WO2013113675A1 - Verfahren zur herstellung von hohlkörpern aus mikrobieller cellulose - Google Patents

Verfahren zur herstellung von hohlkörpern aus mikrobieller cellulose Download PDF

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WO2013113675A1
WO2013113675A1 PCT/EP2013/051628 EP2013051628W WO2013113675A1 WO 2013113675 A1 WO2013113675 A1 WO 2013113675A1 EP 2013051628 W EP2013051628 W EP 2013051628W WO 2013113675 A1 WO2013113675 A1 WO 2013113675A1
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hollow body
cellulose
hollow
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Wolfgang Fried
Dieter Klemm
Victoria Kopsch
Daniel Koth
Friederike Kramer
Sebastian Moritz
Thomas Richter
Dieter Schumann
Ulrike Udhardt
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Kkf Ug
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    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/20—Polysaccharides
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Definitions

  • the invention relates to a method for producing a hollow body of microbial cellulose and a hollow body of microbial cellulose, which is obtainable by the method.
  • prostheses made of synthetic polymers are used today in clinical practice next to the body's own vessels.
  • the preparation of endogenous vessels means additional surgery for the patient, which also involves
  • Dacron® and Teflon® used in general vascular and thoracic surgery for the replacement of large-lumen vessels (vessel diameter> 6mm) such as the aorta or the
  • Pelvic arteries (lliacal arteries) are less susceptible due to significant thrombogenicity, inadequate mechanical strength
  • All natural blood vessels are more or less elastic tubes with an endothelial lining.
  • the structure of the vessel walls corresponds in their quantitative and qualitative nature to the different functions of the individual
  • the tunica intima consists of a smooth, lumen-sided endothelium layer of elongated cells arranged parallel to the blood flow direction and an underlying connective tissue. She is using the bloodstream directly
  • the tunica media is the middle wall layer. It consists of tightly packed
  • tunica externa is the outer thin connective tissue layer that anchors the vessel in the surrounding tissue. In this layer are smaller blood vessels for the nutrition of the vessel wall (exception intima) and nerve plexuses.
  • Cardiac arteries must withstand very high pressure loads. They are of the "elastic” type, ie their media consists of alternating layers of elastic membranes and smooth muscles. The arrangement of the elastic elements in intersecting spiral systems allows the circular and longitudinal, rhythmic stretching of the vessel (elastic deformability) in the lower arteries In the vessels of the "muscular” type, the elastic components decrease, the muscular ones decrease until the elastic material is limited to the internal and external lamina. The vessels are thus able to adapt to the prevailing blood pressure conditions (Roche Lexikon Medizin, ed. Hoffmann-La Roche AG and Urban &
  • a vascular graft also referred to as a vascular graft, should therefore meet the following requirements:
  • biomimetic structure biomimetic structure. It should be biocompatible, ie it must not have thrombogenicity and immunogenicity. It should be resistant to infection and integrated into the body, so ideally the blood vessel implant can no longer be distinguished from the native one.
  • the inner surface of the implant should be such that it has no thrombogenic properties, allows the attachment of the body's own endothelial cells and the formation of a smooth confluent endothelial layer in the artificial vessel.
  • the wall of the implant should allow a mass transfer, comparable to the natural exchange processes.
  • vascular implants which correspond in terms of structure, properties and functionality of a biomimetic and bioactive implant and their dimensions (inner diameter of about 1 - 30 mm, length of 5 - 500 mm) can be varied with respect to the application, are not yet known.
  • Bacterial Nanocellulose (BNC) also known as microbial cellulose and discussed later in this description - offers excellent performance due to its excellent performance
  • BNC Material properties ideal conditions for use as a vascular implant with the requirements described above.
  • BNC differs in its morphology clearly from the cellulose of plant origin. It consists of fibers with a diameter in the nanometer range (20- 100nm), which are 100 times finer than conventional plant cellulose fibers (pulp).
  • the natural nanofiber network shows a skeletal structure comparable to human tissue (collagen). It contains up to 99% water and is able to interact intensively with the environment.
  • BNC is also in wet condition mechanically stable.
  • BNC is a high-purity polymer, free of plant-derived components such as lignin, pectin and hemicelluloses. It is characterized by a high molecular weight (degree of polymerization of about 4,000 - 10,000) and high
  • BNC Crystallinity (80-90%). BNC is not degraded in the human and mammalian organism, triggers no defense reactions of the body and is effectively colonized by the body's own cells (Klemm D, Kramer F, Moritz S, Lindström T, Ankerfors M, Gray D, Dorris A: Nanocelluloses: a new family of nature-based materials, Angew. Chem. Int. Ed. (201 1) 50, 5438-5466).
  • Several methods are known to form bacterial nanocellulose (BNC), in particular as a hollow body for surgical applications such as blood vessels or tissue implants. According to the described molding process
  • microbial cellulose can be formed directly in the production process, in particular to form a hollow body.
  • EP 396 344 A3 describes the production of a microbial cellulose hollow body by means of two glass tubes of different diameters. The glass tubes are inserted into each other, and in the space between the two tube walls, the cultivation of the cellulose-forming microorganism is carried out statically within 30 days. This method is done according to the so-called horizontal static
  • the result is a microbial cellulose with a hollow cylindrical shape.
  • the example shows, e.g. by means of thrombogenesis, that the inner
  • Walls of the cultivation vessel used This process can be used to form surface inhomogeneities, e.g. Cause wrinkles.
  • the use as a vascular prosthesis is therefore rather questionable.
  • WO 01/61026 A1 / US2003013163 discloses a production method for shaped biomaterials, in particular for microsurgical applications as a replacement for Blood vessels 1-3 mm in diameter and smaller.
  • the preparation of a cellulose hollow body by means of two glass tubes of different diameters, which dive into the inoculated with the cellulose-forming bacteria nutrient solution, so that the nutrient solution is drawn into the space of the glass matrix by capillary force and Nähratess- and air circulation is possible.
  • a moist, aerobic environment for cellulose formation is ensured throughout the cultivation process. After 7-14 days of cultivation it forms in the culture vessel
  • WO2007 / 093445A1 / US200901 1 161 describes a process for producing a long cellulose hollow body by culturing a cellulose-forming organism in the interior of a hollow shaped body and growing the long cellulose hollow body in this interior space.
  • a process for producing a long cellulose hollow body by culturing a cellulose-forming organism in the interior of a hollow shaped body and growing the long cellulose hollow body in this interior space.
  • the invention is dispensed with the rotational symmetry about the cylindrical axis of the hollow cylindrical interior by the
  • Cellulose hollow body not along the longitudinal axis of an interior but in the
  • Cellulose hollow body is no longer limited by the layer thickness, which can be achieved by the static growth process and so any desired length is conceivable.
  • the disadvantage of this method is on the one hand in the production cost.
  • a usual static culture to build a cellulosic layer is carried out for 7-10 days.
  • the hollow molded body is placed with the appropriate openings on the growing and supported with a carrier network cellulose layer so that the bacteria penetrate into the hollow body from the outside and the cellulose under
  • the structural conditions of the shaped body vary both longitudinally and perpendicular to the axis. Diffusion processes of the culture solution to Biosyntheseort by the primary structure of cellulose layer and the secondary building up
  • the isolated hollow cellulose bodies are characterized dimensionally stable as well as insufficiently mechanically stable, resulting in great problems, e.g. the pressure stability leads.
  • the inner and outer boundary of the cellulose hollow body are therefore to be regarded as inhomogeneous and unstable, so that the inner and externa ßere wall can not or not evenly counteract an applied pressure.
  • the lumen is dilated, it creates bumps and hollows, which should favor the formation of thrombi.
  • the educational process described in the patent is very difficult to reproduce and hardly to realize the production of large quantities.
  • shaped microbial cellulose is built up on gas-permeable materials (eg PVC, cellulose, cellulose derivatives, polyethylene, silicone, PTFE) in that one side of the material is in contact with an oxygen-containing gas and the other with the nutrient solution, so that the microbial cellulose is formed on this side and then isolated.
  • gas-permeable materials eg PVC, cellulose, cellulose derivatives, polyethylene, silicone, PTFE
  • Dialysis tubing cylindrically shaped microbial cellulose. If, however, an air-filled dialysis tube is placed in a closed vessel filled with culture solution After 3 days of cultivation, a coating of the permeable material with a thin layer of cellulose is found.
  • Cellulose hollow body also includes cultivating a cellulose-producing microorganism on the inner and / or outer surface of an oxygen-permeable hollow support made of cellophane, Teflon, silicone, ceramic or a nonwoven or a woven material.
  • a cellulose-producing microorganism on the inner and / or outer surface of an oxygen-permeable hollow support made of cellophane, Teflon, silicone, ceramic or a nonwoven or a woven material.
  • Microorganism and a culture medium are supplied to the inner and / or outer side of the hollow carrier.
  • the cultivation is carried out under supply of an oxygen-containing gas (or liquid) also on said inner and / or externa ßeren side of the hollow carrier. It forms a gelatinous cellulose with a layer thickness of 0.01 to 20 mm at the surface of the hollow carrier. Due to the interaction of the cellulose-producing microorganism, the produced cellulose and the hollow carrier, a composite of cellulose and hollow carrier is formed within 1-2 months. If the cellulose is not bound to the carrier, this will be removed after the synthesis of the cellulose. A hollow shaped article consisting solely of cellulose can be obtained.
  • WO 2008/040729 A2 describes a method for producing cellulose hollow bodies by culturing cellulose-producing microorganisms on the outer, uniformly smooth surface of a highly oxygen-permeable, non-porous hollow support such as dimethyl silicone, vinylmethyl silicone, fluorosilicone, diphenyl silicone, nitrile silicone).
  • a highly oxygen-permeable, non-porous hollow support such as dimethyl silicone, vinylmethyl silicone, fluorosilicone, diphenyl silicone, nitrile silicone.
  • the interior of the hollow carrier is supplied with an oxygen-containing gas whose oxygen content is above that of the atmospheric oxygen (preferably 100% oxygen), so that the cellulose-producing microorganism is supplied continuously and to the necessary extent with oxygen.
  • the oxygen partial pressure is also varied.
  • cellulose hollow bodies of various dimensions and shapes, as well as branches intended for use in human and animal surgery for the replacement or repair of internal hollow organs such as the urethra, ureter, trachea, digestive tract, lymphatic vessels or blood vessels.
  • the cellulose hollow bodies are made of individual layers parallel to the
  • Bodin et al. Bodin A, Bburgdahl H, Fink H, Gustafsson L, Risberg B, Gatenholm P:
  • Diameter e.g., 1.5-6.0 mm
  • branches to produce.
  • Hollow body A stress-strain test indicates that the hollow bodies are made up of layers that are not firmly joined together, as indicated by different peaks in the stress-strain diagram in FIG. 8.
  • Oxygen permeable membranes are comparable to static horizontal culturing. By contrast, the biosynthesis does not take place directly at the
  • BNC formation is no longer restricted to one direction only, but takes place in all spatial directions.
  • the construction of BNC bodies with almost unlimited hollow body length / dimension is thus possible, but are due to the diffusion-controlled nutrient transport and the material-specific
  • the surface of these discs forms a highly gelatinized and highly hydrated cellulose, which differs significantly from microbial cellulose, which was prepared under static conditions.
  • this cellulose is characterized by a looser structure and a higher water absorption capacity and reduced mechanical characteristics (modulus of elasticity, tensile strength).
  • the external forces caused by the rotational movement during cultivation cause disturbances in the entire crystallization process and thus a looser and more disordered BC fiber structure.
  • Cellulosic product (film, tubing, fiber), which involves the preparation of a cellulose solution of non-bacterial and bacterial cellulose in an amine oxide solvent.
  • the proportion of bacterial cellulose affects the mechanical properties of the final products.
  • the formation of said products is carried out by a purely technical process.
  • the necessary dissolution process destroys the unique structure of the bacterial cellulose.
  • the invention is based on the object to provide an improved method, whereby hollow body of microbial cellulose can be produced.
  • the hollow body should be possible to produce in any form.
  • One or more of these objects are achieved by a method of producing a microbial cellulose hollow body and a microbial cellulose hollow body as set forth in the independent claims or with advantageous embodiments of the invention as specified in the subclaims.
  • Another object of the invention is to provide an improved apparatus and method whereby hollow bodies of high strength and high biocompatibility can be made from a microbial polymer, especially microbial cellulose. If possible, the production in large quantities should be feasible with the least possible effort.
  • the cultivation times should be as short as possible, preferably up to a maximum of 7 cultivation days.
  • the hollow body should continue to be produced in any form.
  • One or more of these objects are achieved with an apparatus and a method of manufacturing a hollow body of a microbial polymer as specified by this specification. Disclosed is a process for producing a microbial cellulose hollow body comprising the following steps:
  • step c) bringing the microbial cellulose obtained in step c) into contact with the mixture reservoir
  • Liquid film remains, the liquid culture medium and the
  • Liquid film wherein the sequence of steps d), e) and f) is optionally repeated one or more times, g) optionally the separation of the microbial cellulose from the template.
  • microbial cellulose refers to a cellulose produced by a
  • Microorganism is produced.
  • Exemplary microorganisms are fungi, bacteria and algae.
  • a number of microorganisms are able to produce cellulose. These include, but are not limited to, algae such as Valonia and Boergesenia, fungi such as Dictyostelium discoideum and bacteria such as Gluconacetobacter, Enterobacter,
  • Gluconacetobacter species are Acetobacter xylinum, Acetobacter pasturianus,
  • Acetobacter aceti Acetobacter ransens.
  • a particularly suitable microorganism is Gluconacetobacter, in particular Gluconacetobacter xylinus.
  • Microbial cellulose is conventionally produced by microorganisms at the interface between air and, for example, a D-glucose-containing nutrient medium in the form of a biofilm (fleece). The bacteria expel the cellulose as fibrils. These are combined into fibers. The interweaving of the fibers results in a three-dimensional, highly hydrous nanofiber network consisting of about 99% water and 1% cellulose (Jonas R, Farah LF: Production and application of microbial cellulose.) Polym. Degrad. Stab (1998), 59 (1 -3), 101-106; Hirai A, Horii F: Cellulose assemblies produced by Acetobacter xylinum.
  • the culture medium also referred to as "nutrient solution” or “nutrient medium” contains conventional ingredients for culturing a cellulose-producing microorganism, such as
  • Glucose, peptone, yeast extract, sodium hydrogen phosphate and citric acid in aqueous solution (Hestrin-Schramm medium).
  • An alternative acidic medium consists of an aqueous solution of glucose, peptone, yeast, acetic acid and ethanol.
  • the process is preferably carried out at a temperature of 20 to 40 ° C.
  • Microwave Cellulose if made by bacteria, is also used with the
  • bacterial cellulose and “bacterial nanocellulose” (BNC).
  • bacterial nanocellulose is derived from the fact that bacterially produced cellulose forms a nanofiber network as mentioned above.
  • the inner wall of the molded body is developed without limit but in constant contact with the culture solution "free” in the room and represents the original (oldest) and looser layer of cellulose gel in the course of
  • Cultivation is formed on the inner hollow carrier surface
  • the quality of the inner lumen can be the
  • the most recent cellulosic layer is always formed between already formed cellulose layers and the outer surface of the hollow carrier. Therefore, the lumen of the BNC hollow body when the
  • the cellulose layer formed on the outer hollow carrier surface which moves into the nutrient solution and is thus displaced outwards, must cover an ever larger area.
  • Bodin et al. report of one, the vascular wall Based layer system of many, not firmly interconnected individual layers of similar morphology, so that the risk of detachment or shifting of individual layers is given.
  • the surface topography (roughness) of the inner lumen is very strongly determined by the surface structure of the gas-permeable material used (pores, gaps, channels and other irregularities). Porous material allows only the passage of micro-oxygen bubbles, which do not ensure the oxygen supply of the microorganisms uniformly over the entire growth level and thus interfere with cellulosic formation and can lead to defects / inhomogeneities in the entire built-hollow cellulose, but especially in the lumen of the hollow cellulose.
  • Non-porous material is intended to provide uniform oxygenation of the
  • Hollow membrane membranes offer the possibility of influencing the morphology of the BNC hollow body and thus its mechanical properties.
  • the cultivation is not purely static, but in so-called “agitated-static" form, wherein the template or the mixture containing culture solution and microorganism, or both, are controlled so that the surface of the template is wetted However, permanent contact of the template with the mixture pool is excluded.
  • Mixture stock comprising the culture medium and the microorganism are moved relative to each other and thereby temporarily, but not constantly, brought into contact.
  • Characteristics of the method are a periodically but not permanently brought into contact with culture solution and microorganism template, the formation of a film containing culture medium and microorganism, on the template and the biosynthesis of cellulose on the template exclusively in and / or on the film - au outside the Mixture supply.
  • interruption of the contact means that the contact between template and mixture supply is interrupted so that no part of the
  • the inner contour of the hollow body is predetermined by a suitably shaped template, on the surface of which, when the method is carried out, there is a liquid film in which the biosynthesis of the cellulose takes place.
  • the cellulose produced directly on the template surface later forms the inner surface of the hollow body.
  • cellulose can be produced by the process more cellulose.
  • the externa ßere shaping of the hollow body according to the invention is non-contact, exclusively by the influence of gravity. After the wetting process, the wetted template is free in the surrounding oxygen-containing atmosphere and the
  • Cellulose formation process takes place in and / or on the film.
  • the entire surface of the template or the film located thereon is in the surrounding oxygen-containing atmosphere.
  • the method does not require an external shaped article, such as e.g. in static culturing processes, where microbial cellulose is formed by cultivating a cellulose-forming microorganism in a space between two walls.
  • the externa ßere shaping of the hollow body is exclusively by the choice of
  • the direction of gravity the frequency and spacing of individual rotations, the time interval between the wetting, the wetting time, the residence time, as explained below, the temperature, and the
  • the inventive method provides optimal conditions for the attachment of bacteria to a template and their uniform supply of nutrients and oxygen.
  • the BNC is included in the culture solution
  • the location of the biosynthesis and thus the location of the highest concentration of bacteria are located in the outer boundary layer of the hollow body and thus not on the side of the cavity, which forms the perspectively in contact with blood in an artificial blood vessel lumen.
  • the described device are performed. It is preferably carried out in a previously sterilized device and with sterile culture medium.
  • the culture medium and the device can be sterilized separately.
  • the culture medium and the device are sterilized together and then fed to the microorganism.
  • the process enables the production of cellulose hollow bodies with different microstructures and nanostructures. It is possible to construct micro and nanostructures in a targeted manner.
  • Biomimetic hollow bodies can be produced.
  • biomimetic means that a human or animal hollow organ,
  • a blood vessel is structurally and / or functionally modeled by the hollow body according to the invention, wherein the structural / functional properties of the natural template need not necessarily be exactly met.
  • biomimetic structure refers in particular to a structure that is as close as possible to the natural blood vessel.
  • a hollow body is to be understood as meaning a body which has a wall which surrounds a cavity.
  • the wall may have one or more openings through which the cavity is accessible.
  • the hollow body can be shaped as desired.
  • the shape is adapted to the later purpose.
  • the hollow body may e.g. the shape of a blood vessel, a gullet, a part of the
  • the hollow body has the shape of a tube or a tube
  • the hollow body may have one or more bends, for example a tube with one or more bends.
  • the hollow body may have one or more branches or branching, for example, the hollow body may have a Y-shape.
  • Length and inner diameter of the hollow body are variable and variable combined with each other.
  • Exemplary inner diameters are 1 -30 mm, preferably 2 to 8 mm, and exemplary lengths are 5-500 mm, preferably 100-200 mm.
  • the length Diameter ratio is preferably greater than 1.
  • the inner diameter can also vary within a hollow body.
  • the hollow body in particular its cavity, may, instead of a round, also have a differently shaped cross section, for example a square, rectangular, triangular, or star-shaped cross section.
  • the template, or "template” is, as already mentioned, the negative form of
  • “Negative form” refers to the adjuvant, the positive form is the desired result, in this case the hollow body / cavity / cavity wall.
  • the template is shaped to complement the shape of the desired cavity to be fabricated and is specified accordingly
  • the template also defines the internal geometry of the hollow body, for example, the template is cylindrical, with a diameter of 1 to 30 mm, preferably 2 to 8 mm, and a length of 5 to 500 mm, preferably 100 to 100 mm. 200 mm, but like the hollow body or cavity, the template can have any desired cross-section, such as round, angular, in particular square, rectangular, triangular, or star-shaped or snowflake-shaped
  • Branches have.
  • the template has a 2-dimensional or 3-dimensional grid-like structure.
  • the template has a surface having structures in the millimeter, micrometer, and / or nanometer range.
  • the structures are, for example, embossments or depressions or both.
  • the structures can be different
  • the template surface can be designed so that the inner surface structure produced in the hollow body, ie the structure of the surface adjacent to the cavity, is adapted to the later function of the hollow body. If, for example, hollow bodies are to be synthesized as a blood vessel replacement, then the surface of the template can be structured such that the inner surface of the synthesized hollow body later enables good endothelization.
  • the material from which the surface of the template is made is not limited in principle.
  • the template has a surface of wood, metal such as aluminum, stainless steel or titanium, plastic, ceramic, synthetic polymers such as polypropylene, polyesters, polyamides or Teflon, paper textile fabric or glass. It can also consist of the entire template of one of these substances.
  • the template itself can be a hollow body or solid (solid).
  • the surface of the template may be untreated or pretreated.
  • the pretreatment may be a change in surface morphology, e.g. by etching, polishing, roughening.
  • the surface may be coated or pre-treated or coated with chemical compounds
  • the template is designed so that on the one hand optimal conditions for binding and supply of the microorganism on its surface and adhesion of the
  • the template is chosen so that the product can be easily detached from the template to obtain the hollow body.
  • the surface of the template is such that the surface quality of the surface of the hollow body passing through in contact with body fluid, in particular blood, during implantation is reproducible.
  • an arrangement of a plurality of templates is used in the method.
  • Templates with the same or different geometry, in particular different cross sections, and / or of the same or different material can be used.
  • An example of an arrangement of several templates is an arrangement of a plurality of cylindrical templates for producing a plurality of hollow-cylindrical or tubular hollow bodies.
  • Several templates of the same or different geometry can be fixed in a clamping device (template matrix) which is connected to a wetting device and / or moving device, as explained in the exemplary embodiments.
  • the template is periodically, preferably briefly, with the
  • Liquid film is determined by the location of the template in space, as the
  • a liquid film comprising the liquid culture medium and the microorganism. Microbial cellulose is formed in and / or on the liquid film.
  • the liquid film can be spread on the template by rotating the template around one or more spatial axes, e.g. by means of the movement device as explained in the examples.
  • the distribution of the liquid can be influenced by the type of the given rotational movement of the template, wherein the
  • Rotation movement can also be interrupted.
  • Hollow body is thus determined by a defined distribution of a liquid film and by a defined movement under the influence of gravity.
  • the template preferably has a geometry with a length-diameter ratio of greater than 1.
  • the template has a rod, cone or cylindrical geometry with a length-diameter ratio greater than 1, for producing a tubular or hollow cylindrical hollow body, wherein branches can be provided.
  • the template has a longitudinal axis. The method is then preferably performed such that the template is rotated about one or more spatial axes which are transversal, preferably perpendicular to the longitudinal axis of the template.
  • a liquid film is formed on the surface of the template.
  • the liquid film is formed by moving and bringing the template and the mixture comprising the culture medium and the microorganism into contact with each other.
  • the relative movement can be such that the template, or the mixture which comprises culture medium and microorganism, or the template and the mixture are moved.
  • the contacting of the surface of a template with the mixture takes place in such a way that the template is immersed in and immersed in the mixture which comprises the culture medium and the microorganism.
  • a movement of the template around One or more spatial axes can be superimposed on an entry and exit movement of the template.
