DE2059788C3 - Bakteriologisches Kontrollmmel - Google Patents

Description

1. etwa 90 bis etwa 97 Gewichtsprozent Nährgelatine, etwa 0.005 bis etwa 0,015 Gewichtsprozent Diäthylaminoäthyldextran und etwa 2 bis etwa 10 Gewichtsprozent Natriumglutamat oder an Stelle von Diäthylaminoäthyldextran und Natriumglutamat der gleichen Menge Polyvinylpyrrolidon oder bei Verwendung von Natriumglutamat an Stelle von Diäthylaminoäthyldextran der gleichen Menge Dextransulfat oder Dextran oder

2. etwa 99,1 bis 99,5% Nährgelatine und zusätzlich Zystein, Thioharnstoff, Glutathion und Monothioglycerin besteht und

3. jedes Plättchen zwischen etwa 10⁵ und 10⁸ lebensfähige Bakterien enthält.

Die Erfindung betrifft ein bakteriologisches Kontrollmittel, das aus stabilen, trockenen, scheibchenlörmigen Plättchen besteht, wobei die Plättchen durch Vakuumtrocknen eines Nährgelatine und Stoffe zur Stabilisierung der Lebensfähigkeit der Bakterien und suspendierte Bakterienkulturen enthaltenden Nährmediums erhalten worden sind.

Das Auffinden und Identifizieren von Bakterien in Proben von Körperflüssigkeiten von Patienten in mikrobiologischen Laboratorien erfordert komplizierte Kulturmedien und Reagenzien. Zur Durchführung der notwendigen Tests bereiten die Laboratorien ihre Kulturmedien und Reagenzien für ihren eigenen Gebrauch häufig selbst zu. Dies kann die Sicherheit der Testergebnisse beeinträchtigen, da viele Kulturmedien und Reagenzien relativ unstabil sind.

Um sicherzustellen, daß die im Laboratorium durchgeführten Tests richtig und genau ablaufen, müssen die Laboratorien ihre Verfahren und Reagenzien mit Kulturen der aufzufindenden Bakterien überprüfen. Da solche Kulturen vorhersagbare biochemische Eigenschaften besitzen, können die Laboratorien den Wert ihrer Verfahren und Reagenzien abschätzen. Zum Zweck dieser Überprüfung müssen die Laboratorien einen Satz Kulturen kaufen und für deren Fortbestand sorgen. Da die Kulturen im allgemeinen sehr unstabil sind und häufig Subkulturen angelegt werden müssen, ergibt sich ein Unsicherheitsfaktor, da jedesmal, wenn von einem Organismus eine Subkultur angelegt wird, Mutationen auftreten können. In der klinischen Bakteriologie besteht daher ein Bedarf nach einer leicht verfügbaren und wirtschaftlichen Quelle von lebensfähigen, einheitlich reagierenden Mikro-Organismen.

Die übliche Methode, Bakterien zu konservieren, die Gefriertrocknung, eignet sich nicht für Kulturen zur routinemäßigen Qualitätskontrolle, da sie umständlich und teuer is:. Beispielsweise muß eine Ampulle mit gefriergetrockneten Bakterien unmittelbar nach der Rekonstitution verwendet werden, und die Herstellung von gefriergetrockneten Kulturen ist schwierig und teuer. Diese werden daher in der Regel gerne zur Fortpflanzung von größeren frischen Kulturen verwendet und nicht direkt in bakteriologischen Verfahren eingesetzt.

ίο Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein stabiles, preiswertes bakteriologisches Kontrollmittel in einheitlich dosierbarer Form bereitzustellen, das direkt in bakteriologischen Testverfahren eingesetzt werden kann.

Zur Lösung dieser Aufgabe dient das bakteriologische Kontrollmittel der eingangs genannten Art, welches sich dadurch auszeichnet, daß das Nährmedium aus

1. etwa 90 bis etwa 97 Gewichtsprozent Nährgelatine, etwa 0,005 bis etwa 0,015 Gewichtsprozent Diäthylaminoäthyldextran und etwa 2 bis etwa 10 Gewichtsprozent Natriumglutamat oder a.i Stelle von Diäthylaminoäthyldextran und Natriumglutamat der gleichen Menge Polyvinylpyrrolidon oder bei Verwendung von Natriumglutamat an Stelle von Diäthylaminoäthyldextran der gleichen Menge Dextransulfat oder Dextran oder

2. etwa 99,1 bis 99,5% Nährgelatine und zusätzlich Zystein, Thioharnstoff, Glutathion und Monothiolglycerin besteht und

3. jedes Plättchen zwischen etwa 10^s und 10⁸ lebensfähige Pakterien enthält.

