DE2608601C3

DE2608601C3 - Mittel zur Abgabe von lebensfähigen Mikroorganismen

Info

Publication number: DE2608601C3
Application number: DE2608601A
Authority: DE
Inventors: Devendra Vaikunthlal South Bend Ind. Mehta (V.St.A.)
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1975-03-03
Filing date: 1976-03-02
Publication date: 1978-06-22
Also published as: DE2608601B2; AR212704A1; DE2608601A1; AU1087176A; BR7601262A; JPS51110090A; GB1526317A; FR2303080B1; IT1053872B; ZA76744B; FR2303080A1

Description

Die Erfindung betrifft Mittel zur Abgabe von lebensfähigen Mikroorganismen bei Berührung mit Wasser. Sie findet daher besonders Anwendung für Verfahren, die mit der Qualitätskontrolle von mikrobiologischen Nährmedien, Reagentien und Verfahren zusammenhängen.

Bei Routinearbeiten in einem mikrobiologischen Labor besteht Bedarf an stabilen standardisierten bequemen Mitteln zur Konservierung von mikrobiologischen Stammkulturen ,n lebensfähigem Zustand. Eine Quelle für übereinstimmende und reproduzierbare mikrobiologische Stämme ist nicht nur für biologische Forschungen und Unterschuchungen notwendig, sondern auch zur Standardisierung und Qualitätskontrolle von mikrobiologischen Nährmedien, Reagentien und Verfahren.

Die Genauigkeit des Nachweises und der Identifizierung von Mikroorganismen hängt ab von reproduzierbaren Medien, Reagentien und Verfahren. Das einzige wirkliche Mittel zur Bestimmung und dadurch Regelung einer derartigen Reprodu/ierbarkeit besteht darin, daß

man die entsprechenden Medien und Reagentien auf bekannte mikrobiologische Vergleichskulturen aufbringt bzw. das Verfahren darauf anwendet- Günstigerweise sollten derartige Vergleichskulturen über längere Zeiten in quantitativ reproduzierbar suspendierter Form lagerfähig sein ohne ihre Lebensfähigkeit einzubüßen oder die mikrobiologischen Eigenschaften der Mikroorganismen zu verändern.

Bei den klassischen Verfahren wurden mikrobiologische Stammkulturen konserviert, indem man den Mikroorganismus in aktiver, sich fortpflanzender Form auf Nähragarschrägen oder Platten hielt und in periodischen Zeitabständen auf weitere Schrägen oder Platten übertrug. Folglich enthielt eine Probe einer Stammkultur, die einige Monate später erhalten wurde, Nachkommen der ursprünglichen mikrobiologischen Organismen und nicht mehr die ursprünglichen Mikroorganismen selbst. So konnte es vorkommen, daß sich über eine gewisse Zeit die Stammkultur von einer reinen Kultur in eine heterogene Kultur umgewandelt hatte aufgrund möglicherweise aufgetretener Mutationen oder Verunreinigungen.

Der Versuch, reine lagerfähige mikrobiologische Kulturen zu erhalten, führte zu dem Verfahren des Gefrierens oder Gefriertrocknens von mikrobiologischen Kulturen. Wie von D. F. D. H ο c k e η h u 11 in Progress in Industrial Microbiology (Heywood & Co., London, 1963) S. 191-214, angegeben, kann die Lagerfähigkeit erreicht werden, indem man die Mikroorganismen in einen »scheintoten« Zustand überführt, in dem die Mikroorganismen lebensfähig sind, aber mit einem extrem niedrigen Stoffwechsel und nicht imstande sind, sich zu vermehren. Ein solcher Scheintod-Zustand kann erreicht werden, indem man entweder die Temperatur, das verfügbare Wasser und/oder den verfügbaren Sauerstoff vermindert, wobei das letzte natürlich nicht auf anaerobe Mikroorganismen anwendbar ist. Während diese Aufgaben allgemein durch Gefrieren oder Gefriertrocknen erreicht werden, sind die erforderliche Zeit und Mühe und die Kosten der Ausrüstung unerwünscht hoch und für die durchschnittlichen mikrobiologischen Labors sind derartige Verfahren im allgemeinen nicht anwendbar. Auch reagieren spezielle Mikroorganismen unterschiedlich auf das Gefrieren und Gefriertrocken, wodurch spezielle Arbeitsweisen für spezielle Gruppen von Mikroorganismen erforderlich sind.

Eine weitere Verbesserung des Gefriertrocknens besteht in der Anwendung des Agarersatzmediums nach der US-PS 33 60 440. Bei der Herstellung einer stabilisierten Stammkultur nach diesem Verfahren werden die Mikroorganismen vordem Lyophilisieren in einem wäßrigen Gemisch suspendiert, bestehend aus mikrobiologischen Nährstoffen und einer Menge eines wasserlöslichen modifizierten Cellulosemaierials, die nicht ausreicht, um aus dem Gemisch eine hochviskose gelatinöse Matrix zu bilden. Dieses Gel wird dann 60 bis 80 h gefriergetrocknet und mechanisch /u einem Pulver zerstoßen. Dieses Verfahren ist insofern ungünstig, da Vorrichtungen zum Lyophilisieren und Zerstoßen bzw. Vermählen erforderlich sind und die Bildung und Handhabung eines mikrobiologischen Gels. Da das Produkt in Form eines Gels vorliegt, treten verschiedene Schwierigkeiten auf bei der Herstellung einer homogenen quantitativen Verteilung der !Mikroorganismen in dem Endprodukt, und häufig ko;nmt es zu einem unerwünschten Einschluß von Luft in der mikrobiologischen Gelmatrix.

