DE69633629T2

DE69633629T2 - Produktion von mikrobieller Zellulose mittels eines rotierenden Scheiben-Film-Bioreaktors

Info

Publication number: DE69633629T2
Application number: DE69633629T
Authority: DE
Inventors: Henry R.Iii Bungay; C. Gonzalo SERAFICA
Original assignee: Rensselaer Polytechnic Institute
Current assignee: Rensselaer Polytechnic Institute
Priority date: 1995-08-01
Filing date: 1996-07-30
Publication date: 2005-11-10
Anticipated expiration: 2016-07-31
Also published as: JP3184537B2; US6071727A; JPH10510437A; CA2228450A1; EP0850314A1; CA2228450C; US5955326A; EP0850314B1; WO1997005271A1; ATE279528T1; EP0850314A4; AU6683796A; DE69633629D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Herstellung mikrobieller Zellulose unter Verwendung eines rotierenden Plattenfilmreaktors. Die Erfindung konzentriert sich auf das Konzept der Verwendung von Filmbioreaktoren zur Herstellung eines kohäsiven Häutchens aus bakterieller Zellulose. Der eingesetzte Filmreaktor ist vom Typ eines rotierenden Scheibenbioreaktors, der für das anhaftende Wachstum von extrazellulare Zellulose erzeugenden Organismen und für die Herstellung eines gallertartigen mikrobiellen Zelluloseprodukts ausgelegt ist.
Die Erfindung betrifft auch ein mikrobielles Zelluloseprodukt mit einzigartigen Eigenschaften und insbesondere ein stark hydratisiertes Häutchen aus mikrobieller Zellulose. Dieses hydratisierte Zelluloseprodukt ist durch einen hohen Anteil (etwa die zweifache Menge) an Wasser pro Einheitsgewicht trockener Zellulose gekennzeichnet, verglichen mit bakterieller Zellulose, die durch ähnliche Zellulose erzeugende Organis men unter statischen Bedingungen erzeugt wird.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des hydratisierten, bakteriellen Zellulosehäutchens durch nicht-statische Kultivierung von Zellulose erzeugenden Organismen in einem Filmbioreaktor. Bei Verwendung eines rotierenden Scheibenbioreaktors ergab sich eine unerwartet hohe Produktionsrate eines einförmigen kohäsiven Gels.
Hintergrund der Erfindung
Eine Reihe von Bakterien, wie insbesondere Stämme von Acetobacter, kann zur Herstellung bakterieller Zellulose kultiviert werden. In Gegenwart von Zucker und Sauerstoff synthetisieren Zellen von Acetobacter Zellulose extrazellular in Form von an der Zelle anhaftenden Fäserchen. Die von den anderen Zellen erzeugten Fäserchen greifen ineinander, um ein hydrophiles Netzwerk zu bilden, das als Häutchen bekannt ist. Typische Prozesse zur Herstellung mikrobieller Zellulose nutzen eine statische Kulturbildung (GB Nr. 2131701). Das Häutchen aus mikrobieller Zellulose wird an dem Luft/Flüssigkeits-Übergang einer bewegungslosen und ungestörten Kultur ausgebildet, die üblicherweise von einer flachen Schale aufgenommen wird. Dieses kohärente, gelartige Häutchen ist für viele Anwendungen, wie beispielsweise einen Wundverband, nach dem Verarbeitungsschritt der Entfernung der Zellen geeignet.
Das US-Patent Nr. 4942128 beschreibt die Herstellung von Zellulose in einer statischen Kultur, wobei ein Polysaccharid, wie Carboxymethylcellulose, mit einem Zellulose erzeugenden Mikroorganismus inkubiert wird. Das 128-Patent beschreibt, dass in einer bewegten Kultur hergestellte Zellulose kein Häutchen erzeugen kann.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung bakterieller Zellulose nutzt herkömmliche, einen Tieftank aufweisende, gerührte Bioreaktoren. Unter diesen bewegten Bedingungen wird eine nicht-häutchenbildende Form bakterieller Zellulose hergestellt. Diese Art von Produktionsablauf ist höchst anfällig für eine Bakterienstamminstabilität, die durch den Verlust der Fähigkeit zur Herstellung von Zellulose und ein graduelles, übermäßiges Wachstum der Zellen zum Ausdruck kommt (Valla, S. und Kjosbakken, J., Cellulose negative mutants of Acetobacter xylinum, Journal of General Microbiology, 128, 1401-(1982)). Nichtsdestotrotz wurde über die verstärkte Produktion netzförmig angelegter, bakterieller Zellulose unter bewegten Bedingungen für mehr als 70 Stunden unter Verwendung mutagenisierter und ausgewählter Stämme berichtet (US-Patent 4,863,565).
Auch umfasst ein vierstufiger Prozess zur Herstellung eines mikrobiellen Zelluloseprodukts (US-Patent 5,273,891) die Verwendung einer gerührten Batch-Kultur. Die Verwendung von luftunterstützten Fermentoren, bei denen Luftblasen anstelle von Flügelrädern zum Vermischen eingesetzt werden, wurde ebenfalls für die Herstellung bakterieller Zellulose ausgelegt (Okiyama, A., Schirae, H., Kano, H. und Yamanaka, S., Bacterial cellulose I. Two-stage fermentation process for cellulose production by acetobacter aceti, Food Hydrocolloids, 6, Nr. 5, 471 bis 477. (1992)). Somit wurde vordem abgesehen von der ungestörten statischen Kulturbildung in Schalen kein alternativer Bioreaktor erwähnt, der zur Herstellung kohärenter Membranhäutchen aus bakterieller Zellulose geeignet ist.