  • bringing the surface of a template into contact with the mixture takes place in such a way that the mixture from the first mixture reservoir is poured over the template. After pouring the mixture over the template is preferably not collected on the surface of the template remaining mixture and reused for further pouring.
  • the surface of a template is brought into contact with the mixture in such a way that the mixture of culture medium and microorganism is sprayed onto the template.
  • the oxygen-containing atmosphere is preferably air or pure oxygen or an oxygen-containing gas mixture.
  • Microwave Cellulose will be in and / or on the
  • Liquid film is formed when it comes into contact with oxygen.
  • process for producing a hollow body of microbial cellulose After separation from the template, the BNC hollow body can be cleaned and sterilized.
  • the microbial cellulose may alternatively remain on the template without performing the described optional separation step.
  • the process according to the invention is described as a "process for the preparation of a precursor of a
  • the microbial cellulose can be purified on the template and sterilized without first being removed from the template, and the microbial cellulose can be stored together with the template
  • the cleaning is preferably carried out with water, aqueous acidic or alkaline solution, or an organic solvent, or a combination thereof
  • the microbial cellulose can then be separated from the template to form a hollow body
  • the separation is effected, for example, by removing the cellulose formed from the template or by removing the template in another manner, for example by stripping off the cellulose from a cylindrical template and obtaining a hollow cylinder without a template core gswashkeit, when the cellulose is cleaned with it on the template, the detachment of cellulose from the template can be promoted.
  • the template can be reused after gently cleaning its surface. But it is also
  • the template can be rotated about one or more spatial axes at least during step c) and / or step f), or one or more of steps f), if step f) is carried out several times.
  • the shape and distribution of the liquid film and the shape of the forming product can be influenced.
  • the template is coated with a defined film of liquid, which in turn leads to a defined shape of the forming product.
  • the rotation can also take place during steps a) and b) and / or during steps d) and e). If, for example, the wetting template is moved relative to the mixture supply and brought into contact therewith, then in addition a relative movement superimposed on the movement of the template can take place about one or more spatial axes.
  • This sequence of steps d) -f) can be repeated one or more times until a desired amount of cellulose has been produced on the surface of the template and the cellulose has reached a desired total layer thickness.
  • Total layer can be composed of several individual layers or phases.
  • a synthesis of further microbial cellulose takes place on already formed cellulose.
  • the above-described rotation may be performed at each of the steps f) (first step f and repetitions thereof when the step sequence d) -f) is repeated).
  • the rotation about one or more spatial axes does not necessarily take place after each wetting process.
  • the sequence of steps d) -f) is carried out 1 to 40 times, preferably 1 to 30 times, without any rotational movement of the liquid film distribution template and in at least one subsequent step f), if the sequence of steps d ) -f) again, a rotation takes place about one or more spatial axes.
  • the times of contacting the surface of a template (step a) with a mixture supply and contacting the microbial cellulose produced in step c) with the mixture supply (step d) are referred to as "wetting times.”
  • the times of contacting of the liquid film containing an oxygen-containing atmosphere (steps c and f) are referred to as “residence times”. Wetting times and residence times can be controlled independently of each other.
  • the residence time in one embodiment is 1 to 60 minutes, preferably 5 to 40 minutes.
  • the total cultivation time is preferably 1-7 days.
  • the total cultivation time corresponds to the total process time within which all steps of the process, such as rotation, wetting and other steps, take place.
  • the duration of the process determines the thickness of the total cellulose layer formed on the template, which corresponds to the wall thickness of the insulated hollow body and which, as mentioned above, consists of several
  • Single layers can be composed.
  • the hollow bodies produced by the process can be purified to remove residues and components of the culture medium and microorganisms.
  • the cleaning is preferably carried out with water, aqueous acidic or alkaline solution, or an organic solvent, or a combination thereof.
  • the hollow bodies obtained by the method can be used without drying after a cleaning process and sterilization as wet implants.
  • the hollow bodies can be gently dried for storage, for example by freeze-drying or critical-point drying, the structure and the re-swellability of nanocellulose being retained.
  • the implant can be swollen again, for example, in saline or even patient's own or allogeneic (pharma-grade) serum.
  • the invention relates to a hollow body of microbial
  • Cellulose obtainable by the method described above.
  • the method basically differs from the methods known from the prior art.
  • the construction of cellulose takes place according to a completely different mechanism.
  • the respective youngest layer is formed at the interface nutrient medium / oxygen-permeable hollow carrier during the biosynthesis process.
  • the youngest layer is thus formed on the side of the later cavity of the hollow body and older layers migrate outwards.
  • the oxygen entry takes place from the side of the lumen and nutrients must be supplied from the outside and penetrate already formed cellulose layers. In this method, it is not possible to deliver microorganisms from the outside because they do not fit through the pores.
  • Cellulose is formed by the same microorganisms that are always located at the site of cellulose formation. It could only be a multiplication by cell division. Deviating from this, the biosynthesis takes place in the present process on the outside of the hollow body, at the interface of the mixture film to surrounding oxygen-containing atmosphere. As a result, the recently formed cellulose is located on the outside and already formed cellulose remains stationary during the synthesis. The oxygen input takes place in contrast to WO2008040729 from the outside, and also the microorganisms and nutrients are supplied to the outside, ie they do not have to penetrate already formed cellulose layers. In the present process is a supply of
  • the hollow body has a wall having an inner surface and an outer surface, the inner surface and the outer surface having identical or similar coverage by microbial cellulose fibers
  • BNC fibers form more or less dense or more or less porous networks.
  • image analysis it is possible to distinguish surface areas in which fibers are located (in a SEM image, for example, lighter) from surface areas in which there are no fibers (gaps, in a SEM image, for example, darker) and the areas in relation to the one considered Total area to put. The coverage per
  • the coverage can be expressed as a percentage.
  • similar in this context means that the coverage on the inner surface and the outer surface relative to each other differ by a maximum of 20%, preferably at most 10%, most preferably at most 5%
  • a similar covering as defined above means a similar porosity of the inner and outer surfaces, the porosity with respect to a surface
  • the non-fiber covered area may be referred to as an "open pore area” or "pore area.”
  • open pore area or "pore area.”
  • Covering and porosity may take into account BNC fibers which are located outside of an inner / outer surface considered to be two-dimensional.
  • a two-dimensional representation of the outer or inner surface of the wall of the hollow body is obtained.
  • the imaged BNC fibers are not always in one plane, since the surfaces may have a certain roughness and / or possibly BNC fibers are imaged which lie behind the surface from the viewing direction of the observer. It has been found that in the hollow body according to the invention the outer surface of the wall can be rougher than the inner surface.
  • SEM magnification ⁇ 10,000 magnification
  • the hollow body has a wall having an inner surface and an outer surface, wherein the inner surface and the outer surface have a similar porosity as defined above.
  • a similar porosity of the inner and outer surface of its wall makes the hollow body of the present invention particularly suitable for use as tunica media, especially of near-heart arteries, due to its uniform fiber structure.
  • the invention provides a hollow body, which by layers of high and functionally reliable surface quality is limited.
  • the surfaces are preferably free of impurities and inhomogeneities.
  • WO2008040729 In the method according to WO2008040729 is obtained only hollow body with a smooth inner surface and a relatively porous outer surface ßer, as shown in Figs. 4A and 4B.
  • the porosity of the inner and outer surface, or their coverages with fibers, are judged not to be similar. This is possibly due to the fact that in the method according to WO2008040729 the youngest layer is formed on the side of the later cavity of the hollow body and older layers migrate outwards and are stretched due to the increasing radius.
  • the wall construction generally consists of many layers, which are clearly distinguishable from one another by scanning electron microscopy (FIG. 5 of WO2008040729).
  • the hollow body according to the invention has a wall with an inner surface and an outer surface, the wall comprising a plurality of layers of microbial cellulose which run parallel to the inner and outer surface of the wall. These layers are also referred to below as “phases.”
  • the layers correspond to the above-mentioned “individual layers or phases” of the wall of the hollow body.
  • the phases of the wall of the hollow body according to the invention are in contrast to the disclosed in WO2008040729 layers as in the
  • phase need not be obtained by a process cycle of wetting / filming and subsequent cellulose formation in or on the film.
  • a phase may be formed by several such process cycles.
  • the phases are by means of
  • the phases are composed of a network of fibers of bacterial nanocellulose, wherein the fiber structures of the phases can be the same or different in the comparison of the phases.
  • the phases are preferably homogeneous in their density over the entire phase thickness. That is, they have no density gradient. Furthermore, the phases are preferably also free of impurities (see also FIGS. 4 to 6, 2,000 times magnification).
  • the invention also relates to a hollow body whose wall is constructed of layers, also referred to as phases as described above, wherein one of the layers, the inner surface, ie, the cavity-side surface, the wall and another layer has the outer surface of the wall and wherein these two layers have identical or similar porosity.
  • the layer / phase having the inner surface of the wall is also referred to as "lumen-side layer / phase" or "cavity-side layer / phase”.
  • Porosity void volume / total volume
  • the volume of the entire layer / phase can be used. But it is also possible to consider only a part of the volume of the layer / phase and this volume part for the purpose of measuring the porosity as
  • an identical or similar three-dimensional / spatial porosity as defined above means that the lumen-side layer / phase and the outside layer / phase have an identical or similar density. Furthermore, an identical or similar three-dimensional / spatial porosity as defined above means that the lumen-side
  • the density is preferably expressed in mass / volume and the fiber density is expressed as the number of fibers / volume.
  • the volume of the volume of the entire layer / phase can be used. However, it is also possible, and preferred to consider only a part of the volume of the layer / phase for determining the density or the fiber density.
  • the term "similar" means, with respect to density and fiber density, that the density / fiber density of the lumen-side phase and the density / fiber density of the outside phase "relative to each other differ by a maximum of 20%, preferably a maximum of 10%, most preferably a maximum of 5%
  • the percentage value of the difference between the values is determined as follows:
  • one or more further phases are arranged between the lumen-side phase and the outside phase. More preferably, these one or more other phases have identical or similar porosity, density and fiber density as the lumen-side phase and the outside-phase.
  • the phases are so firmly connected to one another that they do not delaminate from one another under mechanical stress in a tensile test.
  • a BNC ring of 4 mm inner diameter and 5 mm width is cut and stretched radially at a rate of 0.25 mm / sec.
  • the hollow body is a hollow cylinder having a central axis which runs through the cavity centrally and along the cylinder extension.
  • the hollow body of at least two, rotationally symmetrical about the major axis
  • the phases are firmly connected to one another. Furthermore, the phases preferably have one
  • the phases are preferably characterized by a
  • phase uniform (isotropic), well-branched fiber network. Number and strength of the phases are controlled adjustable. They are arranged so that they correspond to the structure close to a natural vessel, in particular the media (biomimetic structure) and the structure of the body's own structures (adventitia and intima) as well as the
  • the hollow body preferably has one or more openings through which the cavity of the hollow body is accessible.
  • the openings may be e.g. to act on the inflow and outflow opening of a blood vessel part.
  • the hollow body is selected from a tube or a hollow cylinder, which may have one or more branches.
  • the hollow bodies according to the invention are characterized by improved mechanical properties, specifically adjustable microstructures (biomimetic structure) and bioactive surfaces.
  • improved mechanical properties specifically adjustable microstructures (biomimetic structure) and bioactive surfaces.
  • Other preferred mechanical properties arbitrary with the mechanical, structural and geometric already described above
  • the invention also relates to a hollow body having a seam tear strength in the range of 5-15 N, preferably 8-10 N, in particular a hollow cylinder or a tube with such a seam tear strength. Suture tear strength is determined by the method given in the examples. Further, a hollow body having a bursting pressure of at least 400 mm Hg, preferably at least 600 mm Hg and most preferably at least 800 mm Hg is also specified. The bursting pressure is determined by the method given in the examples. In one aspect, the invention also relates to an artificial vessel, in particular for use as an implant in the human or animal body, comprising a hollow body as described above.
  • the hollow body can be present as a composite with other substances, for example with other polymers than BNC such as
  • the hollow body may additionally contain growth and / or recruitment factors and / or other biologically active substances,
  • the hollow body is to be used as an artificial blood vessel, then it can be used directly in the body.
  • the hollow body may also be subjected to a pretreatment, for example, an adhesion of edothelial cells to the
  • the invention relates to the use of a hollow body or an artificial vessel as described above as a medical implant.
  • the hollow bodies and artificial vessels can be used in medical applications as internal hollow structures and vessels, such as blood vessels, esophagus, digestive tract, trachea, urethra, bile duct, ureter, lymph vessels or as a cuff (cuff)
  • Enveloping of endogenous structures such as hollow organs or nerve fibers, or used as an interponate, wherein the hollow body can be used directly or after adaptation to the Organspezifik.
  • Further uses are the use as a medical exercise material, in particular for the realistic training of surgical techniques, in cardiovascular medicine and visceral surgery, to which the hollow body can also be mechanically processed.
  • the invention relates to a device for producing a hollow body from a microbial polymer and a method for producing a hollow body from a microbial polymer or for coating an article with a microbial polymer.
  • an apparatus for producing a hollow body from a microbial polymer, in particular microbial cellulose, comprising
  • a first reservoir containing a mixture which is a liquid
  • microbial polymer refers to a polymer that is characterized by a
  • Microorganism is produced.
  • Exemplary microorganisms are fungi, bacteria and algae.
  • polymer denotes a chemical compound of chain or branched molecules (macromolecules), which in turn consist of identical or similar units, or in other words a large molecule (macromolecule), which consists of repeating identical or similar structural units, as
  • a preferred microbial polymer is microbial cellulose.
  • Microorganisms are able to produce cellulose. These include, but are not limited to, algae such as Valonia and Boergesenia, fungi such as Dictyostelium discoideum and bacteria such as Gluconacetobacter, Enterobacter, Agrobacterium, Pseudomonas, Rhizobium and Zoogloea.
  • a particularly suitable microorganism is Gluconacetobacter, in particular Gluconacetobacter xylinus.
  • the culture medium also referred to as "nutrient solution” or “nutrient medium” contains glucose, peptone, yeast extract, sodium hydrogen phosphate and citric acid in aqueous solution (Hestrin Schramm medium).
  • Microwave Cellulose if made by bacteria, is also used with the
  • bacterial cellulose and “bacterial nanocellulose” (BNC).
  • bacterial nanocellulose (BNC) is derived from the fact that bacterially produced cellulose forms a nanofiber network as mentioned above
  • the invention is sometimes illustrated by the specific case of microbial cellulose, but the invention is also applicable to other microbial polymers.
  • Moldings required e.g. in static culturing processes, where microbial cellulose is formed by culturing a cellulose-forming microorganism in a space between two walls.
  • a liquid film is located in or on which the biosynthesis of the polymer proceeds.
  • the polymer produced directly on the template surface later forms the inner surface of the hollow body.
  • the method further polymer can be generated by the method further polymer.
  • Biomimetic hollow bodies with different micro and nanostructures possible. It is possible to construct micro and nanostructures in a targeted manner. Biomimetic hollow bodies can be produced.
  • biomimetic means that a human or animal hollow organ, for example a blood vessel, is structurally and / or functionally reproduced by the hollow body produced according to the invention, wherein the structural / functional properties of the natural template need not necessarily be exactly met.
  • biomimetic structure refers in particular to a structure that is as close as possible to the natural blood vessel.
  • a hollow body is to be understood as meaning a body which has a wall which surrounds a cavity.
  • the wall may have one or more openings through which the cavity is accessible.
  • the hollow body can be shaped as desired.
  • the shape is adapted to the later purpose.
  • the hollow body may e.g. the shape of a blood vessel, a gullet, a part of the
  • the hollow body has the shape of a tube or a tube
  • Hollow cylinder Length and inside diameter are variable and variably combinable. Exemplary inner diameters are 1 -30 mm, preferably 2 to 8 mm, and exemplary lengths are 5-500 mm, preferably 100-200 mm. The length-diameter ratio is preferably greater than 1. The inner diameter can also vary within a hollow body.
  • the hollow body is a hollow cylinder with one or more branches or branching.
  • the hollow body may have a Y-shape.
  • the hollow body, in particular its cavity, may, instead of a round, also have a differently shaped cross section, for example a square, rectangular, triangular, or star-shaped cross section.
  • the template, or "template” is, as already mentioned, the negative form of
  • the template is shaped in a complementary manner to the shape of the desired cavity to be produced and is specified accordingly
  • the template defines the internal geometry of the hollow body, for example, the template is cylindrical, with a diameter of 1-30 mm, preferably 2-8 mm, and a length of 5-500 mm, preferably 100-200 mm
  • the template can have any desired cross-section, such as round, angular, in particular square, rectangular, triangular, or star-shaped or snowflake-shaped
  • Branches have.
  • the template has a 2-dimensional or 3-dimensional grid-like structure.
  • the device for producing a hollow body has except the template, which defines the inner shape, no internals that define the externa ßere shape of the hollow body.
  • the template has a surface having structures in the millimeter, micrometer, and / or nanometer range.
  • the structures are, for example, embossments or depressions or both.
  • the structures can be different
  • the template surface can be designed so that the inner surface structure produced in the hollow body, ie the structure of the surface adjacent to the cavity, is adapted to the later function of the hollow body. If, for example, hollow bodies are to be synthesized as a blood vessel replacement, the surface of the template can be so be structured so that the inner surface of the synthesized hollow body later allows a good endothelialization.
  • the material from which the surface of the template is made is not limited in principle.
  • the template has a surface of wood, metal such as aluminum, stainless steel or titanium, plastic, ceramic, synthetic polymers such as polypropylene, polyesters, polyamides or Teflon, paper textile fabric or glass. It can also consist of the entire template of one of these substances.
  • the template itself can be a hollow body or solid (solid).
  • the surface of the template may be untreated or pretreated.
  • the pretreatment may be a change in surface morphology, e.g. by etching, polishing, roughening.
  • the surface may be coated or pre-treated or coated with chemical compounds
  • the template is designed so that on the one hand optimal conditions for binding and supply of the microorganism on its surface and adhesion of the polymer are achieved.
  • the template is chosen so that the
  • Polymer product can be easily detached from the template to the
  • the surface of the template is such that the
  • the device has an arrangement of a plurality of templates, also referred to as a template matrix.
  • a template matrix This can have multiple templates with the same or different geometry, in particular different cross sections, and / or the same or different material.
  • An example of an arrangement of several templates is an arrangement of a plurality of cylindrical templates for producing a plurality of hollow-cylindrical or tubular hollow bodies.
  • Several templates of the same or different geometry can be fixed in a clamping device (template matrix), which is connected to a wetting device and / or moving device.
  • the device has a housing which surrounds at least the template and the reservoir so that a mass transfer with the
  • the housing may also enclose the wetting device or parts thereof.
  • the housing is in particular liquid and gas-tight, wherein the term "gas-tight" is preferably based on a surrounding atmosphere under normal pressure.
  • the first reservoir may be a separate part of the device or an area of the device
  • Housing may form the reservoir, wherein liquid mixture is added to the housing itself. The same applies to a second reservoir described below.
  • the housing has a closable opening through which a mass transfer can take place with the environment.
  • a material exchange may be such that media needed in the growth process of the microorganisms, such as e.g. Nutrient solution, inoculum, oxygen, etc., be replenished, kept constant or changed. It can also by opening a microorganism in the
  • Culture medium are given, which is already inside the housing in the reservoir.
  • a mass transfer occurs with the environment under sterile conditions to prevent contamination of the culture medium.
  • closable opening can be designed as a media connection, such as valves, quick couplings, taps, flanges, etc.
  • the housing is partially or completely transparent.
  • the housing has at least one transparent surface
  • a window in particular of heat-resistant glass, through which a visual control of the molding process of the hollow body is possible.
  • the device is sterilizable, in particular by heat, steam, radiation or chemicals.
  • the device can be made, for example, of a material that does not require sterilization using the methods mentioned
  • Damage to the device allows and / or the device can be sized be that it can be introduced into a sterilization device, such as a steam sterilizer.
  • the device has a movement device, with which the template can be rotated about one or more spatial axes.
  • a liquid film which comprises the liquid culture medium and the microorganism is formed on the surface of the template. Microbial polymer is formed in and / or on the liquid film.
  • this liquid film can be distributed on the template by rotating the template around one or more spatial axes.
  • the distribution of the liquid can be influenced by the type of predetermined rotational movement of the template, wherein the rotational movement can also be interrupted.
  • the outer geometry of the hollow body is thus determined by a defined distribution of a liquid film and by a defined movement under the influence of gravity.
  • the template preferably has a geometry with a length-diameter ratio of greater than 1.
  • the template has a rod, cone or cylindrical geometry with a length-diameter ratio of greater than 1, for producing a tubular or hollow cylindrical hollow body, wherein branches can be provided.
  • the template has a longitudinal axis.
  • the movement device is then preferably designed so that the template is rotatable about one or more spatial axis, which is transverse, preferably perpendicular to the longitudinal axis of the template / are.
  • the device according to the invention has a wetting device for wetting the template with the mixture introduced into the reservoir.
  • the above-mentioned liquid film is formed on the surface of the template and the purpose of the wetting means is the formation of the liquid film.
  • the liquid film is formed by moving and bringing the template and the mixture comprising the culture medium and the microorganism into contact with each other.
  • the wetting device can be designed in such a way that thus the template, or the mixture, which culture medium and microorganism, or the template and the mixture can be moved.
  • the wetting device is designed so that the template can be immersed in and immersed in the mixture which comprises the culture medium and the microorganism.
  • the device may have a rod with a drive, with which the rod can be moved up and down in the direction of its longitudinal axis.
  • the template, or an array of templates, may be attached to the rod and the reservoir with mixture therein may be disposed below the template. Through a downward and upward movement of the rod, the template can be immersed in and immersed in the mixture.
  • the above-described movement device can be coupled to the wetting device or the wetting device can be a part of the movement device. It also discloses a device that is both the function of
  • a movement of the template around one or more spatial axes can be an insertion and Ausauchschul the template, in the previous variant of a
  • the wetting device is designed so that the mixture, which comprises the culture medium and the microorganism, can be poured out of the first reservoir via the template.
  • the first reservoir may be movable by the wetting device and mixture in the reservoir may be poured with the wetting device over the template.
  • a second reservoir is present, wherein after the mixture has been poured over the template not remaining on the surface of the template mixture in the second reservoir is trappable.
  • the reversal of this process with the wetting device is also possible: the
  • Wetting device is designed so that thus the mixture containing the
  • Culture medium and the microorganism comprises, can be poured from the second reservoir on the template and after pouring the mixture over the template not on the surface of the template remaining mixture can be collected in the first reservoir.
  • the wetting device is designed so that the mixture of culture medium and microorganism can be sprayed from the first reservoir onto the template.
  • the invention relates to a method for producing a hollow body from a microbial polymer or for coating an article with a microbial polymer, the method comprising the following method steps:
  • a mixture reservoir wherein on the surface of the article, a liquid film remains, which comprises the liquid culture medium and the microorganism, c) contacting the liquid film with an oxygen-containing
  • Liquid film and optionally, the separation of the article from the polymer formed, wherein a
  • the method can be carried out with the device according to the invention described above, but is not limited thereto. Reference is made to all features of a device according to the invention described above and to the entire preceding disclosure.
  • the template of the device corresponds to the subject matter of the above method.
  • the mixture supply of the above process is provided in the reservoir (s) of the apparatus.
  • the article is wetted periodically, preferably for a short time, with the mixture comprising the culture solution and the microorganism. This forms a
  • Liquid film on the surface of the article The shape of this liquid film is determined by the location of the template in space, as gravity acts on this film.
  • interruption of contact means that the contact between
  • Item and mixture supply is interrupted so that no part of the surface of the article during the interruption contact with the mixture supply has.
  • the oxygen-containing atmosphere is preferably air or pure oxygen or an oxygen-containing gas mixture.