Vor einiger Zeit wurde in der US-PS 36 71 400 ein Verfahren beschrieben, bei dem trockene bakteriologisehe Vergleichsproben hergestellt werden, indem ein Tropfen einer Suspension von Bakterien, Nährstoffgelatine und Stabilisatoren, der auf einer wachsartigen Oberfläche verteilt ist, 72 h bei einer Temperatur von 20 bis 25° C unter einem Druck von 500 bis 600 mm Hg getrocknet wird. Bei der Anwendung wird die trockene Probe in Salzlösung suspendiert und nach 2 bis 3 h langem Inkubieren bei 35 bis 37°C ein Anteil der Lösung auf eine Nährstoffagarplatte aufgestrichen. Dieses Verfahren besitzt den Nachteil, daß es langwierig ist und spezielle Ausrüstungen erfordert

In den US-PS 37 67 797 und 38 60 490 ist der Einschluß von speziellen Mikroorganismen in ein hydrophiles Acrylat oder Methacrylat beschrieben unter Bildung einer löslichen mikrobiologischen Kapsel. Derartig eingeschlossene Mikroorganismen verlieres. jedoch ihre Lebensfähigkeit schnell innerhalb kurzer Zeit, manchmal schon innerhalb weniger Tage. Daher sind diese Kapseln zur längeren Lagerung von mikrobiologischen Stammkulturen kaum geeignet.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein bequemes Verfahren zur Herstellung einer trockenen stabilen Form von Mikroorganismen in lebensfähigem Zustand zu entwickeln, bei dem keine langwierigen Verfahren oder spezielle Ausrüstungen erforderlich sind. Außerdem soll die erhaltene trockene mikrobiologische, d. h. Mikroben liefernde Matrix bequemer in der Handhabung und Anwendung für mikrobiologische Zwecke sein als die bekannten Mittel.

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Abgabe von lebensfähigen Mikroorganismen bei Berührung mit Wasser, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es aus einer zusammenhängenden wasserlöslichen polymeren Matrix aus Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, einem wasserlösüchen substituierten Polyvinylpyrrolidon oder einem wasserlöslichen Celluloseether, Carboxymethylcellulose, Hydroxyäthylcellulose und/oder Hydroxypropylcellulose besteht, in der ein mikrobiologisches Gemisch, bestehend zumindest aus einem Mikroorganismus und einem mikrobiologischen Nährstoff, homogen dispergiert ist.

Das erfindungsgemäße Mittel wird gemäß den Maßnahmen des Patentanspruchs 5 hergestellt. Die genannte wasserlösliche polymere Substanz sollte selbstverständlich in einer solchen Menge vorhanden sein, die nicht ausreicht, das wäßrige Gemisch in eine gelatinöse Masse überzuführen. Die Menge an mikrobiologischem Nährmedium sollte selbstverständlich ausreichen, um die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen zu erhalten; außerdem hat es sich gezeigt, daß sie selbstverständlich nicht so groß sein darf, daß sie während des Trocknens des wäßrigen Gemisches zu einem gefährlichen osmotischen Schock für die Mikroorganismen führt.

Die Patentansprüche 2-4 und 6-7 nennen Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Mittels bzw. des Verfahrens zur Herstellung dieses Mittels.

Beim Trocknen des wäßrigen Gemisches entsteht ein Mittel üblicherweise in Form eines Films bzw. einer Folie, das trocken zusammenhängend und wasserlöslich ist und die Bestandteile des wäßrigen Gemisches homogen dispergiert enthält. Weitere Bestandteile wie verträgliche Weichmacher und selbstverständlich auch Mittel zum Ausgleich des osmotischen Druckes können dem Mittel zugesetzt werden, indem man sie vor dem endgültigen Trocknen /u dem wäßrigen Gemisch zusetzt.

Um die Handhabung des wasserlöslichen mikrobiologischen Mittels zu erleichtern, besonders wenn es angewandt wird, um direkt die Oberfläche eines s Näbrstoffgels zu beimpfen, kann das Mittel in einen Träger wie die Schleife bzw. Öse einer mikrobiologisehen Impfnadel eingebaut werden. Bei der Anwendung kann die flache Oberfläche der das mikrobiologische Mittel enthaltenden Schleife mit der feuchten Oberflä-

_[o ehe des Nährstoff gels kurze Zeit zusammengebracht werden, um zu ermöglichen, daß sich die wasserlösliche Substanz zu lösen beginnt. Dann, wenn die wasserlösliehe Substanz vollständig in Lösung geht, können die freigesetzten Mikroorganismen durch entsprechende Bewegung der Impfnadel wie bei einem üblichen Aufstreichverfahren über die Geloberfläche verteilt werden.