Obwohl Filmbioreaktoren seit mehr als 20 Jahren in der Abwasserbehandlungsindustrie üblich sind, wird dieser Typ einer Bioreaktoranordnung nicht zur Herstellung eines Biopolymers eingesetzt. Das Grundprinzip von Filmreaktoren besteht darin, die wachsenden Zellen mit einem Strukturelement des Reaktors zu verknüpfen, um einen Film zu bilden und dann das Zellwachstum entweder durch über den Film strömende Nährstoffe oder durch Bewegung des in dem Strukturelement enthaltenen Films in ein mit Nährstoffen gefülltes Gefäß zu fördern.
Am weitesten verbreitet ist bei diesem Typ eines Filmbioreaktors der Tropfkörper, bei dem der Film stationär ist und Medien durch den Film perkulieren. Das US-Patent Nr. 4,320,198 beschreibt die Herstellung mikrobieller Zellulose durch Kultivierung des Mikroorganismus sphaerotilus natans auf einer Metallplatte mit körniger Oberfläche und durch Zufuhr eines Nährstoffstroms über die Platte. Eine zweite Anwendung betrifft den rotierenden biologischen Contactor (CWC), bei dem der Film in das Medium getaucht wird.
Neben der Abwasserbehandlung liegt eine bekannte Anwendung dieses Typs eines Filmbioreaktors in der Produktion von Fadenpilzen (US-Patent 5,246,854). Der zugeordnete biologische Wachstumsreaktor nutzt einen rotierenden Zylinder, mit dem die Fadenpilze verknüpfen, während der Zylinder teilweise in eine Wanne getaucht wird, die mit einem Nährstoffmedium gefüllt ist. Obwohl viel getan wurde, um die Verwendung dieser konventionellen Filmbioreaktoren für umwelttechnische Anwendungen zu fördern, wurde zuvor nirgends erwähnt, dass das Konzept der Bewegung eines mikrobiellen Films in ein stationäres Medium bei der Herstellung von Biopolymeren, wie einem extrazellularen Zelluloseprodukt, angewendet werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft zumindest zum Teil ein Verfahren zur Herstellung eines stark gelatisierten, mikrobiellen Zellulosehäutchens durch Kulturbildung von Zellulose erzeugenden Organismen über eine längere Zeitdauer unter nicht-statischen Bedingungen in einem rotierenden Plattenfilmbioreaktor. Die Produktionsrate an häutchenbildender, mikrobieller Zellulose ist überraschend hoch angesichts früherer Studien, in denen ausgesagt ist, dass ein Mischen in der Regel die Menge an produzierter Zellulose verringert (Schramm, M. und Hestring, S., Factors affecting production of Cellulose at the Air/Liquid Interface of a culture of Acetobacter xylinum, Journal of General Microbiology, 11, 123 bis 129. (1954)). Zudem sind die hohe Syntheserate und die stark gelatisierte Beschaffenheit des erfindungsgemäßen, mikrobiellen Zellulosehäutchens, das unter Verwendung des rotierenden Plattenfilmbioreaktors nach der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, vollkommen unerwartet.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein stark hydratisiertes, mikrobielles Zelluloseprodukt mit neuen Eigenschaften. Dieses bakterielle Zellulosehäutchen, das mittels eines rotierenden Plattenfilmbioreaktors hergestellt wird, umfasst im Vergleich zu bakteriellen Zellulosehäutchen, die mittels Zellulose erzeugender Organismen unter statischen Bedingungen hergestellt werden, die doppelte Menge an Wasser pro Gewichtseinheit Zellulose. Dieses mikrobielle Zellulosehäutchen kann etwa das 200-Fache seines Gewichts an Wasser absorbieren und weist eine stark gelatisierte dreidimensionale Struktur auf. Sein hoher Wassergehalt ist eine Folge des neuen Herstellungsverfahrens gemäß der Erfindung.