Für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung eignen sich solche nicht sporenbildende Bakterien, die nach der Trocknung lebensfähig bleiben und unter den Bedingungen von beschleunigten Stabilitätsprüfungen stabil bleiben. Während unter diesen Bedingungen viele Bakterienarten geeignet sind, sind die üblichen gramnegativen und grampositiven Bakterien, auf welche die Tests der klinischen Bakteriologie in der Regel gerichtet sind, die besten. Beispiele von einigen geeigneten Organismen sind Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter cloacae, Salmonella typhimurium, Proteus vulgaris, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes u. dgl.

Die für die Mischungen gemäß der vorliegenden Erfindung geeigneten Nährgelatinen sind im allgemeinen kommerziell verfügbar.

Jede kommerziell erhältliche Nährgelatine ist geeignet, vorausgesetzt daß sie getrocknet werden kann und Plättchen mit den erwünschten physikalischen Eigenschaften bildet. Die Menge der Nährgelatine kann zwar zwischen etwa 90 und etwa 97 Gewichtsprozent des Suspensionsmittels variieren, Mischungen mit etwa 96 bis 97%, sind jedoch am günstigsten.

Die in Kombination mit Natriumglutamat verwendete Menge Diäthylaminoäthyldextrar., Dextransulfat oder Dextran soll ausreichen, um die Stabilität der Lebensfähigkeit der Bakterien sicherzustellen.
Es wurde gefunden, daß eine Mischung aus Nährgelatine, Diäthylaminoäthyldextran und Natriumglutamat in den angegebenen Mengen eine ausgezeichnete Stabilität der sich ergebenden Plättchen ergibt. Die Plättchen werden unter antiseptischen Bedin-

gungen hergestellt. Die Plättchen entstehen bei der Vakuumtrocknung von Tropfen des Suspensionsmittels mit den Bakterien. Bei der Trocknung werden die Tropfen in feste scheibenförmige Plättchen übergeführt. Diese Plättchen haben die Form von kreisförmigen Scheiben und ein Gewicht von etwa 2,8 bis etwa 4,0 mg. Diese Form und Größe ergibt sich aus der Größe der Tropfen und der Oberfläche, auf der sie getrocknet werden. Am besten werden Plättchen mit einem Gewicht von etwa 3,2 mg hergestellt. Der Begriff »Plättchen« umfaßt in der vorliegenden Beschreibung die eingetrockneten Tropfen.

Am günstigsten werden die Tropfen auf einer sterilen, nicht klebenden Oberfläche, z. B. einer gewachsten Petrischale, getrocknet, damit die entstehenden Plättchen leicht entfernt wurden können.

Zweckmäßigerweise werden die Tropfen auf der sterilen, nicht klebenden Oberfläche in einem Vakuum von etwa 500 bis 600 mm Hg bei Raumtemperatur getrocknet. Dies kann in einem CaSO₁ enthaltenden Exsiccator erfolgen und dauert in der Regel etwa 72 Stunden. Andere übliche Verfahren der Vakuumtrocknung und andere Bedingungen können mit etwa gleichen Ergebnissen verwendet werden.

Die entstehenden Blättchen können in kleinen sterilen, ein Trocknungsmittel, z. B. Silicagel, CaCl₂, CaSO₄, enthaltenden Gläsern mit Schraubdeckel aufbewahrt werden. Es können auch andere sterile Behälier verwendet werden; die genannten Gläser sind jedoch zur Etikettierung, zum Versand, zur Lagerung und Verwendung im Laboratorium zweckmäßig.

Der Organismus wird für die Trocknung vorbereitet, indem man ihn in einer geeigneten Brühe etwa 15 bis 24 Stunden lang bei etwa 30 bis 40⁰C, am besten bei 37°C, wachsen läßt. Anschließend wird die Kultur zentrifugiert und das sich ergebende, die Bakterien enthaltende Sediment im Nährmedium suspendiert und tropfenweise auf eine nicht klebende Oberfläche gebracht und im Vakuum getrocknet.