Die Erfindung stellt ein billiges Mittel zur Konservierung von Mikroorganismen dar. Die in ihm enthaltenen

:o Mikroorganismen sind unter Beibehaltung ihrer Lebensfähigkeit sehr lange lagerfähig. Die Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels erfordert keine spezielle Ausrüstung, da das wäßrige Gemisch meistens in irgendeinem zur Verfügung stehenden Gefäß hergestellt werden kann und die Trocknung durchgeführt werden kann, indem man das Gemisch unter Standardraumbedingungen stehenläßt.

Üblicherweise besitzt die polymere Substanz ein Molekulargewicht von ungefähr 20 000 bis 1 000 000,

^₀ am besten 100 000 bis 400 000. Die polymere Substanz kann ein oder mehrere Polymere umfassen, mit den gleichen oder unterschiedlichen Molekulargewichten, Substitutionsgraden, molekularen Substitutionen, Intrinsic-Viskositäten usw. Nichtionische wasserlösliche PoIy-

.is mere sind aufgrund ihrer Verträglichkeit mit Mikroorganismen besonders gut. Gut ist Carboxymethylcellulose mit einem Substitutionsgrad von ungefähr 0,4 bis 1,4 und am besten ungefähr 0,65 bis 0,85 und Hydroxyäthyl- und Hydroxypropylcellulose mit einer molaren Substitution von weniger als ungefähr 3,2 und am besten ungefähr 1,0 bis 3,0. Besonders geeignet ist Polyvinylalkohol mit einem Hydrolysegrad von weniger als ungefähr 90%, am besten ungefähr 70 bis 90%.

Es ist jedoch selbstverständlich, daß das wasserlösliehe Gemisch, das unter Bildung des erfindungsgemäßen Mittels getrocknet werden soll, eine solche Menge an der genannten wasserlöslichen polymeren Substanz enthält, die nicht ausreicht, um zur Bildung eines Gels oder einer gelatinösen Matrix zu führen. Das ist klar, um beim Trocknen ein gleichmäßiges zusammenhängendes Mittel zu ergeben und nicht eine ungleichmäßige spöde pulverförmige Substanz, die nicht die Vorteile bei der Handhabung ergibt, wie sie eine zusammenhängende Matrix oder ein Film besitzt. Im allgemeinen enthält das wäßrige Gemisch weniger als 20% und am besten weniger als 5% der wasserlöslichen polymeren Substanz (Gewicht/Volumen). Einige wasserlösliche PoIymere können in größeren Mengen als 5% zugesetzt werden, ohne daß sie dazu führen, daß das wäßrige

(,o Gemisch ein Gel bildet, da sie ein niedriges Molekulargewicht und/oder eine hohe Hydrophilie besitzen. Zum Beispiel kann der Polyvinylalkohol in einer Konzentration bis zu 20% oder darüber (Gewicht/Volumen) in dem wäßrigen Gemisch vorliegen, ohne zur Bildung

hs einer unerwünschten gelartigen Form /u führen. Die Viskosität ist direkt eine Funktion des Molekulargewichts und daher führen die hochmolekularen Formen eines speziellen wasserlöslichen Polymers zu einer

hochviskosen gelatinösen Phase bei geringe ren Konzentrationen als die niedermolekularen Formen des gleichen Polymers. Ähnlich nimmt mit zunehmender Anzahl hydrophiler Gruppen in dem wasserlöslichen Polymer die Polymermenge zu, die erforderlich ist, um eine gelatinöse Phase zu bilden. Die Ausdrücke »Gel« und »gelatinös«, wie sie hier verwendet werden, bezeichnen eine hochviskose gelartige Phase, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie keine unterscheidbare flüssige Phase besitzt

Mikroorganismen, die in das erfindun_;j!sgemäße Mittel eingebaut werden können, umfassen «:ine weile Vielfalt von makroskopischen und mikroskopischen Lebewesen wie Algen, Pilze einschließlich Hefen, Protozoen, Bakterien und Viren. Beispiele für Algen, die in das erfindungsgemäße mikrobiologische Mittel eingebaut werden können, sind solche di:r Arten Aphanacapsa-Gleocapsa, Euglene, Nostac, Plectonema, Selenastrum usw. Zu den Pilzen, die in das erfindungsgemäße Mittel eingebaut werden können, ge'iören die folgenden Arten: Aspergilus, Blastomyces, Candida, Cossidionides, Cryptococcus, Peniciliium uiw. Auch Protozonen wie Trichonomaden können in das Mittel eingebaut werden.

Auch eine große Vielzahl von Bakterien kann in das erfindungsgemäße Mittel eingebaut werden, v/ie solche, die zu den Gruppen Pseudomonadales, Cliiamydobacteriales, Hyphomicrobiales, Eubacteriales, Act riomycetales gehören. Das erfindungsgemäße Mittel ist besonders geeignet zur Konservierung, Lagerung und Anwendung von Bakterien, die zu folgenden Familien gehören: Azotobacteraceae, Rhizobiaceae, Achromobacteraceae, Brucellaceae, Enterobacteriaceae, Bacteriodaceae, Micrococcaceae, Neisseriaceae, Pseudomonadaeeae, Lactobacillaceae, Nocardiaceae und StreptomyceUceae.