  • a preferred microbial polymer of the process is microbial cellulose which is formed in and / or on the liquid film when it comes in contact with oxygen.
  • the contact between the article and the mixture supply is interrupted in the process and the synthesis of the microbial polymer takes place only in and / or on the liquid film which has been separated from the mixture supply.
  • any diffusion processes of culture solution and oxygen play a minor or no role.
  • the process is a coating process in which the article is provided with a polymer layer.
  • a hollow body can be obtained.
  • the item is also referred to as a template.
  • the separation is preferably carried out by withdrawing the polymer formed from the template.
  • the template can be reused after a gentle cleaning of the surface.
  • the object may be rotated about one or more spatial axes during step c). If a device according to the invention is used for the method, this rotation can take place with the movement device already described. In doing so, the shape of the liquid film on the surface of the article is affected. In other words, the template is coated with a defined liquid film, which in turn leads to a defined shape of the forming product. The rotation can also already take place during steps a) and b). For example, if the template for wetting relative to the
  • the following steps are additionally carried out: d) bringing the microbial polymer formed in step c) into contact with the mixture reservoir,
  • This sequence of steps d) -f) may be repeated one or more times until a desired amount of polymer is formed on the surface of the article and the polymer has reached a desired total layer thickness.
  • Total layer can be composed of several individual layers or layers.
  • a synthesis of further microbial polymer takes place on already formed polymer.
  • the inner Form redesign is developed without limit but in constant contact with the culture solution "free” in space and represents the original first (oldest) and looser Cellulosegel Mrs dar.
  • the quality of the inner lumen can be the
  • the most recent cellulosic layer is always formed between already formed cellulose layers and the outer surface of the hollow carrier. Therefore, the lumen of the BNC hollow body when the
  • the cellulose layer formed on the outer hollow carrier surface which moves into the nutrient solution and is thus displaced outwards, must cover an ever larger area.
  • Bodin et al. report of one, the vascular wall Based layer system of many, not firmly interconnected individual layers of similar morphology, so that the risk of detachment or shifting of individual layers is given.
  • the surface topography (roughness) of the inner lumen is very strongly dependent on the surface structure of the inner lumen used gas-permeable material (pores, gaps, channels and other irregular ridges) is determined.
  • Porous material allows only the passage of micro-oxygen bubbles, which do not ensure the oxygen supply of the microorganisms uniformly over the entire growth level and thus interfere with cellulosic formation and can lead to defects / inhomogeneities in the entire built-hollow cellulose, but especially in the lumen of the hollow cellulose.
  • Non-porous material is intended to provide uniform oxygenation of the
  • the cultivation process itself is only very limited controllable. Only the oxygen supply and the diameter of the hollow-body membranes offer the possibility to influence the morphology of the BNC hollow body and thus mechanical properties.
  • the cultivation is not purely static but in a "stirred-static" form, with the article / template or mixture containing culture solution and microorganism, or both, being controlled so as to wet the surface of the template / article A permanent contact of the
  • the externa ßere shaping of the hollow body according to the invention is non-contact, exclusively by the influence of gravity. After the wetting process, the wetted object / the wetted template is free in the surrounding oxygen-containing
  • Atmosphere and the polymer formation process in particular a
  • Cellulose formation process takes place in and / or on the film.
  • the outer shape of the hollow body is defined solely by the choice of cultivation conditions. Cultivation conditions include, for example, the direction of
  • the inventive method provides optimal conditions for the attachment of bacteria to a template or an object and their
  • the BNC is loaded with bacterial cells floating in the culture solution.
  • the location of the biosynthesis and thus the location of the highest concentration of bacteria are located in the outer boundary layer of the hollow body and thus not on the side of the cavity, which forms the perspectively in contact with blood in an artificial blood vessel lumen.
  • phase refers to a layered structure wherein the phase may be composed of multiple layers.
  • the hollow body is a hollow cylinder having a central axis which runs through the cavity centrally and along the cylinder extension.
  • the hollow body of at least two, rotationally symmetrical about the major axis
  • the phases are firmly connected to one another. Furthermore, the phases preferably have a homogeneous structure, without impurities and
  • the phases are characterized by a uniform (isotropic), well-branched fiber network.
  • the number and strength of the phases are controlled adjustable.
  • the walls of all natural arteries and veins are characterized by a 3-layer structure consisting of the tunica intima, the tunica media and the tunica externa (adventicia).
  • the phases are arranged so that they correspond to the structure close to a natural vessel, in particular the media
  • Biomimetic structure and the structure of endogenous structures (adventitia and intima) and the mass transfer comparable to the natural exchange processes
  • the described device are performed. It is preferably carried out in a previously sterilized device and with sterile culture medium.
  • the culture medium and the device can be sterilized separately.
  • the sterilized culture medium is then introduced into the reservoir within the housing of the device, which is also already sterile, for example by an opening in the housing already described above, which closes after introduction of the sterile culture medium and inoculation of the culture medium with the microorganism becomes.
  • the culture solution is introduced into the same before sterilization of the device, and the sterilization of the device and culture medium takes place simultaneously. Subsequently, the culture medium can be inoculated with the microorganism, wherein the microorganism can be introduced through an opening already described above in the housing.
  • the template is preferably already used in the device when it is sterilized. Otherwise, the template would also need to be sterilized separately and then inserted into the sterilized device.
  • step a) The times of contacting the surface of an article (step a) with a mixture supply and contacting the microbial polymer produced in step c) with the mixture supply (step d) are referred to as "wetting times.”
  • step c and f) The times of contacting of the liquid film with a Oxygen-containing atmospheres (steps c and f)) are referred to as “residence times.” Wetting times and residence times can be independently controlled.
  • the object is rotated at least during step c), preferably also during step a) and b), around one or more spatial axes. If the optional steps d), e) and f) are carried out once or several times, then in a further embodiment the object is at least during step f), or one or more of steps f), if step f) is performed several times rotated around one or more spatial axes.
  • the article may also be rotated about one or more spatial axes during steps d) and e) if rotation occurs during step f).
  • the total cultivation time is preferably 1-7 days.
  • the total cultivation time corresponds to the total process time within which all steps of the process, such as rotation, wetting and other steps, take place.
  • the duration of the process determines the thickness of the polymer formed on the template, which corresponds to the wall thickness of the isolated hollow body.
  • the process is preferably carried out at a temperature of 20 to 40 ° C.
  • the hollow bodies obtained by the method can be used as moist implants without drying after a cleaning process.
  • the hollow bodies can be cleaned to remove residues and components of the culture medium and microorganisms.
  • the cleaning is preferably carried out with water, aqueous acidic or alkaline solution, or an organic solvent, or a combination thereof.
  • the hollow bodies can be gently dried for storage, for example by freeze-drying or critical-point drying, the structure and the re-swellability of nanocellulose being retained.
  • the implant can be swollen again, for example, in saline or even patient's own or allogeneic (pharma-grade) serum.
  • Hollow bodies produced by the present apparatus and method can be used in medical applications as internal hollow structures and vessels, such as blood vessels, Esophagus, digestive tract, trachea, urethra, bile duct, ureter,
  • Lymph vessels or as a cuff (cuff) for enveloping endogenous structures such as hollow organs or nerve fibers, or used as an interponate the Hohki emotions can be used directly or after adaptation to the Organspezifik. Further uses are the use as a medical exercise material, especially for the realistic training of surgical techniques, in the
  • the invention also relates to the following objects, methods and
  • a first reservoir (2) which can be filled with a mixture (10) comprising a liquid culture medium and a polymer-forming microorganism,
  • a wetting device for wetting the template with the mixture introduced into the reservoir
  • a housing (15) which surrounds at least the template (3) and the reservoir (2) so that a mass transfer with the environment (18) of the housing can be prevented. 2. Device according to item 1, wherein the housing (15) has a closable opening (17) through which a mass transfer to the environment (18) can take place.
  • Spaces (1 1) is rotatable.
  • Device according to item 4 wherein the movement device (5) is designed so that the template is rotatable about one or more spatial axes which are transverse to a longitudinal axis of the template.
  • the template has a surface of wood, metal, plastic, ceramic, synthetic polymer, paper textile fabric or glass.
  • Device comprising an arrangement of a plurality of templates (3).
  • Device which is sterilizable, in particular by heat, steam, radiation and / or chemicals.
  • the wetting device (6, 7) is designed such that the template (3) can be immersed in and immersed in the mixture (10) comprising the culture medium and the microorganism.
  • the wetting device (6, 7) is designed such that thus the mixture (10) containing the culture medium and the
  • Microorganism comprises, from the first reservoir (2) on the template (3) can be poured.
  • Device having a second reservoir (2 '), wherein after casting of the mixture (10) containing the culture medium and the microorganism comprises, over the template not on the surface of the template remaining mixture (10 ') in the second reservoir (2') is trappable.
  • Device wherein the wetting device (6, 7) is designed such that with it the mixture (10 ') containing the culture medium and the
  • Microorganism can be poured from the second reservoir (2 ') on the template (3) and wherein after the mixture (10') over the template not on the surface of the template remaining mixture (10) in the first reservoir ( 2) can be collected.
  • Method for producing a hollow body from a microbial polymer or for coating an object with a microbial polymer comprising the following method steps:
  • a mixture supply (10) comprising a liquid culture medium and a microbial polymer-forming microorganism
  • Liquid film remains, the liquid culture medium and the
  • Liquid film and optionally, the separation of the article (3) from the polymer formed to obtain a microbial polymer hollow body.
  • Fig. 1 shows a first device for carrying out the method according to the invention with dynamic arrangement of the template and a static arrangement of the mixture, in a sectional view
  • Fig. 2 shows an alternative device for carrying out the method according to the invention with dynamic arrangement of the template and dynamic arrangement of the mixture, in a sectional view
  • Example 1 Construction and mode of operation of devices for carrying out the
  • the device 1 is designed as a bioreactor, with a housing 15 which consists of a vessel 9 and a cover 8 and surrounds the interior space 14.
  • the vessel 9 is closed with the cover 8 and shown here in the closed state.
  • Cover 8 may be made of stainless steel.
  • a separate reservoir 2 for the mixture 10 consisting of a culture solution and a
  • the reservoir 2 and the mixture 10 can be introduced through the opening 17 of the vessel 9 when the cover 8 is removed from the vessel 9.
  • Another closable opening 19 is provided in the cover 8 and closed with a closure 20.
  • Clamping fixtures 4 clamped and form an assembly of several
  • Templates (template matrix).
  • the templates 3 are connected via a coupling 6, here rod-shaped, with a motor 7.
  • the motor 7 can lower the rod 6 and the templates 3 and dip into the mixture 10 in the reservoir 2. In a countermovement, the templates can be raised again and dived. When dousing remains a film of the mixture 10 on the templates 3.
  • the motor 7 and the clutch 6 form a wetting device.
  • the coupling 6 is drawn only shortened. It is designed so long that the immersion and Austauchphi is possible.
  • the mixture 10 is not moved, while for wetting the templates 3 by a downward and upward movement into the mixture 10 and are immersed.
  • the entry and exit movement takes place translationally along the Z-axis shown.
  • the coupling 6 is guided through the opening in the cover 8.
  • the gap between the edge of the opening and the rod is closed by the seal 16, so that the inner space 14 is sealed against the environment 18.
  • Movement device takes place with the motor 7 via the clutch 6.
  • the clutch 6 is rotated about its longitudinal axis and thereby has the function of a shaft.
  • the shaft is connected to a gear (not shown) which is a part of the moving means 5 and the assembly
  • Clamping devices 4 and 3 templates clockwise rotates, represented by a Arrow.
  • the assembly of jigs 4 and templates 3 is rotated about a spatial axis which is perpendicular to the plane of the drawing (X axis).
  • the X-axis is perpendicular to the longitudinal axes of the templates 3, which are aligned longitudinally in the direction of the drawn Z-axis.
  • the movement means may be configured such that the assembly is rotatable, rather than about the X-axis, or in addition, about the drawn Y-axis, or about further axes.
  • a cardanic suspension of the assembly is conceivable.
  • the device 1 is designed as a bioreactor, with a housing 15 which consists of a vessel 9 and a cover 8 and surrounds the interior space 14.
  • a housing 15 which consists of a vessel 9 and a cover 8 and surrounds the interior space 14.
  • the interior 14 are the
  • the first reservoir 2 and the second reservoir 2' are opposite, on both sides of the assembly from
  • Clamping devices 4 and 3 templates arranged. Reservoirs 2, 2 'can be opened in the direction of the templates. With closure devices 13, 13 ', the openings of the reservoirs 2, 2' can be selectively opened or closed.
  • Locking devices 13, 13 ' are not a mandatory feature of the device according to the invention, but advantageous to prevent accidental escape of mixture 10, 10' from the reservoirs 2, 2 '.
  • the schematically illustrated closure devices 13, 13 ' can be, for example, mechanically or electromagnetically controlled valves.
  • the assembly of jigs 4 and templates 3, the first reservoir 2, the second reservoir 2 'and the closure means 13, 13' are surrounded by a sheath 12 and fixed relative thereto and relative to each other.
  • Moving device 5 engages the enclosure 12.
  • the drive of the movement device 5 takes place with the motor 7 via the clutch 6.
  • the clutch 6 is rotated about its longitudinal axis and thereby has the function of a shaft.
  • the shaft is connected to a gear (not shown), which is a part of the movement means 5 and the assembly of sheath 12, jigs 4, templates 3, reservoirs 10, 10 'rotates clockwise, represented by an arrow.
  • the clamping device 4 with the templates 3 are rotated about a spatial axis which is perpendicular to the plane of the drawing (X Axis).
  • the X-axis is perpendicular to the longitudinal axes of the templates 3, which are aligned longitudinally in the direction of the drawn Z-axis.
  • the first reservoir 2 is filled with mixture 10.
  • the first reservoir 2 is moved together with mixture 10 in the upper position, where in this illustration is still the reservoir 2 '.
  • the closure device 13 is opened and the mixture 10 pours out via the templates 3. Not on the surface of the templates 3
  • Reservoir 2 ' whose closure device 13' has also been opened, and is therein collected as a mixture 10 '(in the illustration of Fig. 2, 10' is still the space in which the mixture flows 10 ', not the mixture itself).
  • the mixture 10 ' is poured from the second reservoir 2' on the templates 3 and not on the surface of the Templates 3 remaining mixture is collected in the first reservoir 2.
  • the wetting device 6, 7 and the moving device 5, which rotates the templates 3 are summarized in the embodiment of Fig. 2:
  • Mover 5 rotates the reservoirs 2, 2 'and the templates 3 as indicated above, wetting as explained.
  • the templates 3 and the reservoirs 2, 2 ' can also be rotated about further spatial axes, for example about the Y-axis.
  • the reservoirs 2, 2 'by means of
  • polymer for example cellulose, is formed in and / or on the film on the surface of the templates 3.
  • Fig. 2 The embodiment of Fig. 2 is characterized by a dynamic arrangement of the template and a dynamic arrangement of the culture solution.
  • the device enables a method for constructing BNC implants in which at the same time the templates 3 and the mixture 10 are moved periodically.
  • Example 2 Process - Preparation of a microbial cellulose hollow body: General Procedure:
  • templates 3 are arranged between clamping devices 4 and inserted into the movement device 5.
  • the reactor is then closed with the cover 8 and sterilized. After sterilization of the entire reactor is / are the reservoir 2 or the reservoirs 2, 2 'under sterile
  • Microorganism 247.5 ml of a preculture of a bacterium of the genus
  • Culture solution 4950 ml of nutrient solution containing per liter of deionized water 20.00 g of glucose anhydrous, 5.00 g of bactopeptone, 5.00 g of yeast extract, 3.40 g of di-sodium hydrogen phosphate dihydrate and 1.15 g of citric acid monohydrate and a pH value from 6.0 to 6.3 comprising (Schramm Hestrin medium steam-sterilized at 121 ⁇ C for 20 minutes in an autoclave).
  • the conditions in the reactor interior temperature, pressure, atmosphere composition are adjusted according to the cultivation conditions.
  • Example 1 The various embodiments of a device were explained in Example 1.
  • the movement is preferably carried out discontinuously with frequencies preferably less than 0.01 Hz in such a way that the templates are wetted in a defined manner with culture medium 10.
  • the movement device 5 ensures a defined distribution of the liquid film by deliberately superposed movements.
  • Hollow bodies are taken from bacterial nanocellulose and fed to the workup.
  • the hollow bodies are stripped off the templates, cleaned and stored moist or dried, as described in the general description part.
  • the culture medium 10 could be replaced by appropriate cleaning or rinsing liquids through a further opening.
  • Surgical sutures (eg PROLENE 5/0 (1 metric)) are placed through the wall of a tubular hollow cellulose body as described in the examples, so that the suture is passed through the wall of the hollow body from the outside in the direction of the lumen, the suture is pulled through and then knotted becomes.
  • This procedure corresponds to the production of a so-called single-seamed seam. This process is repeated a few times (e.g., six times) so that six loops are mounted on the circumference of the hollow body.
  • Hollow body fixed and detected one of the loops with a hook, which is connected to the load cell of the testing machine.
  • the testing machine will be in function set so that force transducer and fixation point from each other. This results in a train on the hinged loop, which is torn out when exceeding a certain tensile force from the hollow body. This force is read on the testing machine and repeated the attempt to statistically secure the measured value with all other loops in the manner described.
  • the mean value of the determined forces is the seam tear-out strength of the hollow body.
  • a tubular cellulose hollow body as described in the example is fixed horizontally on two Schlaucholiven with cable ties such that a slip-resistant and largely liquid-tight connection is given.
  • the distance between the olives is 100 mm.
  • One of the Schlaucholiven is connected to a valve, the other with a reservoir which contains water and can be pressurized by compressed air.
  • the pressure in this reservoir is increased to 200 mbar (g) until the cellulosic body is completely filled with water.
  • the valve is closed and the pressure in the reservoir is increased at a rate of 0.1-0.2 bar / s until the cellulose hollow body fails, which is indicated by a strong leakage of water at a narrow limit.
  • Example 2.1 4950 ml of nutrient solution containing per liter of deionized water 20.00 g of glucose anhydrous, 5.00 g of bactopeptone, 5.00 g of yeast extract, 3.40 g of di-sodium hydrogen phosphate dihydrate and 1.15 g of citric acid monohydrate and a pH Value between 6.0 and 6.3 (Hestrin-Schramm medium) and steam-sterilized at 121 ° C for 20 min in an autoclave, with 247.5 ml of a preculture of a bacterium of the genus Inoculated Gluconacetobacter. The sterilized device 1 was filled with the mixture thus prepared.
  • pooled template with the culture solution containing the microorganism was realized by means of the motor 7.
  • the templates assembled in a matrix arrangement were wetted in a time interval of 10 minutes.
  • the superimposed rotational movement about the axes of rotation 1 1 was carried out after each wetting process.
  • the bioreactor 1 including template matrix was disassembled, the BNC hollow cylinders produced were isolated from their templates 3, sterilized and cleaned.
  • Figs. 3, 5-9 are SEM images.
  • FIG. 3 shows the SEM image of the cross section of a BNC hollow cylinder in the overview.
  • the hollow cylinder is composed of 3 parallel rotationally symmetric to the axis and firmly interconnected layers (a, b, c), here referred to as phases (a, b, c) constructed.
  • phases a, b, c
  • the phase a has the inner surface (cavity-side surface) of the wall and is also called the "lumen-sided phase.”
  • the phase c indicates the outer
  • phase a In the lumen-side phase a, both the cross-sectional area and the angled side surface adjacent to the phase b are visible.
  • the lettering "phase a" is drawn on the cross-sectional surface, the side surface of the phase a is located to the right, and only cross-sectional areas of the phases b and c are visible. into the picture plane, are offset.
  • the strip to the right of phase c is a preparation artifact and not part of the wall or surface thereof.
  • the BNC hollow cylinder is limited by 2 layers / interfaces of high surface quality.
  • FIGS. 4-6 show SEM images of the fiber network structures of the phases ac building up the BNC hollow cylinder. All phases are characterized by a very uniform fiber structure of similar fiber density.
  • All three phases a, b, c have a similar spatial porosity, defined as the void volume / total volume.
  • the structure of the BNC hollow cylinders is comparable to that of the tunica media of cardiac arteries from alternating layers of elastic (the phase transitions described by us) and muscular components (the phases we have described).
  • the lumen-side phase a has the inner lumen-side surface of the hollow body
  • the externa ßere phase c has the outer surface of the hollow body. Due to the very uniform fiber structure and fiber density of phases a and c, the inner luminal surface of the hollow cylinder and the outer surface are likely to have similar porosity and similar coverage with fibers, with two-dimensional porosity as defined in FIG Description given.
  • bursting strength of the vascular prosthesis revealed burst pressures in the range of 800mmHg and above. Suture tear strength ranged from 8-10N.
  • the blood compatibility of the vascular prosthesis from Example 2.1 was determined by a
  • vascular prostheses including template matrix disassembled, the BNC hollow cylinder produced isolated from their templates 3, sterilized and purified.
  • the synthesis provided vascular prostheses with an inner diameter of 5 mm, a wall thickness of 3 mm and a length of 15 cm. Burst strength measurements of the vascular prosthesis revealed burst pressures greater than 800 mm Hg.

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Abstract

Verfahren zur Herstellung eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose, oder eines Vorprodukts eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose, das die folgenden Schritte umfasst: a) das in Kontakt bringen der Oberfläche eines Templates, das eine Negativform des Hohlraums des herzustellenden Hohlkörpers und der inneren Wände des Hohlraums ist, mit einem Gemischvorrat, der ein flüssiges Kulturmedium und einen Cellulose bildenden Mikroorganismus umfasst, b) die Unterbrechung des Kontakts zwischen dem Template und dem Gemischvorrat, wobei auf der Oberfläche des Templates ein Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, c) das in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre und die Bildung mikrobieller Cellulose in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm, d) das in Kontakt bringen der in Schritt c) erhaltenen Cellulose mit dem Gemischvorrat, e) die Unterbrechung des Kontakts zwischen der Cellulose und dem Gemischvorrat wobei auf der Oberfläche der Cellulose ein Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, f) das in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre und die Bildung mikrobieller Cellulose in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm, wobei die Folge der Schritte d), e) und f) optional ein- oder mehrmals wiederholt wird, g) optional die Trennung der mikrobiellen Cellulose von dem Template und Hohlkörper aus mikrobieller Cellulose, der nach dem Verfahren erhältlich ist.

Description

Verfahren zur Herstellung von Hohlkörpern aus mikrobieller Cellulose
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose und einen Hohlkörper aus mikrobieller Cellulose, der nach dem Verfahren erhältlich ist.
Um Blutgefäße und andere Hohlorgane im menschlichen oder tierischen Körper zu ersetzen, werden heute in der klinischen Praxis neben körpereigenen Gefäßen Prothesen aus synthetischen Polymeren eingesetzt. Die Präparation körpereigener Gefäße bedeutet für den Patienten einen zusätzlichen operativen Eingriff, welcher ebenfalls mit
beachtlichem Zeit- und Kostenaufwand verbunden ist. Au ßerdem verfügen viele, vor allem ältere Patienten, nicht über ein ausreichendes Maß an gesundem, zur Revaskularisation geeignetem Gefäßmaterial. Kommerzielle, synthetische Prothesematerialien aus
Dacron® und Teflon®, die in der allgemeinen Gefäß- und Thoraxchirurgie für den Ersatz von großlumigen Gefäßen (Gefäßdurchmesser > 6mm) wie der Aorta oder der
Beckenbeinarterien (lliacalarterien) Verwendung finden, unterliegen aufgrund von deutlicher Thrombogenität, unzureichender mechanischer Belastbarkeit, geringer
Elastizität/ verminderter Compliance sowie unzureichender Resistenz gegenüber
Infektionen bezüglich ihres Einsatzgebietes und ihrer Einsatzdauer starken
Beschränkungen. Für den kleinkalibrigen Gefäßersatz (Gefäßdurchmesser 3,0-6,0 mm) z. B. der Herzkranzgefäße sowie für den Mikrogefäßersatz (Gefäßdurchmesser 1 ,0-3,0 mm) können diese Materialien bisher nicht verwendet werden.
