keimsuspension besteht. Täglich werden die Trübung des flüssigen Mährmediums, das Volumen der aus dem Probenahme..Kultivierungsgerät verdrängten Nährmedium-Keimsuspen-· sion sowie die Änderung des Farbtones des Indikators kontrolliert* Ein Untersuchungsergebnis zeigt Figur 1·
Bei gleichzeitigem nachweis von gärenden und säurebildenden Organismen in einem Limonadengrundstoff wird vor der Untersuchung der Grundstoff mit sterilem Wasser verdünnt, analog oben genannter Verfahrensweise mit steriler Indikatorlösung versetzt und der pH-Wert mittels steriler η-Natronlauge eingestellt· Die sich anschließenden Verfahrensschritte erfolgen wie oben genannt. Bei der Bestimmung der Keimbelastung ist der Verdünnungsfaktor zu berücksichtigen.
Ein Untersuchungsergebnis zeigt Figur 2·
Beim Nachweis coliformer Keime ist das Entnahme-Kultivierungssystem mit einem speziellen Nährmedium gefüllt» z· B· Gentiana-Galle-Laktose"1 Lösung· Die Vorbereitung der Proben sowie das Einfüllen der zu unter" suchenden Flüssigkeit und das anschließende Bebrüten der Keime erfolgen ebenfalls wie beschrieben»
Durch einen Kolben oder durch den Unterdruck im System wird eine genau fixierte Probemenge in das Probenahme-Kultivierungsgerät gesaugt, z» B« 1 ml oder 5 mit Nach der Bebrütung und Auswertung der Probe zeigt das Ergebnis bei ausbleibender Gasbildung einen Coliforiaentite r negativ in 1 ml oder 5 rol Probevolumen·
Die Vorrichtung zum Nachweis von Kontaminanten besteht bekannterweise aus dem Kultivierungsgefäß 1 mit einer über einen Abbrechring 7 abbrechbaren Glasspitze 2 und Kanüle 3· Diese Kanüle 3 ist gleichzeitig als Ansaugstutzen für die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe und als Aus™ laufstutzen für die bei der Gasbildung verdrängte Uährmedium-Keimsuspension ausgebildet» Sie besitzt vorzugsweise einen Durchmesser < 3 mm und wird nach der Kultivierung über einen sterilen Stopfen 13 in einem graduierten Meßgefäß 4 stehend gehaltert·
Im Kultivierungsgefäß 1 befindet sich flüssiges Nährmedium 5» während außerhalb dieses Gefäßes 1 ein Glasgefäß 1O für ein oder mehrere feste
Nährmedien 6 angeordnet ist· Dieses Gefäß 10 befindet sich vorzugsweise als abgeteiltes Gefäß neben dem vakuum- oder gasgefüllten Raum 9 und ist mit einer Halterung 11 für das feste Nährmedium 6 versehen. Zur Keimuntersuchung des bebrüteten festen Fährmediums 6 erfolgt die Probenahme aus dem Glasgefäß 1O, indem dieses am Abbrechring 8 geöffnet wird·
-•0-
Bericht zum Stand der (Technik
a) Um£ijiag der Recherche zur Prüfung der Neuheit ι
territorialer Umfang:
sachlicher Umfang:
DDR, BRD, UdSSR,
USA, Frankreich,
Ungarn, Großbritannien,
RPtJ, PCO?, Japan		 B 5/14 C 12 Έ 1/00
A 61 K 1/00 1/04
C 12 1/02 1/16
1/04 1/20
1/08 C 12 Q 1/00
K 1/10 1/02
C 12 M 1/00 1/04
G 12 M 1/02
C 12 1/04
1/06
1/16
zeitlicher Umfang von 1960 bis 1980
b) Aufstellung der recherierten Erfindungsbeschreibungen:
2835 10.1 Becton, Dickinson & Go
East Rutherford U. J. (USA) 10. 8. 1978
10. 9. 1977 USA 823416
2453858 Koma Kord AB Stockholm (Schweden) 13. 11. 1974
13. 11. 1973 Schweden 73175344
2254282 Becton, Dickinson & Go
East Rutherford, IT. J·(USA) 6. 11. 72
6. 1. 72 USA 215730
OS 3012056 VEB Pharmaglaswerke Ueuhaus DDR 28. 3. 1980
28. 3. 1979 DDR WP 211834 28. 6. 1979 DDR WP 213960 3536061 Tri-Po Stopper Corp USA
Wilmington, Delaware 5. 12. 1967
3901765 Becton, Dickinson & Go
East Rutherford IT. J. (USA) 11. 2. 1974
4054491 Koma Nord AB, Stockholm (Schweden) 18. 10. 1977
13. 11. 1973 Schweden 7315344
7340450 Becton, Dickinson, East Rutherford N.J. (USA)
14. 11. 1973
16. 3. 1973 USA 342086
c) Aufstellung weiter Informationsquellen, in denen recheriert wurde:
Von folgendenZeitschriften wurden die Jahrgänge von 1965-1981 gesichtet :
Brauwelt· Ausgabe B. Beilage: Brauwissenschaft Nürnberg Monatsschrift für Brauerei, Beilage zu: Tageszeitung für Brauerei, Berlin-W.
