DE2608601A1

DE2608601A1 - Mittel zur abgabe von lebensfaehigen mikroorganismen

Info

Publication number: DE2608601A1
Application number: DE19762608601
Authority: DE
Inventors: Devendra Vaikunthlal Mehta
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1975-03-03
Filing date: 1976-03-02
Publication date: 1976-09-16
Also published as: GB1526317A; ZA76744B; FR2303080B1; AU1087176A; AR212704A1; DE2608601B2; DE2608601C3; IT1053872B; BR7601262A; FR2303080A1; JPS51110090A

Description

Die Erfindung betrifft ein trockenes zusammenhängendes wasserlösliches Mittel umfassend eine polymere Substanz, in der ein homogenes Gemisch aus einem Mikroorganismus und einem mikrobiologischen Nährmedium enthalten ist. Ein solches Mittel, das üblicherweise die Form einer Folie besitzt, wird hergestellt, indem man in wäßrigem Medium den Mikroorganismus, die Nährstoffe und eine solche Menge einer wasserlöslichen polymeren Substanz löst, die nicht ausreicht, daß das entstehende Gemisch zu einer hochviskosen gelatinösen Masse wird und anschließend das wäßrige Gemisch trocknet. Wenn man dieses mikrobiologische%ittel mit einem feuchten, das mikrobiologische Wachstum unterstützenden Medium zusammenbringt, löst sich die polymere

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Substanz und setzt den eingeschlossenen Mikroorganismus in lebensfähiger Form für ein ungehemmtes Wachstum in Berührung mit dem Wachstumsmedium frei.

Die Erfindung betrifft Mittel zur Lagerung und Konservie-· rung von Mikroorganismen in lebensfähiger Form. Sie findet daher besonders Anwendung für Verfahren, die mit der Qualitätskontrolle von mikrobiologischen Nährmedien,Reagent ien und Verfahren zusammenhängen.

Bei Routinearbeiten in einem mikrobiologischen Labor besteht Bedarf an stabilen standardisierten bequemen Mitteln zur Konservierung von mikrobiologischen Stammkulturen (stock cultures) in lebensfähigem Zustand. Eine Quelle für übereinstimmende und reproduzierbare mikrobiologische Stämme ist nicht nur für biologische Forschungen und Untersuchungen notwendig, sondern auch zur Standardisierung und Qualitätskontrolle von mikrobiologischen Nährmedien, Reagentien und Verfahren.

Die Genauigkeit des Nachweises und der ^identifizierung von Mikroorganismen hängt ab von reproduzierbaren Medien, Reagentien und Verfahren. Das einzige wirkliche Mittel zur Bestimmung und dadurch Regelung einer derartigen Reproduzierbarkeit besteht darin, daß man die entsprechenden Medien und Reagentien auf bekannte mikrobiologische Vergleichskulturen aufbringt bzw. das Verfahren darauf anwendet. Günstigerweise sollten derartige Vergleichskulturen über längere Zeiten in quantitativ reproduzierbarer suspendierter Form lagerfähig sein ohne ihre Lebensfähigkeit einzubüßen oder die mikrobiologischen Eigenschaften der Mikroorganismen zu verändern.

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Bei den klassischen Verfahren wurden mikrobiologische Stammkulturen konserviert, indem man den Mikroorganismus in aktiver sich fortpflanzender Form auf Nähragarschrägen oder Platten hielt und in periodischen Zeitabständen auf weitere Schrägen oder Platten übertrug« Folglich enthielt ' eine Probe einer Stammkultur, die einige Monate später erhalten wurde, Nachkommen der ursprünglichen mikrobiologischen Organismen und nicht mehr die ursprünglichen Mikroorganismen selbst. So konnte es vorkommen, daß sich über eine gewisse Zeit die Stammkultur von einer reinen Kultur in eine heterogene Kultur umgewandelt hatte aufgrund möglicherweise aufgetretener Mutationen oder Verunreinigungen.

Der Versuch,reine lagerfähige mikrobiologische Kulturen zu erhalten führte zu dem Verfahren des Gefrierens oder Gefriertrocknens von mikrobiologischen Kulturen. Wie von DoF.D. Hockenhull in Progress in Industrial Microbiology (Heywood & Co., London, 1963) S.191-214, angegeben, kann die Lagerfähigkeit erreicht werden, indem man die Mikroorganismen in einen "scheintoten" Zustand ( state of "suspended animation") überführt, inpem die Mikroorganismen lebensfähig sind, aber mit einem extrem niedrigen Stoffwechsel und nicht im Stande sind sich zu vermehren. Ein solcher Scheintod-Zustand kann erreicht werden, indem man entweder die Temperatur, das verfügbare Wasser und/oder den verfügbaren Sauerstoff vermindert, wobei das letzte natürlich nicht auf anaerobe Mikroorganismen anwendbar ist. Während diese Aufgaben allgemein durch Gefrieren oder Gefriertrocknen erreicht werden, sind die erforderliche Zeit und Mühe und die Kosten der Ausrüstung unerwünscht hoch und für die durchschnittlichen mikrobiologischen Labors sind derartige Verfahren im allgemeinen nicht anwendbar. Auch reagieren spezielle Mikroorganismen unterschiedlich auf das Gefrieren und Gefriertrocknen, durch spezielle Arbeitsweisen erforderlich für spezielle Gruppen von Mikroorganismen .erforderlich sind.

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Eine weitere Verbesserung des Gefriertrocknens besteht in der Anwendung des mikrobiologischen Hydrogel Agarersatzmediums nach der US-PS 3 360 440. Bei der Herstellung einer stabilisierten Stammkultur nach diesem Verfahren werden die Mikroorganismen vor dem Lyophilisieren in einem wäßrigen Gemisch suspendiert,bestehend aus mikrobiologischen Nährstoffen und einer Menge eines wasserlösliches modifizierten Cellulosematerials, die nicht ausreicht, um aus dem Gemisch eine hochviskose gelatinöse Matrix zu bilden. Dieses Gel wird dann 60 bis 80 h gefriergetrocknet und mechanisch zu einem Pulver zerstoßen» Dieses Verfahren ist insofern ungünstig, da Vorrichtungen zum Lyophilisieren und Zerstoßen bzw. Vermählen erforderlich sind und die Bildung und Handhabung eines mikrobiologischen Gels. Da das Produkt in Form eines Gels vorliegt, treten verschiedene Schwierigkeiten auf bei der Herstellung einer homogenen quantitativen Verteilung der Mikroorganismen in dem Endprodukt und häufig kommt es zu einem unerwünschten Einschluß von Luft in der mikrobiologischen Gelmatrix.