Alle natürlichen Blutgefäße sind mehr oder weniger elastische Röhren mit einer endothelialen Auskleidung. Der Aufbau der Gefäßwände entspricht in ihrer quantitativen und qualitativen Beschaffenheit den unterschiedlichen Funktionen der einzelnen
Blutkreislaufabschnitte. Grundlegend sind die Wände aller natürlichen Arterien und Venen durch einen 3-Schichten-Aufbau gekennzeichnet:
- Die Tunica intima besteht aus einer glatten, lumenseitigen Endothelschicht aus langgestreckten, parallel zur Blutstromrichtung angeordneten Zellen und einem daruntergelegenen Bindegewebe. Sie wird direkt über den Blutstrom mit
Nährstoffen und Sauerstoff versorgt.
- Die Tunica media ist die mittlere Wandschicht. Sie besteht aus dicht gefügten
glatten Muskelzellen mit zirkulärem oder spiralförmigem Verlauf und elastischen und kollagenen Fasern. - Die Tunica externa (Adventicia) ist die äu ßere dünne Bindegewebsschicht, die das Gefäß in dem umgebenden Gewebe verankert. In dieser Schicht befinden sich kleinere Blutgefäße für die Ernährung der Gefäßwand (Ausnahme Intima) und Nervengeflechte.
Während die Venen durch nur undeutlich voneinander abgrenzbare Schichten
charakterisiert sind, existieren bei den Arterien elastische Schichten zwischen Intima und Media (Membrana elastica interna) und zwischen Media und Adventitia (Membrana elastica externa). Da Venen im Blutkreislauf nur geringen Druckbelastungen ausgesetzt sind, sind ihre Gefäßwände dünner und muskuläre Elemente zugunsten des
Bindegewebes reduziert. Der Wandaufbau ermöglicht eine starke Dehnung der Venen, Venenklappen verhindern einen Rückfluss des Blutes und gewährleisten einen herzwärts gerichteten Blutstrom. Herznahe Arterien müssen sehr hohen Druckbelastungen standhalten. Sie sind vom „elastischen" Typ, d.h. ihre Media besteht aus wechselnden Lagen von elastischen Membranen und glatter Muskulatur. Die Anordnung der elastischen Elemente in einander überkreuzenden Spiralsystemen ermöglicht die zirkuläre und longitudinale, rhythmische Dehnung des Gefäßes (elastische Verformbarkeit). In den herzferneren Arterien ändert sich entsprechend der andersartigen Funktion der Bau der Gefäßwände. In den Gefäßen vom„muskulären" Typ verringern sich die elastischen Bauelemente, die muskulären nehmen zu bis das elastische Material auf die Lamina elastica interna und externa beschränkt ist. Die Gefäße sind so in der Lage, sich den jeweils herrschenden Blutdruckverhältnissen anzupassen (Roche Lexikon Medizin, Hrg. Hoffmann-La Roche AG und Urban &
Schwarzenberg, U & S München, Wien, Baltimore, 1998, 4. Auflage; K. Sommer (Hrg), Der Mensch-Anatomie, Physiologie, Ontogenie. Volk und Wissen, Berlin, 1983, 5.
Auflage).
Ein Blutgefäßimplantat, auch bezeichnet als„vascular graft", sollte deshalb den folgenden Anforderungen entsprechen:
Es soll eine dem natürlichen Blutgefäß möglichst nahekommende Struktur
(biomimetische Struktur) aufweisen. Es soll biokompatibel sein, d.h. es darf keine Thrombogenität und Immunogenizität besitzen. Es sollte resistent gegenüber Infektionen sein und in den Körper integriert werden, so dass im Idealfall das Blutgefäßimplantat nicht mehr vom nativen Gefäß unterschieden werden kann.
Es soll über die biologische Funktionalität der nativen Blutgefäße verfügen und den Aufbau körpereigener Strukturen anregen (Bioaktivität). Die innere Oberfläche des Implantats soll so beschaffen sein, dass sie keine thrombogenen Eigenschaften aufweist, die Anlagerung von körpereigenen Endothelzellen und die Ausbildung einer glatten konfluierenden Endothelschicht im künstlichen Gefäß ermöglicht. Die Wandung des Implantats soll einen Stoffaustausch, vergleichbar mit den natürlichen Austauschprozessen, gestatten.
Es soll eine angemessene mechanische Stabilität aufweisen, um den statischen, dynamischen und punktuellen Belastungen (z.B. Blutdruck, Körperbewegungen, Kräfte an der Verbindungsstelle zu den natürlichen Gefäßen) standzuhalten.
Darüber hinaus soll es in einem Hochdrucksystem dauerhaft funktionieren.
Es soll ausreichend elastisch, einfach sterilisierbar und chirurgisch sehr gut handhabbar sowie in den erforderlichen Abmessungen verfügbar und lagerfähig sein. Derartige Gefäßimplantate, die hinsichtlich Struktur, Eigenschaften und Funktionalität einem biomimetischen und bioaktiven Implantat entsprechen und deren Dimensionen (innerer Durchmesser von etwa 1 - 30 mm, Länge von 5 - 500 mm) hinsichtlich des Einsatzgebietes variiert werden können, sind bisher nicht bekannt. Bakterielle Nanocellulose (BNC) - auch mikrobielle Cellulose genannt und nachfolgend in dieser Beschreibung noch erläutert - bietet aufgrund ihrer exzellenten
Materialeigenschaften ideale Voraussetzungen für den Einsatz als Gefäßimplantat mit dem vorstehend beschriebenen Anforderungsbild. BNC unterscheidet sich in ihrer Morphologie deutlich von der Cellulose pflanzlichen Ursprungs. Sie besteht aus Fasern mit einem Durchmesser im Nanometerbereich (20- 100nm), die 100mal feiner als herkömmliche Pflanzencellulosefasern (Zellstoff) sind. Das natürliche Nanofaser- Netzwerk zeigt eine dem menschlichen Gewebe (Kollagen) vergleichbare Gerüststruktur. Es enthält bis zu 99% Wasser und ist in der Lage, intensive Wechselwirkungen mit der Umgebung einzugehen. BNC ist auch im feuchten Zustand mechanisch stabil. BNC ist ein hochreines Polymer, frei von pflanzlichen Begleitkomponenten wie Lignin, Pektin und Hemicellulosen. Sie zeichnet sich durch ein hohes Molekulargewicht (Polymerisationsgrad von ca. 4.000 - 10.000) und hohe
Kristallinität (80-90%) aus. BNC wird im menschlichen und Säugetierorganismus nicht abgebaut, löst keine Abwehrreaktionen des Körpers aus und wird von körpereigenen Zellen wirksam besiedelt (Klemm D, Kramer F, Moritz S, Lindström T, Ankerfors M, Gray D, Dorris A: Nanocelluloses: a new family of nature-based materials. Angew. Chem. Int. Ed. (201 1 ) 50, 5438-5466). Es sind mehrere Methoden bekannt, bakterielle Nanocellulose (BNC) insbesondere als Hohlkörper für chirurgische Anwendungen wie Blutgefäße oder Gewebeimplantate zu formen. Entsprechend den beschriebenen Formgebungsverfahren werden
unterschiedliche BNC-Hohlkörper mit unterschiedlicher Dimension, Struktur und
Oberflächengüte sowie mechanischer Belastbarkeit und Festigkeit erhalten.
Es ist bekannt, dass mikrobielle Cellulose direkt im Herstellungsprozess, insbesondere zu einem Hohlkörper geformt werden kann. Folgende Methoden der Herstellung
hohlzylindrischer Celluloseformkörper werden beschrieben: EP 396 344 A3 beschreibt die Herstellung eines mikrobiellen Cellulosehohlkörpers mittels zweier Glasröhren unterschiedlicher Durchmesser. Die Glasröhren werden ineinander gefügt, und im Raum zwischen den beiden Rohrwandungen wird die Kultivierung des Cellulose-bildenden Mikroorganismus statisch innerhalb von 30 Tagen durchgeführt. Dieses Verfahren erfolgt entsprechend der sogenannten horizontalen statischen
Kultivierungsmethode. Es entsteht eine mikrobielle Cellulose mit hohlzylindrischer Gestalt. Das Beispiel zeigt allerdings, z.B. anhand von Thrombenbildung, dass die innere
Oberfläche des nach diesem Verfahren mikrobiell hergestellten Hohlzylinders den
Qualitätsansprüchen an ein Gefäßimplantat nicht umfassend genügt. Die übliche statische Kultivierung schließt das Abwärtsschieben des Celluloseproduktes entlang der
Wandungen des verwendeten Kultivierungsgefäßes ein. Dieser Vorgang kann zur Bildung von Oberflächeninhomogenitäten wie z.B. Falten führen. Der Einsatz als Gefäßprothese ist daher eher bedenklich.
WO 01/61026 A1/ US2003013163 offenbart ein Herstellungsverfahren für geformte Biomaterialien, insbesondere für mikrochirurgische Anwendungen als Ersatz von Blutgefäßen mit 1 -3 mm Durchmesser und kleiner. Die Herstellung eines Cellulosehohlkörpers erfolgt mittels zweier Glasröhren unterschiedlicher Durchmesser, die in die mit den Cellulose-bildenden Bakterien beimpfte Nährlösung eintauchen, so dass die Nährlösung in den Zwischenraum der Glasmatrix durch Kapillarkraft eingezogen und Nährlösungs- sowie Luftzirkulation möglich wird. Im Kultivierungsgefäß ist während des gesamten Kultivierungsprozesses ein feuchtes, aerobes Milieu zur Cellulosebildung gewährleistet. Nach 7-14 Kultivierungstagen bildet sich im Kultivierungsgefäß
entsprechend der üblichen statischen Kultivierung ein anisotropes, schichtartiges BNC- Vlies aus. Im Zwischenraum zwischen den beiden Glasrohren bildet sich gleichzeitig unter den modifizierten statischen Kultivierungsbedingungen ein Cellulosehohlzylinder aus einem Mikrofibrillar/Nanocellulosenetzwerk rotationssymmetrisch um den Glaskern entlang der Längsachse des hohlzylindrischen Innenraums der Glasmatrix. Der Nachteil dieser Methode besteht darin, dass die auf diesem Wege produzierten Hohlkörper nur eine Länge von wenigen Zentimetern (bis zu 3 cm) erreichen.
WO2007/093445A1 / US200901 1 161 beschreibt einen Prozess zur Herstellung eines langen Cellulosehohlkörpers, indem ein Cellulose-bildender Organismus im Innenraum eines hohlen Formkörpers kultiviert wird und der lange Cellulosehohlkörper in diesem Innenraum wächst. Im Rahmen der Erfindung wird auf die Rotationssymmetrie um die zylindrische Achse des hohlzylindrischen Innenraumes verzichtet, indem der
Cellulosehohlkörper nicht entlang der Längsachse eines Innenraumes sondern im
Wesentlichen senkrecht dazu von einer Längsseite des hohlen Formkörpers zur gegenüberliegenden Längsseite entsteht. Das bedeutet, dass die Länge des
Cellulosehohlkörpers nicht länger durch die Schichtdicke limitiert wird, die durch den statischen Wachstumsprozess erreicht werden kann und so jede gewünschte Länge denkbar ist.
Der Nachteil dieser Methode besteht zum einen im Herstellungsaufwand. Zunächst wird eine übliche statische Kultivierung zum Aufbau einer Celluloseschicht 7-10 Tage durchgeführt. Danach wird der hohle Formkörper mit den entsprechenden Öffnungen auf die wachsende und mit einem Trägernetz unterstützte Celluloseschicht gelegt, so dass die Bakterien in den Hohlkörper von außen eindringen und die Cellulose unter
modifizierten statischen Kultivierungsbedingungen parallel aber nicht
rotationssymmetrisch zur Längsachse des Formkörperinnenraumes, also von unten nach oben, in dem Formkörper innerhalb von 2 bis 3 Wochen gebildet wird. Während der Kultivierung ist darauf zu achten, dass verbrauchte Nährlösung ersetzt wird. Die durch einen unteren Schlitz der Matrix einwandernden Bakterien müssen sich im Verlauf der Kultivierung an die kontinuierliche Veränderung der Biosyntheseflächen (Wechsel zwischen Vergrößerung und Verkleinerung) anpassen. Insbesondere das Verbinden der beidseits des Matrixkerns getrennt voneinander aufgebauten Bakteriencellulose- Halbzylinder zu einer homogenen Einheit ist problematisch.
Die strukturellen Gegebenheiten des Formkörpers variieren sowohl längs als auch senkrecht zur Achse. Diffussionsprozesse der Kulturlösung zum Biosyntheseort durch die primär aufgebaute Celluloseschicht sowie die sich aufbauende sekundäre
Celluloseschicht innerhalb des Formkörpers führen zur Ausbildung zusätzlicher strukturellen Inhomogenitäten. Die isolierten Cellulosehohlkörper sind dadurch vermindert formstabil sowie unzureichend mechanisch stabil, was zu großen Problemen z.B. der Druckstabilität führt. Auch die innere und äußere Begrenzung des Cellulosehohlkörpers sind deshalb als inhomogen und instabil anzusehen, so dass die innere und äu ßere Wand einem angelegten Druck gar nicht oder nicht gleichmäßig entgegenwirken kann. Das Lumen wird geweitet, es entstehen Beulen und Mulden, was die Bildung von Thromben begünstigen sollte. Darüber hinaus ist der im Patent beschriebene Bildungsprozess nur sehr schwer reproduzierbar zu gestalten und kaum für die Produktion großer Stückzahlen zu realisieren.
Desweiteren gibt es Schriften, die sich mit der Herstellung von BNC-Hohlkörpern an gaspermeablen Oberflächen beschäftigen. Nach EP 186 495 A2 wird geformte mikrobielle Cellulose an gaspermeablen Materialien (z.B. PVC, Cellulose, Cellulosederivate, Polyethylen, Silikon, PTFE) aufgebaut, indem die eine Seite des Materials mit einem Sauerstoff-enthaltenden Gas in Kontakt steht und die andere mit der Nährlösung, so dass die mikrobielle Cellulose an dieser Seite gebildet und anschließend isoliert wird. Wird z.B. ein entsprechender Dialyseschlauch aus
herkömmlicher Cellulose mit Nährmedium und Cellulose-bildenden Mikroorganismen befüllt und die Kultivierung über einer geringen Menge destillierten Wassers in
geschlossenen Glasgefäßen zur Gewährleistung feuchter aerober Bedingungen durchgeführt, bildete sich innerhalb von 2 Tagen bei 25^ im Inneren des
Dialyseschlauches zylindrisch geformte mikrobielle Cellulose. Wird hingegen ein Luft- gefüllter Dialyseschlauch in ein mit Kulturlösung befülltes abgeschlossenes Gefäß gegeben, findet man nach 3 Kultivierungstagen eine Ummantelung des permeablen Materials mit einer dünnen Celluloseschicht.
Der in EP 396 344 A3 beschriebene Prozess zur Herstellung mikrobieller
Cellulosehohlkörper schließt ebenfalls die Kultivierung eines Cellulose-produzierenden Mikroorganismus an der inneren und/oder äu ßeren Oberfläche eines Sauerstoff- permeablen Hohlträgers aus Cellophan, Teflon, Silikon, Keramik oder einem nicht- gewebten bzw. einem gewebten Material ein. Ein Cellulose-produzierender
Mikroorganismus und ein Kulturmedium werden der inneren und/oder äußeren Seite des Hohlträgers zugeführt. Die Kultivierung erfolgt unter Zuführung eines Sauerstoff-haltigen Gases (oder Flüssigkeit) ebenfalls an der besagten inneren und/oder äu ßeren Seite des Hohlträgers. Es bildet sich eine gallertartige Cellulose mit einer Schichtstärke von 0,01 bis 20 mm an der Oberfläche des Hohlträgers. Auf Grund der Wechselwirkung des Cellulose- produzierenden Mikroorganismus, der produzierten Cellulose und des Hohlträgers entsteht innerhalb von 1 -2 Monaten ein Komposit von Cellulose und Hohlträger. Ist die Cellulose nicht an den Träger gebunden, wird dieser nach der Synthese der Cellulose entfernt. Ein hohl geformter Artikel, der ausschließlich aus Cellulose besteht, kann erhalten werden. WO 2008/040729 A2 beschreibt eine Methode zur Herstellung von Cellulosehohlkörpern durch Kultivierung von Cellulose-produzierenden Mikroorganismen an der äu ßeren, gleichmäßig glatten Oberfläche eines hoch Sauerstoff-permeablen, nicht-porösen Hohlträgers wie Dimethylsilikon, Vinylmethylsilikon, Fluorosilikon, Diphenylsilikon, Nitrilsilikon). Der Innenraum des Hohlträgers wird mit einem Sauerstoff-enthaltendem Gas, dessen Sauerstoffgehalt über dem des Atmosphärensauerstoffs liegt (bevorzugt 100% Sauerstoff), beliefert, so dass der Cellulose-produzierende Mikroorganismus kontinuierlich und im notwendigen Umfang mit Sauerstoff versorgt wird. Der Sauerstoff- Partialdruck wird ebenfalls variiert. Es können Cellulosehohlkörper verschiedener Dimension und Form sowie mit Verzweigungen aufgebaut werden, die zum Einsatz in der Chirurgie von Mensch und Tier zum Ersatz oder zur Reparatur von inneren Hohlorganen wie Harnröhre, Harnleiter, Luftröhre, Verdauungstrakt, Lymphgefäße oder Blutgefäße gedacht sind. Die Cellulosehohlkörper sind aus einzelnen Schichten parallel zur
Gefäßwand aufgebaut, und weisen eine dichte innere und eine poröse äußere Oberfläche auf. Berstdrücke bis zu 880 mmHg werden in Beispielen angegeben. Es ist angegeben, dass durch die Konzentration vom Sauerstoff im Gas, das durch die nicht-porösen, Sauerstoff-permeablen Hohlträger geleitet wird, die Festigkeit der aufgebauten Bakterielle Cellulose (BC)-Röhrchen steuerbar ist.
Bodin et al. (Bodin A, Bäckdahl H, Fink H, Gustafsson L, Risberg B, Gatenholm P:
Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotech. Bioeng. (2007) 97, 425-434) betrifft den gleichen Gegenstand wie WO 2008/040729 A2, was man bei einem Vergleich der Abbildungen beider
Publikationen ersieht. Die potentiellen Gefäßprothesen erreichten einen Berstwert von 880 mmHg, wenn sie in Gegenwart von 100% Sauerstoff produziert werden. Innerhalb von ca. 5-7 Kultivierungstagen ist es möglich, BC-Röhrchen variabeler Längen und
Durchmesser (z.B. 1 ,5 -6,0 mm) sowie mit Verzweigungen zu produzieren. Zusätzlich zu WO 2008/040729 A2 offenbart Bodin et al. mechanische Tests der hergestellten
Hohlkörper. Ein Spannungs-Dehnungs-Test weist darauf hin, dass die Hohlkörper aus Schichten aufgebaut sind, die nicht fest miteinander verbunden sind, erkennbar an verschiedenen Peaks im Spannungs-Dehnungs-Diagramm in Fig. 8.
Bäckdahl et al. (Bäckdahl H, Risberg B, Gatenholm P: Observations on bacterial cellulose tube formation for application as vascular graft. Materials Science and Engineering (201 1 ) 31 , 14-21 ) betrifft den gleichen Gegenstand wie WO 2008/040729 A2, was man aus dem Material-und-Methoden-Teil ersieht. REM-Untersuchungen und Untersuchungen mittels konfokaler Mikroskopie an ungereinigten BC-Röhrchen zeigen hohe
Bakterienkonzentrationen dicht am Lumen.
Die oben zitierte Biosynthese von bakterieller Cellulose an der Oberfläche von
sauerstoffdurchlässigen Membranen ist vergleichbar mit der statischen Horizontal- Kultivierung. Abweichend davon erfolgt die Biosynthese nicht unmittelbar an der
Grenzfläche Nährmedium-Luft sondern an der Grenzfläche Nährmedium- sauerstoffpermeabler Hohlträger. Die BNC-Bildung ist nicht mehr auf nur eine Richtung beschränkt, sondern erfolgt in alle Raumrichtungen. Der Aufbau von BNC-Körpern mit fast unbegrenzter Hohlkörperlänge/ Dimension wird somit möglich, allerdings sind aufgrund des diffusionsbestimmten Nährstofftransports und der Material-bestimmten
Sauerstoffversorgung Limitierungen der Wandstärken zu erwarten. Im Vergleich zur Nährmedium-Luft Grenzflächenkultivierung geben Putra et al. eine Reduzierung der Celluloseschichtdicke um Zweidrittel an (A Putra, A Kakugo, H Furukawa, JP Gong, Y Osada: Tubulär bacterial cellulose gel with oriented fibrils on the curved surface. Polymer (2008) 49, 1885-1891 ).
Bekannt ist auch die BNC-Herstellung unter Verwendung von Reaktoren mit rotierenden Scheiben„rotating disc reactors" (WO 9705271 A1 , Mormino R, Bungay H: Composites of bacterial cellulose and paper made with a rotating disk bioreactor. Appl. Microbiol.
Biotechnol. (2003) 62, 503-506). Die Grundidee dieses Verfahrens besteht darin, wachsende Zellen an Strukturelemente eines Bioreaktors zu heften, um einen Biofilm zu bilden. Indem diese Strukturelemente durch eine stationäre Nährlösung bewegt werden, fördert man weiterhin das Zellwachstum. Eine oder mehrere ständig rotierende - z.B. perforierte oder aufgerauhte - Scheiben tauchen partiell aber dauerhaft in eine
Kulturlösung, die Cellulose-produzierende Mikroorganismen enthält, ein. Auf der
Oberfläche dieser Scheiben bildet sich eine stark gelatisierte und stark hydratisierte Cellulose, die sich deutlich von mikrobieller Cellulose unterscheidet, die unter statischen Bedingungen hergestellt wurde. So ist diese Cellulose durch eine lockerere Struktur und eine höhere Wasserabsorptionskapazität sowie reduzierte mechanische Kenngrößen (Elastizitätsmodul, Zugfestigkeit) gekennzeichnet. Die äußeren Kräfte, die durch die Rotationsbewegung während der Kultivierung auftreten, bewirken Störungen im gesamten Kristallisationsprozess und somit eine lockerere und ungeordnetere BC-Faserstruktur. Der Austausch der Scheiben gegen eine horizontal angeordnete Walze macht es zwar möglich, Röhren unterschiedlicher Durchmesser herzustellen Krystynowicz A, Czaja W, Wiktorowska-Jezierska A, Goncalves-Miskiewicz M, Turkiewicz M, Bielecki S: Factors affecting the yield and properties of bacterial cellulose. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2002) 29, 189-195), eine Verwendung als Gefäßersatz scheint aufgrund des Eigenschaftsprofils aber nicht möglich. Eine Verbesserung der mechanischen
Eigenschaften der unter dynamischen Bedingungen hergestellten Cellulose-Tubes konnte nur durch den Einbau eines Verstärkungsmaterials (Polyesterschlauch) erreicht werden (Ciechanska D, Wietecha J, Kazmierczak D, Kazmierczak J: Biosynthesis of modified bacterial cellulose in a tubulär form. Fibres and Textiles in Eastern Europe (2010) 18, 98- 104).