Außerdem können verschiedene Viren in das mikrobiologische Mittel eingebaut werden, i. B. RNS-Viren wie Enterovirus, Paramyxovirus und Myxovirus; DNS-Viren wie Polyomavirus, Adenovirus, Hcrpesvirus und Poxvirus; einige andere klinisch wichtige Viren wie Hepatitisvirus oder Australienantigen und Rubellavirus; verschiedene Bakterioviren, besonders Bakteriophagen usw.

Es ist festzustellen, daß besonders empfindliche Mikroorganismen einen schnelleren Verlust an Lebensfähigkeit zeigen als die Mehrzahl der üblichen Mikroorganismen. Die Mengen oder Konzentrationen an wasserlöslichem Polymer, Nährmedium und selbstverständlich gegebenenfalls dem Mittel zum Ausgleich des osmotischen Druckes können innerh-ilb eines weiten Bereichs eingestellt werden, um den !,peziellen Erfordernissen der einzelnen Mikroorganismen entgegenzukommen. Die speziellen in das erfinduni;;sgemäße Mittel eingebauten Mikroorganismen hängen von der beabsichtigten Anwendung des Mittels ab. Zum Beispiel werden für klinische Anwendungen Escher chia coli. Staphylococcus aureus, Entcrobacter cloacae, Klebsieila pneumoniae, Streptococcus pyrogenes, Salmonella typhimurium, Proteus vulgaris, Serratia niarcesens, Pseudomonas aeruginasa, Bacillus stereothermophilus. Bacillus subtilis etc. eingebaut.

Auch ein einzelner Mikroorgamismenstamin kann in das erfindungsgemäße Mittel eingebaut wc-den. um eine lagerfähige homogene Kultur eine¹, reinen Stammes zu erhallen. Hei bestimmten Anwendungsgebieten, besonders bei Verfahren der (Qualitätskontrolle, kann es günstig sein, zwei oder mein ere untc r->chicdlichc biologisch verträgliche Arien von Mikmorganis-

■)"

men einzubauen, wenn das Mittel eine Probe wie Urin oder Auswurf simulieren soll.

Das in das erfindungsgemäße Mittel eingebaute Nährmedium kann eine oder mehrere chemische Substanzen umfassen, die diiekt oder indirekt den Stoffwechsel des in dem Mittel enthaltenen Mikroorganismus beeinflussen. Zum Beispiel umfassen Nährmedien, die angewandt werden können, solche Substanzen, die für die Lebensfähigkeit oder das Wachstum der Mikroorganismen erforderlich sind, sowie Substanzen, die das mikrobiologische Wachstum hemmen, die günstig sind, um eine Kontamination während der Herstellung und Anwendung des mikrobiologischen Miuels zu verzögern. Daher gehören zu der Gruppe der Substanzen, die in das mikrobiologische Mittel als Hahrsubstanzen eingebaut werden können, Proteine. Polypeptide wie Pepton, Aminosäuren, Nucleinsäuren, Polynucleotide, Kohlenhydrate einschließlich Mono- und Disaccharide wie Glucose und Saccharose und Polysaccharide, Wachstumsfaktoren wie Vitamine und Hormone und anorganische Elemente und Ionen.

Während der Trockung des wäßrigen Gemisches, enthaltend die einzubauenden Mikroorganismen, das Nährmedium und die genannte wasserlösliche polymere Substanz, wird angenommen, daß der auf die Mikroorganismuszellen ausgeübte osmotische Druck sich verändert. Das Vorliegen einer großen Menge ionisierbarer Substanzen in dem wäßrigen Gemisch führt offensichtlich zu einer Zunahme des osmotischen Druckes auf die mikrobiologischen Zellen während des Trockungsverfahrens, wodurch die Gefahr eines implosiven Zusammenfallens der Zellwände zunimmt. Wenn andererseits jedoch nur eine kleine Menge an ionisierbaren Substanzen in dem wäßrigen Gemisch vorhanden ist, führt es offensichtlich zu einem Abfallen des exogenen osmotischen Druckes während des Trocknungsverfahrens und dadurch wird die Gefahr eines explosiven Zerreißens der Zellwände vergrößert. Wie aus den folgenden Beispielen hervorgeht, ist es möglich, ein Nährmedium zu wählen, daß die gewünschte Menge an ionisierbaren Substanzen enthält, so daß das Nährmedium in einer ausreichenden Menge zu dem wäßrigen Gemisch zugesetzt werden kann, um die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen aufrechtzuerhalten, während die Menge so gering ist, daß sie die Mikroorganismuszellen nicht gefährlich beeinflußt.