Die bei diesem Verfahren entstehenden Plättchen enthalten etwa 10^s bis 10^e lebensfähige Organismen pro Plättchen, und die Lebensfähigkeit dieser Organismen ist so geschützt, daß keine Änderung der biochemischen Eigenschaften eintreten kann. Diese Stabilität wird bewiesen durch einen beschleunigten Stabilitätstest, in dem die Lebensfähigkeit der Organismen bestehen bleibt, nachdem die Plättchen während 5 bis 7 Stunden Temperaturen von 100° C unterworfen wurden. Dieses Ergebnis ist bemerkenswert, da die gleichen Bakterien bei solchen Temperaturen normalerweise abgetötet werden. Somit eignen sich dip Bakterien in der vorliegenden Form ausgezeichnet für Kontrollzwecke. Die bakteriologischen Laboratorien haben damit die Möglichkeit einer verbesserten Qualitätskontrolle ihrer Testverfahren und demzufolge die Gewähr für genauere Tests und zuverlässige Ergebnisse.

Zur Kontrolle eines diagnostischen. Testverfahrens werden am besten zwei Organismen ausgewählt, und zwar einer, für den dieser Test positiv, und einer, für den dieser Test negativ ist. Das einen Organismus enthaltene Plättchen wird dann entweder direkt dem Testmedium beigegeben oder es wird in ein geeignetes flüssiges Wachstumsrnedium gebracht und etwa 2 bis 24 Stunden inkubiert. Im letzteren Fall wird eine geeignete Menge der Bakteriensuspension in das Testverfahren eingesetzt, um seine Wirksamkeit und Genauigkeit zu prüfen.

In der nachfolgenden Tabelle I sind einige der hauptsächlichsten Identifikationstests für Bakterien und ihre Reaktion auf den Kontrollorganismus aufgeführt. Die Ergebnisse können beispielsweise dazu verwendet werden, zu prüfen, ob der Oxidasetest für Pseudomonas aeruginosa im Laboratorium richtig ausgeführt wird. Wenn also der Test mit Pseudomonas aeruginosa enthaltenden Kontrollplättchen positiv und mit Escherichia coli enthaltenden Kontrollplättchen negativ ist, bedeutet das, daß das Testverfahren in Ordnung ist.

In Tabelle II sind einige Kohlenhydrat-Gärungsreaktionen der Kontrollorganismein zusammengestellt.

Diese Daten können beispielsweise dazu verwendet werden, die Ergebnisse des Raffinose-Gärungstests zu korrelieren und festzustellen, ob er im Laboratorium richtig durchgeführt wurde. Wenn also der Test mit Enterobacter cloacae enthaltenden Kontrollplättchen positiv und mit Proteus vulgaris enthaltenden Kontrollplättchen negativ ist, dann ist das im Laboratorium ausgeführte Testverfahren in Ordnung.

Tabelle III enthält eine Zusammenstellung der empfohlenen Organismen für die positive und negative Kontrolle bakteriologischer Tests.

Tabelle I

Reaktionen von Kontrollproben in den hauptsächlichsten Bestimmungstests

Gram	Oxydase	O/F	Gas der	Methyl	Voges-	H,S	KCN	Urease
färbung		(Glu	Glukose	rot	Pros-	(TSI)		(Chri-
		kose)"	fermen		kaucr			stensen)
			tation
')

Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Enterobacter cloacae
Salmonella typhimurium
Proteus vulgaris
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa

F	- NA	NA	NA	NA	NA
F	- NA	NA	NA	NA	NA
F	+ -	+	—	+	+
F	+ +	—	+	—	—
F		—	+	+	+
F	+ +	—	—	—	—
O				_

Tabelle 1 (Fortsetzung)

Zitrat Lysin- Ornithin- Arginin- MaIoiSim-Deicarb-Dekarb-Dihydronate mens) oxylase oxylase läse

·) O = Oxidativ; F = Fernientativ. NA = nicht anwendbar.
NT = nicht getestet.

Koagu- Katalase läse

6,5% DNASE Nitrat-NaCl reduktion

Staphylococcus aureus NA	NA	NA
Staphylococcus epidermidis NA	NA	NA
Enterobacter cloacae -f-	—	+
Salmonella typhimurium +	+	+
Proteus vul^aris —	—	—
Escherichia coli —	+	+
Pseudomonas aeruginosa +	NT	NT

NA NA

NA NA

NA
NA

NA -

NA -

+ ³) NT + NA NA NA NA

·) 48 h, schwach nach 24 h.