Vor einiger Zeit wurde in der US-PS 3 671 400 ein Verfahren beschrieben, bei dem trockene bakteriologische Vergleichsproben hergestellt werden, indem ein Tropfen einer Suspension von Bakterien, Nährstoffgelatine und Stabilisatoren der auf einer wachsartigen Oberfläche verteilt ist, 72 h bei einer Temperatur von 20 bis 25⁰C unter einem Druck von 500 bis 600 mm Hg getrocknet wird. Bei der Anwendung wird die trockene Probe in Salzlösung suspendiert und nach 2 bis 3 h langem Inkubieren bei 35 bis 37⁰C ein Anteil der Lösung auf eine Nährstoffagarplatte aufgestrichen. Dieses Verfahren besitzt den Nachteil, daß es langwierig ist und spezielle Ausrüstungen erfordert.

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In den US-PSen 3 767 797 und 3 860 490 ist der Einschluß von speziellen Mikroorganismen in ein hydrophiles Acrylat oder Methacrylat beschrieben unter Bildung einer löslichen mikrobiologischen Kapsel. Derartig eingeschlossene Mikroorganismen verlieren jedoch ihre Lebensfähigkeit schnell innerhalb kurzer Zeit, manchmal schon innerhalb weniger Tage. Daher sind diese Kapseln zur längeren Lagerung von mikrobiologischen Stammkulturen kaum geeignet.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung^ein bequemes Verfahren zur Herstellung einer trockenen stabilen Form von Mikroorganismen in lebensfähigem Zustand zu entwickeln, bei dem keine langwierigen Verfahren oder speziellen Ausrüstungen erirderlich sind. Außerdem soll die erhaltene trockene mikrobiologische/Matrix bequemer in der Handhabung und Anwendung für mikrobiologische Zwecke sein als die bekannten Mittel.

Ein sehr bequemes trockenes nicht gelatinous Mittel enthaltend Mikroorganismen, die in lebensfähigem Zustand freigesetzt werden können wenn das Mittel mit einer wäßrigen Flüssigkeit in Berührung kommt, kann hergestellt werden, indem man ein wäßriges Gemisch herstellt, bestehend aus den Mikroorganismen, einem mikrobiologischen Nährmedium und einer in V/asser löslichen Substanz, und das entstandene wäßrige Gemisch trocknet. Die wasserlösliche polymere Substanz sollte in einer solchen Menge vorhanden sein, die nicht ausreicht, das wäßrige Gemisch in eine gelatinöse Masse überzuführen. Die Menge an mikrobiologischem Nährmedium sollte ausreichen, um die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen zu erhalten und außerdem hat es sich gezeigt, daß sie nicht so groß sein darf, daß sie während des Trocknens des wäßrigen Gemisches zu einem gefährlichen osmotischen Schock für die Mikroorganismen führt.

+) d.h. Mikroben liefernde

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Beim Trocknen des wäßrigen Gemisches entsteht ein Mittel üblicherweise in Form eines Films bzw. einerFolie, das trocken zusammenhängend und wasserlöslich ist und die Bestandteile des wäßrigen Gemisches homogen dispergiert enthält. Weitere Bestandteile wie verträgliche Weichmacher und Mittel zum Ausgleich des osmotischen Druckes können dem Mittel zugesetzt werden, indem man sie vor dem endgültigen Trocknen zu dem wäßrigen Gemisch zusetzt.

Um die Handhabung des wasserlöslichen mikrobiologischen Mittels zu erleichtern, besonders wenn es angewandt wird, um direkt die Oberfläche eines Nährsto'xgels zu beimpfen, kann das Mittel in einen Träger wie die Schleife bzw. einer Öse mikrobiologischen Impfnadel eingebaut werden. Bei der Anwendung kann die flache Oberfläche der das mikrobiologische Mittel enthaltenden Schleife der entstehenden Vorrichtung mit der feuchten Oberfläche des Nährstoffgels kurze Zeit zusammengebracht werden, um zu ermöglichen, daß sich die wasserlösliche Substanz zu lösen beginnt. Dann, wenn die wasserlösliche Substanz vollständig in Lösung geht, können die freigesetzten Mikroorganismen durch entsprechende Bewegung der Impfnadel wie bei einem üblichen Aufstreichverfahre'n über die Geloberfläche verteilt werden.

Die vorliegende Erfindung stellt ein einzigartiges und billiges Mittel zur Konservierung von Mikroorganismen dar. Das wasserlösliche mikrobiologische Mittel ist weiter dadurch gekennzeichnet, daß es eine höhere Stabilität bezogen auf die Lebensdauer von lebensfähigen Mikroorganismen über längere Lagerzeiten besitzt. Die Herstellung des mikrobiologischen Mittels erfordert keine spezielle Ausrüstung, da das wäßrige Gemisch meistens in irgendeinem zur Verfügung stehenden Gefäß hergestellt werden kann und die Trocknung durchgeführt werden kann, indem man das Gemisch unter

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Standardraumbedingungen stehen läßt.

Allgemein kann irgendeine wasserlösliche polymere Substanz verwendet werden, die im Stande ist, eine zusammenhängende wasserlösliche Masse vorzugsweise in Form eines Films bzw; einer Folie zu bilden, wenn eine wäßrige Lösung dieser Substanz getrocknet wird. Derartige Substanzen, die als wasserlösliche polymere Substanzen für die erfindungsgemäßen Mittel angewandt werden können, umfassen natürliche und synthetische lineare und vernetzte Polymere, wobei die letzteren auf solche begrenzt sind, die in dem wäßrigen Gemisch,aus dem das mikrobiologische Mittel hergestellt werden soll, nicht zur Gelbildung führen. Üblicherweise besitzt die polymere Substanz ein Molekulargewicht von ungefähr 20 000 bis 1 000 000 und vorzugsweise 100 000 bis 400 000. Die polymere Substanz kann ein oder mehrere Polymere umfassen, mit den gleichen oder unterschiedlichen Molekulargewichten, Substitutionsgraden, molekularen Substitutionen, Intrinsic-Viskositäten usw. Nicht-ionische wasserlösliche Polymere sind aufgrund ihrer Verträglichkeit mit Mikroorganismen bevorzugt. Beispiele für geeignete wasserlösliche Polymere sind Polyvinylpyrrolidon und die wasserlöslichen substituierten Polyvinylpyrrolidone und die wasserlöslichen Celluloseäther wie die Alkyl-, Carboxyalkyl- und Hydroxyalkyläther von Cellulose. Derartige wasserlösliche Celluloseäther umfassen besonders Carboxymethylcellulose, besonders solche mit einem Substitutionsgrad von ungefähr 0,4 bis 1,4 und vorzugsweise ungefähr 0,65 bis 0,85 und Hydroxyäthyl- und Hydroxypropylcellulose vorzugsweise mit einer molaren Substitution von weniger als ungefähr 3,2 und vorzugsweise ungefähr 1,0 bis 3,0. Besonders geeignet ist Polyvinylalkohol, besonders ein solcher mit einem Hydrolysegrad von weniger als ungefähr 90 % und vorzugsweise ungefähr 70 bis 90 %.