In WO 2000023516 wird ein Prozess zur Herstellung eines extrudierten
Celluloseproduktes (Film, Rohr/Schlauch, Faser) beschrieben, der die Herstellung einer Celluloselösung aus nicht-bakterieller und bakterieller Cellulose in einem Aminoxid- Lösungsmittel einschließt. Der Anteil der bakteriellen Cellulose beeinflusst die mechanischen Eigenschaften der Endprodukte. Die Bildung der genannten Produkte erfolgt durch ein rein technisches Verfahren. Durch den hierfür notwendigen Löseprozess wird die einzigartige Struktur der Bakteriencellulose zerstört. Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein verbessertes Verfahren anzugeben, womit Hohlkörper aus mikrobieller Cellulose hergestellt werden können. Die Hohlkörper sollten möglichst in beliebiger Form herstellbar sein. Weiterhin war es eine Aufgabe, einen verbesserten Hohlkörper aus mikrobieller Cellulose bereitzustellen, insbesondere für medizinische Anwendungen. Eine oder mehrere dieser Aufgaben werden gelöst mit einem Verfahren zur Herstellung eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose und einem Hohlkörper aus mikrobieller Cellulose, wie in den unabhängigen Ansprüchen angegeben, oder mit vorteilhaften Ausgestaltungen der Erfindung, wie in den Unteransprüchen angegeben. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine verbesserte Vorrichtung und ein Verfahren anzugeben, womit Hohlkörper mit hoher Festigkeit und hoher Bioverträglichkeit aus einem mikrobiellen Polymer, insbesondere mikrobieller Cellulose, hergestellt werden können. Wenn möglich sollte die Fertigung in hoher Stückzahl mit möglichst wenig Aufwand durchführbar sein. Die Kultivierungszeiten sollen möglichst kurz, vorzugsweise bis zu maximal 7 Kultivierungstagen, liegen. Die Hohlkörper sollen weiterhin in beliebiger Form herstellbar sein. Eine oder mehrere dieser Aufgaben werden gelöst mit einer Vorrichtung und einem Verfahren Herstellung eines Hohlkörpers aus einem mikrobiellen Polymer, wie von dieser Beschreibung angegeben. Angegeben wird ein Verfahren zur Herstellung eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose, das die folgenden Schritte umfasst:
a) das in Kontakt bringen der Oberfläche eines Templates,
das eine Negativform des Hohlraums des herzustellenden Hohlkörpers und der inneren Wände des Hohlraums ist,
mit einem Gemischvorrat, der ein flüssiges Kulturmedium und einen Cellulose bildenden Mikroorganismus umfasst,
b) die Unterbrechung des Kontakts zwischen dem Template und dem
Gemischvorrat, wobei auf der Oberfläche des Templates ein Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, c) das in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen
Atmosphäre und die Bildung mikrobieller Cellulose in und/oder auf dem
Flüssigkeitsfilm,
d) das in Kontakt bringen der in Schritt c) erhaltenen mikrobiellen Cellulose mit dem Gemischvorrat,
e) die Unterbrechung des Kontakts zwischen der mikrobiellen Cellulose und dem Gemischvorrat wobei auf der Oberfläche der mikrobiellen Cellulose ein
Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den
Mikroorganismus umfasst,
f) das in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen
Atmosphäre und die Bildung mikrobieller Cellulose in und/oder auf dem
Flüssigkeitsfilm, wobei die Folge der Schritte d), e) und f) optional ein- oder mehrmals wiederholt wird, g) optional die Trennung der mikrobiellen Cellulose von dem Template.
Der Begriff„mikrobielle Cellulose" bezeichnet eine Cellulose, die durch einen
Mikroorganismus produziert wird. Beispielhafte Mikroorganismen sind Pilze, Bakterien und Algen. Eine Reihe von Mikroorganismen ist in der Lage, Cellulose herzustellen. Dazu zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Algen wie Valonia und Boergesenia, Pilze wie Dictyostelium discoideum und Bakterien wie Gluconacetobacter, Enterobacter,
Agrobacterium, Sarcina, Pseudomonas, Rhizobium und Zoogloea. Beispiele von
Gluconacetobacter spezies sind Acetobacter xylinum, Acetobacter pasturianus,
Acetobacter aceti, Acetobacter ransens. Ein besonders geeigneter Mikroorganismus ist Gluconacetobacter, insbesondere Gluconacetobacter xylinus.
Mikrobielle Cellulose wird herkömmlich durch Mikroorganismen an der Grenzfläche zwischen Luft und einem z.B. D-Glucose-haltigen Nährmedium in Form eines Biofilms (Vlies) hergestellt. Die Bakterien stoßen die Cellulose als Fibrillen aus. Diese lagern sich zu Fasern zusammen. Durch die Verflechtung der Fasern entsteht ein dreidimensionales, hoch wasserhaltiges Nanofaser-Netzwerk, das aus ca. 99% Wasser und 1 % Cellulose besteht (Jonas R, Farah LF: Production and application of microbial cellulose. Polym. Degrad. Stab (1998), 59(1 -3), 101 -106; Hirai A, Horii F: Cellulose assemblies produced by Acetobacter xylinum. ICR Annual Report (1999) 6, 28-29; Klemm D, Heublein B, Fink H-P, Bohn A: Cellulose: fascinating biopolymer as sustainable raw material. Angew. Chem. Int. Ed. (2005) 44, 3358-3393). Das Kulturmedium, auch bezeichnet als„Nährlösung" oder„Nährmedium" enthält übliche Bestandteile zur Kultivierung eines Cellulose produzieren Mikroorganismus, wie z.B.
Glucose, Pepton, Hefeextrakt, Natriumhydrogenphosphat und Citronensäure in wässriger Lösung (Hestrin-Schramm-Medium). Ein alternatives saures Medium besteht aus einer wässrigen Lösung von Glucose, Pepton, Hefe, Essigsäure und Ethanol.
Das Verfahren wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 bis 40 ^ durchgeführt.
Mikrowelle Cellulose wird, sofern sie von Bakterien hergestellt wird, auch mit den
Begriffen„bakterielle Cellulose" und„bakterielle Nanocellulose" (BNC) bezeichnet. Der Begriff „bakterielle Nanocellulose (BNC) ist daraus hergeleitet, dass bakteriell produzierte Cellulose wie oben erwähnt ein Nanofasernetzwerk bildet.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber der Biosynthese von bakterieller Cellulose an der Oberfläche einer sauerstoffdurchlässigen Membran nach dem Stand der Technik sind unter anderem folgende:
I. Wird die Cellulose an der inneren Seite eines permeablen Hohlträgers
synthetisiert, wird die innere Formkörperwandung ohne Begrenzung aber in ständigem Kontakt zur Kulturlösung„frei" im Raum entwickelt und stellt die ursprünglich erste (älteste) und lockerere Cellulosegelschicht dar. Im Verlauf der
Kultivierung steht der an der inneren Hohlträgeroberfläche gebildeten
Celluloseschicht, die sich in die Nährlösung hineinbewegt, immer weniger Platz zur Verfügung. Die Ausbildung von Störstellen (Faltungen, Verdichtungen) innerhalb des Schichtsystems und am Lumen ist die Folge. Weitere wesentliche Nachteile dieser Methoden bestehen demnach darin, dass die auf diese Weise hergestellten Hohlzylinder keine hinreichend glatte, homogene innere Oberfläche aufweisen. Da neben der Ausbildung von gravierenden
Oberflächeninhomogenitäten durch Falten- oder Muldenbildung auch die Gefahr der Ablösung von Teilen der Cellulose gegeben ist, bergen diese Hohlzylinder ein sehr großes Thromboserisiko. Die Qualität des inneren Lumens kann den
Anforderungen an einen Blutgefäßersatz nicht entsprechen.
II. Wird die Cellulose an der äußeren Seite eines permeablen Hohlträgers
synthetisiert, wird die jüngste Celloluloseschicht immer zwischen bereits gebildeten Celluloseschichten und der äußeren Oberfläche des Hohlträgers gebildet. Daher entspricht das Lumen des BNC-Hohlkörpers, wenn der
Hohlträgers entfernt wurde, der aktuell synthetisierten jüngsten, festeren
Celluloseschicht, die eine hohe Bakterienzahl enthält (Bäckdahl H, Risberg B, Gatenholm P: Observations on bacterial cellulose tube formation for application as vascular graft. Materials Science and Engineering (201 1 ) 31 , 14-21 ).
Im Verlauf der Kultivierung muss die an der äußeren Hohlträgeroberfläche gebildete Celluloseschicht, die sich in die Nährlösung hineinbewegt und damit nach au ßen ortsverlagert wird, eine immer größere Fläche abdecken.
Morphologische Veränderungen können die Folge sein. Bodin et al. (Bodin A, Bäckdahl H, Fink H, Gustafsson L, Risberg B, Gatenholm P: Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotech Bioeng (2007) 97, 425-434) berichten von einem, die Gefäßwand aufbauendem Schichtensystem aus sehr vielen, nicht fest miteinander verbundenen Einzelschichten ähnlicher Morphologie, so dass die Gefahr des Ablösens bzw. Verschiebens einzelner Schichten gegeben ist.
III. Au ßerdem kann davon ausgegangen werden, dass die Oberflächentopgraphie (Rauhigkeit) des inneren Lumens sehr stark von der Oberflächenstruktur des eingesetzten gas-permeablen Materials (Poren, Spalten, Kanäle und andere Unregelmäßigkeiten) bestimmt wird. Poröses Material erlaubt nur die Passage von Mikrosauerstoffblasen, die die Sauerstoffversorgung der Mikroorganismen nicht gleichmäßig über die gesamte Wachstumsebene gewährleisten und somit die Cellulosebildung stören und zu Defekten/Inhomogenitäten in der gesamten aufgebauten hohlen Cellulose, insbesondere aber auch im Lumen der hohlen Cellulose führen können.
IV. Nicht-poröses Material soll die gleichmäßige Sauerstoffversorgung der
Mikroorganismen gewährleisten und die Gasblasenbildung unterbinden. Als mögliche Folge kann eine zu starke Haftung der BNC am Trägermaterial angenommen werden. Die Isolierung des Cellulosetubes führt zu Verletzungen der inneren Oberfläche. V. Durch die Erhöhung des angelegten partiellen Sauerstoffdrucks an der äußeren Wandung eines gaspermeablen, nicht-porösen Hohlträgers wie in WO
2008/040729 A2 beschrieben, wird ein Gasüberdruck an der inneren Wandung des gebildeten Cellulosehohlkörpers initiiert. Dieser Gasüberdruck wirkt zum einen der Diffusion der Kulturlösung durch die gebildete Cellulose entgegen, zum anderen können auch Ablöseprozesse der sich bildenden Cellulose vom Träger während der Kultivierung nicht ausgeschlossen werden. Das Einschließen von Gasblasen führt zu Fehlstellen/Inhomogenitäten innerhalb der Cellulose sowie an der inneren Oberfläche.
VI. Die hohe Konzentration an Cellulose-synthetisierenden Bakterien über die
gesamte innere Oberfläche der Cellulosehohlkörper stellt hohe Anforderungen an eine sich an Produktion und Isolierung anschließende Reinigung, da bei
Verwendung der so hergestellten Cellulosehohlkörper als Blutgefäßersatz diese innere Oberfläche der Kontaktfläche mit dem Blut entspricht. Trotz intensiver Reinigung können Reaktionen des Immunsystems auf Verunreinigungen nicht ausgeschlossen werden.
VII. Wird BNC an der Oberfläche von sauerstoffdurchlässigen Membranen kultiviert, ist von verminderter Biokompatibilität, -Stabilität sowie fehlender Bioaktivität des Materials auszugehen. Außerdem ist das Kultivierungsverfahren an sich nur sehr eingeschränkt steuerbar. Lediglich die Sauerstoffzufuhr und der Durchmesser der
Hohlkörper-Membranen bieten die Möglichkeit, auf die Morphologie des BNC- Hohlkörpers und damit auf mechanische Eigenschaften Einfluss zu nehmen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Kultivierung nicht rein statisch, sondern in sogenannter„bewegt-statischer" Form, wobei das Template oder das Gemisch, enthaltend Kulturlösung und Mikroorganismus, oder beides, gesteuert so bewegt werden, dass die Oberfläche des Templates benetzt wird. Ein dauerhafter Kontakt des Templates mit dem Gemischvorrat wird jedoch ausgeschlossen. Das Template und der
Gemischvorrat, der das Kulturmedium und den Mikroorganismus aufweist, werden relativ zueinander bewegt und dabei zeitweise, aber nicht ständig, in Kontakt gebracht.
Kennzeichen des Verfahrens sind ein periodisch aber nicht dauerhaft mit Kulturlösung und Mikroorganismus in Kontakt gebrachtes Template, die Ausbildung eines Films, der Kulturmedium und Mikroorganismus enthält, auf dem Template und die Biosynthese der Cellulose auf dem Template ausschließlich in und/oder auf dem Film - au ßerhalb des Gemischvorrats. Der Begriff „Unterbrechung des Kontakts" bedeutet, dass der Kontakt zwischen Template und Gemischvorrat so unterbrochen wird, dass kein Teil der
Oberfläche des Templates während der Unterbrechung Kontakt zum Gemischvorrat hat. Das Templat wird also bei der Unterbrechung des Kontakts von dem Gemischvorrat vollständig getrennt bzw. von dem Gemischvorrat vollständig entfernt.
Es wird in dem Verfahren die Innenkontur des Hohlkörpers durch ein geeignet geformtes Template vorgegeben, auf dessen Oberfläche sich bei Durchführung des Verfahrens ein Flüssigkeitsfilm befindet, in welchem die Biosynthese der Cellulose abläuft. Somit bildet die direkt auf der Templateoberfläche erzeugte Cellulose später die innere Oberfläche des Hohlkörpers. Auf dieser auf der Templateoberfläche erzeugten Cellulose kann durch das Verfahren weitere Cellulose erzeugt werden.
Durch periodischen, aber vorzugsweise kurzzeitigen Kontakt mit dem Kulturmedium wird eine Versorgung der Mikroorganismen mit Nährstoffen etc. sichergestellt. Die äu ßere Formung des Hohlkörpers erfolgt erfindungsgemäß berührungsfrei, ausschließlich durch den Einfluss der Schwerkraft. Nach dem Benetzungsvorgang befindet sich das benetzte Template frei in der umgebenden Sauerstoff-haltigen Atmosphäre und der
Cellulosebildungsprozess erfolgt in und/oder auf dem Film. Die gesamte Oberfläche des Templates bzw. der darauf befindliche Film befindet sich in der umgebenden Sauerstoffhaltigen Atmosphäre.
Bei dem Verfahren ist kein äu ßerer Formkörper vonnöten wie z.B. bei Verfahren der statischen Kultivierung, wo mikrobielle Cellulose durch Kultivierung eines Cellulose- bildenden Mikroorganismus in einem Raum zwischen zwei Wandungen gebildet wird. Die äu ßere Formgebung des Hohlkörpers wird ausschließlich durch die Wahl der
Kultivierungsbedingungen definiert. Zu den Kultivierungsbedingungen zählen
beispielsweise die Richtung der Schwerkrafteinwirkung, die Häufigkeit und der Abstand einzelner Drehungen, das Zeitintervall zwischen den Benetzungen, die Benetzungszeit, die Verweilzeit, wie nachfolgend noch erläutert, die Temperatur, und die
Kultivierungsdauer. Während des Verfahrens ist ein Kulturlösungs- und
Sauerstoffaustausch zwischen der sich bildenden Schicht des Hohlkörpers und dem Kultivierungsmillieu gegeben, so dass eine optimale Versorgung mit Nährmedium, Luft und Mikroorganismen gewährleistet ist. Bei dem Verfahren werden Prozesse vermieden, bei welchen Stoffe durch eine bereits gebildete Celluloseschicht hindurchtreten müssen, was zu Störungen im Aufbau dieser Schichten führen kann. Erfindungsgemäß erfolgen eine kurzzeitige Benetzung und damit die erforderliche Zufuhr der Kulturlösung an den Ort der Biosynthese. Damit ist die Zufuhr der Kulturlösung im Gegensatz zu den genannten und diskutierten Publikationen nicht mehr
diffusionsbestimmt. Bei der Benetzung werden alle für die Biosynthese notwendigen Nährstoffe sowie Bakterien übertragen.
Bei der BNC-Herstellung unter Verwendung von Reaktoren mit rotierenden Scheiben wird zwar die Diffusionsbarriere überwunden, was durch eine ständige rotierende Bewegung des Templates in der Kulturlösung erreicht wird. Der dauerhafte Kontakt der
Mikroorganismen mit der Kulturlösung führt aber zu BNC-Produkten mit strukturellen Nachteilen, wie bei der Würdigung des Standes der Technik genannt. Durch die gesteuerte Zufuhr der Kulturlösung wird erfindungsgemäß die
Cellulosebildungsgeschwindigkeit so geregelt, dass optimale Verdichtungs- und
Verfestigungsprozesse ermöglicht werden. Überraschend bietet das erfindungsgemäße Verfahren optimale Bedingungen für die Anlagerung von Bakterien an ein Template und deren gleichmäßige Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff. Gleichzeitig wird die BNC mit in der Kulturlösung
freibeweglichen Bakterienzellen beladen. Der Ort der Biosynthese und damit der Ort der höchsten Bakterienkonzentration befinden sich in der äußeren Grenzschicht des Hohlkörpers und damit nicht auf der Seite des Hohlraums, der bei einem künstlichen Blutgefäß das perspektivisch mit Blut in Kontakt stehende Lumen bildet. Das erfindungsgemäße Verfahren, kann in der in den Ausführungsbeispielen
beschriebenen Vorrichtung durchgeführt werden. Es wird vorzugsweise in einer zuvor sterilisierten Vorrichtung durchgeführt und mit sterilem Kulturmedium. In einer Variante können das Kulturmedium und die Vorrichtung getrennt voneinander sterilisiert werden. In einer anderen Variante werden das Kulturmedium und die Vorrichtung gemeinsam sterilisiert und anschließend der Mikroorganismus zugeführt. Mit dem Verfahren wird die Herstellung von Cellulosehohlkörpern mit verschiedenen Mikro- und Nanostrukturen ermöglicht. Es ist möglich, Mikro- und Nanostrukturen gezielt aufzubauen. Es können biomimetische Hohlkörper erzeugt werden. Der Begriff „biomimetisch" bedeutet, dass ein menschliches oder tierisches Hohlorgan,
beispielsweise ein Blutgefäß, durch den erfindungsgemäß hergestellten Hohlkörper strukturell und/oder funktionell nachgebildet wird, wobei die strukturellen/funktionellen Eigenschaften der natürlichen Vorlage nicht notwendigerweise exakt erfüllt sein müssen. Der Begriff„biomimetische Struktur" bezeichnet insbesondere eine dem natürlichen Blutgefäß möglichst nahekommende Struktur.
Mit dem Verfahren hergestellte BNC-Implantate sind durch verbesserte mechanische Eigenschaften und bioaktive Oberflächen gekennzeichnet. Unter einem Hohlkörper ist ein Körper zu verstehen, der eine Wand aufweist, die einen Hohlraum umgibt. Die Wand kann eine oder mehrere Öffnungen haben, durch welche der Hohlraum zugänglich ist.
Grundsätzlich kann der Hohlkörper beliebig geformt sein. Die Form wird dem späteren Einsatzzweck angepasst. Für medizinische Verwendungen als Implantat kann der Hohlkörper z.B. die Form eines Blutgefäßes, einer Speiseröhre, eines Teils des
Verdauungstrakts, einer Luftröhre, einer Harnröhre, eines Gallengangs, eines Harnleiters, eines Lymphgefäßes oder einer Manschette (cuff) haben. Diese natürlichen Formen können exakt oder annähernd erreicht sein.
In einer Ausführungsform hat der Hohlkörper die Form einer Röhre oder eines
Hohlzylinders. Ferner kann der Hohlkörper eine oder mehrere Biegungen aufweisen, beispielsweise eine Röhre mit einer oder mehreren Biegungen sein. Weiterhin kann der Hohlkörper eine oder mehrere Verzweigungen bzw. Verästelungen aufweisen, beispielsweise kann der Hohlkörper eine Y-Form haben.
Länge und Innendurchmesser des Hohlkörpers sind variabel und variabel miteinander kombinierbar. Beispielhafte Innendurchmesser sind 1 -30 mm, vorzugsweise 2 bis 8 mm, und beispielhafte Längen sind 5-500 mm, vorzugsweise 100-200 mm. Das Längen- Durchmesser-Verhältnis ist vorzugsweise größer 1 . Der Innendurchmesser kann auch innerhalb eines Hohlkörpers variieren.
Der Hohlkörper, insbesondere sein Hohlraum, kann statt eines runden auch einen anders geformten Querschnitt, beispielsweise einen quadratischen, rechteckigen, dreieckigen, oder sternförmigen Querschnitt aufweisen.
Das Template, oder auch„Templat", ist wie bereits erwähnt die Negativform des
Hohlraums des Hohlkörpers und der inneren Wände des Hohlraums. Der Begriff
„Negativform" bezeichnet das Hilfsmittel, die Positivform ist das gewünschte Ergebnis, in diesem Fall der/die Hohlkörper/Hohlraum/Hohlraumwand. Das Template ist komplementär zur Form des gewünschten herzustellenden Hohlraums geformt und wird entsprechend vorgegeben. Entsprechend ist über die Form der oben angegebenen Hohlkörper auch die Form des Templates definiert. Das Template gibt die Innengeometrie des Hohlkörpers vor. Beispielsweise ist das Template zylinderförmig, mit einem Durchmesser von 1 -30 mm, vorzugsweise 2-8 mm, und einer Länge von 5-500 mm, vorzugsweise 100-200 mm. Wie der Hohlkörper oder Hohlraum kann das Template aber einen beliebigen Querschnitt besitzen, wie rund, eckig, insbesondere quadratisch, rechteckig, dreieckig, oder stern- oder schneeflockenförmig. Ebenso wie der Hohlkörper kann das Template
Verzweigungen aufweisen. In einer weiteren Ausführungsform hat das Template eine 2- dimensionale oder 3-dimensionale gitterartige Struktur.
In einer Ausführungsform hat das Template eine Oberfläche, die Strukturen im Millimeter-, Mikrometer- und/oder Nanometerbereich aufweist. Die Strukturen sind beispielsweise Ehebungen oder Vertiefungen oder beides. Die Strukturen können verschiedene
Geometrien aufweisen. Über eine Templateoberfläche können gleichartige oder verschiedene Strukturen regelmäßig oder unregelmäßig verteilt sein. Die Templateoberfläche kann so ausgeführt sein, dass die bei dem Hohlkörper erzeugte innere Oberflächenstruktur, d.h. die Struktur der Oberfläche, die an den Hohlraum angrenzt, der späteren Funktion des Hohlkörpers angepasst ist. Sollen z.B. Hohlkörper als Blutgefäßersatz synthetisiert werden, so kann die Oberfläche des Templates so strukturiert sein, dass die innere Oberfläche des synthetisierten Hohlkörpers später eine gute Endothelisierung ermöglicht. Das Material, woraus die Oberfläche des Templates gefertigt ist, ist prinzipiell nicht beschränkt. In einer Ausführungsform hat das Template eine Oberfläche aus Holz, Metall, wie Aluminium, Edelstahl oder Titan, Kunststoff, Keramik, synthetischen Polymeren wie Polypropylen, Polyestern, Polyamiden oder Teflon, Papier Textilgewebe oder Glas. Es kann auch das gesamte Template aus einem der genannten Stoffe bestehen. Das Template selbst kann ein Hohlkörper oder massiv (Vollkörper) sein.
Die Oberfläche des Templates kann unbehandelt sein oder vorbehandelt sein.