Aufgrund der Hydrophilie der meisten üblichen mikrobiologischen Nährmedien wird der Gehalt an Nährmedium in dem wäßrigen Gemisch im allgemeinen auf einem erforderlichen Minimum gehalten, um die Trocknung zu verbessern während die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen aufrechterhalten wird. Im üblichen Falle ist daher nur eine kleine Menge an ionisierbaren Nährstoffen während des Trocknens vorhanden, was offensichtlich zu einem Abfall des exogenen osmotischen Druckes führt, der für die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen unsicher ist. In einem solchen Falle ist es selbstverständlich besonders günstig, dem wäßrigen Gemisch ein den osmotischen Druck ausgleichendes Mittel zuzusetzen, das im Stande ist, den osmotischen Druck während des Trocknens auf einer günstigen Höhe zu halten. Ein derartiges den osmotischen Druck ausgleichendes Mittel ist üblicher v.eise ein wasserlösliches chemisches Reagens, das im Stande ist. bei Berührung mil einer wäl.trigen l'Kissigkeii zu ionisieren. Geeignete den osmotischen Druck ausgleichende Mittel umfassscn anorganische Salze und Kohlenhulrüte wie Glucose. Lactose. Maltose. Mannn

und Saccharose.

In vorteilhafter Weise enthält das erfindungsgemäßc Mittel Weichmacher wie Polyole. Glykole, wie Äthylenglykol und Polyäthylenglykol und Glycerin, die die Flexibilität und Abschälbarkeit des Mittels erleichtern, wenn es in der Form einer Folie hergestellt wird. Selbstverständlich kann es günstig sein, inerte Füllstoffe zur Erzielung einer größeren Masse oder verträgliche Hintergrundfarbstoffe zur Farbcodierung oder aus anderen ästhetischen Gründen zuzusetzen. Indikatoren für das mikrobiologische Wachstum können selbstverständlich ebenfalls zugesetzt werden und können besonders geeignet sein für Vei fahren der Qualitätskontrolle. Beispiele für geeignete Indikatoren für das mikrobiologische Wachstum sind Chromogene, die auf das Vorhandensein mikrobiologischer Zellen ansprechen, z. B. pH-Indikatoren, die auf den Fermentationsstoffwechsel ansprechen oder Tetrazoliumsalze, die auf die chemische Zusammensetzung der mikrobiologischen Zellen selbst ansprechen.

Bei der Herstellung des wasserlöslichen mikrobiologischen Mittels wird zunächst ein wäßriges Gemisch hergestellt, umfassend die Mikroorganismen, Nährstoffe, das genannte wasserlösliche Polymer und die gegebenenfalls sonst noch vorhandenen Substanzen, die in das mikrobiologische Mittel eingebaut werden sollen. Außer dem Mikroorganismus oder den Mikroorganismen, die in dem entstehenden trockenen Mittel enthalten sein sollen, werden alle Bestandteile des wäßrigen Gemisches unter aseptischen Bedingungen zusammengegeben. Das wäßrige Gemisch wird vor dem Trocknen gut vermischt, um eine homogene Dispersion aller Bestandteile zu erreichen.

Der Anteil der in dem wäßrigen Gemisch vorhandenen Bestandteile kann in einem weiteren Bereich variieren, wobei die folgenden Bereiche, die angegeben sind als Gewicht/Volumen des wäßrigen Gemisches, jeweils zulässig bzw. günstig sind.

Bestandteile	Zulässiger	Ciünsli{!ei
	Bereich	Hereieh
Genanntes wasserlösliches	0.1- >20	3.0-5.0
Polymer
Nährmedium	0.1-10.0	2.0-5.0
Mitlcl /um Ausgleich des	0.0-10.0	2.0-5.0
osmolischcn Druckes
Weichmacher	0.0-2.0	0.1 -0.5

Das Trocknen des wäßrigen Gemisches kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden. Sehr einfach kann das wäßrige Gemisch auf eine nicht benetzbare, im allgemeinen flache. Oberfläche aufgegossen oder auf andere Weise darauf verteilt werden unter Bildung einer dünnen Schicht der Flüssigkeit, die nach Entfernung des Wassers eine Folie ergibt. Eine geringe Feuchtigkeit oder leicht erhöhte Temperaturen können angewandt werden, um die Trocknung zu beschleunigen. Hitze kann jedoch einen nachteiligen Effekt auf die Mikroorganismen ausüben. Das wäßrige Gemisch wird im allgemeinen getrocknet, bis der Glcichgcwichtsfeuchtigkcitsgehalt bei Raumbedingungen erreicht ist. Bei Standard-Raumtemperatur und -feuchtigkeit kann dieser Trocknungsgrad innerhalb von 5 min bis 2 h je nach der Dicke des F'ilms erreicht werden. Im allgemeinen muß eine geringe minimale Feuchtigkeitsmenge in dem mikrobiologischen Mittel noch vorhanden sein, um die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen aufrechtzuerhalten. Der oben angegebene Glcichgcwichtsfeuchtigkeiisgehalt kann von Mittel /u Mittel /wischen ungefähr 2 und 1 5% schwanken.