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Es ist jedoch kritisch, daß das wasserlösliche Gemisch, das unter Bildung des mikrobiologischen Mittels getrocknet werden soll, eine solche Menge an der wasserlöslichen polymeren Substanz enthält, die nicht ausreicht, um zur Bildung eines Gels oder einer gelatinösen Matrix zu führen. ' Das ist erforderlich, um beim Trocknen ein gleichmäßiges zusammenhängendes Mittel zu ergeben und nicht eine ungleichmäßige spröde pulverförmige Substanz, die nicht die Vorteile bei der Handhabung ergibt, wie sie eine zusammenhängende Matrix oder ein Film besitzt. Im allgemeinen enthält das wäßrige Gemisch weniger als ungefähr 20 % und vorzugsweise weniger als 5 % der wasserlöslichen polymeren Substanz (Gewicht/Volumen). Einige wasserlösliche Polymere können in größeren Mengen als 5 % zugesetzt werden ohne daß sie dazu führen, daß das wäßrige Gemisch ein Gel bildet, da sie ein niedriges Molekulargewicht und/oder eine hohe Hydrcphilie besitzen. Z.B. kann das besonders bevorzugte Polymer Polyvinylalkohol in einer Konzentration bis zu 20 % oder darüber (Gewicht/Volumen) in dem wäßrigen Gemisch vorliegen, ohne zuij&ildung einer unerwünschten gelartigen Form zu führen. Die Viskosität ist direkt eine Funktion des Molekulargewichts und daher führen die hochmolekularen Formen eines speziellen wasserlöslichen Polymers zu einer hochviskosen gelatinösen Phase bei geringeren Konzentrationen als die niedermolekularen Formen des gleichen Polymers. Ähnlich nimmt mit zunehmender Anzahl hydrophiler Gruppen in dem wasserlöslichen Polymer die Polymermenge zu, die erforderlich ist, um eine gelatinöse Phase zu bilden« Die Ausdrücke ''GeI" und "gelatinös "_s wie sie hier verwendet werden, bezeichnen eine hochviskose gelartige Phase, die dadurch gekennzeichnet ist₉ da6 sie keine unterscheidbare flüssige Phase besitzt₍ und die Ausdrücke sind nicht zu verwechseln mit der begrenzten Bedeutung der¹ Atisdrücke bezogen auf das physiochemische Phuiomen der Gelbildung als Funktion des Grades der Vernetzung.

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Mikroorganismen, die in das wasserlösliche mikrobiologische Mittel eingebaut werden können, umfassen eine weite Vielfalt von makroskopischen und mikroskopischen Lebewesen wie Algen, Pilze einschließlich Ken, Protozoen, Bakterien und Viren. Beispiele für Algen, die in das erfindungsgemäße mikrobiologische Mittel eingebaut werden können, sind solche der Arten Aphanacapsa-Gleocapsa, Euglene, Nostac, Plectonema, Selenastrum usw. Zu den Pilzen, die in das mikrobiologische Mittel eingebaut werden können, gehören die folgenden Arten: Aspergilus, Blastomyces, Candida, Cossidionides, Cryptococcus, Penicillium usw. Auch Protozonen wie Trichonomaden können in das Mittel eingebaut werden.

Eine große Vielzahl von Bakterien kann in das erfindungsgemäße mikrobiologische Mittel eingebaut werden, wie solche, die zu den Gruppen Pseudomonadales, Chlamydobacteriales, Hyphomicrobiales, Eubacteriales, Actinomycetales gehören usw. Das erfindungsgemäße mikrobiologische Mittel ist besonders geeignet zur Konservierung, Lagerung und Anwendung von Bakterien, die zu den folgenden Familien gehören: Azotobacteraceae, Rhizobiaceae, Achromobacteraceae, Brucellaceae, Enterobacteriaceae, Bacteriodaceae, Micrococcaceae, Neisseriaceae, Pseudomonadaceae, Lactobacillaceae, Nocardiaceae und Streptomycetaceae.

Außerdem können verschiedene Viren in das mikrobiologische Mittel eingebaut werden, z.B. RNS-Viren wie Enterovirus, Paramyxovirus und Myxovirus; DNS-Viren wie Polyomavirus, Adenovirus, Herpesvirus und Poxvirus; einige andere klinisch wichtige Viren wie Hepatitisvirus oder Australienantigen und Rubellavirus; verschiedene Bakterioviren besonders Bakteriophagen usw.

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Es ist festzustellen, daß immer die Möglichkeit besteht, daß besonders empfindliche (zerbrechliche) Mikroorganismen einen schnelleren Verlust an Lebensfähigkeit zeigen können als die Mehrzahl von Mikroorganismen. Die vorliegende Erfindung stellt jedoch ein Verfahren zur Herstellung eines' mikrobiologischen Mittels dar, das eine sehr weite Anwendbarkeit besitzt. Die Mengen ode r/fconz ent rat ionen an wasserlöslichem Polymer, Nährmedium und dem Mittel zum Ausgleich des osmotischen Druckes soweit erforderlich, können innerhalb eines weiten Bereichs eingestellt werden, um den speziellen Erfordernissen der einzelnen Mikroorganismen oder deren Gruppen entgegenzukommen« Um die Handhabungsfähigkeit des erfindungsgemäßen Mittels zu verbessern oder die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen zu unterstützen, können andere Substanzen zu dem Mittel zugesetzt werden, wie wasserunlösliche und dispergierbare Polymere, kolloidale oder gelatinöse Substanzen, inerte Füllstoffe, filmbildende Zusätze, Verdickungsmittel, Weichmacher, Emulgatoren, Dispersionsmittel usw. Die speziellen in das erfindungsgemäße Mittel eingebauten Mikroorganismen hängen von der beabsichtigten Anwendung desMittels ab. Z.B. werden für klinische Anwendungen solche Organismen zur Konservierung und Lagerung eingebaut wie die üblichen pathogenen Mikroben wie Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pyrogenes, Salmonella typhimurium, Proteus vulgaris, Serratia marcesens, Pseudomonas aeruginasa, Bacillus stereothermophilus, Bacillus subtilis usw.

