DE1941768A1

DE1941768A1 - Verfahren zur Herstellung von Uricase

Info

Publication number: DE1941768A1
Application number: DE19691941768
Authority: DE
Inventors: Knud Aunstrup; Mahler Jorn Leo
Original assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Current assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Priority date: 1968-08-19
Filing date: 1969-08-16
Publication date: 1970-02-26
Also published as: BE737607A; GB1221235A; DE1941768B2; US3669843A; DE1941768C3; FI46400C; CH525956A; FR2015907A1; AT294733B; NO131605B; NO131605C; SE359566B; FR2015907B1; DK124338B; FI46400B

Description

PATH M ΤΑί|·-ι₇

10 231 10/re

Novo Terapeutisk Laboratorium A/S, Kopenhagen (Dänemark)

Verfahren zur Herstellung von Uricase.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Urioase, einem Enzym das die Oxidation von Harnsäure spezifisch katalysiert.

Uricase kann für die Behandlung bei Gicht eingesetzt werden. Ein v/eiterer Verwendungszweck besteht in der Bestimmung der Harnsäure im Blut und Urin*

üricacc wird im allgemeinen aus inneren tierischen Organen _K wie beispielsweise der liieren und Leber, durch Extraktion und Fraktionierung isoliert. Die hierbei angewendeten Verfahren sind jedoch kompliziert und die Ausgangsmaterialien teuer, so dass der Preis der nach den bekannten Verfahren hergestellten Uricase verhältnismässig hoch liegt. In den letzten Jahren v/urde deshalb der Gewinnung von Uricase aus mikrobischen Quellen besonderes Interesse entgegengebracht. Derartige Verfahren sind von verschiedenen Autoren beschrieben worden, bei·*

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BAD ORIGtNAU

spielsweise in der britischen Patentschrift 1 104 197 und in der französischen Patentschrift 1 529 675.

Ein allgemeines Merkmal der bekannten Verfahren besteht darin,' dass das Enzym in den Mikroorganismen intrazellular auftritt, so dass eine mechanische oder chemische Zerstörung der Zellen notwendig ist, um das Enzym»freizumachen. Darüberhinaus ist das erzeugte Enzym in vielen fällen an Teilchen gebunden, was einen erheblichen !lachteil dann darstellt, wenn Enzyme hoher Reinheit verlangt werden, wie dies beispielsv/eise für therapeutische Zwecke der Fall ist.

Es v/urde nun gefunden, dass der Mikroorganismus Bazillus fa3tidiosus oder ein neuer Bazillus, der eine "Variante von Bazillus fastidiosus darstellt, bei der Kultivierung unter aeroben Bedingungen auf einen Medium, welches Harnsäure oder ein äquivalent von dieser und andere geeignete liährstoffe enthält, in hoher Ausbeute Uricase erzeugt und diese in der Kulturflüssigkeit anreichert, so dass die Reinigung auf einfache Weise erfolgen kann.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Üricase ist demzufolge dadurch gekennzeichnet, dass Bazillus fastidiosus oder einer Variante hiervon unter aeroben Bedingungen auf einem Medium kultiviert wird, das,Harnsäure oder ein Äquivalent hiervon enthält, wonach gegebenenfalls die erzeugte Ürieaasaus dem Kulturmedium isoliert wird.

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BAD

Wie es sich aus nachfolgendem ergibt, können folgende Bazillusstämme für die Zwecke der Erfindung mit Vorteil eingesetzt werden: Bazillus fastidiosus NCIB 104-23, Bazillus fastidiosus NCIB 10424, Bazillus fastidiosus var. NCIB 10425 und Bazillus fastidiosus var. NCIB 10372.