Bei der Anwendung können derartige Folien als

-■ ganzes Stück verwendet werden oder sie können in eine Vielzahl von Teilen, vorzugsweise in Form von Scheiben, geteilt oder zerschnitten werden. Fs hai sich im allgemeinen gezeigt, daß die eingebauten Mikroorganismen quantitativ in einem getrockneten Film mit

i<> konstanter Dicke in einzelnen Teilen des Oberflächenbereiches verteilt sind. Die in der mikrobiologischen Folie eingeschlossenen Mikroorganismen können freigesetzt werden, indem man die Folie mit einem wäßrigen Medium wie Salzlösung, einer wäßrigen

is Nährstoffbrühe oder der feuchten Oberfläche eines Nährstoffgels oder einer Nährstoffschräge zusammenbringt.

Das erfindungsgemäße Mittel kann selbstverständlich auch mit einem Träger zusammengebracht werden,

;<· indem man ein bereits getrocknetes mikrobiologisches Mittel durch geeignete Befestigungs- oder Klebevorrichtungen mit dem Träger verbindet.

Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels ermöglicht somit eine Anzahl Formen von

2s Mittel und Träger.

Es ist z. B. möglich, das erfindungsgemäße Mittel in Filmform mit verschiedenen mehrschichtigen Mitteln zusammenzubringen, umfassend eine oder mehrere Folien und eine oder mehrere Schichten, enthaltend

in Nährstoffe oder andere mikrobiologische Reagentien in einer Matrix, umfassend polymere Substanzen, Kolloide, Gele, absorbierende flächige Materialien oder eine Kombination davon.

Die Erfindung wird durch die folgenden nachgereich-

ϊ< ten Beispie'e näher erläutert.

Beispiel 1

Nach diesem Beispiel wurden erfindungsgemäße Mittel, enthaltend einen gramnegativen Mikroorganis-JO mus, hergestellt und angewandt.

Zu !0OmI Wasser wurden 4,0g 80- bis 90%iger hydrolisierter Polyvinylalkohol mit einem Molekulargewicht von ungefähr 250 000, 0,1 g Hirn-Hcrz-Infusionsmedium und 2,0 g Saccharose gegeben. Die entstehende ^s Lösung wurde in einem Dampfsterilisator 15 min bei 125°C sterilisiert.

Zu 50 ml der sterilisierten Lösung wurde 1.0 ml einer dreifach gewaschenen Suspension des granincgativen Organismus Escherichia coli in steriler Salzlösung in so einer Konzentration von ungefähr 10⁷ Zellen/ml gegeben. Die restlichen 50 ml der sterilisierten Lösung wurden als Vergleichslösung zurückbehalten.

Das Mikroorganismusgemisch und die Vergleichstsung wurden aseptisch auf getrennte Plastikfolien in ss einer Dicke von 1,27 mm (50 mil) mit Hilfe eines Spachtels aufgebracht. Das aufgegossene Gemisch und die aufgegossene Vergleichslösung wurden über Nacht unter Standard-Raumbedingungen unter einer sterilen Haube getrocknet.

(... Drei ungefähr 3.226 cm² große Stücke von den beiden Folien wurden von den Plastikfolien abgezogen. Fin Teil der Vergleichsfolie und ein Teil der erfindungsgemdßcn Folie wurden aseptisch auf getrennte Fosin-Melhylenblau-Agar-PIatten aufgelegt. Außerdem wurde je ein ·■> Teil der erfindungsgemäßen Folie und der Vcrglciehsfolic aseptisch auf getrennte Blutagar-Plattcn aufgebracht und eine dritte Probe der Vergleichsfolic und der erfindungsgemäßen Folie zunächst getrennt in 5 ml

26 08

ίο

Volumina einer 3,7%igen Hirn-Herz-lntusionsbrühe gelöst und zwei gleiche Anteile der entstehenden Lösungen auf Agarplatten aufgestriehen, und /war die ,ersten Anteile jeder Lösung auf getrennte Eosin-Methylenblau-Agar-Platten und die /.weiten Anteile jeder Lösung aufgetrennte Blutagar-Platten. Die 8 beimpften Agarplatten wurden ungefähr 18 h bei 37"C und 70"/» relativer Feuehtigkeit inkubiert.

Mikrobenwachstum wurde auf allen Platten beobachtet, die direkt oder indirekt mit den erfindungsgemäßen Folien beimpft worden waren, während kein Wachstum auf den Vergleichsplatien auftrat. Isolierte Kolonien, die die für Escherichia coli typische Morphologie, Farbe und Form besaßen, wurden auf den durch Aufstreichen der Brühe, in der die erfindungsgemäße Folie gelöst war, erhaltener. Platten beobachtet. Typisches Rasenwach.stum wurde auf den Platten beobachtet, die direkt mit den erfindungsgemaßen Folien in Berührung gebracht worden waren.

Der Teil der erfindungsgemaßen Folie, der nicht von der Plastikfolie abgenommen worden war, wurde in einem getrockneten Glas bei Raumtemperatur 5 Tage aufbewahrt. Die so gelagerten Folien wurden dann auf lebensfähige Mikroorganismen wie oben untersucht. Man erhielt im wesentlichen die gleichen Ergebnisse.

Beispiel 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei 8,0 g Polyvinylalkohol anstelle von 4 g zur Herstellung der Ausgangslösung verwendet wurden. Positives und typisches Mikrobenwachstum wurde in allen Fällen fü: das erfindungsgemäße Mittel beobachtet. Die Ergebnisse waren im wesentlichen die gleichen wie in Beispiel 1.