Eine einzelne Art von Mikroorganismen kann in das mikrobiologische Mittel eingebaut werden, um eine lagerfähige homogene Kultur eines reinen Stammes zu erhalten. Bei bestimmten Anwendungsgebieten, besonders bei Verfahren der Qualitätskontrolle kann es günstig sein, zwei oder mehrere unterschiedliche biologisch verträgliche Arten von Mikroorganismen einzubauen, wenn das Mittel eine Probe wie Urin oder Auswurf simulieren soll.

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Das in das mikrobiologische Mittel eingebaute Nährmedium kann eine oder mehrere chemische Substanzen umfassen, die direkt oder indirekt den Stoffwechsel des in dem Mittel enthaltenen Mikroorganismus beeinflussen. Z.B. umfassen Nährmedien, die angewandt werden können, solche Substanzen, die für die Lebensfähigkeit oder das Wachstum der Mikroorganismen erforderlich sind, sowie Substanzen, die das mikrobiologische Wachstum hemmen, die günstig sind, um eine Kontamination wahrend der Herstellung und Anwendung des mikrobiologischen Mittels zu verzögern. Daher gehören zu derGruppe der Substanzen, die in das mikrobiologische Mittel als Nährsubstanzen eingebaut werden können, Proteine, Polypeptide wie Pepton, Aminosäuren, Nucleinsäuren, Polynucleotide, Kohlenhydrate einschließlich Mono- und Disaccharide wie Glucose und Saccharose und Polysaccharide, Wachstumsfaktoren wie Vitamine und Hormone und anorganische Elemente und Ionen.

Während der Trocknung des wäßrigen Gemisches enthaltend die einzubauenden Mikroorganismen, das Nährmedium und die wasserlösliche polymere Substanz wird angenommen, daß der auf die Mikroorganismuszellen ausgeübte osmotische Druck sich verändert. Das Vorliegen einer großen Menge ionisierbarer Substanzen in dem wäßrigen Gemisch führt offensichtlich zu einer Zunahme des osmotischen Druckes auf die mikrobiologischen Zellen während des Trocknungsverfahrens, wodurch die Gefahr eines implosiven Zusammenfallens der Zellwände zunimmt. Wenn andererseits jedoch nur eine kleine Menge an ionisierbaren Substanzen in dem wäßrigen Gemisch vorhanden ist, führt es offensichtlich zu einem Abfallen des exogenen osmotischen Druckes während des Trocknungsverfahrens und dadurch wird die Gefahr eines explosiven Zerreißens der Zellwände vergrößert. Wie aus den folgenden Beispielen hervorgeht, ist es möglich, ein Nährmedium zu wählen, das die gewünschte Menge an ionisierbären Substanzen enthält, so daß das Nährmedium in einer ausreichenden Menge zu dem wäßrigen Gemisch zugesetzt werden kann, um die

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Lebensfähigkeit der Mikroorganismen aufrecht zu erhalten, während die Menge so gering ist, daß sie die Mikroorganismuszellen nicht gefährlich beeinflußt.

Aufgrund der Hydrophilie der meisten üblichen mikrobiologischen Nährmedien wird der Gehalt an Nährmedium in dem wäßrigen Gemisch im allgemeinen auf einem erforderlichen Minimum gehalten, um die Trocknung zu verbessern während die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen aufrechterhalten wird. Im üblichen Falle ist daher nur eine kleine Menge an ionisierbaren Nährstoffen während des Trocknens vorhanden, was offensichtlich zu einem Abfall des exogenen osmotischen Druckes führt, der für die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen unsicher ist. In einem solchen Falle ist es besonders günstig dem wäßrigen Gemisch ein den osmotischen Druck ausgleichendes Mittel zuzusetzen, das im Stande ist, den osmotischen Druck während des Trocknens auf einer günstigen (gesunden) Höhe zu halten. Ein derartiges den osmotischen Druck ausgleichendes Mittel ist üblicherweise ein wasserlösliches chemisches Reagens, das im Stande ist, bei Berührung mit einer wäßrigen Flüssigkeit zu ionisieren. Geeignete den osmotischen Druck ausgleichende Mittel umfassen anorganische Salze und Kohlenhydrate wie Glucose, Lactose, Maltose, Mannit und Saccharose.

Verschiedene andere Substanzen können dem wäßrigen Gemisch zugesetzt werden, um in das mikrobiologische Mittel eingebaut zu werden. Derartige Substanzen umfassen Weichmacher wie Polyole, Glykole, wie Äthylenglykol und Polyäthylenglykol und Glycerin, die die Flexibilität und Abschälbarkeit des mikrobiologischen Mittels erleichtern, wenn es in der bevorzugten Form eines Films hergestellt wird. Es kann auch günstig sein _f inerte Füllstoffe zur Erzielung einer größeren Masse oder verträgliche Hintergrundfarbstoffe zur Farbcodierung oder aus anderen aesthetischen Gründen zuzusetzen. Indikatoren für das mikrobiologische Wachstum können

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ebenfalls zugesetzt werden und können besonders geeignet sein für Verfahren der Qualitätskontrolle. Beispiele für geeignete Indikatoren für das mikrobiologische Wachstum sind Chromogene, die auf das Vorhandensein mikrobiologischer Zellen ansprechen, z.B. pH-Indikatoren, die auf den Fermentationsstoffwechsel ansprechen oder Tetrazoliumsalze, die auf die chemische Zusammensetzung der mikrobiologischen Zellen selbst ansprechen.

Bei der Herstellung des wasserlöslichen mikrobiologischen Mittels wird zunächst ein wäßriges Gemisch hergestellt, umfassend die Mikroorganismen, Nährstoffe, das wasserlösliche Polymer und die gegebenenfalls sonst noch vorhandenen Substanzen, die in das mikrobiologische Mittel eingebaut werden sollen. Außer dem Mikroorganismus oder den Mikroorganismen, die in dem entstehenden trockenen Mittel enthalten sein sollen, werden alle Bestandteile des wäßrigen Gemisches unter aseptischen Bedingungen zusammengegeben. Das wäßrige Gemisch enthält in Lösung das wasserlösliche Polymer und die wasserlöslichen Bestandteile des Nährmediums und gegebenenfalls vorhandene Substanzen. Die Mikroorganismen und die wasserunlöslichen oder kolloidalen Bestandteile des Nährmediums und die gegebenenfalls sonst noch vorhandenen unlöslichen Bestandteile bilden eine Suspension. Das wäßrige Gemisch wird vor dem Trocknen gut vermischt, um eine homogene Dispersion aller Bestandteile zu erreichen.

