JPS5871893A - Ｒ−ニコチンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は培養法によるＲ−ニコチンの製造法に関する。

ニコチ／には２′位の炭素原子の不斉性によシル−二コ
チ／と８−二コチ／の２つの光学異性体があシ、タバコ
植物に含まれるニコチンはすべてＳ−型であることが知
られている。Ｓ−二コチ／はたばこに喫煙満足感を与え
る重畳な物質と考えられるが致死作用もあり、複雑な生
理作用を持つことから、神経生理など医学研究において
も重要な物質である。

一方、ルーニコチンはＳ−二コチ／に比し生理作用が約
１／１０程度と低く、またＳ−ニコチンの作用に対して
抑制的に働くという知見もあり、かつ、最近たばこの香
喫味に対しても望ましい結果を与えることが判明するな
ど、医薬やたばこなどの産業分野への応用が江目されて
いる。

従来、几−ニコチ／の製造法としては大別して次の２通
シの方法が知られている。第１の方法はラセミニコチ／
の有機酸塩の再結晶法による方法であるが、この方法は
収率が極めて悪く通常１０峰程度以下であって大量生産
も困難であるため一般には極く少量調整する場合に用い
られているに過ぎない。次に第２の方法として培養法す
なわちラセミニコチ／含有培地に８−ニコチン分解菌を
接種培養して８−二コチ／のみを選択的に分解したのち
、咳培養物よりルーニコチンを抽出する方法（山下費子
ら：農芸化学会誌３７、Ｐ、３８５〜３８８．１９６３
　）が知られている。しかし、従来公知の８−ニコチン
分解菌は培地中のニコチン濃度が（Ｌ４１１程度の低濃
度でも生育が阻害されるという欠点があるため、このよ
うな８−ニコチン分解菌を用いて几−ニコテ／を製造す
る場合には培養槽や抽出装置等の製造装置規模が極めて
大きなものとなるのみならず、抽出用の有機溶媒などの
使用−天童となるなど技術上、経済上の問題が多く実用
化は困難であった。

このような問題点を解決する観点から本発明者等は、高
濃度二コチ／でも生育が阻害されない８−ニコチン分解
菌を得ることを目的として、種々の葉たばこや土壌中か
ら１００菌株以上のニコチン分解菌を分離し、ニコチン
耐性を検定したところ、岩手県大迫のたばこ畑土壌から
ニコチン濃度１僑の高濃度ニコチン培地で生育可能な−
を分離することに成功した。この薗扛シ。

トモナスｌｌプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔ
ｉｄａ）に属し、Ｓ−二コチ／を分解するがルーニコチ
ンを分解しないという基質特異性を有する醒であること
を見出し本発明をなすに至った〇 すなわち、本発明はラセミニコチン含有培地に、シュト
モナス・プチダに属するＳ−ニコチンを分解しＲ−ニコ
チ／を分解しない高濃度ニコチン耐性菌を培養して得ら
れる培養物からルーニコチンを抽出採取することを特徴
とするＲ−ニコチ／の製造法である。

本発明に使用する菌はシュトモナス・プチダＪＴ８−９
として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した細菌
（微工研菌寄第６１４６号）であシその細菌学的性質は
次に示すとおりである。

なお細菌学的性質に関する試験および同定は、アメリカ
細菌学者協会編マニュアル・オプ・ミクロバイオロジカ
ル・メソツズ（８ｕｅｉｅｔｙ　ｏｆＡｍｅｒｉｃａｎ
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｓｔｓ　：Ｍａｎｕａｌ　
　ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　（ＭｃＧｒａｗ　Ｈｉ　１１．１９５７　））、コ
ーワンおよびスティール共著マニ、アル・フォア・ザ・
アイデ／ティフイケイシ冒ン拳オプ・メディカル−バク
テリア（８，Ｔ、　　Ｃｏｗａｎ　　ａｎｄＫ、Ｊ、　
５ｔｅｅｌ：Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　ｔｈｓ　Ｉｄ＠ｎ
ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆＭｅｄｉｃａｌ　Ｂａｃｔ
ｅｒｉａ　（Ｃａｎｔｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖ＊　Ｐｒｅ
ａ＠％１９７Ｇ））おヨヒバージェーズ・マニュアル・
オブ・デタミネーテイブーバクテリオロジ−８版（Ｂｅ
ｒｇｅｙｖａＭａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｖｅ　Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ）ｇｙ　８　ｔｈ　ｅｄ
、。