Beispielsweise kann die Vorbehandlung eine Veränderung der Oberflächenmorphologie sein, z.B. durch ätzen, polieren, aufrauen. Die Oberfläche kann beschichtet oder mit chemischen Verbindungen vorgehandelt oder überzogen sein
Das Template ist so beschaffen, dass zum einen optimale Bedingungen für die Bindung und Versorgung des Mikroorganismus an seiner Oberfläche und eine Haftung der
Cellulose erreicht werden. Zum anderen wird das Template so gewählt, dass das Produkt auf einfache Weise vom Template gelöst werden kann, um den Hohlkörper zu erhalten. Die Oberfläche des Templates ist so beschaffen, dass die Oberflächenqualität der bei Implantation in Kontakt mit Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, tretenden Oberfläche des Hohlkörpers reproduzierbar ist.
In einer speziellen Ausführungsform wird in dem Verfahren eine Anordnung aus mehreren Templates eingesetzt, auch bezeichnet als Template-Matrix. Es können Templates mit gleicher oder unterschiedlicher Geometrie, insbesondere unterschiedlicher Querschnitte, und/oder aus gleichem oder unterschiedlichem Material eingesetzt werden. Dadurch können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mehrere gleiche oder unterschiedliche Hohlkörper erhalten werden. Ein Beispiel für eine Anordnung aus mehreren Templates ist eine Anordnung aus mehreren zylinderförmigen Templates zur Herstellung mehrerer hohlzylinderförmiger bzw. röhrenförmiger Hohlkörper. Mehrere Templates gleicher oder unterschiedlicher Geometrie können in einer Einspannvorrichtung fixiert sein (Template- Matrix), welche mit einer Benetzungseinrichtung und/oder Bewegungseinrichtung verbunden ist, wie in den Ausführungsbeispielen erläutert.
In dem Verfahren wird das Template periodisch, vorzugsweise kurzzeitig, mit dem
Gemisch, das die Kulturlösung und den Mikroorganismus umfasst, benetzt. Hierbei bildet sich ein Flüssigkeitsfilm auf der Oberfläche des Templates. Die Form dieses
Flüssigkeitsfilmes wird durch die Lage des Templates im Raum bestimmt, da die
Schwerkraft auf diesen Film einwirkt. Auf der Oberfläche des Templates wird ein Flüssigkeitsfilm gebildet, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst. In und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm wird mikrobielle Cellulose gebildet. Der Flüssigkeitsfilm kann auf dem Template verteilt werden, indem das Template um eine oder mehrere Raumachsen rotiert wird, z.B. mittels der Bewegungseinrichtung wie in den Beispielen erläutert. Durch eine vorgegebene Bewegung des Templates wird eine noch bessere Verteilung der Flüssigkeit auf der
Oberfläche des Templates erreicht. Die Verteilung der Flüssigkeit kann durch die Art der vorgegebenen Rotationsbewegung des Templates beeinflusst werden, wobei die
Rotationsbewegung auch unterbrochen werden kann. Die äußere Geometrie des
Hohlkörpers wird somit durch eine definierte Verteilung eines Flüssigkeitsfilmes und durch eine definierte Bewegung unter dem Einfluss der Schwerkraft bestimmt.
Vorzugsweise hat das Template eine Geometrie mit einem Längen-Durchmesser- Verhältnis von größer 1 . Beispielsweise hat das Template eine stab-, Kegel oder zylinderförmige Geometrie mit einem Längen-Durchmesser- Verhältnis von größer 1 , zur Herstellung eines röhren- oder hohlzylinderförmigen Hohlkörpers, wobei Verzweigungen vorgesehen sein können. Bei dieser Geometrie weist das Template eine Längsachse auf. Das Verfahren wird dann vorzugsweise so durchgeführt, dass das Template um eine oder mehrere Raumachsen rotiert wird, die quer, vorzugsweise senkrecht zur Längsachse des Templates ist/sind.
Wie erwähnt, wird ein Flüssigkeitsfilm auf der Oberfläche des Templates gebildet. Der Flüssigkeitsfilm wird dadurch gebildet, dass das Template und das Gemisch, welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus aufweist, relativ zueinander bewegt und dabei in Kontakt gebracht werden. Grundsätzlich kann die Relativbewegung derart sein, dass das Template, oder das Gemisch, welches Kulturmedium und Mikroorganismus aufweist, oder das Template und das Gemisch bewegt werden.
In einer Variante erfolgt das in Kontakt bringen der Oberfläche eines Templates mit dem Gemisch derart, dass das Template in das Gemisch, welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, ein- und ausgetaucht wird. Eine Bewegung des Templates um eine oder mehrere Raumachsen kann einer Ein- und Austauchbewegung des Templates überlagert sein.
In einer Variante erfolgt das in Kontakt Bringen der Oberfläche eines Templates mit dem Gemisch derart, dass das Gemisch aus dem ersten Gemischvorrat über das Template gegossen wird. Nach dem Gießen des Gemisches über das Template wird vorzugsweise nicht an der Oberfläche des Templates verbleibendes Gemisch aufgefangen und für ein weiteres Übergießen wieder verwendet. In einer Variante erfolgt das in Kontakt Bringen der Oberfläche eines Templates mit dem Gemisch derart, dass das Gemisch aus Kulturmedium und Mikroorganismus auf das Template gesprüht wird.
Die sauerstoffhaltige Atmosphäre ist vorzugsweise Luft oder reiner Sauerstoff oder ein sauerstoffhaltiges Gasgemisch. Mikrowelle Cellulose wird in und/oder auf dem
Flüssigkeitsfilm gebildet wird, wenn dieser mit Sauerstoff in Kontakt kommt.
Der Kontakt zwischen dem Template und dem Gemischvorrat wird bei dem Verfahren unterbrochen und die Synthese der Cellulose erfolgt nur in oder auf dem Flüssigkeitsfilm, der von dem Gemischvorrat getrennt wurde. Dadurch spielen etwaige
Diffussionsprozesse von Kulturlösung und Sauerstoff eine untergeordnete oder gar keine Rolle. Überraschenderweise wurde gefunden, dass keinerlei Cellulose-Bildung innerhalb bzw. auf der Flüssigkeitsoberfläche des Gemischvorrats stattfindet. Am Ende des Verfahrens können Template und Cellulose voneinander getrennt werden, um den Hohlhörper ohne Kern zu erhalten. Daher erfolgt als optionaler Schritt die Trennung des Templates von der gebildeten Cellulose, sodass ein Hohlkörper aus mikrobieller Cellulose ohne Template erhalten wird. In diesem Fall wird das
erfindungsgemäße Verfahren als„Verfahren zur Herstellung eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose" bezeichnet. Nach Trennung von dem Template kann der BNC- Hohlkörper gereinigt und sterilisiert werden.
Die mikrobille Cellulose kann alternativ auf dem Template verbleiben, ohne dass der beschriebene optionale Trennungsschritt durchgeführt wird. In diesem Fall wird das erfindungsgemäße Verfahren als„Verfahren zur Herstellung eines Vorprodukts eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose" bezeichnet. Das Vorprodukt bezeichnet das Template mit darauf befindlicher mikrobieller Cellulose. Die mikrobielle Cellulose kann auf dem Template gereinigt und sterilisiert werden, ohne dass sie zuvor von dem Template entfernt wird. Desweiteren kann die mikrobielle Cellulose mit dem Template zusammen gelagert werden, ohne dass sie von dem Template entfernt wird. Die Reinigung erfolgt vorzugsweise mit Wasser, wässriger saurer oder alkalischer Lösung, oder einem organischen Lösungsmittel, oder einer Kombination davon. Zur endgültigen Verwendung kann dann die mikrobielle Cellulose vom Template getrennt werden, um einen Hohlkörper zu erhalten. Die Trennung erfolgt z.B. dadurch, dass die gebildete Cellulose von dem Template abgezogen wird oder das Template auf andere Art und Weise entnommen wird. Beispielsweise wird die Cellulose von einem zylinderförmigen Template abgestreift und ein Hohlzylinder ohne Template-Kern erhalten. Durch eine Reinigungsflüssigkeit kann, wenn die Cellulose damit auf dem Template gereinigt wird, die Ablösung der Cellulose von dem Template befördert werden. Je nach verwendetem Material kann das Template nach schonender Reinigung seiner Oberfläche wieder verwendet werden. Es ist aber auch möglich, das Template zum Zweck der Trennung von der Cellulose zu zerstören.
Das Template kann in einer speziellen Ausführungsform zumindest während Schritt c) und/oder dem Schritt f), oder einem oder mehreren der Schritte f), wenn der Schritt f) mehrmals durchgeführt wird, um eine oder mehrere Raumachsen rotiert werden. Mit dieser Maßnahme kann die Form und Verteilung des Flüssigkeitsfilms und die Form des sich bildenden Produktes beeinflusst werden.
Anders ausgedrückt wird dabei das Template mit einem definierten Flüssigkeitsfilm überzogen, was wiederum zu einer definierten Form des sich bildenden Produktes führt. Die Rotation kann auch bereits während Schritt a) und b) und/oder während der Schritte d) und e), erfolgen. Wenn beispielsweise das Template zur Benetzung relativ zu dem Gemischvorrat bewegt und mit diesem in Kontakt gebracht wird, dann kann zusätzlich eine der Bewegung des Templates überlagerte Relativbewegung um eine oder mehrere Raumachsen erfolgen.
Diese Folge der Schritte d)-f) kann ein- oder mehrmals wiederholt werden, bis eine gewünschte Menge Cellulose auf der Oberfläche des Templates erzeugt ist und die Cellulose eine gewünschte Gesamtschichtdicke erreicht hat. Die sogenannte
Gesamtschicht kann aus mehreren Einzelschichten bzw. -Phasen zusammengesetzt sein. Bei dieser Verfahrensvariante erfolgt eine Synthese weiterer mikrobieller Cellulose auf bereits gebildeter Cellulose.
Die oben beschriebene Rotation kann bei jedem der Schritte f) (erster Schritt f und Wiederholungen davon, wenn die Schrittfolge d)-f) wiederholt wird) erfolgen. Anders ausgedrückt, erfolgt das Rotieren um eine oder mehrere Raumachsen nicht zwingend nach jedem Benetzungsvorgang. In einer Verfahrensvariante wird die Folge der Schritte d)-f) 1 -40 mal, vorzugsweise 1 - 30 mal durchlaufen ohne dass eine Rotationsbewegung des Templates zur Verteilung des Flüssigkeitsfilms erfolgt und in zumindest einem darauffolgenden Schritt f), wenn die Folge der Schritte d)-f) erneut durchlaufen wird, erfolgt eine Rotation um eine oder mehrere Raumachsen.
Die Zeiten des in Kontakt Bringens der Oberfläche eines Templates (Schritt a) mit einem Gemischvorrat und des in Kontakt Bringens des in Schritt c) erzeugter mikrobieller Cellulose mit dem Gemischvorrat (Schritt d) werden als„Benetzungszeiten" bezeichnet. Die Zeiten des in Kontakt Bringens des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre (Schritte c und f) werden als„Verweilzeiten" bezeichnet. Benetzungszeiten und Verweilzeiten können von einander unabhängig gesteuert werden. Die Verweilzeit beträgt in einer Ausführungsform 1 -60 Minuten, vorzugsweise 5 - 40 min.
Die Gesamtkultivierungszeit beträgt vorzugsweise 1 -7 Tage. Die Gesamtkultivierungszeit entspricht der gesamten Prozesszeit, innerhalb welcher alle Schritte des Verfahrens, wie Dreh-, Benetzungs- und sonstige Schritte ablaufen. Die Dauer des Verfahrens bestimmt die Dicke der auf dem Template gebildeten Cellulose-Gesamtschicht, die der Wandstärke des isolierten Hohlkörpers entspricht und die wie oben erwähnt aus mehreren
Einzelschichten zusammengesetzt sein kann.
Die mit dem Verfahren hergestellten Hohlkörper können gereinigt werden, um Reste und Bestandteile des Kulturmediums und Mikroorganismen zu entfernen. Die Reinigung erfolgt vorzugsweise mit Wasser, wässriger saurer oder alkalischer Lösung, oder einem organischen Lösungsmittel, oder einer Kombination davon.
Die mit dem Verfahren erhaltenen Hohlkörper können ohne Trocknung nach einem Reinigungsprozess und Sterilisation als feuchte Implantate eingesetzt werden. Andererseits können die Hohlkörper zur Lagerung, beispielsweise durch Gefriertrocknung oder Kritischpunkttrocknung, schonend getrocknet werden, wobei die Struktur und die Wiederquellbarkeit von Nanocellulose erhalten bleiben. Vor einer chirurgischen
Anwendung kann das Implantat beispielsweise in physiologischer Kochsalzlösung oder auch patienteneigenem oder allogenem (pharma-grade) Serum wieder gequollen werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Hohlkörper aus mikrobieller
Cellulose, der durch das vorangehend beschriebene Verfahren erhältlich ist. Wie bereits zuvor beschrieben unterscheidet sich das Verfahren grundsätzlich von den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren. Der Aufbau von Cellulose findet nach einem gänzlich verschiedenen Mechanismus statt. Bei der Biosynthese von bakterieller Cellulose an der Oberfläche einer sauerstoffdurchlässigen Membran nach WO2008040729 wird während des Biosyntheseprozesses die jeweils jüngste Schicht an der Grenzfläche Nährmedium/sauerstoffpermeabler Hohlträger gebildet. Die jüngste Schicht wird also auf der Seite des späteren Hohlraums des Hohlkörpers gebildet und ältere Schichten wandern nach außen. Der Sauerstoffeintrag erfolgt von der Seite des Lumens und Nährstoffe müssen von der Au ßenseite zugeführt werden und bereits gebildete Cellulose-Schichten durchdringen. Bei diesem Verfahren ist keine Zufuhr von Mikroorganismen von äußern möglich, da diese nicht durch die Poren passen. Cellulose wird durch die immer gleichen Mikroorganismen gebildet, die bereit am Ort der Cellulosebildung lokalisiert sind. Es könnte lediglich eine Vermehrung durch Zellteilung erfolgen. Abweichend davon erfolgt die Biosynthese im vorliegenden Verfahren auf der Außenseite des Hohlkörpers, an der Grenzfläche vom Gemischfilm zu umgebender sauerstoffhaltiger Atmosphäre. Dadurch ist die jüngst gebildete Cellulose au ßenseitig lokalisiert und bereits gebildete Cellulose bleibt während der Synthese ortsfest. Der Sauerstoffeintrag erfolgt im Gegensatz zu WO2008040729 von der Au ßenseite, und auch die Mikroorganismen und Nährstoffe werden der Au ßenseite zugeführt, müssen also bereits gebildete Cellulose- Schichten nicht durchdringen. Im vorliegenden Verfahren ist eine Zufuhr von
Mikroorganismen von der Au ßenseite im Gegensatz zu WO2008040729 möglich. Durch diese unterschiedlichen Bildungsprozesse wird ein Produkt mit neuartiger Struktur erhalten.
Insbesondere weist der Hohlkörper eine Wand mit einer inneren Oberfläche und einer äußeren Oberfläche auf, wobei die innere Oberfläche und die äu ßere Oberfläche eine identische oder ähnliche Bedeckung durch Fasern aus mikrobieller Cellulose pro
Flächeneinheit aufweisen. Wie erwähnt, bilden BNC Fasern mehr oder weniger dichte bzw. mehr oder weniger poröse Netzwerke aus. Mit Methoden der Bildauswertung ist es möglich, Oberflächenbereiche, in denen sich Fasern befinden (in einer REM Aufnahme beispielsweise heller) von Oberflächenbereichen, in denen sich keine Fasern befinden (Lücken, in einer REM Aufnahme beispielsweise dunkler) abzugrenzen und die Bereiche ins Verhältnis zur betrachteten Gesamtfläche zu setzen. Die Bedeckung pro
Flächeneinheit kann dann ausgedrückt werden als Bedeckung =
Teil des betrachteten Flächenausschnitts, der von Fasern bedeckt ist / Gesamtfläche des betrachteten Flächenausschnitts
Die Bedeckung kann als Prozentzahl angegeben werden. Der Begriff „ähnlich" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass sich die Bedeckung auf der inneren Oberfläche und der äußeren Oberfläche relativ zueinander um maximal 20% unterscheiden, vorzugsweise maximal 10%, am meisten bevorzugt maximal 5%. Der Prozentwert des Unterschieds zwischen den Werten wird wie folgt ermittelt: Unterschied (%) =
(zahlengrößerer Wert - zahlenkleinerer Wert)/ zahlenkleinerer Wert * 100.
Eine ähnliche Bedeckung wie oben definiert bedeutet eine ähnliche Porosität der inneren und äu ßeren Oberfläche, wobei die Porosität mit Bezug auf eine Oberfläche
zweidimensional definiert ist als Porosität (zweidimensional^
Teil der des betrachteten Flächenausschnitts, der nicht von Fasern bedeckt ist /
Gesamtfläche des betrachteten Flächenausschnitts
Die nicht Fasern bedeckte Fläche kann als„offenporige Fläche" oder„Porenfläche" bezeichnet werden. Für den Zusammenhang zwischen Bedeckung und zweidimensionaler Porosität gilt:
Porosität + Bedeckung = 1 , oder ausgedrückt in Prozentzahlen: Porosität (%) + Bedeckung (%) = 100 %,
Bei der Bedeckung und Porosität können BNC Fasern mit berücksichtigt werden, die etwas au ßerhalb einer als zweidimensional angenommen inneren/äu ßeren Oberfläche liegen. Bei einer elektronenmikroskopischen Aufnahme erhält man eine zweidimensionale Darstellung der äußeren bzw. inneren Oberfläche der Wand des Hohlkörpers. Die abgebildeten BNC-Fasern liegen aber nicht immer in einer Ebene, da die Oberflächen eine gewisse Rauigkeit aufweisen können und/oder gegebenenfalls BNC Fasern mit abgebildet werden die aus Blickrichtung des Betrachters hinter der Oberfläche liegen. Es hat sich gezeigt, dass bei dem erfindungsgemäßen Hohlkörper die äußere Oberfläche der Wand rauer sein kann als die innere Oberfläche. Bei der Ermittlung der Bedeckung und Porosität werden vorzugsweise alle BNC Fasern mit berücksichtigt, die auf einer REM Aufnahme (10.000fache Vergrößerung) sichtbar sind und sie werden so behandelt als lägen sie in einer Ebene, da die Bedeckung/Porosität auf eine Flächeneinheit bezogen werden.
Somit weist der Hohlkörper eine Wand mit einer inneren Oberfläche und einer äu ßeren Oberfläche auf, wobei die innere Oberfläche und die äußere Oberfläche eine ähnliche Porosität, wie oben definiert aufweisen. Der Begriff„ähnlich" bedeutet mit Bezug auf die Porosität, dass sich die zweidimensionale Porosität der inneren Oberfläche und der äußeren Oberfläche relativ zueinander um maximal 20% unterscheiden, vorzugsweise maximal 10%, am meisten bevorzugt maximal 5%. Der Prozentwert des Unterschieds zwischen den Werten wird wie folgt ermittelt: Unterschied (%) =
(zahlengrößerer Wert - zahlenkleinerer Wert)/ zahlenkleinerer Wert * 100.
Eine gleichartige Porosität von innerer und äußerer Oberfläche seiner Wand macht den Hohlkörper der vorliegenden Erfindung aufgrund des gleichmäßigen Faseraufbaus insbesondere geeignet zur Verwendung als Tunica media, insbesondere von herznahen Arterien. Die Erfindung stellt einen Hohlkörper bereit, der durch Schichten hoher und funktionsrelvanter Oberflächenqualität begrenzt ist. Die Oberflächen sind vorzugsweise frei von Störstellen und Inhomogenitäten.
Bei dem Verfahren nach WO2008040729 erhält man ausschließlich Hohlkörper mit einer glatten inneren Oberfläche und einer relativ dazu sehr porösen äu ßeren Oberfläche, wie in den Fig. 4A und 4B gezeigt. Die Porosität der inneren und äußeren Oberfläche, bzw. deren Bedeckungen mit Fasern, sind als nicht ähnlich beurteilt. Dies ist möglicherweise darin begründet, dass bei dem Verfahren nach WO2008040729 die jüngste Schicht auf der Seite des späteren Hohlraums des Hohlkörpers gebildet wird und ältere Schichten nach au ßen wandern und aufgrund des zunehmenden Radius gedehnt werden. Der Wandaufbau besteht generell aus vielen Schichten, die rasterelektronenmikroskopisch deutlich unterscheidbar/voneinander abgegrenzt sind (Fig. 5 der WO2008040729).
Insbesondere weist der erfindungsgemäße Hohlkörper eine Wand mit einer inneren Oberfläche und einer äußeren Oberfläche auf, wobei die Wand mehrere Schichten aus mikrobieller Cellulose umfasst, welche parallel zur der inneren und äu ßeren Oberfläche der Wand verlaufen. Diese Schichten werden nachfolgend auch als„Phasen" bezeichnet. Die Schichten entsprechen den oben bereits genannten„Einzelschichten bzw.-Phasen" der Wand des Hohlkörpers. Die Phasen der Wand des erfindungsgemäßen Hohlkörpers stellen sich im Gegensatz zu den in WO2008040729 offenbarten Schichten als in der
Rasterelektronenmikroskopie über größere Bereiche einheitliche Strukturen dar, weshalb in Abgrenzung zu WO2008040729 hierin der Begriff „Phase" gebraucht wird
Diese Phasen müssen nicht durch einen Verfahrenszyklus von Benetzung/Filmbildung und anschließender Cellulosebildung in oder auf dem Film erhalten sein. Eine Phase kann durch mehrere solche Verfahrenszyklen gebildet sein. Die Phasen sind mittels
Rasterelektronenmikroskopie, beispielsweise bei 24facher Vergrößerung, optisch voneinander unterscheidbar. Die Phasen sind aus einem Netzwerk aus Fasern bakterieller Nanonocellulose aufgebaut, wobei die Faserstrukturen der Phasen beim Vergleich der Phasen gleich oder unterschiedlich sein können.
Vorzugsweise sind die Phasen in ihrer Dichte über die gesamte Phasendicke homogen. D.h. sie weisen keinen Dichtegradienten auf. Ferner sind die Phasen vorzugsweise auch frei von Störstellen (siehe auch Fig. 4 bis 6, 2.000fache Vergrößerung). Die Erfindung betrifft auch einen Hohlkörper, dessen Wand aus Schichten, auch bezeichnet als Phasen aufgebaut ist wie oben beschrieben, wobei eine der Schichten die innere Oberfläche, d.h. die hohlraumseitige Oberfläche, der Wand aufweist und eine weitere Schicht die äußere Oberfläche der Wand aufweist und wobei diese beiden Schichten eine identische oder ähnliche Porosität aufweisen. Die Schicht/Phase, die die innere Oberfläche der Wand aufweist, wird auch als„Lumen-seitige Schicht/Phase" oder „hohlraumseitige Schicht/Phase" bezeichnet. Die Schicht/Phase, die die äußere
Oberfläche der Wand aufweist, wird auch als„außenseitige Schicht/Phase" bezeichnet. Mit Bezug auf die räumlich ausgebildeten Schichten/Phasen ist die Porosität räumlich definiert als:
Porosität (räumlich, dreidimensional) = Hohlraumvolumen/Gesamtvolumen Bei dem Gesamtvolumen kann das Volumen der gesamten Schicht/Phase herangezogen werden. Es ist aber auch möglich, nur einen Teil des Volumens der Schicht/Phase zu betrachten und diesen Volumenteil zum Zweck der Messung der Porosität als
„Gesamtvolumen" zu betrachten. Der Begriff „ähnlich" bedeutet mit Bezug auf die räumliche Porosität, dass sich die Porosität der Lumen-seitigen Phase und die Porosität der au ßenseitigen Phase" relativ zueinander um maximal 20% unterscheiden, vorzugsweise maximal 10%, am meisten bevorzugt maximal 5%. Der Prozentwert des Unterschieds zwischen den Werten wird wie folgt ermittelt: Unterschied (%) =
(zahlengrößerer Wert - zahlenkleinerer Wert)/ zahlenkleinerer Wert * 100. Eine identische oder ähnliche dreidimensionale/räumliche Porosität wie oben definiert bedeutet, dass die Lumen-seitige Schicht/Phase und die außenseitige Schicht/Phase eine identische oder ähnliche Dichte aufweisen. Ferner bedeutet eine identische oder ähnliche dreidimensionale/räumliche Porosität wie oben definiert, dass die Lumen-seitige
Schicht/Phase und die außenseitige Schicht/Phase eine identische oder ähnliche
Faserdichte aufweisen. Die Dichte wird vorzugsweise angegeben als Masse/Volumen und die Faserdichte wird angegeben als Anzahl Fasern/Volumen. Bei dem Volumen kann das Volumen der gesamten Schicht/Phase herangezogen werden. Es ist aber auch möglich, und bevorzugt, zur Bestimmung der Dichte oder der Faserdichte nur einen Teil des Volumens der Schicht/Phase zu betrachten. Der Begriff „ähnlich" bedeutet mit Bezug auf die Dichte und Faserdichte, dass sich die Dichte/Faserdichte der Lumen-seitigen Phase und die Dichte/Faserdichte der au ßenseitigen Phase" relativ zueinander um maximal 20% unterscheiden, vorzugsweise maximal 10%, am meisten bevorzugt maximal 5%. Der Prozentwert des Unterschieds zwischen den Werten wird wie folgt ermittelt:
Unterschied (%) =
(zahlengrößerer Wert - zahlenkleinerer Wert)/ zahlenkleinerer Wert * 100.