Der Anteil der in dem wäßrigen Gemisch vorhandenen Bestandteile kann in einem weiten Bereich varrieren, wobei die folgenden Bereiche, die angegeben sind als Gewicht/Volumen des wäßrigen Gemisches jeweils zulässig bzw. bevorzugt sind.

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Bestandteile zulässiger Bereich bevorzugter Bereich

wasserlösliches 0,1 - 10,0 3,0 - 5,0 Polymer

Nährmedium 0,1 - 10,0 2,0 - 5,0

Mittel zum Aus- 0,0-10,0 2,0-5,0 gleich des osmotischen Druckes

Weichmacher 0,0 - 2,0 0,1 - 0,5

Das Trocknen des wäßrigen Gemisches kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden. Sehr einfach kann das wäßrige Gemisch auf eine nicht benetzbare im allgemeinen flache Oberfläche aufgegossen oder auf andere Weise darauf verteilt werden unter Bildung einer dünnen Schicht der Flüssigkeit, die nach Entfernung des Wassers eine mikrobiologische Folie ergibt. Das Trocknen kann erreicht werden, indem man

temperatur-

die Verdampfung des Wassers unter Standard-Raum- und-feuchtigkeit sbe dingungen stattfinden läßt. Eine geringe Feuchtigkeit oder leicht erhöhte Temperaturen können angewandt werden, um die Trocknung zu beschleunigen. Hitze kann jedoch einen nachteiligen Effekt auf die Mikroorganismen ausüben. Das wäßrige Gemisch wird im allgemeinen getrocknet bis der Gleichgewichtsfeuchtigkeitsgehalt bei Raumbedingungen erreicht ist. Bei Standard-Raumtemperatur und-feuchtigkeit kann dieser Trocknungsgrad innerhalb von 5 min bis 2 h je nach der Dicke des Films erreicht werden. Im allgemeinen muß eine geringe minimale Feuchtigkeitsmenge in dem mikrobiologischen Mittel noch vorhanden sein, um die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen aufrecht zu erhalten· Der oben angegebene Gleichgewichtsfeuchtigkeitsgehalt kann von Mittel zu Mittel zwischen ungefähr 2 und 15 % schwanken und ist ge-.eignet für die mikrobiologische Lebensfähigkeit.

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Bei der Anwendung können derartige gegossene mikrobiologische Folien als ganzes Stück verwendet werden oder sie können in eine Vielzahl von Teilen,vorzugsweise in Form von Scheiben geteilt oder zerschnitten werden. Es hat sich im allgemeinen gezeigt, daß die eingebauten Mikroorganismen quantitativ in einem getrockneten Film mit konstanter Dicke in einzelnen Teilen des Oberflächenbereiches verteilt sind. Die in der mikrobiologischen Folie eingeschlossenen Mikroorganismen können freigesetzt werden, indem man die Folie mit einem wäßrigen Medium wie Salzlösung einer wäßrigen Nährstoffbrühe oder der feuchten Oberfläche eines Nährstoffgels oder einer Nährstoffsehräge zus ammenbringt.

Das mikrobiologische Mittel kann wahlweise mit einem Träger zusammengebracht werden, indem man das wäßrige Gemisch mit dem gewünschten Trägerglied vor oder während des Trocknens an einem oder mehreren Punkten zusammenbringt oder indem man ein bereits getrocknetes mikrobiologisches Mittel durch geeignete Befestigungs- oder Klebevorrichtungen mit dem Träger verbindet.

Das erfindungsgemäße bequeme Verfahren zur Herstellung der mikrobiologischen Mittel ermöglicht eine Anzahl anderer Formen von Mittel und Träger, Z.B. kann das wäßrige Gemisch unter Bildung einer kontinuierlichen Zwischenschicht auf ein absorbierendes flächiges Material wie saugfähiges Papier aufgegossen oder auf andere Weise aufgebracht werden. Das absorbierende Material selbst kann mit einem mikrobiologischen Nährmedium, Hintergrundfarbstoffen oder Wachstumsindikatoren versehen sein, um bei Rehydratisierung der Struktur dem freigesetzten Mikroorganismen ein Nährmedium zur Verfügung zu stellen und ein in dem saugfähigen Material eingebettetes Feuchtigkeitsreservoir.

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Andere mögliche Formen umfassen ein Überziehen mindestens eines Teils der inneren Oberfläche eines Flüssigkeitsbehälters, z.B. eines Reagensglases mit dem mikrobiologischen Mittel. Bei Zugabe einer Nährbrühe in einen solchen Behälter erhält man eine flüssige Kultur. Es ist auch möglich, das mikrobiologische Mittel in Filmform mit verschiedenen mehrschichtigen Mitteln zusammenzubringen,umfassend eine oder mehrere mikrobiologische Folien und eine.oder mehrere Schichten enthaltend Nährstoffe oder andere mikrobiologische Reagentien in einer Matrix,umfassend polymere Substanzen, Kolloide, Gele, absorbierende flächige Materialien oder eine Kombination davon.

Eine besonders geeignete Form von mikrobiologischer Folie und Träger, die besonders geeignet ist zur Anwendung für Qualitätskontrolluntersuehungen umfaßt eine Impfnadel mit einer Schleife, wobei der mikrobiologische Film in der Schleife gebildet worden ist und sich über die Öffnung dieser Schleife erstreckt. Übliche Impfnadeln aus Metall oder Kunststoff können für diesen Zweck angewandt werden. Eine günstige Wegwerfvorrichtung kann aus einer Kunststoffimpfnadel bestehen, in deren Sohleife ein mikrobiologischer Film gebildet worden ist. Das entstehende Prüfmittel zur Qualitätskontrolle kann in einem feuchtigkeitsundurchlässigen Plastikbeutel oder in einer trockenen Flasche während der Lagerung eingeschlossen sein. Bei der Anwendung können die in der Folie eingebauten Mikroorganismen in eine wäßrige Nährbrühe abgegeben werden durch Eintauchen der den Film bzw. die Folie enthaltenden Schleife der Impfnadel in die Brühe, wobei sich die Folie löst. Um die Oberfläche eines Nährgels zu beimpfen, kann die Schleife der Impfnadel flach gegen die nasse Geloberfläche geführt werden, wodurch eine Lösung des mikrobiologischen Films eintritt. Die freigesetzten Mikroorganismen können dann durch Bewegen der Schleife über die Geloberfläche entsprechend einem üblichen Auf-

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streichverfahren auf derGeloberfläche verteilt werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Nach diesem Beispiel wurden wasserlösliche mikrobiologische Mittel enthaltend einen
gestellt und angewandt.