（Ｔｈｅ　Ｗｉｌｌｉａｍｍ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ、１
９７４））に基づいて行なった・試験に用いた菌体はす
べて栄養寒天培地に２８℃で生育させたものを用いた。

ＪＴ８−９の細菌学的性質 形状：　　　　　桿菌 ベノ毛−他系、４〜５本 コロニーの形態：乳白色、半透明、凸レンズ状、円形、
金縁 最適′ｆ！ｉ（：　　　　６．８ 生育適温：　　　２８℃ 死滅温度：　　　７０℃（１０分間） ダラム染色：　　陰性 カタラーゼ活性：有 オキシダーゼ活性：有 糖の分解形式二　酸化的 硝酸塩の還元：　なし ポリ−β−ハイドロキンブチレイトの蓄？＊：なし有 螢光色素の生成：（（ ピオンアニンの生成：なし カロチノイドの生成：なし ４１℃での生育：なし 蔗糖からのレバ７の生成：なし アルギニ／デヒドロラーゼ活性：有 卵黄培地でのレンチナーゼ活性：なし ゼラチンの液化：陰性 デンプンの加水分解：陰性 栄養要求性：　　なし 酸素との関係：　好気性 ぺ／ジルアミンの利用：有 炭素源として利用する化合物ニブドウ糖、亨−バリ／、
β−アラニ／、ＤＬ−アル ギニン 炭素源として利用しない化合物ニドレノ・ロース、メソ
、イノシトール、ゲラニオール 炭素源および窒素源として利用する化合物：Ｓ−二コチ
／ 炭素源および窒素源として利用しない化合物：Ｒ−ニコ
チン　４ ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量：　６０．２チ 最少生育阻止濃度： Ｓ−ニコチン　　２嘩 ルーニコチ／　　２嘩 ラセミニコチン　２９＆ 以上の性質から本薗をシュドモナス拳プチダ（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ（Ｔｒｅｖｉｓａｎ）　
Ｍｉｇｕｌａ　）と同定した。

次に本発明の詳細な説明する。なお、本明細書中におい
てチは特記しない＠９重量哄を表わすＯ 使用する培地は、オートクレーブを用いて加熱加圧滅菌
した例えば第１表の組成の培地に、あらかじめＩＨ６，
ｓに調整した後Ｖ過滅■又は加熱加圧滅菌した１０チ磯
度のラセミニコチン水溶液を、培地中のニコチン濃度が
１％以下になるように無菌的に加えて調整する。第１表
の組成の培地は特に変わった特徴を有するものではなく
一般に細菌培養用として知られている種々の合成培地と
類似した組成であシ、無機塩の組成も特に厳密に規定す
る必要はなく各無機塩の量を１／２〜２倍程度増減して
も差支えない。又、公知の細菌培養用の合成培地をその
まま５Ｈを調整して用いてもよい。培地のＩＨは６．５
〜７．５、好ましくは６．８が適している。

第１表　培地の組成 ＫＨ諺ＰＯ４１ｔ ＭｇＳＯ＊　　　　　　　　　　　１　ｔＦ＠ＳＯ＝・
７Ｈ歯０　　　　　　０．０１１ＦＣａＣ１＊　　　　
　　　　　　　ｏ、　０３７５１Ｍｎ８０ｉ　＊７Ｈｓ
　Ｏｏ、　０１２　ｔＨ會Ｂｌｏｗ　　　　　　　　　
　Ｏ，２２９ｆＺｎＳＯａ　　・ＳＨｓ　　０　　　　
　　　　　　　　　　　　　０．　１　７　　ｓ　　ｔ
Ｎａｇ　ＭＯＯ４ｅ　２Ｈｓ　０　　　　　０．０１１
　ｔＣｕ８０ａ　　ｓＨ曾Ｏｏ、　　ＯＯｓ　　ｔＣｏ
ＳＯａ　−７ＨＩ　Ｏｏ、　ｏ　　ｏ　ｓ　　ｔエチレ
／ジアミ／４酢酸　　０．３７５　ｆイースト・エキス
　　　　　０．５ｆ 稍製氷　　　　１ノ 益Ｈ６，８ また肉エキス、酵母エキスおよびペプト／などを含む天
然培地を用いることもできるが高価であり、第１表の培
地に比べＳ−ニコチン分解に大きな差はない。