*) Am oberen Rand positiv.

') Schwach positiv nach 72 h (unsicher).

⁴) Langsam positiv; negativ nach 24 h; j

positiv nach 72 h.

Tabelle Il

Kohlenhydrat-Gärungsreaktionen von Kontrollorganismen

Adonii Arabi- Zello- Duicit Glyzerin nose biose

Inosit

Laktose Inulin

Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis Enterobacter cloacae
Salmonella typhimurium
Proteus vulgaris
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa

Tabelle II (Fortsetzung)

Maltose Mannit Raffinose Methyl- Salizin
pentose

Sorbit

Saccha- Treharose lose

Xylose

Staphylococcus aureus + . +

Staphylococcus epidermidis -f- —

Enterobacler cloacae + +

Salmonella typhimurium + +

Proteus vulgaris + —

Escherichia coli + +

Pseudomonas aeruginosa — —

') Positiv nach 3 bis 6 Tagen.

²) Schwach positiv nach 72 h; positiv nach 7 Tagen.

³) Negativ nach 72 h, positiv nach 8 Tagen.

') Schwach positiv nach 48 h; positiv nach 6 Tagen. °) Negativ nach 2 h; positiv nach 7 Tagen. (+) — verzögert positiv.

-t

Tabelle III

Empfohlene Organismen für die positive und negative Kontrolle bakteriologischer Tests

Liste der Organismen

1. Escherichia coli

2. Enterobacter cloacae

3. Proteus vulgaris

4. Staphylococcus aureus

5. Staphylococcus epidermidis

6. Salmonella typhimurium

7. Pseudomonas aeruginosa

8. Streptococcus pyogenes

Test	Empfohlener	Organismus
	Positiv	Negativ
1. Oxidase	7	1 oder 2
2. Indol	1	2 oder 3
3. Methylrot	1	2
4. Voges-Proskauer	2	1
5. Zitrat	2 oder 6	1
6. Schwefelwasserstoff (TSI)	6	1 oder 2
7. Urease	3	1
8. Lysin-Dekarboxylase	6	2 oder 3
9. Ornithin-Dekarboxylase	2	3
10. Arginin-Dihydrolase	2	3
11. Katalase	beliebig	—
12. Koagulase	4	5
13. KCN	2	1
14. D NAase	4	5
15. Glukosefermentation	1	7*)
16. Laktosefermentation	1 J.	3
17. Mannitfermentation	4	5
18. /S-Hämolyse auf Blut-	8	5
Agar
19. Bacitracin-Scheiben-Test	8	—
20. Natriumhippurat	4	8

*) Organismus Nr. 7 ist negativ für Glukosefermentation, baut aber das Kohlenhydrat oxidativ ab.

Alle in diesen Tabellen aufgeführten Tests und ihre Sichtbarmachung der positiven und negativen Reaktionen, welche die Anwesenheit oder das Fehlen eines Organismus durch Wachstum, Färbung oder Farbwechsel anzeigen, sind bekannt.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Illustration der Erfindung. Die Temperaturen sind in ⁰C angegeben.

Beispiel 1

Plättchen zur Kontrolle bakteriologischer Testverfahren werden wie folgt hergestellt:

Einen bestimmten Organismus läßt man in 10 ml Nährmedium etwa 16 bis 18 Stunden bei 37°C wachsen. Das Nährmedium setzt sich zusammen aus 17 g pancreatisch verdautem Casein, 3 g Soyabohnenpepton, 5 g Natriumchlorid, 2,5 g sekundärem Kaliumphosphat, 2,5 g Glucose und 1000 ml destilliertem Wasser. Der resultierende pH-Wert liegt bei etwa 7,3.

Die sich ergebende Kultur wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit entfernt. Das zurückbleibende, die Bakterien enthaltende Sediment wird in 4 ml einer sterilen Mischung aus 96,99 Gewichtsprozent Nährgelatine, 0,01 Gewichtsprozent Diäthylaminoäthyldextran und 3 Gewichtsprozent Natriumglutamat suspendiert.