Mittel enthaltend einen gramnegativen Mikroorganismus her-

Zu 100 ml Wasser wurden 4,0 g 80 bis 90 %iger hydrolisierter Polyvinylalkohol mit einem Molekulargewicht von ungefähr 250 000 ( Elvanol U 50-42, der E.I. duPont de Nemours and Company, Wilmington, Delaware), 0,1 g Hirn-Herz-Infusionsmedium ( der BBL, Division of Becton, Dickinson and Company, Cockeysville, Maryland) und 2,0 g Saccharose gegeben. Die entstehende Lösung wurde in einem Dampfsterilisator 15 min bei 125°C sterilisiert.

Zu 50 ml der sterilisierten Lösung wurde 1,0 ml einer dreifach gewaschenen Suspension des gramnegativen Organismus Escherichia coli (ATCC 25922) in steriler Salzlösung in

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einer Konzentration von ungefähr 10' Zellen/ml gegeben. Die restlichen 50 ml der sterilisierten Lösung wurden als Vergleichslösung zurückbehalten.

Das Mikroorganismusgemisch und die Vergleichslösung wurden aseptisch aufgetrennte Plastikfolien in einer Dicke von 1,27 mm (50 mil) mit Hilfe eines Gardner-Spachtels (Gardner casting knife, der Gardner Laboratories, Inc. Bethesda, Maryland) aufgebracht. Das aufgegossene mikrobiologische Gemisch und die aufgegossene Vergleichslösung wurden über Nacht unter Standard-Raumbedingungen unter einer sterilen Haube getrocknet.

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Drei ungefähr 3,226 cm (1/2 square inch) große Stücke von den beiden Folien wurden von den Plastikfolien abgezogen. Ein Teil der Vergleichsfolie und ein Teil der mikro biologischen Folie wurden aseptisch auf getrennte Eosin- . Methylenblau-Agar-Platten aufgelegt. Außerdem wurde je ein Teil der mikrobiologischen Folie und der Vergleichsfolie aseptisch auf getrennte Blutagar-Platten aufgebracht und eine dritte Probe der Vergleichsfolie und der mikrobiologischen Folie zunächst getrennt in 5 ml Volumina einer 3,7 %lgen Hirn-Herz-Infusionsbrühe gelöst und zwei gleiche Anteile der entstehenden Lösungen auf Agarplatten aufgestrichen und zwar die ersten Anteile jeder Lösung auf getrennte Eosin-Methylenblau-Agar-Platten und die zweiten Anteile jeder Lösung auf getrennte Blutagar-Platten. Die 8 beimpften Agarplatten wurden ungefäh: 70 % relativer Feuchtigkeit inkubiert.

8 beimpften Agarplatten wurden ungefähr 18h bei 37⁰C und

Ein. positives mikrobiologisches Wachstum (Mikrobenwachstum) wurde auf allen Platten beobachtet, die direkt oder indirekt mit den mikrobiologischen Folien beimpft worden waren, während kein Yiachstum auf den Vergleichsplatten auftrat. Isolierte Kolonien, die die für Escherichia coli typische Morphologie, Farbe und Form besaßen, wurden auf den durch Aufstreichen der Brühe , in der die mikrobiologische Folie gelöst war, erhaltenen Platten beobachtet. Typisches Rasenwachstum wurde auf den Platten beobachtet, die direkt mit den mikrobiologischen Folien in Berührung gebracht worden waren.

Der Teil der mikrobiologischen Foliey der nicht von der Plastikfolie abgenommen worden war, wurde in einem getrockneten Sei Raumtemperatur 5 Tage aufbewahrt. Die so gelagerten mikrobiologischen Folien wurden dann auf ihre Fähigkeit, Wachstum zu erzeugen, wie oben untersuchte Man

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erhielt im wesentlichen die gleichen Ergebnisse.

Beispiel 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei 8,0 g Polyvinylalkohol anstelle von 4 g zur Herstellung der Ausgangslösung verwendet wurden. Positives und typisches Mikrobenwachstum wurde in allen Fällen für das mikrobiologische Mittel beobachtet. Die Ergebnisse waren im wesentlichen die gleichen wie in Beispiel 1.

Beispiel 3

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei der graiapositive Mikroorganismus Styphylococcus aureus ATCC 25923 anstelle des gramnegativen Escherichia coli verwendet wurde. Positives und typisches Mikrobenwachstum für Staphylococcus aureus wurde auf allen Platten beobachtet, die direkt oder indirekt mit dem mikrobiologischen Mittel beimpft worden waren, während kein Wachstum auf den Vergleichsplatten auftrat.

Beispiel 4

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei 2,0 g Hydroxypropylcellulose mit einem Molekulargewicht von ungefähr 275 000 ( G grade der Hercules, Inc., Wilmington, Delaware) anstelle von 4 g Polyvinylalkohol zur Herstellung der wäßrigen Lösung verwendet wurden. Die Ergebnisse waren im wesentlichen die gleichen wie in Beispiel 1.

Beispiel 5

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei 2,0 g Carboxymethylcellulose mit einem Molekulargewicht von ungefähr 250 000 (7M grade der Hercules, Inc., Wilmington, Delaware) anstelle von 4 g Polyvinylalkohol zur Herstellung der wäßrigen Lösung verwendet wurden. Die Ergebnisse waren im wesentlichen die gleichen wie in Beispiel 1..

b 0 9 8 3 8 / 0 8 B 7

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1A-47 Sf5S

$0

Beispiel 6

In diesem Beispiel wurden erfindungsgemäße wasserlösliche mikrobiologische Mittel mit Impfschleifen zusammengegeben, wobei die mikrobiologischen Mittel einen Weichmacher, aber kein Mittel zum Ausgleich des osmotischen Druckes enthielten.

Zu 100 ml Wasser wurden 3,0 g Polyvinylalkohol (Elvanol # 50-42, der E.I₀ duPont de Nemours and Company, Wilmington, Delaware), 1,2 g Bactopeptonmedium (der Difco Laboratories, Detroit, Michigan) und 1,2 g eines Polyolweichmachers (Pluronic F-127 der BASF Wyanndotte Corporation, Wyanndotte, Michigan) gegeben. Die entstehende Lösung wurde 15 min in einem Autoklaven sterilisiert.