ラセミニコチン水溶液の曾Ｈ調整には塩酸や硫コ 酸などの鉱＃あるいはりンゴ酸や鳳ハク酸なとの有機酸
を用いることができるが、有機酸はＳ−ニコチン分解１
により利用されるのでむしろ鉱酸より好ましい。

次にラセミニコチン水溶液を加えた無菌培地に、第１表
の培地にラセミニコチ／又はＳ−二・コチ／を０．４〜
１チ加えた培地であらかじめ本発明の高一度二コテン耐
性８−ニコチン分解１を培養したＩｋｖＭ液を１１５０
〜１１５（容量比）接種し温度２５〜３２℃で好気的に
培養する・培養方法は振盪培養または通気培養のいずれ
でもよいが、培養槽にｐＨ電極および溶存酸素電極を取
り付けこれらを測定しながら通気攪拌培養する方法が最
も望ましい。この理由としては、Ｓ−ニコチ／を０．４
〜１嘩含む培地においてＬ培養中のｐＨの変化が大きく
、培養の前半では酸性になシ終りに近うくとアルカリ性
になる傾向があるので、培地、のｐＥ（を望ましい範囲
になるように調整するために培地ｐＨの連続測定が必要
であ秩父Ｓ−ニコチンが培地中に存在する間は溶存酸素
濃度が０であり、消費し尽されると上昇するので、Ｓ−
ニコチン分解の指標として培地中の溶存酸素を測定する
ためである。この通気攪拌培養はバーチ式、半連続式お
よび連軟式のいずれの方法でもよい。

本発明は、ラセミニコチンの半分の成分であるＳ−ニコ
チ／を、高濃度二コチ／耐性Ｓ−ニコチン分、屑繭を用
いて分解して純粋なルーニコノ１ チンのみを得る方法であるが、培地中の、ニコチン濃度
が約−１％を超えると８−ニコチ７分解−の生育が阻害
され遂には死滅してｓ−ニコチ／の分解が出土される。

ラセミニコチ／含有培地にＳ−ニコチン分解園を接種し
培養すると培養液のニコチン濃度がＦがるので、培養液
に残存しているニコチンと新たに加えるラセミニコチン
との合計量が培養液の１％を超えないようにラセミニコ
チンを追加添加して培養を継続することができる。この
操作を繰り返すことにょプ能率よくルーニコチ／を製造
することができる。

このためには培養液のニコチン濃度を連続的に測定すれ
ばよいが、これは実際上極めて困難である。Ｓ−＝コチ
７分解菌の対数増殖期以降においてはＳ＝ニコチンが培
地中にある間は溶存酸素濃度が０であり、消費し尽され
ると溶存酸素一度が上昇する。この九め溶存酸素濃度を
連続的に測定することにより、培養液中の８−ニコチン
が分解され尽した時点を知ることができ、これによって
上記したラセミニコチンの断続添加を行なう。

培養の終期が近づい九とき、培養中の培養液のニコチン
濃度を測定し、加えたラセミニコテ／の量から計算にょ
シ８−ニコチ／が分解し尽されたことを確認するか、又
は培養中のニコチンの旋光度を測定し残存二コテ／がル
一体のみであることを確認して培養を終了させる・実用
とする。）と同じになりてから１時間以上培養　−を続
けてから培養を終了δせてもよい。

次に培養が終了した培養液を加熱して８０℃以上にする
か、ｐＨ３以下の酸性にして蛋白質等を凝固させ遠心分
離にょシ菌体等の固形物を除く・次いでこの上澄液をｐ
Ｈ９以上のアルカリ性とした後有機溶媒でＲ−ニコチ／
を抽出する。