Ein wichtiger Vorteil der nach der Erfindung erhaltenen bakteriellen Uricase besteht gegenüber den handelsüblichen Präparaten der bekannten Uricase immmalianen Ursprungs darin, dass eL- m hohe Aktivität und vollständige löslichkeit nit einer niedrigen Absorption im ultravioletten Spektralbereich zusammentreffen. Die vollständige Löslichkeit gewährleistet die Stabilität der (niedrigen)Enzymabsorption, die Voraussetzung ist für eine genaue Bestimmung der Harnsäure mit der Differenzial-Ultraviolett-Spektroskopie.

B. fastidiosus wurde von L.E. den Dooren de Jong, Zentralbl. Bakt. Par., 2. Abt. 72» 344 (1929). beschrieben. Im nachfolgenden sind die charakteristischen Eigenschaften des Mikroorganismus, wie sie von den Dooren de Jong angegeben sind, aufgeführt:

Morphologie: Kotile stammbildende Sporen, 4*5 x 1.5-2.5/u

* ,Sr

Sporen oval, terminal Kolonieform: Die Kolonien werden durch charakteristische

rhizoide Auswüchse umgeben. Nährstoffanforderungen:

Harnsäure ist für das V/ach st um erforderlich

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BAD ORIGINAL

und kann als ausschliessliche Kohlenstoff- und Stickstoffquelle eingesetzt werden. Kein anaerobes Wachstum.

Die charakteristischen Eigenschaften der vorerwähnten neuen Variante von B. fastidiosus sind nachfolgend angegeben:

Morphologie: Hichtmotile, stammbildende Sporen Sporangium nicht gequollen Sporen oval, zentral bis subterminal,

0,6 /U χ 0,8 /U Vegetative Zellen auf Bouillonagar +

1 io Harnsäure, 0,6 - 0,8 /U χ 3 - 4 /U. Vegetative Zellen auf Bouillonagar, .. 0,6 - 0,8 /U χ 1 - 2 /U.

Nährstoffanforderungen:

Harnsäure kann als ausschliessliche Harnstoff- und Stickstoffquelle eingesetzt werden.

Wachstum auf Bouillonagar:

Gering; die Kolonien sind farblos und besitzen nicht unterbrochene Kanten.

. Durchmesser nach 3-4 Tagen bei 37⁰C:

1-2 mm.
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Das Wachstum kann auf Verunreinigungen der Harnsäure in dem Medium zurückzuführen sein.

Wachstum auf Bouillonagar + 1 ^aß> Harnsäure:

Gut nach 24 Stunden bei 37⁰C Charakteristische, spiegeleierähnliche Kolonien mit nicht unterbrochenen Kanten und einem Durchmesser von 3-5 mm. Das Wachstum ist besser als auf reiner Harnsäure.

Anaerobes Wachstum:

Keines.

Zwei Stämme dieser neuen Variante von B. fastidiosus wurden isoliert, nämlich NCIB 10425 und IiCIB 10372.

B. fastidiosus var. NCIB 10372 (C 327) wurde aus einer Bodenprobe (von Seeland, Dänemark) in der folgenden Weise isoliert:

In Erlenmeyer-Kolben mit einem Passungsvermögen von 500ml wurden ;Jeweils 100 ml eines Mediums folgender Zusammensetzung eingegeben:

Harnsäure ' 1 .&' . '

Na₂HPO^.12H₂O 2g
Leitungswasser 100 ml -

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BAÖ OBlGrNAL.

1 *J ·+ I

In ;jeden Kolben wurde 1 g der Bodenprobe eingebracht. Es wurde dann während 10 Minuten gelcocht, um die vegetativen Zellen" zu entfernen. Der Inhalt der Kolben wurde dann inkubiert bei 30⁰G auf einem Schütteltisch (220 U/min) während 4 Tagen, wonach der Inhalt der Kolben in eine andere Gruppe von Kolben überführt wurde, welche das vorerwähnte Medium enthielten. Diese Kolben wurden während zwei Tagen inkubiert und der Inhalt der Kolben wurde hiernach au-f Harnsäureagar ausgebreitet, der die obige Zusammensetzung besass und zusätzlich noch 2 $ Agar enthielt. Die in dieser Weise behandelten Agarplatten wurden bei 30⁰C inkubiert und nach klaren Zonen untersucht, v/elche die Auflösung des Harnsäureniederschlags anzeigen.