Die makroskopischen und mikroskopischen Eigenschaften des mikrobiellen Zelluloseprodukts, das gemäß den rotierenden Zuchtbedingungen der Erfindung hergestellt wird, unterscheiden sich von denen jener Produkte, die unter bekannten statischen Bedingungen hergestellt werden. In makroskopischer Hinsicht bildet die Zellulose, die mittels des rotierenden Plattenfilmbioreaktors hergestellt wird, einen stark gelatisierten Film, der nach fünf Tagen Zucht eine Dicke von etwa 20 bis 30 mm aufweist, verglichen mit einem mikrobiellen Zellulosefilm von 3 bis 5 mm Dicke, der an der Luft/Flüssigkeits-Grenzfläche einer statischen Kultur, die über dieselbe Zeitspanne herangezogen wird, ausgebildet wird. Dieses kontinuierliche Häutchen, das unter Verwendung des Filmreaktors erzeugt wurde, weist auch eine offenere Struktur auf, die ein höheres Wasserabsorptionsvermögen im Vergleich zu dem unter statischen Bedingungen gewonnenen Zelluloseprodukt bedingt. In mikroskopischer Hinsicht wird ebenfalls von dem Vorhandensein von Unterschieden ausgegangen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung extrazellularer mikrobieller Zellulose, bei dem ein bakterieller Stamm, der zur Herstellung extrazellularer mikrobieller Zellulose geeignet ist, aerob in einem Nährmedium kultiviert wird, das eine Kohlenstoffquelle und weitere Nährstoffe enthält, wobei das Verfahren die Verwendung eines rotierenden Plattenfilmbioreaktors einschließt. Der biologische Reaktor umfasst:

a) eine Reihe kreisförmiger Scheiben (obwohl jede Form möglich ist) mit der geeigneten Maschengröße, die sowohl die Anlagerung und das Wachstum mikrobieller, Zellulose erzeugender Organismen als auch die Produktion extrazellularer, mikrobieller Zellulose ermöglicht, wobei die Scheiben auf einer Welle montiert sind, um eine Drehung zu unterstützen;
b) einen horizontal angeordneten Trog (vorzugsweise zylindrisch) ausreichender Länge und Tiefe, um ein biologisches Medium aufzunehmen, in dem, wenn enthalten, zumindest ein Teil der aufgenommenen Scheiben eingetaucht ist; der abgedeckte Trog sollte auch Öffnungen aufweisen, um eine Medienzufuhr, eine Luft/Sauerstoff-Zufuhr, eine Inokulation, eine pH-Überwachung und eine Probenentnahme zu ermöglichen; und
c) ein externes rotierendes Mittel, das an der Welle befestigt ist, um die in dem Trog angeordneten Scheiben in Drehung zu versetzen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren zur Herstellung extrazellularer mikrobieller Zellulose mittels Zellulose erzeugender Organismen wie folgt gekennzeichnet:

1) Bereitstellen eines biologischen Reaktionsgefäßes, wie oben beschrieben;
2) Einleiten des biologischen Mediums in den Trog;
3) Einleiten eines Inokulums eines extrazellularen Zellulose erzeugenden Organismus in den Trog;
4) Drehen der eingetauchten Scheiben, die in dem biologischen Reaktor enthalten sind, mit einer effektiven Drehzahl;
5) Zugabe der Medien Nährstoffe, Chemikalien und Polymere, Sauerstoff und Überwachen der Bedingungen in dem biologischen Reaktor, wie z. B. des pH-Wertes, wann immer erforderlich; und
6) Ernten des auf den Scheiben gebildeten Zellulosefilms durch geeignete Mittel.

Das Verfahren zur Herstellung mikrobieller Zellulose unter Verwendung eines rotierenden Plattenfilmreaktors nach der Erfindung weist mehrere Vorteile gegenüber den bestehenden Prozessen und geläufigen Verfahren zur Herstellung mikrobieller Zellulose auf. Diese Vorteile der vorliegenden Erfindung betreffen große Flächen, die zur Zelluloseherstellung verfügbar sind, die Fähigkeit der Änderung von Medienbedingungen während der Zellulosesynthese, hohe Zelluloseproduktionsraten und eine leichte Maßstabsvergrößerung für die Herstellung großer Volumina häutchenbildender mikrobieller Zellulose.
Jeder Bakterienstamm, der zur Herstellung extrazellularer mikrobieller Zellulose geeignet ist, kann bei dem Verfahren nach der Erfindung verwendet werden. Geeignete Stämme umfassen Stämme, die zu der Gattung Acetobacter gehören, beispielsweise Acetobacter-Xylinium-Stämme der Gattungen ATCC 10245, 23769, 1082.
Eine große Auswahl an Kohlenstoffquellen kann verwendet werden, einschließlich Lactat, Ethanol, Glycerol, Melasse, Saccharose und andere Zucker, wie Fructose und insbesondere Glucose. Die geeignete anfängliche Kohlenstoffquellenkonzentration liegt in dem Bereich zwischen 2 und 100 gm/l. Zucker kann der in dem Reaktor wachsenden Kultur zugegeben werden, um eine bestimmte gewünschte Konzentration für eine optimale Zelluloseherstellung aufrecht zu erhalten. Für eine Produktion in großem Maßstab können verschiedene Rohstoffe als Stickstoffquellen eingesetzt werden, einschließlich in Wasser eingeweichter Mais (corn steep liquor).
Der anfängliche pH-Wert, bei dem gemäß der Erfindung der Zellulose erzeugende Organismus zu kultivieren ist, liegt zwischen 3 und 6, bevorzugt zwischen 4,5 und 5,5, und besonders bevorzugt bei 5,0. Der pH-Wert in dem Bioreaktor kann durch Puffer, wie Citrat, oder durch Zugabe von Base oder Säure zu dem Medium gesteuert werden, um den pH-Wert in dem gewünschten Bereich zu halten.
Die Luftzufuhr in den Reaktor kann bezüglich ihrer Zusammensetzung von Luft (21% Sauerstoff) bis 100% Sauerstoff und bezüglich ihrer Einströmrate in Abhängigkeit davon, was am besten für die Herstellung mikrobieller Zellulose geeignet ist, verändert werden. Die Aufrechterhaltung eines positiven Sauerstoffdrucks in dem Bioreaktor vergrößert die Produktionsrate und verhindert Kontamination.
Die Drehzahl ist üblicherweise abhängig von der Größe oder dem Durchmesser der Scheibe, die in dem biologischen Reaktor verwendet wird. Beispielsweise sollte bei einer Scheibe mit 12 cm Durchmesser die Drehzahl in dem Bereich zwischen 1 und 30 rpm liegen, wobei 6 bis 12 rpm bevorzugt werden. Die Drehzahl der Scheiben während der Zelluloseherstellung hat einen merklichen Einfluss auf die Produktionsrate an Zellulose während der Fermentation.