Die suspendierten Organismen werden unter antiseptischen Bedingungen mit einer Pasteurpipette in Tropfen von etwa 0,02 bis etwa 0,05 ml auf eine sterile, gewachste Petrischale gebracht. Die Schalen mit den Tropfen werden in einen CaSO₄ enthaltenden Exsiccator gebracht, der auf 500 bis 600 mm Hg evakuiert wird, und bleiben in diesem bei Zimmertemperatur, ungefähr 20 bis 25 C. während 72 Stunden. Durch die Trocknung weiden die Tropfen in feste scheibenförmige Plättchen umgewandelt. Die Plättchen werden unter antiseptischen Bedingungen von der gewachsten Oberfläche entfernt und in kleine, sterile, ein Trocknungsmittel, z. B. Kieselgel, enthaltende Gläser mit Schraubverschlüssen gegeben. In jedes Glas kommen etwa 30 Plättchen. Diese Gläser eignen sich für die Zusammenstellung eines Testsatzes für Laboratorien und für Transport und Lagerung.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt die Anwendung der Kontrollplättchen.

(a) Indirekte Methode

Ein Plättchen wird unter antiseptischen Bedingungen mit einer sterilen Pinzette aus einem Glas entnommen und in einen sterilen Behälter mit Schraubverschluß gebracht, der 2 ml steriles Nährmedium des Beispiels 1 enthält, und bei 37^CC 1 bis 2 Stunden inkubiert. Es bildet sich eine Suspension von lebensfähigen Organismen.

Eine kleine Menge dieser Suspension wird dazu verwendet, ein entsprechendes biochemisches Testmedium zu impfen. Durch Beobachtung des Ergebnisses kann die Qualität des Tests bestimmt werden.

(b) Direkte Methode

Ein Plättchen wird direkt dem Testmedium beigegeben, wie beispielsweise in dem folgenden Coagulasetest:

Zwei Blättchen, eines mit Staphylococcus aureus und eines mit Staphylococcus epidermidis werden in getrennte, ein Kaninchenplasma enthaltende Probenröhrchen gegeben. Nach 3 Stunden gerann das Plasma in dem Staphylococcus aureus enthaltenden Probenröhrchen, während Staphylococcus epidermidis ein negatives Ergebnis zeigte.

Mit Hilfe dieses Tests kann der Bakteriologe feststellen, ob sein Coagulasetestverfahren korrekt und genau durchgeführt wird. Auf die gleiche Weise können die Verfahren der anderen hier beschriebenen Tests ausgewertet werden.

Beispiel 3

Die Stabilität der in den Blättchen konservierten Organismen wird durch einen beschleunigten Stabilitätstest bestimmt, der wie folgt ausgeführt wird:

Einzelne Blättchen werden in acht sterile, geschlossene (nicht luftdicht) Reagenzgläser der Größe 13 χ 100 mm gebracht. Eines der Reagenzgläser dient zur Kontrolle des Wachstums und wird keiner Hitzebehandlung unterzogen. Die übrigen Reagenzgläser werden in ein thermostatisiertes Ölbad gebracht. Wenn die Temperatur im Inneren eines zur Kontrolle im Ölbad befindlichen leeren Reagenzglases 100 C er-

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reicht hat, beginnt die Zeitrechnung für die übrigen Proben.

In stündlichen Abständen wird jeweils ein Reagenzglas mit einem darin enthaltenen Plättchen herausgenommen. Unmittelbar nach der Entnahme werden 3 ml Nährmedium des Beispiels 1 in das Reagenzglas gegeben. Nach der Zugabe der Brühe werden alle

Reagenzgläser über Nacht bei 37°C inkubiert und am folgenden Tag auf Wachstum untersucht.

Normale Kulturen mit den entsprechenden Organismen würden bei den gleichen TcmperaUirhedingungen in weniger als 1 Stunde abgetötet werden. Dk Ergebnisse des beschleunigten Stabilitätstcsts sind \vu folgt:

Organismus

Stunden	bei 100°	2	3
O	1	4-	4-
+	+	4-	4-
4-		4-	4-
-L

Pseudomonas aeruginosa
Enterobacter cloacae
Salmonella typhimurium

+ = Wachstum.

■r-

4-	4-	4-
4-	4-	4-
4-	.1-	T

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Bakteriologisches Kontrollmittel, das aus stabilen, trockenen, scheijchenförmigen Plättchen besteht, wobei die Plättchen durch Vakuumtrocknen eines Nährgelatine und Stoffe zur Stabilisierung der Lebensfähigkeit der Bakterien und suspendierte Bakterienkulturen enthaltenden Nährmediums erhalten worden sind, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium aus