Vorzugsweise sind zwischen der Lumen-seitigen Phase und der außenseitigen Phase eine oder mehrere weitere Phasen angeordnet. Besonders bevorzugt weisen diese eine oder mehrere weiteren Phasen eine identische oder ähnliche Porosität, Dichte und Faserdichte auf wie die Lumen-seitige Phase und die au ßenseitige Phase.
Vorzugsweise sind die Phasen so fest miteinander verbunden, dass sie bei mechanischer Beanspruchung in einem Zugversuch nicht voneinander delaminieren. Dies bedeutet insbesondere, dass keine Delamination in Form verschiedener Peaks im Zug- Dehnungsdiagramm sichtbar sind, wenn ein Zugversuch mit der Methode durchgeführt wird, wie sie in Bodin A et al., Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotech. Bioeng. (2007) 97, 425-434 auf Seite 427 unter der Überschrift„Tensile Measurement" beschrieben sind. Hierbei wird ein Ring aus BNC mit 4 mm Innendurchmesser und 5 mm Breite geschnitten und radial mit einer Geschwindigkeit von 0,25 mm/s gestreckt.
Insbesondere ist der Hohlkörper ein Hohlzylinder mit einer Mittelachse, die mittig und längs der Zylinderausdehnung durch den Hohlraum verläuft. Insbesondere ist der Hohlkörper aus mindestens zwei, rotationssymmetrisch um die Hauptachse
angeordneten, parallel zueinander verlaufenden, miteinander verbundenen, BNC-Phasen gekennzeichnet. Auf diese Weise kann ein biomimetischer Aufbau der Wand des
Hohlkörpers erzeugt werden. Im Gegensatz zu WO 2008/040729 sind die Phasen fest miteinander verbunden. Desweiteren besitzen die Phasen vorzugsweise einen
homogenen Aufbau, ohne Störstellen und Strukturgradienten.
Überraschender Weise wurde gefunden, dass dieser Aufbau dem Hohlkörper über die gesamte Länge Formstabilität und gleichmäßig hohe mechanische Reiß- und
Druckfestigkeit sowie ausreichende Elastizität unabhängig vom inneren Durchmesser des Hohlkörpers verleiht. Die Phasen sind vorzugsweise charakterisiert durch ein
gleichmäßiges (isotropes), gut verzweigtes Fasernetzwerk. Anzahl und Stärke der Phasen sind kontrolliert einstellbar. Sie sind so angeordnet, dass sie der einem natürlichen Gefäß nahe kommenden Struktur insbesondere der Media entsprechen (biomimetische Struktur) und den Aufbau körpereigener Strukturen (Adventitia und Intima) sowie den
Stoffaustausch vergleichbar mit dem natürlicher Austauschprozesse (bioaktives Material) anregen. Der Aufbau als geschichtete Phasenstruktur hat mutmaßlich, und ohne auf diese Erklärung festgelegt zu sein, eine mechanischen Stabilität, Biokompatibilität durch Endothelisierbarkeit der inneren Oberfläche, und eine Integration in die körpereigene Gewebestruktur zur Folge. Der Hohlkörper weist vorzugsweise eine oder mehrere Öffnungen auf, durch die der Hohlraum des Hohlkörpers zugänglich ist. Bei den Öffnungen kann es sich z.B. um die Zufluss und die Abflussöffnung eines Blutgefäßteils handeln.
Geometrien des Hohlkörpers wurden bereits anhand des Herstellungsverfahrens weiter oben erläutert. In einer speziellen Ausführungsform ist der Hohlköper ausgewählt aus einer Röhre oder einem Hohlzylinder, der eine oder mehrere Verzweigungen aufweisen kann.
Die erfindungsgemäßen Hohlkörper sind durch verbesserte mechanische Eigenschaften, gezielt einstellbare Mikrostrukturen (biomimetischer Aufbau) und bioaktive Oberflächen gekennzeichnet. Weitere bevorzugte mechanische Eigenschaften, die beliebig mit den oben bereits beschriebenen mechanischen, strukturellen und geometrischen
Eigenschaften kombinierbar sind, sind nachfolgend beschrieben. Die Erfindung betrifft auch einen Hohlkörper mit einer Nahtausreißfestigkeit im Bereich von 5 - 15 N, vorzugsweise 8-10 N, insbesondere einen Hohlzylinder oder eine Röhre mit einer solchen Nahtausreißfestigkeit. Die Nahtausreißfestigkeit wird nach der Methode bestimmt, die in den Beispielen angegeben ist. Ferner wird auch ein Hohlkörper mit einem Berstdruck von mindestens 400 mm Hg angegeben, vorzugsweise mindestens 600 mm Hg und am meisten bevorzugt mindestens 800 mm Hg. Der Berstdruck wird nach der Methode bestimmt, die in den Beispielen angegeben ist. In einem Aspekt betrifft die Erfindung auch ein künstliches Gefäß, insbesondere zur Anwendung als Implantat im menschlichen oder tierischen Körper, aufweisend einen Hohlkörper wie zuvor beschrieben. Der Hohlkörper kann als Komposit mit weiteren Stoffen vorliegen, beispielsweise mit anderen Polymeren als BNC wie z.B.
Cellulosederivate, Alginat oder Proteine, beispielsweise zum Zweck der Verbesserung der mechanischen Eigenschaften. Der Hohlkörper kann zusätzlich Wachstums- und/oder Rekrutierungsfaktoren und/oder andere biologisch wirksame Stoffe enthalten,
beispielsweise zum Zweck der Verbesserung ihrer Bioaktivität durch Anlagerung und Einwanderung körpereigener Zellen.
Wenn der Hohlkörper als künstliches Blutgefäß eingesetzt werden soll, dann kann er direkt in den Körper eingesetzt werden. Der Hohlkörper kann auch einer Vorbehandlung unterzogen werden, beispielsweise kann eine Adhäsion von Edothelzellen an die
Oberfläche des Hohlkörpers erfolgen.
In noch einem Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Hohlkörpers oder eines künstlichen Gefäßes, wie vorangehend beschrieben, als medizinisches Implantat. Die Hohlkörper und künstlichen Gefäße können in medizinischen Anwendungen als innere Hohlstrukturen und -gefäße, wie Blutgefäße, Speiseröhre, Verdauungstrakt, Luftröhre, Harnröhre, Gallengang, Harnleiter, Lymphgefäße oder als Manschette (cuff) zur
Umhüllung von körpereigenen Strukturen wie Hohlorganen oder Nervenfasern, oder als Interponat eingesetzt werden, wobei die Hohlkörper direkt oder nach Adaption an die Organspezifik eingesetzt werden können. Weitere Verwendungen sind die Verwendung als medizinisches Übungsmaterial, insbesondere für das realitätsnahe Training chirurgischer Techniken, in der cardiovaskulären Medizin und der Viszeralchirurgie, wozu die Hohlkörper auch mechanisch bearbeitet werden kann.
In noch einem Aspekt betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Herstellung eines Hohlkörpers aus einem mikrobiellen Polymer und ein Verfahren zur Herstellung eines Hohlkörpers aus einem mikrobiellen Polymer oder zur Beschichtung eines Gegenstands mit einem mikrobiellen Polymer.
Angegeben wird eine Vorrichtung zur Herstellung eines Hohlkörpers aus einem mikrobiellen Polymer, insbesondere mikrobieller Cellulose, aufweisend
- ein Template, das die Negativform des Hohlraums des herzustellenden
Hohlkörpers und der inneren Wände des Hohlraums ist,
- ein erstes Reservoir, das mit einem Gemisch, welches ein flüssiges
Kulturmedium und einen Polymer bildenden Mikroorganismus umfasst, befüllbar ist,
- eine Benetzungseinrichtung zur Benetzung des Templates mit dem in das
Reservoir eingebrachten Gemisch
- ein Gehäuse, welches zumindest das Template und das Reservoir so
umschließt, dass ein Stoffaustausch mit der Umgebung verhinderbar ist.
Der Begriff„mikrobielles Polymer" bezeichnet ein Polymer, das durch einen
Mikroorganismus produziert wird. Beispielhafte Mikroorganismen sind Pilze, Bakterien und Algen.
Der Begriff Polymer bezeichnet eine chemische Verbindung aus Ketten- oder verzweigten Molekülen (Makromolekülen), die wiederum aus gleichen oder gleichartigen Einheiten bestehen, oder mit anderen Worten ein großes Molekül (Makromolekül), das aus sich wiederholenden gleichen oder gleichartigen Struktureinheiten besteht, die als
unverzweigte, verzweigte oder vernetzten Molekülketten angeordnet sind.
Ein bevorzugtes mikrobielles Polymer ist mikrobielle Cellulose. Eine Reihe von
Mikroorganismen ist in der Lage, Cellulose herzustellen. Dazu zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Algen wie Valonia und Boergesenia, Pilze wie Dictyostelium discoideum und Bakterien wie Gluconacetobacter, Enterobacter, Agrobacterium, Pseudomonas, Rhizobium und Zoogloea. Ein besonders geeigneter Mikroorganismus ist Gluconacetobacter, insbedondere Gluconacetobacter xylinus. Das Kulturmedium, auch bezeichnet als„Nährlösung" oder„Nährmedium" enthält Glucose, Pepton, Hefeextrakt, Natriumhydrogenphosphat und Citronensäure in wässriger Lösung (Hestrin-Schramm-Medium). Mikrowelle Cellulose wird, sofern sie von Bakterien hergestellt wird, auch mit den
Begriffen„bakterielle Cellulose" und„bakterielle Nanocellulose" (BNC) bezeichnet. Der Begriff „bakterielle Nanocellulose" (BNC) ist daraus hergeleitet, dass bakteriell produzierte Cellulose wie oben erwähnt ein Nanofasernetzwerk bildet. Nachfolgend wird die Erfindung bisweilen anhand des speziellen Falls der mikrobiellen Cellulose dargestellt. Dennoch ist die Erfindung auch auf andere mikrobielle Polymere anwendbar.
Nachteile von vorstehend beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen des Standes der Technik wurden insbesondere durch die folgende Maßnahmen überwunden:
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung und ihrer Anwendung in einem
Herstellungsverfahren für Hohlkörper aus mikrobiellem Polymer ist kein äußerer
Formkörper vonnöten wie z.B. bei Verfahren der statischen Kultivierung, wo mikrobielle Cellulose durch Kultivierung eines Cellulose-bildenden Mikroorganismus in einem Raum zwischen zwei Wandungen gebildet wird.
Weiterhin werden bei der Durchführung des Verfahrens in der erfindungsgemäßen Vorrichtung alle Prozesse vermieden, bei welchen Stoffe durch eine bereits gebildete Celluloseschicht hindurchtreten müssen, was zu Störungen im Aufbau dieser Schichten führen kann, so dass eine optimale Versorgung mit Nährmedium, Luft und
Mikroorganismen gewährleistet ist.
Es wird mit der Vorrichtung und in dem Verfahren die Innenkontur des Hohlkörpers durch ein geeignet geformtes Template vorgegeben auf dessen Oberfläche sich bei
Durchführung des Verfahrens ein Flüssigkeitsfilm befindet, in oder auf welchem die Biosynthese des Polymers abläuft. Somit bildet das direkt auf der Templateoberfläche erzeugte Polymer später die innere Oberfläche des Hohlkörpers. Auf diesem auf der Templateoberfläche erzeugten Polymer kann durch das Verfahren weiteres Polymer erzeugt werden. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und Verfahren wird die Herstellung von
Cellulosehohlkörpern mit verschiedenen Mikro- und Nanostrukturen ermöglicht. Es ist möglich, Mikro- und Nanostrukturen gezielt aufzubauen. Es können biomimetische Hohlkörper erzeugt werden. Der Begriff „biomimetisch" bedeutet, dass ein menschliches oder tierisches Hohlorgan, beispielsweise ein Blutgefäß, durch den erfindungsgemäß hergestellten Hohlkörper strukturell und/oder funktionell nachgebildet wird, wobei die strukturellen/funktionellen Eigenschaften der natürlichen Vorlage nicht notwendigerweise exakt erfüllt sein müssen. Der Begriff„biomimetische Struktur" bezeichnet insbesondere eine dem natürlichen Blutgefäß möglichst nahekommende Struktur.
Die mit der Vorrichtung und dem Verfahren hergestellten BNC-Implantate sind durch verbesserte mechanische Eigenschaften und bioaktive Oberflächen gekennzeichnet. Unter einem Hohlkörper ist ein Körper zu verstehen, der eine Wand aufweist, die einen Hohlraum umgibt. Die Wand kann eine oder mehrere Öffnungen haben, durch welche der Hohlraum zugänglich ist.
Grundsätzlich kann der Hohlkörper beliebig geformt sein. Die Form wird dem späteren Einsatzzweck angepasst. Für medizinische Verwendungen als Implantat kann der Hohlkörper z.B. die Form eines Blutgefäßes, einer Speiseröhre, eines Teils des
Verdauungstrakts, einer Luftröhre, einer Harnröhre, eines Gallengangs, eines Harnleiters, eines Lymphgefäßes oder einer Manschette (cuff) haben. Diese natürlichen Formen können exakt oder annähernd erreicht sein.
In einer Ausführungsform hat der Hohlkörper die Form einer Röhre oder eines
Hohlzylinders. Länge und Innendurchmesser sind variabel und variabel miteinander kombinierbar. Beispielhafte Innendurchmesser sind 1 -30 mm, vorzugsweise 2 bis 8 mm, und beispielhafte Längen sind 5-500 mm, vorzugsweise 100-200 mm. Das Längen- Durchmesser-Verhältnis ist vorzugsweise größer 1 . Der Innendurchmesser kann auch innerhalb eines Hohlkörpers variieren.
In einer speziellen Ausführungsform ist der Hohlkörper ein Hohlzylinder mit einer oder mehreren Verzweigungen bzw. Verästelungen. Beispielsweise kann der Hohlkörper eine Y-Form haben. Der Hohlkörper, insbesondere sein Hohlraum, kann statt eines runden auch einen anders geformten Querschnitt, beispielsweise einen quadratischen, rechteckigen, dreieckigen, oder sternförmigen Querschnitt aufweisen.
Das Template, oder auch„Templat", ist wie bereits erwähnt die Negativform des
Hohlraums des Hohlkörpers und der inneren Wände des Hohlraums. Der Begriff „Negativform" bezeichnet das Hilfsmittel, die Positivform ist das gewünschte Ergebnis, in diesem Fall der/die Hohlkörper/Hohlraum/Hohlraumwand. Das Template ist komplementär zur Form des gewünschten herzustellenden Hohlraums geformt und wird entsprechend vorgegeben. Entsprechend ist über die Form der oben angegebenen Hohlkörper auch die Form des Templates definiert. Das Template gibt die Innengeometrie des Hohlkörpers vor. Beispielsweise ist das Template zylinderförmig, mit einem Durchmesser von 1 -30 mm, vorzugsweise 2-8 mm, und einer Länge von 5-500 mm, vorzugsweise 100-200 mm. Wie der Hohlkörper oder Hohlraum kann das Template aber einen beliebigen Querschnitt besitzen, wie rund, eckig, insbesondere quadratisch, rechteckig, dreieckig, oder stern- oder schneeflockenförmig. Ebenso wie der Hohlkörper kann das Template
Verzweigungen aufweisen. In einer weiteren Ausführungsform hat das Template eine 2- dimensionale oder 3-dimensionale gitterartige Struktur.
Die Vorrichtung zur Herstellung eines Hohlkörpers besitzt außer dem Template, welches die innere Form definiert, keinerlei Einbauten, die die äu ßere Form des Hohlkörpers definieren. In einer Ausführungsform hat das Template eine Oberfläche, die Strukturen im Millimeter-, Mikrometer- und/oder Nanometerbereich aufweist. Die Strukturen sind beispielsweise Ehebungen oder Vertiefungen oder beides. Die Strukturen können verschiedene
Geometrien aufweisen. Über eine Templateoberfläche können gleichartige oder verschiedene Strukturen regelmäßig oder unregelmäßig verteilt sein.
Die Templateoberfläche kann so ausgeführt sein, dass die bei dem Hohlkörper erzeugte innere Oberflächenstruktur, d.h. die Struktur der Oberfläche, die an den Hohlraum angrenzt, der späteren Funktion des Hohlkörpers angepasst ist. Sollen z.B. Hohlkörper als Blutgefäßersatz synthetisiert werden, so kann die Oberfläche des Templates so strukturiert sein, dass die innere Oberfläche des synthetisierten Hohlkörpers später eine gute Endothelisierung ermöglicht.
Das Material, woraus die Oberfläche des Templates gefertigt ist, ist prinzipiell nicht beschränkt. In einer Ausführungsform hat das Template eine Oberfläche aus Holz, Metall, wie Aluminium, Edelstahl oder Titan, Kunststoff, Keramik, synthetischen Polymeren wie Polypropylen, Polyestern, Polyamiden oder Teflon, Papier Textilgewebe oder Glas. Es kann auch das gesamte Template aus einem der genannten Stoffe bestehen. Das Template selbst kann ein Hohlkörper oder massiv (Vollkörper) sein.
Die Oberfläche des Templates kann unbehandelt sein oder vorbehandelt sein.
Beispielsweise kann die Vorbehandlung eine Veränderung der Oberflächenmorphologie sein, z.B. durch ätzen, polieren, aufrauen. Die Oberfläche kann beschichtet oder mit chemischen Verbindungen vorgehandelt oder überzogen sein
Das Template ist so beschaffen, dass zum einen optimale Bedingungen für die Bindung und Versorgung des Mikroorganismus an seiner Oberfläche und eine Haftung des Polymers erreicht werden. Zum anderen wird das Template so gewählt, dass das
Polymerprodukt auf einfache Weise vom Template gelöst werden kann, um den
Hohlkörper zu erhalten. Die Oberfläche des Templates ist so beschaffen, dass die
Oberflächenqualität der bei Implantation in Kontakt mit Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, tretenden Oberfläche des Hohlkörpers reproduzierbar ist.
In einer speziellen Ausführungsform weist die Vorrichtung eine Anordnung aus mehreren Templates auf, auch bezeichnet als Template-Matrix. Diese kann mehrere Templates mit gleicher oder unterschiedlicher Geometrie, insbesondere unterschiedlicher Querschnitte, und/oder aus gleichem oder unterschiedlichem Material aufweisen. Dadurch können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mehrere gleiche oder unterschiedliche Hohlkörper erhalten werden. Ein Beispiel für eine Anordnung aus mehreren Templates ist eine Anordnung aus mehreren zylinderförmigen Templates zur Herstellung mehrerer hohlzylinderförmiger bzw. röhrenförmiger Hohlkörper. Mehrere Templates gleicher oder unterschiedlicher Geometrie können in einer Einspannvorrichtung fixiert sein (Template- Matrix), welche mit einer Benetzungseinrichtung und/oder Bewegungseinrichtung verbunden ist. Wie vorangehend erwähnt, weist die Vorrichtung ein Gehäuse auf, welches zumindest das Template und das Reservoir so umschließt, dass ein Stoffaustausch mit der
Umgebung verhinderbar ist. Sowohl in dem Reservoir als auch auf der Oberfläche des Templates befindet sich während des Verfahrens zur Herstellung des Hohlkörpers ein Gemisch, welches ein flüssiges Kulturmedium und einen Polymer bildenden
Mikroorganismus umfasst. Zweck des Gehäuses ist es, eine Kontamination des
Kulturmediums mit unerwünschten Substanzen oder Organismen zu verhindern. Das Gehäuse kann auch die Benetzungseinrichtung oder Teile davon umschließen. Das Gehäuse ist insbesondere flüssigkeits- und gasdicht, wobei der Begriff „gasdicht" vorzugsweise auf eine umgebende Atmosphäre unter Normaldruck bezogen ist.
Das erste Reservoir kann eigener Teil der Vorrichtung sein oder ein Bereich des
Gehäuses kann das Reservoir bilden, wobei flüssiges Gemisch in das Gehäuse selbst gegeben wird. Gleiches gilt für ein nachfolgend beschriebenes zweites Reservoir.
In einer Ausführungsform weist das Gehäuse eine verschließbare Öffnung auf, durch welche ein Stoffaustausch mit der Umgebung erfolgen kann. Ein Stoffaustauch kann beispielsweise derart sein, dass beim Wachstumsprozess der Mikroorganismen benötigte Medien, wie z.B. Nährlösung, Impflösung, Sauerstoff etc., nachgeliefert, konstant gehalten oder verändert werden. Es kann auch durch die Öffnung ein Mikroorganismus in das
Kulturmedium gegeben werden, das sich bereits im Inneren des Gehäuses im Reservoir befindet. Vorzugsweise erfolgt ein Stoffaustausch mit der Umgebung unter sterilen Bedingungen, um eine Kontamination des Kulturmediums zu verhindern. Die
verschließbare Öffnung kann als Medienanschluss ausgestaltet sein, beispielsweise Ventile, Schnellkupplungen, Hähne, Flanschen, etc.
In einer Variante der Vorrichtung ist das Gehäuse insgesamt oder teilweise durchsichtig. Vorzugsweise weist das Gehäuse wenigstens eine durchsichtige Fläche auf,
beispielsweise ein Fenster, insbesondere aus wärmebeständigem Glas, durch welche eine optische Kontrolle des Formgebungsprozesses des Hohlkörpers möglich ist.
In noch einer Ausführungsform ist die Vorrichtung sterilisierbar, insbesondere durch Hitze, Dampf, Strahlung oder Chemikalien. Die Vorrichtung kann beispielsweise aus einem Material gefertigt sein, das eine Sterilisation mit den genannten Methoden ohne
Schädigung der Vorrichtung erlaubt und/oder die die Vorrichtung kann so dimensioniert sein, dass sie in ein Sterilisationseinrichtung, beispielsweise einen Dampfsterilisator eingebracht werden kann.
In einer Ausführungsform weist die Vorrichtung eine Bewegungseinrichtung auf, womit das Template um eine oder mehrere Raumachsen rotierbar ist. Wie nachfolgend anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens noch genauer beschrieben, wird auf der Oberfläche des Templates ein Flüssigkeitsfilm gebildet, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst. In und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm wird mikrobielles Polymer gebildet. Mittels der Bewegungseinrichtung kann dieser Flüssigkeitsfilm auf dem Template verteilt werden, indem das Template um eine oder mehrere Raumachsen rotiert wird.