Die Kolonien, die klare Zonen lieferten, wurden auf frische Harnsäure-Agar-Platten überführt, bis reine Kulturen erhalten wurden. Diese Kulturen wurden dann einer Gefriertrocknung unterworfen.

B. fastidiosus var. ITGIB 10425 wurde aus einer Bodenprobe, von einem Hühnergehege isoliert, wobei ähnlich wie oben beschrieben vorgegangen wurde, allerdings mit der Ausnahme, dass das Anreicherungsmedium 1 <$> Harnsäure und 0,1 # K₂HPO. in Leitungswasser enthielt und die Erlenmeyer-Kolben während 5 Tagen bei 37⁰C ohne Schütteln inkubiert wurden. Die Bakterien wurden

diesen Kolben isoliert indem sie auf. Agarplatten ausgebreitet wurden, welche die oben angegebene Zusammensetzung zuzüglich 2 i> Agar enthielten.

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T?f"*l

Das in der erfindungsgemässen Weise hergestellte Uricace-■ , enzym ist löslich und in Lösung stabil. Die Aktivität des Enzyms ist bei etwa pH 9,0 am grössten. ITach der nachfolgend beschriebenen Reinigung ist die natürliche Absorption des Enzyms bei 293 m /U hinreichend niedrig wie es für die Verwendung des Enzyms bei der Harnsaurebestiiamung verlangt wird.

Die Uricaseeinheit, auf welche nachfolgend Bezug genommen wird, wird wie folgt bestimmt:

30,00 mg Harnsäure wird in 0,1 H Boratpuffer (pH 9,0) aufgelöst. Der pH wird mit 1,0 K LiOH eingestellt und mit 0,1 K Boratpuffer (pH 9,0) wird bis auf ein Endvolumen von 150 ml aufgefüllt.

4,00 ml dieses Mediums werden in einen Messkolben von 1CO ml Fassungsvermögen gebracht, der auf einer Hohlwelle Xu. 37⁰O rotiert, wodurch eine wirksame Belüftung gewährleistet wird. 1,00 ml der zu untersuchenden Enzymlösung (pH 9,0) wird zugegeben und nach 10 Minuten wird der Kolben mit 0,1 H HGl aufgefüllt, wodurch die Reaktion unterbrochen wird. Die optische Dichte*(OD) wird in einer Quarzkuvette gegen Luft bei 283 m/U gemessen. Der Blindwert wird in der Yieise erhalten, dass HCl vor der EnzymlöGung zugegeben wird (um eine Reaktion zu vermeiden) und die Messung wie oben durchgeführt wird. Die Differenz zwischen den beiden oc - .xoniossenen Werten ist 283«

009809/ i Bi₁ 1

Eine Uricaseeinheit wird in der Weise definiert, dass sie 1 /U Hol Harnsäure pro Minute "bei pH 9,0 und 37 C abbaut. Da Harnsäure in 0,1 H HCl die maximale optische Dichte bei 283m/U besitzt, wobei die molare Extinktion 1,238 χ 1(r beträgt, errechnet sich die Anzahl der Uricaseeinheiten pro ml Enzymlösung wie folgt:

Einheiten pro ml = —3—πτ

1 ,O

Das erfindungsgemässe Verfahren v/ird durch die nachfolgenden Beispiele weiterhin veranschaulicht.