Der Betrieb des biologischen Reaktors kann durch Batch-Fermentierung, Zufuhr-Batchfermentierung und kontinuierliche Fermentierung erfolgen, wobei jedes Verfahren seine eigenen Vorteile aufweist. Batch-Fermentierung kann ausreichend sein zur Herstellung häutchenbildener, mikrobieller Zellulose für Massenanwendungen. Zufuhr-Batchfermentierung oder kontinuierliche Verarbeitung kann insbesondere bei der Herstellung modifizierter oder zusammengesetzter mikrobieller Zellulo sehäutchen wünschenswert sein.
Die verschiedenen neuen Merkmale, die die Erfindung charakterisieren, sind detailliert in den beigefügten Ansprüchen herausgestellt und bilden einen Teil dieser Offenbarung. Für ein besseres Verständnis der Erfindung, von deren Vorteilen im Betrieb und von speziellen Aufgaben, die durch deren Anwendung gelöst werden, wird auf die beiliegenden Zeichnungen und die Beschreibung verwiesen, in der eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dargestellt ist.
Kurzbeschreibung der Zeichnung
In der Zeichnung zeigt
1 eine perspektivische Ansicht eines rotierenden Plattenfilmbioreaktors gemäß der vorliegenden Erfindung mit mikrobiellem Zellulosehäutchen, das sich auf den Scheiben ausbildet;
2 ein Schaubild, in dem die lineare Beziehung zwischen der Zuchtzeit und der Menge an Zellulose dargestellt ist, die einerseits in dem rotierenden Plattenfilmbioreaktor (RDR) und andererseits in einer statischen Kultur hergestellt wurde;
3 ein Schaubild, in dem der Einfluss der Drehzahl der Scheiben in dem rotierenden Plattenfilmbioreaktor auf die Produktionsrate an mikrobieller Zellulose dargestellt ist;
4 ein Schaubild, in dem der Einfluss der anfänglichen Zuckerkonzentration in dem rotierenden Plattenfilmbioreaktor auf die Produktionsrate an mikrobieller Zellulose dargestellt ist;
5 ein Schaubild, in dem die Zuckerkonzentration und das Zellulosefilmwachstum während eines Zufuhr-Batchbetriebs des rotierenden Plattenbioreaktors dargestellt sind; und
6 ein Schaubild, in dem der Einfluss des Betriebs-pH-Wertes auf die Zelluloseherstellung während eines Batch-Betriebs des rotierenden Plattenbioreaktors dargestellt ist.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
In der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung werden Besonderheiten des in 1 dargestellten rotierenden Plattenfilmbioreaktors diskutiert. Dieser Scheibentyp 12, der bei dem biologischen Reaktor 10 gemäß der Erfindung eingesetzt wird, weist eine geeignete Maschengröße auf, um eine Überbrückung zwischen den zwei Filmen, die sich auf beiden Seiten der Scheibe entwickeln, zu ermöglichen. Es wird zur Ausführung der vorliegenden Erfindung bevorzugt, dass die Scheibe die Form eines Maschen- oder Lochblechs hat, das aus rostfreiem Stahl oder polymeren Werkstoffen mit ausreichender Festigkeit gefertigt ist.
Die Größe bzw. der Durchmesser der Scheibe entspricht einem ausgewählten prozentualen Anteil des Durchmessers des Zylinders 20 des zylindrischen biologischen Reaktors 10, der die Scheibe enthält, wobei 80% bis 90% des Durchmessers des zylindrischen Trogs wünschenswert sind. Der mit "G" bezeichnete Abstand zwischen den Scheiben 12, die auf der Welle 14 sitzen, ist so klein wie möglich, um den verfügbaren Bereich für das Wachstum der Zellulose erzeugenden Organismen und die Produktion mikrobieller Zellulose durch diese Organismen zu maximieren. Die Grenzwert für diesen Abstand entspricht der abschließenden Dicke des bakteriellen Zellulosehäutchens am Ende der Fermentierung.
Die zylindrische Gestalt des biologischen Reaktors 10 wird gewählt, um die Menge an biologischem Medium 16 zu minimieren, die zur Benetzung der rotierenden Scheibe während der Rotation erforderlich ist. Eine Vergrößerung des rotierenden Plattenfilmbioreaktors kann durch Vergrößerung entweder der Länge des zylindrischen Trogs oder des Zylinders 20 oder des Durchmessers des zylindrisches Trogs oder beides realisiert werden. Dies erhöht wiederum die Anzahl an Scheiben 12 und den für das Zellwachstum und die Zelluloseherstellung verfügbaren Flächenbereich, der in dem biologischen Reaktor vorhanden ist.
Die Welle 14, die die in der zylindrischen Wanne 20 enthaltenen Scheiben 12 verbindet und trägt, ist in der Mitte der Scheiben angeordnet, könnte aber auch im Außenbereich der Scheiben angeordnet sein, wenn eine Gruppe von Scheiben vorliegen würde. Ein hermetisch dichtendes Lager 22 wird verwendet, um die Welle 14 mit einer extern angeordneten Dreheinrichtung 18 zu verbinden. Die bevorzugte Dreheinrichtung ist ein Elektromotor. Die Drehzahl der Scheiben 12, die in dem biologischen Reaktor 10 enthalten sind, sollte einen wirksamen Wert haben, der teilweise von dem Durchmesser der eingesetzten Scheibe abhängt. Geeignete Drehzahlen liegen in dem Bereich zwischen 1 rpm und 60 rpm, vorzugsweise zwischen 6 und 12 rpm. Jeder geeignete Verbindungsmechanismus, wie eine Auswahl von Getrieben zur Betätigung mehrerer rotierender Wellen, die mit Scheiben bestückt sind, die in mehreren zylindrischen biologischen Reaktoren enthalten sind und die einen Motor nutzen, kann für einen Mehrreaktorbetrieb vorgesehen sein. Solch eine Anordnung mehrerer biologischer Reaktoren kann die Gesamtproduktionskapazität erhöhen.