抽出方法は振分けまたは連続向流抽出勢いかなる方法で
もよい０使用する有機溶媒としてはエーテルあるいはク
ロロホルム等が適している。

このルーニコチ／抽出溶液から有機溶媒を留去するとと
によ６ａ−＝クチ／ｌ−得る０ここで得られたルーニコ
チンはやや褐色を帯びわずかの不純物を含んでいるので
、必要に応じ減圧蒸留することにより無色の純粋なＲ−
ニコチンを得る。

次に本発明を実施例によって説明する。

実施例１ 第１表の組成の培地＆９７５ｊを丸菱理化装置研究所製
の１０１容ＭＤ５００型発酵槽に入れオートクレーブで
１２１℃、１５分間滅菌した後、これにあらかじめこは
く酸でｐＨを６．８に調整したのち孔径０，４５μｍの
フィルターで濾過滅菌シた１０１％ラセミニコチ／溶液
５２５−を無菌的に添加し計６．５１の培地を調整した
。別に、第１表の組成の培地に０．２−のＳ−二コチ／
を加えこはく酸でｐＨを６．８に調整した培地５００−
を３１容　、三角フラスコに入れ綿栓をしてオートクレ
ーブで１２１℃１５分間滅菌したのち、１８■試験管の
栄養寒天斜面培地１本に生育させたシュトモナス・プチ
ダＪＴ８−９１１Ｉ株（＃１研菌寄第６１４６号）の１
体全量を接種し、゛３０℃２４時間振盪培養して種１液
を調整し九〇この種ｄＩ液５０〇−を前記の培地６．５
１に接種しく培地のラセミニコチ／濃度ｄ０．７５％と
なる。）３０１１１：通気量毎分０．５Ｊ、攪拌速度３
００　ｒｐｍで２１時間培養した後、培養液中のニコチ
ン濃度が０．３７５％であることをつ。オーターズ社製
ＡＬＣ／ＧＰＣ２２０型液体クロマトグラフィーを用い
て９１［認し培養を終了した。なお発酵槽に紘同社裂の
Ｄ−ｓｏｏｆｉｐＨ電極とＬＭ−ｚＨｃ型ｐＨ制御装置
を付け、培養液のｐｆ（が６．５〜７．５を保つように
必要に応じて２規定苛性ソーダおよび４規定硫酸を滴下
した。

また同社製のＤＸ−５００型溶存酸素電極を付は溶存酸
素濃度をｐＨとともにレコーダーに記録した。この培養
物を９０℃ｌＯ分間加熱した後国産遠心器ＫＫａの遠心
器）１−６００型ローターＱを用いて沈澱物を除去した
後、２規定苛性ソーダを添゛加してｐＨを１１に調整し
、エーテルで抽出を行なった・このエーテル溶液をロー
タリーエバポレーター全量いてエーテルを除去し、淡褐
色の液体的２５ｆ１に得た。この液体を減圧蒸留して９
５〜９７℃１５■Ｈｅの留分として２４．５ｔの無色透
明な液体を得た＠この液体旋光度は〔α〕Ｈ＝＋１６９
°で６＃）ルーニコチンのみであることが確認され、こ
の収率は９３，３チでありた。

実施例２ 第１表の組成の培地＆６５Ｊを実施例１と同様の１０１
容の発酵槽に入れてオートクレーブで１２１℃１５分間
滅菌した後、これにあらかじめり／ゴ酸でｐＨを６．８
に調整し実施例１と同様に濾過１１ＥｆｌたｌＯ嘩ラう
ミニコチ／溶液３５０ｍを無−的に添加した合計６ノの
培地に、前もって実施例１と同様に操作して得たＪＴ８
−９菌株（徴工研１寄第６１４６号）の種菌液ｌＪを接
種しくラセミニコチン濃度ｏ、　ｓ　％　）　、温度３
０℃、通気量毎分４．５ｊ、攪拌速度３００　ｒｐｍで
培養した０培養１８時間経過後に溶存酸素濃度が上りは
じめ、溶存酸素濃度が２０１１に表り九時点で、あらか
じめり／ゴ酸でｐＨ６，８に調整した１０１＆ラセミニ
コチン溶液１７５ｍを加え培養を継続し九〇この操作を
さらに１回縁シ返し培養を継続した。