Beispiel 3

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei der grampositive Mikroorganismus Styphylococcus aureus anstelle des gramnegativen Escherichia coli verwendet wurc'e. Positives und typisches Mikrobenwachstum für Staphylococcus aureus wurde auf allen Platten beobachtet, die direkt oder indirekt mit dem erfindangsgemäßen Mittel beimpft worden waren, während kein Wachstum auf den Vergleichsplatten auftrat.

Beispiel 4

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei 2,0 g Hydroxypropylcellulose mit einem Moleku- _so Escherichia coli largewicht von ungefähr 275 000 anstelle von 4 g Polyvinylalkohol zur Herstellung der wäßrigen Lösung verwendet wurden. Die Ergebnisse waren im wesentlichen die gleichen wie in Beispiel 1.

Beispiel 5

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei 2,0 g Carboxymethylcellulose mit einem Molekulargewicht von ungefähr 250 000 anstelle von 4 g Polyvinylalkohol zur Herstellung der wäßrigen Lösung verwendet wurden. Die Ergebnisse waren im wesentlichen die gleichen wie in Beispiel 1.

Beispiel 6

Dieses Beispiel zeigt die Beziehung zwischen dem Gehalt an Nährmedium der erfindungsgemäßen Mittel und der Lebensfähigkeit der eingebauten Mikroorganismen über eine Zeitspanne.

Verschiedene Mikroorganismen enthaltende erfindungsgemäße Folien wurden in Impfschleifen eingebaut, wobei die folgenden Mengen an Bestandteilen, angegeben als Gewichts-%, in der wäßrigen Lösung verwendet wurden.

F.scherichia coli

Polyvinylalkohol 5.0"/«

Weichmacher (PolyoxyaIkylenderivat

von Propylenglykol) 0,25%

Nährmedium (Pepton) 1.2-10,0%

Mittel /.um Ausgleich des usmolischen

Druckes (Saccharose) 3.0%

Lnterobacter cloacae

Polyvinylalkohol 1,0%

Weichmacher (Polyoxyal kylenderi vat

von Propylenglykol) 0,25%

Nährmedium (Pepton) 2.0-5.0%

Mittel zum Ausgleich des osmolischen

Druckes (."idtcharose) 5,0%

Salmonella typliimiirium

Polyvinylalkohol 3,0%

Weichmacher (Polyoxyal kylenderi vat

von Propylenglykol) 0.25%

Nährmedium (Pepton) 2,0-5,0%

Mittel zum Ausgleich des osmolischen

Druckes (Saccharose) 3.0%

Die Anzahl der ursprünglich in die Folien eingebauten lebensfähigen Organismen wurde dreifach für jede Reihe von Mikroorganismen bestimmt durch Lösen einer bestimmten erfindungsgemaßen Folie in Salzlösung. Dann wurde eine Reihenverdünnung hergestellt, wobei die letzt j Verdünnung auf Platten ausgestrichen und die ein..einen Kolonien gezählt wurden, die beim Inkubieren entstanden waren. Die Gesamtzahl der Mikroorganismen in der Folie wurde dann aus der Auszählung und dem Verdünnungsfaktor berechnet.

Die erfindungsgemäßen Folien wurden in feuchtigkeilsdicluen Behältein bei ungefähr 50"C gelagert. Die Anzahl der lebensfähigen Organismen, die in den gelagerten Folien noch vorhanden waren, wurde in bestimmten Zeitabständen auf die oben beschriebene Weise dreifach bestimmt. Die Ergebnisse für jeden von drei Mikroorganismen sind im folgenden als Prozent noch lebensfähige Mikroorganismen angegeben.

Lagerung	Nährmediuni	Nährmedium	3.0%	5,0%	l0,0^u/(i
(h)	1.2%	2,0%	100	100	100
0	100	100	61,0	6.2	5.9
5	6,9	29.9	7,8	2,2	λ5
8	1,2	6,4	0,25*)	0,032	0,0 lö
30.5	0.002	5.5
Enterobacter cloacae
Lagerung	3.0%	4.0%	5.0%
(h)	100	100	100
0	36,0	240	19.2
5,5	14.0	21.0	18.0
24	5.6	13.0*)	13.1
30

26 08

Salmonell	a lyphinniriiim	i.0%	4.0%	■■"i.O'l'n
I ageriing	Nahrmedium	100	100	100
(h)	2.0%	12,8	9,1	—
0	100	4.6	6.8	Ji.7
14,5	7.J	6,2	5.5	25.6*
41	6.6
65.5	2.4

*) ΛΚ optimale Mv'iif.'c an N;ihi medium an/uselicn

Andere erfindungsgemäße Folien, enthaltend verschiedene andere Mikroorganismen, wurden auf die gleiche Weise untersucht, wobei die überwiegende Mehrzahl von ihnen zu ähnlichen Ergebnissen führte, wie sie oben für Escherichia coli und Enterobacter

cloacae angegeben sind. Es ist zu bemerken, daß, da die Gesamtzahl der ursprünglich in die erfindungsgemäße Folie nach dem Verfahren des Beispiels 2 eingebauten Mikroorganismen ungefähr 10^b Zellen/ml betrug, ein "/»-Satz von 1% überlebender Mikroorganismen 10⁴ lebensfähige Zellen/ml bedeutet.