Schweizer Brauerei-Rundschau, Zürich Mitteilungen der Versuchsstation für das Gärungsgewerbe Wien
Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie, Morphologie, Physiologie und Ökologie der Mikroorganismen, Berlin Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -forschung, München, Berlin-W.
Archiv für Mikrobiologie, Berlin-W.
Journal of the Institute of Brewing, London ■ Folia microbiologica, Praha Journal of general microbiology, London, Cambridge European Journal of biotechnology Microbiology Extract
d) Auswahl bekannter technischer Lösungen zum Stand der Technik:
US-PS 35 36061 DE-OS 30 12056 DE-OS 28 35101 DE-OS 24 II65I
32237Ί5
1 Kultivierungsgefäß
2 abbrechbare Glasspitze
3 Kanüle
4 graduiertes Meßgefäß
5 flüssiges Nährmedium
6 festes Mährmedium
7 Abbrechring für Gefäß 1
8 Abbrechring für Glaskörper 10
9 Vakuum-gasgefüllter Raum
10 Glasgefäß für festes Mährmedium 6
11 Halterung
12 Kolben
13 steriler Stopfen
Leerseite

Claims (1)

  1. ν* ■ ■ ■ ■
    1· Verfahren zum Nachweis von Kontaminanten iß der Lebensmittelindustrie, wobei keimhaltige Flüssigkeiten oder Flüssigkeiten, in welche Keime zum Zwecke der Untersuchung mittels bekannter Methoden eingebracht werden, in einem kombinierten Probenahme-Kultivierungsgerät mit einer ausgewählten Menge an Nährmedium vermischt werden, dadurch gekennzeichnet, daß die anschließende Kultivierung der Nährmedium-Keimsuspension über einem nach unten offenen Auslaufstutzen des Probenahme-Kultivierungsgerätes erfolgt, während der Kultivierung bei Gasbildung durch die Untersuchungsorganismen äquivalente meßbare Mengen an Nährmedium-Keimsuspension ausfließen und dabei in Verbindung mit Trübungs- und Farbänderungen des indikatorhaltigen Nährmediums gleichzeitig in Analogwerten quantitative Aussagen zum Keimgehalt, zur Gasbildung, zur Gäraktivität und zur Säurebildung derKontaminationsorganismen getroffen werden.
    2· Verfahren ngch Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß in einem gesonderten Teil des Kultivierungsgefäßes ein oder mehrere feste Nährmedien zusätzlich eingebracht sind, ngch Einführung der zu untersuchenden Flüssigkeit ein kolonie-/rasenförmiges Wachstum der üntersuchungskeime auf diesen festen Nährböden erfolgt und nach der Kultivierung Proben zur mikroskopischen Kontrolle und/oder weiteren Untersuchung sowie zur Fortzüchtung von Organismen entnommen werden·
    3« Vorrichtung zum Nachweis von Kontaminanten, bestehend aus einem kombinierten Probenahme- und Kultivierungsgerät mit Kultivierungsgefäß,abbrechbarer Glasspitze, Kanüle und Abbrechring sowie flüssigem und festem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß die Kanüle (3) gleichzeitig als Ansaugstutzen für die zu untersuchende Flüssigkeit und als Auslaufstutzen für die bei der Gasbildung verdrängte Nährmedium-Keimsuspension ausgebildet ist, vorzugsweise einen Durchmesser<3 mm besitzt und über einen sterilen Stopfen (13) in einem graduierten Meßgefäß (4-) stehend gehaltert ist«
    4· Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet» daß außerhalb des Kultivierungsgefäßes (1) für das flüssige Fährmedium (5) ein Glasgefäß (1O) für ein oder mehrere feste Nährmedien (6), vorzugsweise als abgeteiltes Gefäß neben dem vakuum- oder gasgefüllten Raum (9)' angeordnet und mit einer Halterung (11) für das feste Nährmedium (6) versehen ist·
    - 10 -
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