Der zylindrische Trog 20 nach der vorliegenden Erfindung weist Öffnungen 24 zur Befestigung von Messfühlern 26 zur Messung von Reaktorbedingungen, wie pH-Wert und Temperatur, auf. Die Öffnungen können in der unteren Hälfte des zylindrischen Trogs 20 angeordnet sein, der das biologische Medium 16 enthält. Proben- und Ablauföffnungen 28 sind ebenfalls in dem Aufbau enthalten. Der Gesamtaufbau des biologischen Reaktors gemäß dieser Erfindung kann luftdicht ausgeführt sein, so dass eine Sauerstoffzufuhr möglich ist, wodurch ein positiver Druck in dem Reaktor zwecks erhöhter Zelluloseproduktion aufrecht erhalten wird (Schramm et al., 1954) und eine Kontamination durch nicht-sterile Luft von außen verhindert wird.
Die Verwendung des rotierenden Plattenfilmbioreaktors bietet einige Vorteile gegenüber bestehenden Prozessen und Verfahren zur Herstellung mikrobieller Zellulose. Die vorliegende Erfindung weist neben der Fähigkeit zur Erzeugung einer häutchenbildenden mikrobiellen Zellulose die Fähigkeit zur Modifizierung des Zellulosefilms, während dieser in dem Bioreaktor synthetisiert wird, auf. Durch Steuerung der Medienbedingungen und -zusammensetzung ist es nicht nur möglich, die Zelluloseproduktion in dem biologischen Reaktor zu optimieren, sondern es wird auch die Aufnahme unterschiedlicher Typen von Polymeren/Additiven in das sich entwickelnde Zellulosehäutchen ermöglicht. Derartige Modifikationen in dem Medium wären bei einem statischen Kultivierungssystem sehr schwer durchzuführen. Die Zugabe von Polymeren/Additiven zu den kontinuierlichen Schichten an wachsender Zellulose kann bei dem rotierenden Plattenfilmreaktor leichter durchgeführt werden als bei gerührten Tieftankbioreaktorsystemen nach dem Stand der Technik. Die Bildung von Zellulose durch extrazellulare Zellulose erzeugende Organismen erfolgt an dem Luft/Flüssigkeits-Übergang, und die Zelluloseproduktion ist direkt proportional zu der Fläche dieses Übergangs (Masaoka, S., Ohe, T. und Sakota, M., Production of Cellulose from Glucose by Acetobacter xylinum, Journal of Fermentation and Bioengineering, 74 Nr. 1, 18–22 (1993)). Im Vergleich zu statischen Zuchtverfahren stellt die vorliegende Erfindung eine höhere Größenordnung größerer Flächenbereiche für den Flüssigkeitsvolumenanteil, der für ein bakterielles Zellulosefilmwachstum verfügbar ist, bereit. Eine Maßstabsvergrößerung der vorliegenden Erfindung kann leicht erreicht werden durch Vergrößerung der Länge des zylindrischen Trogs oder durch Verwendung einer Scheibe mit größerem Durchmesser, wodurch der Bereich für das Zellwachstum und die Zelluloseproduktion vergrößert wird. Die modulare Beschaffenheit des im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen biologischen Reaktors ermöglicht die Steigerung der Produktionskapazität durch Erhöhung der Anzahl der im Betrieb befindlichen Module/Bioreaktoren. Verluste infolge von Kontamination können dann durch diesen modularen Aufbau der vorliegenden Erfindung minimiert werden.
Jeder bakterielle Stamm, der zur Produktion extrazellularer mikrobieller Zellulose geeignet ist, kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Geeignete Stämme umfassen diejenigen, die zu der Gattung Acetobacter gehören, beispielsweise Stämme der Spezies Acetobacter xylinum, wie die Stämme ATCC 10245, 23769. Das Inokulum kann durch Inkubieren der extrazellulare Zellulose erzeugenden Organismen präpariert werden, die aus einer wachsenden Kultur auf einer Agarschräge (agar slant) gewonnen werden, und zwar in einem geeigneten Medium bei einer wirksamen Temperatur von etwa 25 bis 35°C, vorzugsweise bei 30°C. Die Inkubationszeit liegt zwischen drei und fünf Tagen in Abhängigkeit von der Größe des verwendeten Inokulums. Nach der Aufzucht wird das resultierende mikrobielle Zellulosehäutchen eingeweicht, um die Zellulose erzeugenden Zellen freizugeben. Vor dessen Zufuhr in den Reaktor wird das Inokulum üblicherweise zentrifugiert oder filtriert, um die Zellen von der Zellulose zu trennen. Die Medien für den Reaktor können getrennt in einem Autoklaven unter geeigneten Bedingungen für eine wirksame Zeitdauer sterilisiert werden, um eine weitgehende Sterilisation zu erreichen. Der gesamte biologische Reaktor und die Inhalte können in einem temperaturgesteuerten Raum bei einer geeigneten Temperatur, vorzugsweise bei 30°C, angeordnet werden. Ein steriles sauerstoffhaltiges Gas kann während des Wachstums der extrazellulare Zellulose erzeugenden Organismen und während der Herstellung von mikrobieller Zellulose durch diese Organismen eingeleitet werden.