Beispiel 1

B. factidiosus IiCIB 10423 wurde auf Schüttelkolben mit einem !Fassungsvermögen von 500 ml kultiviert, welche 100 ml eines Mediums nachfolgender Zusammensetzung enthielten:

Harnsäure Saccharose Hefeextrakt KH₂PO₄ ,MgSO₄

Kasein, aus dem das Trypsin digeriert wurde

Polyglykol

Die Kultivierung wurde bei 3O⁰C während 5 Tagen auf einem rotierenden Schütteltisch durchgeführt (220 U/min). Die

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10	g/l
5	g/i
1	ß/1
1	g/l
0,	5g/l
5	g/l
0,	1g/l

- 9 - ' .
Uricaseausbeute betrug 0,24 Einheiten pro ml. Der pH war 8,9.

Beispiel 2

B. fastidiosus NCIB 10424 wurde wie in Beispiel 1 beschrieben kultiviert; die Ausbeute betrug 0,27 Einheiten pro ml. Der pH lag bei 9,0. _ · ,

Beispiel 3

B. fastidiosus var. KCIB 10425 wurde wie in Beispiel 1 beschrieben kultiviert; die Ausbeute betrug 0,18 Einheiten
pro ml. Der pH lag bei 9,0.

Beispiel 4

In einem Fermentationsbehälter mit einem Passungsvermögen von 10 1 wurden 6 1 eines Mediums mit der im Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung angesetzt.

Das Medium wurde während 60 Minuten bei 120⁰C sterilisiert,
auf 35⁰C abgekühlt und mit 100 ml.einer 24 Stunden alten Kultur von B. fastidiosus var. UCIB 10372 aus einem Schüttelkolben geimpft, wobei das Medium die oben beschriebene Zusammensetzung besass. Es wurde mit dem Rühren und der Belüftung be- . " ßonnQn und die Fermentation bei 34⁰C fortgeführt, flach 96 Stunden wurde eine Uricaseaktivität von 0,27 Einheiten pro ml er- ■ , halten. Die Fermentation wurde beendet'und die Kulturflüssigkeit in der folgenden V/eise aufbereitet:

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- ίο -

Nach dem Abzentrifugieren der Zellen wurden 160 ml der Kulturflüssigkeit auf -10⁰C gebracht. 300 ml Azeton(-1O°C) wurden unter Umrühren zugegeben. Nach einer Stunde wurde der Niederschlag abzentrifugiert (O⁰C, 4-00 U/min, 10 Hinuten) und in 160 ml 0,1 M Boratpuffer bei pH 9_f0 wieder aufgelöst. Die erhaltene Lösung enthielt 0,23 Einheiten pro ml. Nach der Dialyse gegen zwei Teile Boratpuffer (pH 9,0) bei 3 - 5⁰C wurde ein stabiles flüsiges Produkt erhalten. Der

Wert dieses Produktes entsprach den Anforderungen für die Harnsäurebestimmung. Der 0^093 ^^ev^ entspricht 0,40 Einheiten pro ml. Dies entspricht einer natürlichen Enzymabsorption von OD₂Q, =0,009 unter Bedingungen, wie sie für die Harnsäurebestimmung typisch sind (Volumen: 3 ml; Reaktionsdauer bei Raumtemperatur: 16 Minuten; pH 9,0).

Die Nährmedien und die Reinigungsverfahren, wie sie in den vorstehenden Beispielen beschrieben wurden, können im Rahmen der Erfindung wesentliche Änderungen erfahren, beispielsweisey&adurch, dass die speziellen Bestandteile der vorstehenden medien durch andere Bestandteile ersetzt werden. Die vorstehend und in den Ansprüchen verwendete Formulierung "ein Harnsäure oder ein Äquivalent von dieser enthaltendes Kedium" umfasst sowohl Harnsäure als solche als auch andere Verbindungen, > die ebenfalls die Erzeugung von Uricase ermöglichen, wenn sie bei dem vorliegenden Verfahren eingesetzt werden.