Beispiel 7

Dieses Beispiel zeigt die hohe Stabilität von erfindungsgemäß hergestellten Mitteln für verschiedene Mikroorganismen, die über 1 Jahr bei 4°C und 25"C gelagert worden waren.

Verschiedene Mikroorganismen wurden erfindungsgemäß in Folien eingebaut, die man in Impfschleifen anordnete, wobei die folgenden Mengen jeweils als Gew.-%, bezogen auf die wäßrige Lösung, verwendet wurden.

Mikroorganismus	Polyvinylalkohol	Weichmacher	Pepton-	Saccharose
		(wie vorstehend)	Nährmedium
Escherichia coli	5,0	0,25	3,0	3,0
Staphylococcus aureus	5.0	0,25	2,0	2,0
Enterobacter cloacae	3,0	0,25	4,0	3,0
Klebsieila pneumoniae	5,0	0,25	3,0	4,0
Streptococcus pyogenes	3,0	0,25	3,0	5,0
Salmonella typhimurium	3.0	0.25	5,0	3,0
Prottus vulgaris	5,0	0,25	2,0	2,0

Die optimale Menge an Nährmedium, in diesem Falle Pepton, wurde für jede Zubereitung entsprechend Beispiel 3 bestimmt. Die Gesamtzahl der in jede Reihe von Folien eingebauten Mikroorganismen wurde entsprechend Beispiel 6 bestimmt. Die erhaltenen jrfindungsgemäßen Folien wurden in zwei Teilen bei 4 C bzw. 25"C gelagert und die Anzahl der lebensfähigen Mikroorganismen entsprechend Beispiel 6 periodisch bestimmt. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Mikroorganismus	Anfangs/ahl	Lagcrdauer	Anzahl der noch	lebenden
			Mikroorganismen
		(Tage)	4" C	25" C
Escherichia coli	1,7 · 10"	366	7,5 · 10"	8,6 · 10'
Staphylococcus aureus	9,3 · 10'	427	1,4 · \0^r-	-
Staphylococcus aureus	9,3 · 105	125	—	1,3 ■ 101
Enterobacter cloacae	1,5 ■ 10"	483	8,0 · 1Oi	3.0 · 1Oi
Klebsiella pneumoniae	5.3 · 10"	457	2,2 ■ 105	8,0 · 1Oi
Streptococcus pyogenes	1.0 · 10"	399	2,8 · 105	—
Streptococcus pyogenes	1,0 · 10"	214	—	9.8 · 10-'
Salmonella typhimurium	5.3 · 10"	378	7,6 ■ 10⁴	2.3 · 1Oi
Proteus vulgaris	1,0 - 10"	357	4,8 ■ ΙΟ⁴	3.3 · 10"

Aus diesen Werten geht hervor, daß die erfindungsgemäß hergestellten Mitte! die ursprünglich 10^b lebensfähige Mikroorganismen enthielten, wenn sie über 1 |ahr bei Raumtemperatur gelagert worden waren, noch imstande waren mehr als 10^J lebensfähige Mikroorganismen freizusetzen und bis zu 10⁵ lebensfähige Mikroorganismen, wenn sie über 1 |ahr bei 4°C gelagert worden waren.

Claims

Patentansprüche:

1. Mittel zur Abgabe von lebensfähigen Mikroorganismen bei Berührung mit Wasser, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer zusammenhängenden wasserlöslichen polymeren Matrix aus Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, einem wasserlöslichen substituierte;) Polyvinylpyrrolidon oder einem wasserlöslichen Celluloseäther, Carboxymethylcellulose, Hydroxyäthylcellulose und/oder Hydroxypropylcellulose besteht, in der ein mikrobiologisches Gemisch, bestehend zumindest aus einem Mikroorganismus und einem mikrobiologischen Nährstoff, homogen dispergiert ist.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das mikrobiologische Gemisch zusätzlich einen Weichmacher enthält.

3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form einer Folie vorliegt.

4. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Folie in Form einer Scheibe vorliegt.

.5. Verfahren zur Herstellung der Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein wäßriges Gemisch aus mindestens einer Art eines Mikroorganismus, einem mikrobiologischen Nährstoff und Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, einem wasserlöslichen substituierten Polyvinylpyrrolidon oder einem wasserlöslichen Celluloseäther, Carboxymethylcellulose, Hydroxyäthylcellulose und/oder Hydroxypropylcellulose herstellt und dieses wäßrige Gemisch trocknet.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, ein wasserlösliches substituiertes Polyvinylpyrrolidon oder einen wasserlöslichen Celluloseäther, Carboxymethylcellulose, Hydroxyäthylcellulose und/oder Hydroxypropylcellulose im wäßrigen Gemisch in einer Menge von weniger als 20 Gew.-% verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man dem wäßrigen Gemisch zusätzlich einen Weichmacher zusetzt.