Zu 27 ml der sterilisierten Lösung wurden 3,0 ml einer gewaschenen Suspension einer 18 h alten Kultur von Escherichia coli (ATCC 25922) in 0,5 %iger Peptonlösung in einer Konzen-

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tration von ungefähr 10 Zellen/ml gegeben. Das entstehende Gemisch wurde 2 min gut gemischt.

Die Schleife bzw. Öse von Impfschleifen (mit ungefähr 8 cm langen Handgriffen und einem inneren Durchmesser der Schleife von ungefähr 1-2 mm und einem äußeren Durchmesser von ungefähr 2-4 mm) wurden in das Mikroorganismusgemisch getaucht und seitlich herausgezogen, wobei ein Flüssigkeitsfilm entstand, der die Öse vollständig ausfüllte. Die so erhaltenen Filme wurden ungefähr 30 min bei einer relativen Feuchtigkeit unter 10 % bei Raumtemperatur in senkrechter Lage in der Luft getrocknet.

Um die Lebensfähigkeit der in die Folie eingebauten Mikroorganismen zu untersuchen, wurden verschiedene der getrockneten Schleifen mit Blutagarplatten in Berührung gebracht,

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so daß der Teil der Schleife, der mit dem mikrobiologischen Film überzogen war, flach auf der feuchten Agaroberflache auflag. Nach ungefähr 5 bis 10 s hatten sich die mikrobiologischen Filme ausreichend gelöst, um ein Aufstreichen der Mikroorganismen auf die Agar-Oberfläche zu ermöglichen. Beim Inkubieren über Nacht bei 37°C erhielt man das typische isolierte Kolonienwachstum«,

Beispiel 7

Dieses Beispiel zeigt die Beziehung zwischen dem Gehalt an mikrobiologischem Nährmedium der erfindungsgemäßen mikrobiologischen Mittel und der Lebensfähigkeit der eingebauten Mikroorganismen über eine Zeitspanne.

Verschiedene Mikroorganismen wurden entsprechend dem Beispiel 6 in die mikrobiologischen Filme auf den Impfschleifen eingebaut, wobei die folgenden Mengen an Bestandteilen, angegeben als Gewichts-%,in der wäßrigen Lösung verwendet wurden.

Escherichia coli (ATCC 25922)

Wasserlösliches Polymer (Polyvinylalkohol) 5,0 %

Weichmacher (Pluronic F-127) 0,25 %

Nährmedium (Pepton) 1,2-10,0 %

Mittel zum Ausgleich des osmotischen

Druckes (Sucrose) 3,0 %

Enterobacter cloacae (ATCC 23355)

Wasserlösliches Polymer (Polyvinylalkohol) 3,0 %

Weichmacher (Pluronic F-127) 0,25

Nährmedium (Pepton) 2,0-5,0 %

Mittel zum Ausgleich des osmotischen 3,0 %

Druckes (Sucrose)

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1A-47 Γ,5Γ»

Salmonella typhimurium (ATCC 14028)

Wasserlösliches Polymer (Polyvinylalkohol) 3,0 % Weichmacher (Pluronic F-127) 0,25 %

Nährmedium (Pepton) 2,0-5,0 %

Mittel zum Ausgleich des osmotischen 3,0 %

Druckes (Sucrose)

Die Anzahl der ursprünglich in die Folien eingebauten lebensfähigen Organismen wurde dreifach für jede Reihe von Mikroorganismen bestimmt durch Lösen einer bestimmten mikrobiologischen Folie in Salzlösung. Dann wurde eine Reihenverdünnung hergestellt, wobei die letzte Verdünnung auf Platten ausgestrichen und die einzelnen Kolonien gezählt wurden, die beim Inkubieren entstanden waren. Die Gesamtzahl der Mikroorganismen in der Folie wurde dann aus der Auszählung und dem Verdünnungsfaktor berechnet.

Die mikrobiologischen Folien wurden in feuchtigkeitsdichten Behältern bei ungefähr 50⁰C gelagert. Die Anzahl der lebensfähigen Organismen, die in den gelagerten Folien noch vorhanden waren, wurde in bestimmten Zeitabständen auf die oben beschriebene Weise dreifach bestimmt. Die Ergebnisse für jeden von drei Mikroorganismen sind im folgenden als Prozent noch lebensfähige Mikroorganismen angegeben.

Escherichia coli (ATCC 25922)

Lagerung	1	,2	%	3,0	Nährmedium	96	5	t°	,2	10,	0 $0
Ch)	1	00		100		1	00	,2	100
O		6,	9	61,	0		6	,032	5	,9
5		1,	2	7,	8		2		2	,5
8		ο,	002	ο,	25*		0	0	,018
30,5

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22 -

1A-47

Enterobacter cloacae (ATCC 23355)

Lagerung	2,0	%	3.0	%	Nähme dium	5.0	%
Ch)	100		100		4.0 %	100
0	29	,9	36,	0	100	19	,2
5,5	6	,4	14,	0	24,0	18	,0
24	5	,5	5,	6	21,0	13	,1
30				13,0*

Salmonella typhimurium (ATCC 14028)

Lagerung	2,0	%	3.0	/ο	Nährmedium	5.0	oZ
Lh)	100		100		• 4,0 %	100
0	7,	3	12	,8	100	-
19,5	6,	6	4	,6	9,1	33,	7
41	2,	4	6	,2	6,8	25,	6*
65,5				5,5

* Als optimale Menge an Nährmedium anzusehen

Andere mikrobiologische Folien₍ enthaltend verschiedene andere Mikroorganismen wurden auf die gleiche Weise untersucht, wobei die überwiegende Mehrzahl von ihnen zu ähnlichen Ergebnissen führte wie sie oben für Escherichia coli und Enterobacter cloacae angegeben sind. Eine Zunahme oder Abnahme der Nährstoffkonzentrationen im Verhältnis zu der Konzentration, die ein optimales Überleben der Mikroorganismen ergab, führte im allgemeinen zu einer Abnahme der überlebenden Organismen. Es ist zu bemerken, daß, da die Gesamtzahl der ursprünglich in die mikrobiologische Folie nach dem Verfahren des Beispiels 2 eingebauten Mikroorganismen ungefähr 10 Zellen/ml betrug, ein %-Satz von 1 % überlebender Mikroorganismen 10 lebensfähige Zellen/ml bedeutet.