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Beispiel 5

Unter den in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen wurde nach einer 112stündigen Fermentation in einem Fermentationsgefäss mit einem Fassungsvermögen von 100 1 eine Uricaseaktivität von 0,70 Einheiten pro ml erhalten. Die Fermentation wurde dann abgebrochen.

45 1 Kulturflüssigkeit wurden zentrifugiert, wobei 44 1 an klarer obenauf schwimmender Flüssigkeit und 370 g Satz erhalten wurde. Die obenauf schwimmende" Flüssigkeit wurde auf O⁰O abgekühlt und 85 1 Azeton (auf -1O⁰C abgekühlt) unter Umrühren zugegeben, wonach die Mischung auf -10⁰C abgekühlt wurde. Nach einstündigen Rühren wurde sie zentrifugiert und der Niederschlag .(73 C nassgewicht) bei O⁰C in 10 1 von 0,1 H Tris-Hydrochlorsäure-Puffer(pH (25⁰C) =8,0; {Dris=tris (hydroxyme thyl)-aminonethan). Die Lösung wurde gegen 2 χ 250 1 desselben PuffGrs während 16+24 Stunden bei 4⁰C dialysiert. Das Dialysat wurde solange zentrifu3iert, bis es klar war. Der Uricasegehalt betrug dann 2,50 Einheiten pro ml.

Zu 400 ml des zentrifugiert en Dialysat s wurden 149 mg EDi¹A-Dinatriumsalz (SDTA = Ä'thylendiamintetraessigsäure) zugegeben. Das Dialysat wurde auf einer Säule adsorbiert, die etwa 7g DEAE A-50 Sephadex Ionenaustauscher enthielt, der mit 0,1 M Iris-Hydrochlorsäure-Puffer von pH = 8,0 ins Gleichgewicht gebracht wurde* Die Eluierung wurde mit einem anstei-

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BAD" ORIGINAL·.-

genden Gradienten von 1540 ml desselben Puffers + 1540 ml desselben Puffers mit einem Gehalt von 1 Mol Natriumchlorid pro 1 durchgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und enthielten insgesamt 780 Einheiten Uricase. Die spezifische Aktivität betrug-4s56 Einheiten pro ml und der Viert von ^0D293 " °»090/Einheiten/ml. Die Uricaselösung wurde mit 0,1 M Tris-Hydrochlorsäure-Puffer pH = 8,0 verdünnt, um sie auf 4,0 Einheiten pro ml einzustellen und EDTA-Dinatriumsalz wurde zugegeben,um die Konzentration auf 10"^ Mol EDTA pro Liter einzustellen. Hiernach wurde das Produkt in Ampullen lyophilisiert, die jeweils 5 ml enthielten. Bei Zugabe von 2 ml destilliertem Y/asser enthielt eine Ampulle genügend ITricase um 100 Harnsäurebestimmungen durchführen zu können. Bei dem Enzym ist OD,,«- = 0,006 unter den Bedingungen wie sie bei einer schnellen HarnsäureheStimmung vorliegen, d.h. Volumen =s 5 ml, Reaktionszeit = 8 Minuten bei Raumtemperatur, pH = 9,0 - 9,5·-Das lyophilisierte Enzymprodukt ist sowohl bei 4°ö als auch bei Raumtemperatur (25⁰G) stabil·

00 9809/15V1 BAD OFUGtNAl*

Claims

■ - 13 - . ' Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von TJricase, dadurch gekennzeichnet, dass der Bazillus fastidiosus oder eine Variante hiervon unter aeroben Bedingungen auf einem Harnsäure oder ein Äquivalent von dieser enthaltendem Medium kultiviert wird, wonach gegebenenfalls die erzeugte Uricase aus dem Kulturmedium isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Bazillus fastidiosus ITGIB 10423 verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Bazillus fastidiosus IiGIB 10424 verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Bazillus fastidiosus var. ITCIB 10425 verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da3S Bazillus fastidiosus var. ITCIB 10372 verwendet wird.

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