Wenn der biologische Reaktor im Zufuhr-Batchmodus betrieben wird, wird zusätzliches Medium im Verlauf der Fermentation in den Reaktor eingeleitet. In Abhängigkeit von den Anforderungen an das in dem Reaktor zu erzeugende Produkt können die Zusammensetzung und der Zustand des Mediums entsprechend verändert werden. Wenn eine kontinuierliche Fermentierung gewünscht ist, kann, nachdem sich ausreichend Zellulosefilm an den Platten ausgebildet hat, die erzeugte Zellulose abgekratzt und geerntet werden. Der Ablauf kann dann fortgesetzt werden, um Wachstum und Anlagerung der Zellulose erzeugenden Organismen an die Scheibe zu ermöglichen. Zusätzlicher Nährstoff und Inokulum können in Abhängigkeit von den Anforderungen des Reaktors zugegeben werden. Die Betriebsbedingungen, wie Drehzahl und pH-Wert, sind im Abschnitt „Zusammenfassung der Erfindung" ausgeführt.
Nachdem somit die Erfindung beschrieben ist, werden die nachfolgenden Beispiele nur zu Erläuterungszwecken angeführt, wobei sie in keiner Weise als Beschränkung der Erfindung verstanden werden sollen.
Beispiel 1
Vergleich der Zelluloseerzeugung in statischen Kulturen und in einem rotierenden Plattenfilmbioreaktor (RDFB)
Bei dem extrazellulare Zellulose erzeugenden Mikroorganismus handelt es sich um einen Acetobacter-xylinum-Stamm, der von dem National Science and Research Institute der University of Philippines, Quezon City, Philippinen, bezogen wurde. Der Mikroorganismus wird auf Tomatenserumbrühe in Agarschrägen gehalten und monatlich umgesetzt. Die Zusammensetzung des Mediums der Haltekultur (TSB) ist wie folgt: 50 g/l Saccharose oder Glukose, 50 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Bactopepton, 10% v/v Tomatenserum, 1 g/l K₂HPO₄, 0,2 g/l MgSO₄·7H₂O, und 0,1 g/l NaCl, pH = 5. Die Zelluloseerzeugungsrate in Tomatenserumbrühe (TSB) wird regelmäßig überprüft, um sicherzustellen, dass keine Veränderung oder Verunreinigung stattgefunden hat.
Keimteströhrchen, die 25 ml an 50 g/l Glukose, 5 g/l Bactopepton und 5 g/l Hefeextrakt (GYP-Medium) enthalten, werden mittels Agarschrägen geimpft. Die Kulturen in den Teströhrchen werden drei Tage lang bei 30°C ohne Schütteln herangezogen und dann in einen 250-Erlenmeyer-Kolben überführt, der 150 ml GYP-Medium enthält. Nach drei Tagen statischer Kultur werden die Keimkolben verwendet, um sowohl die statischen Kolbenkulturen als auch den rotierenden Plattenfilmreaktor auf einem Level von 15% v/v zu impfen.
Ein Teil des geimpften GYP-Mediums wird in die Kolben der statischen Kultur überführt, die als Kontrollen dienen, und der Rest wird verwendet, um den rotierenden Plattenfilmbioreaktor bis zu der die Hälfte kennzeichnenden Markierung zu füllen. Sowohl die statischen als auch die rotierenden Kulturen werden bei 30°C herangezogen, und Proben werden jeden Tag entnommen.
Um die Zelluloseproduktion zu messen, werden die Häutchen in der statischen Kultur und der an der rotierenden Scheibe ausgebildete Film geerntet und dann mit entionisiertem Wasser gespült. Beide werden dann einer heißen 2%-igen NaOH-Lösung 30 Minuten lang ausgesetzt, um die in dem Häutchen eingebetteten Zellen auszulösen. Die nassen Zellulosehäutchen werden dann in entionisiertem Wasser eingeweicht, bis die Farbe weiß oder transparent wird, und dann über Nacht bei 55°C getrocknet. Die resultierenden, getrockneten Zellulosefilme werden gewogen (Daten in 2 dargestellt).
Beispiel 2
Vergleich des Wassergehalts eines statisch erzeugten und in einem rotierenden Plattenbioreaktor erzeugten mikrobiellen Zelluloseprodukts
Der Wassergehalt der nach den beiden Verfahren hergestellten, mikro biellen Zellulose wird durch Messung des Nassgewichts und des Trockengewichts der beiden Zelluloseprodukte verglichen. Die mikrobiellen Zellulosehäutchen für diese Studie werden aus einer fünf Tage alten Kultur unter Verwendung eines GYP-Mediums gewonnen. Nach dem Ernten der Häutchen sowohl in dem statischen als auch in dem rotierenden Bioreaktor werden die Zelluloseprodukte unter Verwendung von entionisiertem Wasser und 2%-igem NaOH, wie vorstehend erwähnt, gesäubert.