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Beispiel 8

Dieses Beispiel zeigt die hohe Stabilität von erfindungsgemäß hergestellten mikrobiologischen Mitteln für verschie dene Mikroorganismen, die über 1 Jahr bei 4⁰C und 25⁰C gelagert worden waren.

Verschiedene Mikroorganismen wurden in mikrobiologische Filme eingebaut, die in den Impfschleifen enthalten waren, entsprechend dem Beispiel 6, wobei die folgenden Mengen jeweils als Gew.-%, bezogen auf die wäßrige Lösung verwendet wurden.

Mikroorganismus Polyvinyl- Pluronic Pepton Sucrose

alkohol F-127

Escherichia	5,0	0,25	3,0	-	2,0	3,0
coli
Staphylococcus	5,0	0,25	4,0	2,0
aureus
Enterobacter	3,0	0,25	3,0	3,0
cloacae
Klebsiella	5,0	0,25	3,0	4,0
pneumoniae
Streptococcus	3,0	0,25	5,0	5,0
pyogenes
Salmonella	3,0	0,25	2,0	3,0
typhimurium
Proteus	5,0	0,25	2,0
vulgaris

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2 6 O 3 R O 1

Die optimale Menge an Nährmedium₍in diesem Falle Pepton wurde für jede Zubereitung entsprechend Beispiel 3 bestimmt. Die Gesamtzahl der in jede Reihe von mikrobiologischen Folien eingebauten Mikroorganismen wurde entsprechend Beispiel 7 bestimmt,, Die erhaltenen mikrobiologischen Folien wurden in zwei Teilen bei A-⁰C bzw. 25⁰C gelagert und die Anzahl der lebensfähigen Mikroorganismen entsprechend Beispiel 7 periodisch bestimmt. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Mikroorganismus Anfangs·

zahl

Lagerdauer Anzahl der noch lebenden Mikro-Organismen

4⁰C

25⁰C

Escherichia 1,7x10 coli

Staphylococcus 9,3x10" aureus

Staphylococcus 9,3x10' aureus

Enterobacter 1,5x10 cloacae

Klebsiella 5,3x10ⁱ pneumoniae

Streptococcus 1,0x10 pyogenes

Salmonella 5,3x10 typhimurium

Proteus 1,0x10 vulgaris

366 7,5x1O⁴ 8,6x1O¹ 427 1,4x1O⁵

125

399 2,8x10-

214

1,3x10

483 8,0x1O³ 3,0x1 457 2,2x1O⁵ 8,0x1

9,8x10"

378 7,6x1O⁴ 2,3x1 357 4,8x1O⁴ 3,3x1O⁴

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Aus diesen Werten geht hervor, daß die erfindungsgemäß hergestellten mikrobiologischen Mittel,die ursprünglich 10 lebensfähige Mikroorganismen enthielten, wenn sie über 1 Jahr bei Raumtemperatur gelagert worden waren, noch imstande waren mehr als 10 lebensfähige Mikroorganismen freizusetzen und bis zu 10^ lebensfähige Mikroorganismen, wenn sie über 1 Jahr bei 4⁰C gelagert worden waren.

Patentansprüche;

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Claims

Patentansprüche

Mittel zur Abgabe von lebensfähigen Mikroorganismen bei Berührung mit Wasser, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer zusammenhängenden wasserlöslichen polymeren Matrix besteht, in der ein mikrobiologisches Gemisch, bestehend zumindest aus einem Mikroorganismus und einem mikrobiologischen Nährstoff,homogen dispergiert ist.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserlösliche Polymer ein lineares Polymer ist.
3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß das lineare Polymer Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, ein wasserlösliches substituiertes Polyvinylpyrrolidon oder ein wasserlöslicher Celluloseäther, Carboxymethylcellulose, Hydroxyäthylcellulose und/oder Hydroxypropylcellulose ist.
4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge

kennzeichnet

daß das mikrobiologische G_pmisch

zusätzlich einen Weichmacher enthält.
5. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Bakterium der Familien Azotobacteraceae, Rhizobiaceäe, Achromobacteraceae, Brucellaceae, Enterobacteriaceae, Bacteriodaceae, Micrococcaceae, Neisseriaceae, Pseudomonadaceae, Lacto-

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bacillaceae, Nocardiaceae und/oder Streptomycetaceae ist.
6. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß es in Form einer Folie, vorzugsweise in Form einer Scheibe, vorliegt.
7. Verfahren zur Herstellung der Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß man ein wäßriges Gemisch aus mindestens einer Art eines Mikroorganismus, einem mikrobiologischen Nährstoff und einer wasserlöslichen polymeren Substanz herstellt und dieses wäßrige Gemisch trocknet.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß man die wasserlösliche polymere Substanz in einer Menge verwendet, die nicht ausreicht, das wäßrige Gemisch in eine gelatinöse Masse überzuführen.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet , daß man das mikrobiologische Nährmedium in einer Menge verwendet, die ausreicht, um nach dem Trocknen die Lebensfähigkeit des Mikroorganismus aufrecht zu.erhalten und zu gering ist, um den Mikroorganismus beim Trocknen aufgrund einer Unausgewogenheit des osmotischen Druckes gefährlich zu beeinflussen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet , daß man das wäßrige Gemisch trocknet bis der Gleichgewichtsfeuchtigkeitsgehalt gegenüber .Standardraumbedingungen erreicht ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß man dem wäßrigen Gemisch zusätzlich ein Reagens zusetzt, das bei Berührung mit einer wäßrigen Flüssigkeit ionisiert wird.

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12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß man das ionisierbare Reagens in einer solchen Menge zusetzt, daß es zusammen mit dem mikrobiologischen Nährstoff den osmotischen Druck so ausgleicht, daß die Lebensfähigkeit des Mikroorganismus während des Trocknens erhalten bleibt. . .*-.'■' *i"~
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet , daß man als ionisierbares Reagens ein Kohlenhydrat und/oder ein anorganisches Salz verwendet.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet , daß man die wasserlösliche polymere Substanz im wäßrigen Gemisch in einer Menge von weniger als 20 Gew.-?f> verwendet.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichn et , daß man dem wäßrigen Gemisch .1

einen Weichmacher zusetzt.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 15, dadurch gekennzeichnet , daß man das wäßrige Gemisch vor dem Trocknen mit einem Träger zusammenbringt.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger eine Öse verwendet.
18o . Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet , daß man als Öse die Öse einer Impfnadel verwendet.
19. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,· daß man als Träger ein saugfähiges Material verwendet.

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