培養液の溶存酸素Ｉ！ＩＮ＆が１００％に達してから２
時間培養して培養を終了した０この培養物を実施例１と
同様にして加熱、遠心分離、溶媒抽出、溶媒除去および
減圧蒸留を行い無色透明の液体６５、Ｏｆを得た。この
液体の旋光度は〔α〕背＝＋１６９°であシ純粋のＲ−
ニコチンであった。この収率は９２．８％であった。

実施例３ 実施例１と同様の１０１容発酵槽に、溶存酸素測定装置
と連動するアト−に、に製ＳＪ？ユービ／グポンプで無
菌培地を供給する装置を装着し、培養液の溶存酸素濃度
が一度０−になりた後１５−以上の濃度になった時にポ
ンプが作動し、１５哄以下になった時にポンプが停止す
るように設定した・さらにこの発酵槽にレベルセンサー
とこれに連動するポンプによシ発酵槽内の培養液が７ノ
になった時にＩノの培養液を研出するように装置を構成
した。排出された培養液は鈴木精工社製８ＫＪ−３型ミ
ニファーメンタ−に導き、３０℃通気量毎分１１で３時
間培養した後ポンプで全量を排出するように装置を組立
てた。このき二ファーメ／ターから排出された培養物は
あらかじめ塩酸を入れた大型バケツに流入するようにし
た。

次いで、先ず前記の１０１容発酵槽に第１表の組成の培
地５．２ｊを入れオートクレーブで１２１℃１５分間滅
菌した後、あらかじめり／ゴ酸でｐＨ６，８に調整し濾
過滅菌したｌＯ−ラセミニコチ／溶液３００−を加えて
合計＆５Ｊとした。仁の培地に、実施例１と同様にして
得九種菌液５００ｍｇを接種し３０℃通気量毎分３．５
　ｊ　、攪拌速度ａ　ｏ　ｏ　ｒｐｍで培養を開始した
。別に第１表の組成の培地１２．７５Ｊをオートクレー
ブで１２１℃、１５分間滅−したのち、あらかじめり／
ゴ酸でｐｉ−１６，８に調整し濾過滅−した１０−ラセ
ミニコチン溶液２．２５１を加えた合計１５１の１．５
　％ラセミニコチン培地金上記したチ、−ビ／グポンプ
で断続的に発酵槽に供給した。ｉ回の供＃蓋は約１００
−であった。上記装置を作動させ１４０時間培養ｔ−続
けた。最終の５Ｉｌｌ！ｉ培地供給をしてから４時間培
養を続けて培養を終了゛し九〇総培地量は初発の０．５
哄ラセミニコチン培地６１（種菌液を含む・）と１．５
Ｓラセミニコチン培地１４ノであった◎この培養物を塩
酸でｐＨ２に調整した後、実施例１と同様に遠心分離、
溶は抽出、溶媒除去および減圧蒸留を行ない無色透明な
液体１０９ｔを得た。この液体の旋光度は（ａ）υ＝＋
１６９’でｓｂ純粋の几−ニコチ／であった。

この収率は９０．８−であった。

以上詳細に説明したように、本発明によればラセミニコ
テ／からＳ−ニコテ／のみをニコチン濃度１嘩という高
濃度ニコチン耐性分解−によシ分解することができるの
で、従来公知の８−ニコチン分解−のニコチン濃度耐性
が０．２　％程度であった場合に比し、約５倍以上に及
ぶルーニコチンの製造能力向上がはかられる顕著な効果
を有する◎ 出願人　日本専売公社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、　ラセミニコチン含有培隼に、シ、）”４ス・プチ
   ダに属するＳ−ニコチ／を分解しＲ−ニコチンを分解し
   ないニコチン耐性菌を培養して得られる培養物からＲ−
   ニコチ／を抽出採取することを特徴とするＲ−ニコチ／
   の製造法。