Das Nassgewicht des mikrobiellen Zelluloseprodukts wird durch Entwässern des wassergetränkten Häutchens während 5 Minuten und anschließende Gewichtsermittlung gemessen. Das Trockengewicht wird nach Trocknung des nassen Häutchens bei 55°C über Nacht gemessen. Die Ergebnisse zeigen an, dass mikrobielle Zellulose, die unter statischen Bedingungen gewonnen wurde, typischerweise ein Verhältnis von trockener Zellulose zu nasser Zellulose von etwa 1 : 100 aufweist. Die mikrobielle Zellulose, die durch den rotierenden Plattenbioreaktor hergestellt wurde, weist ein Verhältnis von 1 : 200 auf, was zeigt, dass sie stärker gelatisiert ist und ein höheres Wasserabsorptionsvermögen als das statisch gewachsene Häutchen besitzt.
Beispiel 3
Einfluss der Drehzahl auf die Zelluloseerzeugung in einem RDFB
Mehrere einen Liter fassende rotierende Plattenbioreaktoren werden mit dem gleichen geimpften GYP-Medium beschickt und bei 30°C inkubiert. Jeder Reaktor hat eine andere Drehzahl, die in den Bereich von 20 bis 30 rpm fällt. Die Dicke des sich entwickelnden Films, die direkt proportional zu der Menge an erzeugtem Zelluloseprodukt ist, wird für jede Drehzahl täglich gemessen. Die in 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass für die Scheibengröße, die in jedem der Reaktoren verwendet wurde (12 cm Durchmesser), die Drehzahl, die schnelles Filmwachstum anzeigt, zwischen 12 und 30 rpm, vorzugsweise bei 12 rpm liegt. Obwohl eine optimale Drehzahl für eine 12 cm-Scheibe ermittelt wurde, kann solch eine wünschenswerte Drehzahl in Abhängigkeit von der Größe der verwendeten Scheibe variieren. Eine Berechnung der Umfangsgeschwindigkeit für jede Scheibengröße kann bei der Bestimmung der geeigneten Drehzahl für eine gegebene Scheibengröße hilfreich sein.
Beispiel 4
Einfluss unterschiedlicher, anfänglicher Zuckerkonzentrationen auf die Zelluloseerzeugung
Der Einfluss der anfänglichen Zuckerkonzentration in dem Medium auf die Zelluloseerzeugung in einem im Batch-Betrieb arbeitenden, rotierenden Plattenbioreaktor wird untersucht. Mehrere Reaktoren, die Medium mit unterschiedlichen anfänglichen Zuckerkonzentrationen enthalten, die in dem Bereich zwischen 5 g/l bis 100 g/l liegen, werden fünf Tage lang betrieben. Die anderen Komponenten werden gleichgehalten, wobei die Produktionsrate an Zellulose für jeden Bioreaktor durch Messen der Dicke des an den Scheiben entwickelten Films verglichen wird. Wie vorstehend erwähnt, ist die Filmdicke direkt proportional zur Menge an erzeugter Zellulose. Wie 4 zu entnehmen ist, zeigen die Ergebnisse, dass oberhalb von 25 g/l ein Anstieg der Zuckerkonzentration nicht einem Anstieg der Zelluloseproduktion während der fünf Tage dauernden Aufzuchtzeit entspricht. Jedoch kann eine ungeeignete Menge an Zucker, wie beispielsweise 5 g/l, die Zelluloseproduktion beeinträchtigen. Daher sollte, um die Menge an erzeugter Zellulose zu maximieren, ein bestimmter Wert einer Zuckerkonzentration in dem Bioreaktor während der gesamten Fermentierung aufrecht erhalten werden. Solch eine Zuckerkonzentration liegt zwischen 5 g/l und 25 g/l.
Beispiel 5
Zufuhr-Batchbetrieb des rotierenden Plattenbioreaktors mit Steuerung der Zuckerkonzentration
Der rotierende Plattenbioreaktor wird im Zufuhr-Batchmodus betrieben, wobei Zucker im Verlauf der Fermentierung zugegeben wird, um ein bestimmtes Level einer Zuckerkonzentration in dem Reaktor aufrecht zu erhalten. Für unsere Zwecke werden zwei Reaktoren gleichzeitig betrieben, wobei in einem eine Zuckerkonzentration von 25 g/l und in dem anderen eine Zuckerkonzentration von 10 g/l aufrecht erhalten wird. Die Zuckerkonzentrationen werden unter Verwendung eines YSI-Glukose-Analysators überwacht. Auf Grundlage der zwei durchgeführten Läufe (5) werden ähnliche Zelluloseproduktionsraten für beide aufrecht erhaltenen Konzentrationen beobachtet, wie durch nahezu gleiche Filmwachstumsraten auf den Platten dargestellt. Um die Menge an vergeudetem Zucker zu verringern, wodurch der Ertrag an Zellulose pro g Zucker vergrößert wird, wird eine Konzentration von 10 g/l in dem Bioreaktor bevorzugt.
Beispiel 6
Einfluss des Betriebs-pH auf die Zelluloseproduktion beim Batch-Betrieb des rotierenden Plattenbioreaktors
Die Produktionsrate an Zellulose wird sehr stark durch den Betriebs-pH des Mediums beeinflusst (Masaoka, 1993). Um diesen Effekt in dem Bioreaktor zu zeigen, werden zwei einen Liter fassende, rotierende Plattenbioreaktoren gleichzeitig betrieben, wobei in einem ein pH-Wert von 5 aufrecht erhalten wird und der andere keine pH-Steuerung hat. Die pH-Einstellung erfolgt durch die Zugabe von Base, wie verdünntem NaOH, während des Fermentierungslaufs. Die gemessene Filmwachstumsrate wird verwendet, um die Zelluloseproduktionsrate, wie vorstehend, anzugeben. Wie 6 zu entnehmen ist, zeigen die Ergebnisse, dass durch das Aufrechterhalten des pH-Werts in dem Reaktor auf dem wünschenswerten Level, wie z. B. einem pH-Wert von 5, eine erhöhte Zelluloseproduktion erreicht werden kann.
Obwohl eine spezielle Ausführungsform der Erfindung gezeigt und detailliert beschrieben wurde, um die Anwendung der Grundsätze der Erfindung darzustellen, versteht es sich, dass die Erfindung anderweitig ausgeführt werden kann, ohne diese Grundsätze zu verlassen.

Claims

Häutchenbildende mikrobielle Zellulose, dadurch hergestellt, dass a) ein Medium, welches einen Cellulose produzierenden Mikroorganismus enthält, in einem rotierenden Plattenbioreaktor aerob inkubiert wird.
Häutchenbildende mikrobielle Zellulose gemäß Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus zu der Gattung Acetobacter gehört.
Häutchenbildende mikrobielle Zellulose gemäß Anspruch 2, wobei der Mikroorganismus zu der Art Acetobacter Xylinium gehört.
Häutchenbildende mikrobielle Zellulose gemäß Anspruch 2, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Acetobacter Xylinium Stämmen TCC 10245, ATCC 23769 und ATCC 1082.
Häutchenbildende mikrobielle Zellulose gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei diese ein Gewichtsverhältnis von Zellulose zu absorbiertem Wasser von annähernd 1 : 200 aufweist.
Häutchenbildende mikrobielle Zellulose gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei jenes Verhältnis 1 : 200 beträgt.
Häutchenbildende mikrobielle Zellulose gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend einen Film.
Häutchenbildende mikrobielle Zellulose gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei in diese ein Wirkstoff eingearbeitet ist.
Häutchenbildende mikrobielle Zellulose gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei in diese ein Polymer eingearbeitet ist.
Häutchenbildende mikrobielle Zellulose gemäß Anspruch 7, wobei der Film eine Dicke von etwa 20 bis 30 mm aufweist.
Ein Verfahren zur Herstellung einer stark hydratisierten häutchenbildenden Zellulose, wobei diese ein Gewichtsverhältnis von Zellulose zu absorbiertem Wasser von annähernd 1 : 200 aufweist, umfassend a) aerobes Inkubieren eines Mediums, welches einen Zellulose produzierenden Mikroorganismus enthält in einem rotierenden Plattenbioreaktor, um die hydratisierte häutchenbildende Zellulose herzustellen.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 11, weiter umfassend b) das Sammeln der hydratisierten häutchenbildenden Zellulose.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 11 oder 12, wobei der Reaktor a) eine Vielzahl von Scheiben umfasst, welche auf einer rotierenden Welle montiert sind, wobei die Scheiben eine Maschengröße aufweisen, die für das Festhalten und das Wachstum von Organismen, welche extra-zelluläre mikrobielle Zellulose produzieren, sowie für die Produktion von extra-zellulärer mikrobieller Zellulose ausgelegt sind; b) eine Mulde umfasst, die dafür angepasst ist, das Medium zu enthalten und mindestens einen Teil der Scheiben einzutauchen; und c) einen rotierenden Antrieb umfasst, welcher an jene Welle angeschlossen ist.
Ein Verfahren gemäß den Ansprüchen 11 bis 13, wobei der Mikroorganismus zu der Gattung Acetobacter gehört.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei der Mikroorganismus zu der Art Acetobacter Xylinium gehört.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Acetobacter Xylinium Stämmen ATCC 10245, ATCC 23769 und ATCC 1082.
Ein Verfahren gemäß den Ansprüchen 11 bis 16, wobei die stark hydratisierte häutchenbildende Zellulose einen Film umfasst.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei der Film eine Dicke von etwa 20 bis 30 mm aufweist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 18, wobei das Verfahren mittels eines Prozesses durchgeführt wird, welcher ausgewählt ist aus Batchverarbeitungsprozessen, Zufuhr-Batchverarbeitungsprozessen und kontinuierlichen Prozessen.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 19, wobei das Medium einen Zusatzstoff umfasst, der in die hoch hydratisierte häutchenbildende Zellulose eingearbeitet wird.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 20, wobei das Medium ein Polymer umfasst, welches in die hoch hydratisierte häutchenbildende Zellulose eingearbeitet wird.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, welche eine häutchenbildende mikrobielle Zellulose umfasst, wobei diese ein Gewichtsverhältnis von Zellulose zu absorbiertem Wasser von annähernd 1 : 200 aufweist, umfassend a) das aerobe Inkubieren eines Zellulose produzierenden Mikroorganismus in einem rotierenden Bioreaktor, um die häutchenartige mikrobielle Zellulose herzustellen, wobei der Bioreaktor eine Vielzahl von Scheiben umfasst, welche auf einer drehbaren Welle montiert sind, und die Scheiben eine Maschengröße aufweisen, die für das Festhalten und die Produktion von häutchenbildender mikrobieller Zellulose ausgelegt sind, wobei die Zellulose produzierenden Mikroorganismen auf einer oder mehr Scheiben gehalten werden, und wobei die Scheiben rotieren, um wechselweise die Zellulose produzierenden Mikroorganismen in einer Flüssigkeit unterzutauchen bzw. die Zellulose produzierenden Mikroorganismen durch ein sauerstoffhaltiges gasförmiges Medium durchlaufen zu lassen.