Durch eine vorgegebene Bewegung des Templates wird eine noch bessere Verteilung der Flüssigkeit auf der Oberfläche des Templates erreicht. Die Verteilung der Flüssigkeit kann durch die Art der vorgegebenen Rotationsbewegung des Templates beeinflusst werden, wobei die Rotationsbewegung auch unterbrochen werden kann. Die äußere Geometrie des Hohlkörpers wird somit durch eine definierte Verteilung eines Flüssigkeitsfilmes und durch eine definierte Bewegung unter dem Einfluss der Schwerkraft bestimmt.
Vorzugsweise hat das Template eine Geometrie mit einem Längen-Durchmesser- Verhältnis von größer 1 . Beispielsweise hat das Template eine stab-, Kegel oder zylinderförmige Geometrie mit einem Längen-Durchmesser-Verhältnis von größer 1 , zur Herstellung eines röhren- oder hohlzylinderförmigen Hohlkörpers, wobei Verzweigungen vorgesehen sein können. Bei dieser Geometrie weist das Template eine Längsachse auf. Die Bewegungseinrichtung ist dann vorzugsweise so ausgeführt, dass das Template um eine oder mehrere Raumachse rotierbar ist, die quer, vorzugsweise senkrecht zur Längsachse des Templates ist/sind.
Wie bereits erwähnt, weist die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Benetzungseinrichtung zur Benetzung des Templates mit dem in das Reservoir eingebrachten Gemisch auf. Bei der Benetzung wird der oben erwähnte Flüssigkeitsfilm auf der Oberfläche des Templates gebildet und der Zweck der Benetzungseinrichtung ist die Bildung des Flüssigkeitsfilms. Der Flüssigkeitsfilm wird dadurch gebildet, dass das Template und das Gemisch, welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus aufweist, relativ zueinander bewegt und dabei in Kontakt gebracht werden. Grundsätzlich kann die Benetzungseinrichtung so ausgestaltet sein, dass damit das Template, oder das Gemisch, welches Kulturmedium und Mikroorganismus aufweist, oder das Template und das Gemisch bewegt werden können.
In einer Variante ist die Benetzungseinrichtung so ausgestaltet, dass damit das Template in das Gemisch, welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, ein- und ausgetaucht werden kann. Beispielsweise kann die Einrichtung einen Stab mit einem Antrieb, womit der Stab in Richtung seiner Längsachse auf- und abwärts bewegt werden kann, aufweisen. Das Template, oder eine Anordnung von Templates, kann an dem Stab befestigt sein und das Reservoir mit darin befindlichem Gemisch kann unterhalb des Templates angeordnet sein. Durch eine Abwärts- und Aufwärtsbewegung des Stabes kann das Template in das Gemisch ein- und ausgetaucht werden.
Die zuvor beschriebene Bewegungseinrichtung kann mit der Benetzungseinrichtung gekoppelt sein oder die Benetzungseinrichtung kann ein Teil der Bewegungseinrichtung sein. Es wird auch eine Einrichtung offenbart, die sowohl die Funktion der
Benetzungseinrichtung als auch die Funktion der Bewegungseinrichtung aufweist. Eine Bewegung des Templates um eine oder mehrere Raumachsen kann einer Ein- und Austauchbewegung des Templates, die in der vorangehenden Variante einer
Benetzungseinrichtung erwähnt wurde, überlagert sein.
In einer weiteren Variante ist die Benetzungseinrichtung so ausgestaltet, dass damit das Gemisch, welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, aus dem ersten Reservoir über das Template gegossen werden kann. Beispielsweise kann das erste Reservoir durch die Benetzungseinrichtung bewegbar sein und in dem Reservoir befindliches Gemisch kann mit der Benetzungseinrichtung über das Template gegossen werden. Vorzugsweise ist ein zweites Reservoir vorhanden, wobei nach dem Gießen des Gemisches über das Template nicht an der Oberfläche des Templates verbleibendes Gemisch in dem zweiten Reservoir auffangbar ist. In einer speziellen Variante ist auch die Umkehrung dieses Prozesses mit der Benetzungseinrichtung möglich: Die
Benetzungseinrichtung ist so ausgestaltet, dass damit das Gemisch, welches das
Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, aus dem zweiten Reservoir über das Template gegossen werden kann und nach dem Gießen des Gemisches über das Template nicht an der Oberfläche des Templates verbleibendes Gemisch in dem ersten Reservoir aufgefangen werden kann. In noch einer Ausführungsform ist die Benetzungseinrichtung so ausgestaltet, dass damit das Gemisch aus Kulturmedium und Mikroorganismus aus dem ersten Reservoir auf das Template gesprüht werden kann.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Hohlkörpers aus einem mikrobiellen Polymer oder zur Beschichtung eines Gegenstands mit einem mikrobiellen Polymer, wobei das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte umfasst:
a) das in Kontakt bringen der Oberfläche eines Gegenstands,
mit einem Gemischvorrat, der ein flüssiges Kulturmedium und einen mikrobielles Polymer bildenden Mikroorganismus umfasst,
b) die Unterbrechung des Kontakts zwischen dem Gegenstand und dem
Gemischvorrat, wobei auf der Oberfläche des Gegenstands ein Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, c) das in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen
Atmosphäre und die Bildung mikrobiellen Polymers in und/oder auf dem
Flüssigkeitsfilm, und optional, die Trennung des Gegenstands von dem gebildeten Polymer, wobei ein
Hohlkörper aus mikrobiellem Polymer erhalten wird.
Das Verfahren kann mit der vorangehend beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt werden, ist aber nicht darauf beschränkt. Es wird auf alle vorangehend beschriebenen Merkmale einer erfindungsgemäßen Vorrichtung und die gesamte vorangehende Offenbarung Bezug genommen. Wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung eingesetzt wird, so entspricht das Template der Vorrichtung dem Gegenstand des obigen Verfahrens. Der Gemischvorrat des obigen Verfahrens wird in dem Reservoir/ den Reservoirs der Vorrichtung bereitgestellt.
Der Gegenstand wird periodisch, vorzugsweise kurzzeitig, mit dem Gemisch, das die Kulturlösung und den Mikroorganismus umfasst, benetzt. Hierbei bildet sich ein
Flüssigkeitsfilm auf der Oberfläche des Gegenstands. Die Form dieses Flüssigkeitsfilmes wird durch die Lage des Templates im Raum bestimmt, da die Schwerkraft auf diesen Film einwirkt.
Der Begriff„Unterbrechung des Kontakts" bedeutet, dass der Kontakt zwischen
Gegenstand und Gemischvorrat so unterbrochen wird, dass kein Teil der Oberfläche des Gegenstands während der Unterbrechung Kontakt zum Gemischvorrat hat.
Das in Kontakt bringen der Oberfläche eines Gegenstands, mit dem Gemischvorrat und die Unterbrechung des Kontakts erfolgen mit der zuvor beschriebenen
Benetzungseinrichtung, wenn eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens eingesetzt wird.
Die sauerstoffhaltige Atmosphäre ist vorzugsweise Luft oder reiner Sauerstoff oder ein sauerstoffhaltiges Gasgemisch. Ein bevorzugtes mikrobielles Polymer des Verfahrens ist mikrobielle Cellulose, die in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm gebildet wird, wenn dieser mit Sauerstoff in Kontakt kommt.
Der Kontakt zwischen dem Gegenstand und dem Gemischvorrat wird bei dem Verfahren unterbrochen und die Synthese des mikrobiellen Polymers erfolgt nur in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm, der von dem Gemischvorrat getrennt wurde. Dadurch spielen etwaige Diffussionsprozesse von Kulturlösung und Sauerstoff eine untergeordnete oder gar keine Rolle. Überraschenderweise wurde gefunden, dass keinerlei Polymer-Bildung innerhalb bzw. auf der Flüssigkeitsoberfläche des Gemischvorrats stattfindet. Wird der Gegenstand nach Herstellung des Polymers nicht von dem Polymer getrennt, so stellt das Verfahren ein Beschichtungsverfahren dar, bei dem der Gegenstand mit einer Polymerschicht versehen wird. Wird der Gegenstand von dem Polymer getrennt, so kann ein Hohlhörper erhalten werden. In letzterem Fall wird der Gegenstand auch als Template bezeichnet. Die Trennung erfolgt vorzugsweise dadurch, dass das gebildete Polymer von dem Template abgezogen wird. Beispielsweise wird eine Polymer von einem
zylinderförmigen Template abgestreift und ein Hohlzylinder aus Polymer erhalten. Je nach verwendetem Material kann das Template nach Oberflächen-schonender Reinigung wieder verwendet werden. Der Gegenstand kann in einer speziellen Ausführungsform während Schritt c) um eine oder mehrere Raumachsen rotiert werden. Wenn eine erfindungsgemäße Vorrichtung für das Verfahren eingesetzt wird, kann diese Rotation mit der bereits beschriebenen Bewegungseinrichtung erfolgen. Dabei wird die Form des Flüssigkeitsfilms auf der Oberfläche des Gegenstands beeinflusst. Anders ausgedrückt wird das Template mit einem definierten Flüssigkeitsfilm überzogen, was wiederum zu einer definierten Form des sich bildenden Produktes führt. Die Rotation kann auch bereits während Schritt a) und b) erfolgen. Wenn beispielsweise das Template zur Benetzung relativ zu dem
Gemischvorrat bewegt und mit diesem in Kontakt gebracht wird, dann kann zusätzlich eine der Bewegung des Templates überlagerte Relativbewegung um eine oder mehrere Raumachsen erfolgen.
In einer Variante des Verfahrens werden zusätzlich die folgenden Schritte durchgeführt: d) das in Kontakt bringen des in Schritt c) gebildeten mikrobiellen Polymers mit dem Gemischvorrat,
e) die Unterbrechung des Kontakts zwischen dem mikrobiellen Polymer und dem Gemischvorrat wobei auf der Oberfläche des Polymers ein Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus enthält, f) das in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen
Atmosphäre und die Bildung mikrobiellen Polymers in und/oder auf dem
Flüssigkeitsfilm,
Diese Folge der Schritte d)-f) kann ein- oder mehrmals wiederholt werden, bis eine gewünschte Menge Polymer auf der Oberfläche des Gegenstands erzeugt ist und das Polymer eine gewünschte Gesamtschichtdicke erreicht hat. Die sogenannte
Gesamtschicht kann aus mehreren Einzelschichten bzw. -Lagen zusammengesetzt sein. Bei dieser Verfahrensvariante erfolgt eine Synthese weiteren mikrobiellen Polymers auf bereits gebildetem Polymer.
Die Vorteile dieses erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber der Biosynthese von bakterieller Cellulose an der Oberfläche einer sauerstoffdurchlässigen Membran nach dem Stand der Technik sind unter anderem folgende: Wird die Cellulose an der inneren Seite eines permeablen Hohlträgers
synthetisiert, wird die innere Formkörperwandung ohne Begrenzung aber in ständigem Kontakt zur Kulturlösung„frei" im Raum entwickelt und stellt die ursprünglich erste (älteste) und lockerere Cellulosegelschicht dar. Im Verlauf der Kultivierung steht der an der inneren Hohlträgeroberfläche gebildeten
Celluloseschicht, die sich in die Nährlösung hineinbewegt, immer weniger Platz zur Verfügung. Die Ausbildung von Störstellen (Faltungen, Verdichtungen) innerhalb des Schichtsystems und am Lumen ist die Folge. Weitere wesentliche Nachteile dieser Methoden bestehen demnach darin, dass die auf diese Weise hergestellten Hohlzylinder keine hinreichend glatte, homogene innere Oberfläche aufweisen. Da neben der Ausbildung von gravierenden
Oberflächeninhomogenitäten durch Falten- oder Muldenbildung auch die Gefahr der Ablösung von Teilen der Cellulose gegeben ist, bergen diese Hohlzylinder ein sehr großes Thromboserisiko. Die Qualität des inneren Lumens kann den
Anforderungen an einen Blutgefäßersatz nicht entsprechen.
Wird die Cellulose an der äußeren Seite eines permeablen Hohlträgers
synthetisiert, wird die jüngste Celloluloseschicht immer zwischen bereits gebildeten Celluloseschichten und der äußeren Oberfläche des Hohlträgers gebildet. Daher entspricht das Lumen des BNC-Hohlkörpers, wenn der
Hohlträgers entfernt wurde, der aktuell synthetisierten jüngsten, festeren
Celluloseschicht, die eine hohe Bakterienzahl enthält (Bäckdahl H, Risberg B, Gatenholm P: Observations on bacterial cellulose tube formation for application as vascular graft. Materials Science and Engineering (201 1 ) 31 , 14-21 ).
Im Verlauf der Kultivierung muss die an der äußeren Hohlträgeroberfläche gebildete Celluloseschicht, die sich in die Nährlösung hineinbewegt und damit nach au ßen ortsverlagert wird, eine immer größere Fläche abdecken.
Morphologische Veränderungen können die Folge sein. Bodin et al. (Bodin A, Bäckdahl H, Fink H, Gustafsson L, Risberg B, Gatenholm P: Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotech Bioeng (2007) 97, 425-434) berichten von einem, die Gefäßwand aufbauendem Schichtensystem aus sehr vielen, nicht fest miteinander verbundenen Einzelschichten ähnlicher Morphologie, so dass die Gefahr des Ablösens bzw. Verschiebens einzelner Schichten gegeben ist.
Au ßerdem kann davon ausgegangen werden, dass die Oberflächentopgraphie (Rauhigkeit) des inneren Lumens sehr stark von der Oberflächenstruktur des eingesetzten gas-permeablen Materials (Poren, Spalten, Kanäle und andere Unregelmäßigkeieten) bestimmt wird. Poröses Material erlaubt nur die Passage von Mikrosauerstoffblasen, die die Sauerstoffversorgung der Mikroorganismen nicht gleichmäßig über die gesamte Wachstumsebene gewährleisten und somit die Cellulosebildung stören und zu Defekten/Inhomogenitäten in der gesamten aufgebauten hohlen Cellulose, insbesondere aber auch im Lumen der hohlen Cellulose führen können.
IV. Nicht-poröses Material soll die gleichmäßige Sauerstoffversorgung der
Mikroorganismen gewährleisten und die Gasblasenbildung unterbinden. Als mögliche Folge kann eine zu starke Haftung der BNC am Trägermaterial angenommen werden. Die Isolierung des Cellulosetubes führt zu Verletzungen der inneren Oberfläche.
V. Durch die Erhöhung des angelegten partiellen Sauerstoffdrucks an der äußeren Wandung eines gaspermeablen, nicht-porösen Hohlträgers wie in WO
2008/040729 A2 beschrieben, wird ein Gasüberdruck an der inneren Wandung des gebildeten Cellulosehohlkörpers initiiert. Dieser Gasüberdruck wirkt zum einen der Diffusion der Kulturlösung durch die gebildete Cellulose entgegen, zum anderen können auch Ablöseprozesse der sich bildenden Cellulose vom Träger während der Kultivierung nicht ausgeschlossen werden. Das Einschließen von Gasblasen führt zu Fehlstellen/Inhomogenitäten innerhalb der Cellulose sowie an der inneren Oberfläche.
VI. Die hohe Konzentration an Cellulose-synthetisierenden Bakterien über die
gesamte innere Oberfläche der Cellulosehohlkörper stellt hohe Anforderungen an eine sich an Produktion und Isolierung anschließende Reinigung, da bei
Verwendung der so hergestellten Cellulosehohlkörper als Blutgefäßersatz diese innere Oberfläche der Kontaktfläche mit dem Blut entspricht. Trotz intensiver Reinigung können Reaktionen des Immunsystems auf Verunreinigungen nicht ausgeschlossen werden.
VII. Wird BNC an der Oberfläche von sauerstoffdurchlässigen Membranen kultiviert, ist von verminderter Biokompatibilität, -Stabilität sowie fehlender Bioaktivität des
Materials auszugehen. Außerdem ist das Kultivierungsverfahren an sich nur sehr eingeschränkt steuerbar. Lediglich die Sauerstoffzufuhr und der Durchmesser der Hohlkörper-Membranen bieten die Möglichkeit, auf die Morphologie des BNC- Hohlkörpers und damit auf mechanische Eigenschaften Einfluss zu nehmen. In dem Verfahren erfolgt die Kultivierung nicht rein statisch sondern in„bewegt-statischer" Form, wobei der Gegenstand/das Template oder das Gemisch, enthaltend Kulturlösung und Mikroorganismus, oder beides, gesteuert so bewegt werden, dass die Oberfläche des Templates/Gegenstands benetzt wird. Ein dauerhafter Kontakt des
Gegenstands/Templates mit dem Gemischvorrat wird jedoch ausgeschlossen. Das Template/der Gegenstand und der Gemischvorrat, der das Kulturmedium und den Mikroorganismus aufweist, werden relativ zueinander bewegt und dabei zeitweise, aber nicht ständig, in Kontakt gebracht. Kennzeichen des Verfahrens sind ein periodisch aber nicht dauerhaft mit Kulturlösung und Mikroorganismus in Kontakt gebrachtes Template/Gegenstand, die Ausbildung eines Films, der Kulturmedium und Mikroorganismus enthält, auf dem Template/Gegenstand und die Biosynthese des Polymers auf dem Template/Gegenstand ausschließlich in und/oder auf dem Film - au ßerhalb des Gemischvorrats.
Durch periodischen, aber vorzugsweise kurzzeitigen Kontakt mit dem Kulturmedium wird eine Versorgung der Mikroorganismen mit Nährstoffen etc. sichergestellt. Die äu ßere Formung des Hohlkörpers erfolgt erfindungsgemäß berührungsfrei, ausschließlich durch den Einfluss der Schwerkraft. Nach dem Benetzungsvorgang befindet sich der benetzte Gegenstand/das benetzte Template frei in der umgebenden Sauerstoff-haltigen
Atmosphäre und der Polymerbildungsprozess, insbesondere ein
Cellulosebildungsprozess, erfolgt in und/oder auf dem Film. Die äußere Formgebung des Hohlkörpers wird ausschließlich durch die Wahl der Kultivierungsbedingungen definiert. Zu den Kultivierungsbedingungen zählen beispielsweise die Richtung der
Schwerkrafteinwirkung, die Häufigkeit und der Abstand einzelner Drehungen, das Zeitintervall zwischen den Benetzungen, die Benetzungszeit, die Verweilzeit, wie nachfolgend noch erläutert, die Temperatur, und die Kultivierungsdauer. Während des Verfahrens ist ein Kulturlösungs- und Sauerstoffaustausch zwischen der aufwachsenden Schicht des Hohlkörpers und dem Kultivierungsmillieu gegeben, so dass eine optimale Versorgung mit Nährmedium, Luft und Mikroorganismen gewährleistet ist.
Erfindungsgemäß erfolgen eine kurzzeitige Benetzung und damit die erforderliche Zufuhr der Kulturlösung an den Ort der Biosynthese. Damit ist die Zufuhr der Kulturlösung im Gegensatz zu den genannten und diskutierten Publikationen nicht mehr diffusionsbestimmt. Bei der Benetzung werden alle für die Biosynthese notwendigen Nährstoffe übertragen.
Bei der BNC-Herstellung unter Verwendung von Reaktoren mit rotierenden Scheiben wird zwar die Diffusionsbarriere überwunden, was durch eine ständige rotierende Bewegung des Templates in der Kulturlösung erreicht wird. Der dauerhafte Kontakt der
Mikroorganismen mit der Kulturlösung führt aber zu BNC-Produkten mit strukturellen Nachteilen, wie bei der Würdigung des Standes der Technik genannt. Durch die gesteuerte Zufuhr der Kulturlösung wird erfindungsgemäß die
Cellulosebildungsgeschwindigkeit so geregelt, dass optimale Verdichtungs- und
Verfestigungsprozesse ohne Störungen im Kristallisationsprozess ermöglicht werden.
Überraschend bietet das erfindungsgemäße Verfahren optimale Bedingungen für die Anlagerung von Bakterien an ein Template oder einen Gegenstand und deren
gleichmäßige Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff. Gleichzeitig wird die BNC mit in der Kulturlösung freibeweglichen Bakterienzellen beladen.
Der Ort der Biosynthese und damit der Ort der höchsten Bakterienkonzentration befinden sich in der äußeren Grenzschicht des Hohlkörpers und damit nicht auf der Seite des Hohlraums, der bei einem künstlichen Blutgefäß das perspektivisch mit Blut in Kontakt stehende Lumen bildet.
Mit dem Verfahren lassen sich Hohlkörper herstellen, die eine Wand mit phasenweisem Aufbau besitzen. Der Begriff „Phase" bezeichnet eine schichtartige Struktur, wobei die Phase aus mehreren Schichten aufgebaut sein kann.
Insbesondere ist der Hohlkörper ein Hohlzylinder mit einer Mittelachse, die mittig und längs der Zylinderausdehnung durch den Hohlraum verläuft. Insbesondere ist der Hohlkörper aus mindestens zwei, rotationssymmetrisch um die Hauptachse
angeordneten, parallel zueinander verlaufenden, miteinander verbundenen,
störungsfreien BNC-Phasen gekennzeichnet. Auf diese Weise kann ein biomimetischer Aufbau der Wand des Hohlkörpers erzeugt werden. Im Gegensatz zu WO 2008/040729 wurde gefunden, dass die Phasen fest miteinander verbunden sind. Desweiteren besitzen die Phasen vorzugsweise einen homogenen Aufbau, ohne Störstellen und
Strukturgradienten. Überraschender Weise wurde gefunden, dass dieser Aufbau dem Hohlkörper über die gesamte Länge Formstabilität und gleichmäßig hohe mechanische Reiß- und
Druckfestigkeit sowie ausreichende Elastizität unabhängig vom inneren Durchmesser des Hohlkörpers verleiht. Die Phasen sind charakterisiert durch ein gleichmäßiges (isotropes), gut verzweigtes Fasernetzwerk. Anzahl und Stärke der Phasen sind kontrolliert einstellbar. Grundlegend sind die Wände aller natürlichen Arterien und Venen durch einen 3-Schichten-Aufbau aus der Tunica intima, der Tunica media und der Tunica externa (Adventicia) gekennzeichnet. Die Phasen sind so angeordnet, dass sie der einem natürlichen Gefäß nahe kommenden Struktur insbesondere der Media entsprechen
(biomimetische Struktur) und den Aufbau körpereigener Strukturen (Adventitia und Intima) sowie den Stoffaustausch vergleichbar mit dem natürlicher Austauschprozesse
(bioaktives Material) anregen. Das erfindungsgemäße Verfahren, kann wie bereits erwähnt in der eingangs
beschriebenen Vorrichtung durchgeführt werden. Es wird vorzugsweise in einer zuvor sterilisierten Vorrichtung durchgeführt und mit sterilem Kulturmedium. In einer Variante können das Kulturmedium und die Vorrichtung getrennt voneinander sterilisiert werden. Zur Durchführung des Verfahrens wird anschließend das sterilisierte Kulturmedium in das Reservoir innerhalb des Gehäuses der Vorrichtung, welche ebenfalls bereits steril sind, eingebracht, beispielsweise durch eine oben bereits beschriebene Öffnung im Gehäuse, die nach Einbringen des sterilen Kulturmediums und Impfung des Kulturmediums mit dem Mikroorganismus verschlossen wird. In einer anderen Variante wird die Kulturlösung vor dem Sterilisieren der Vorrichtung in dieselbe eingebracht, und die Sterilisation von Vorrichtung und Kulturmedium erfolgt gleichzeitig. Anschließend kann das Kulturmedium mit dem Mikroorganismus beimpft werden, wobei der Mikroorganismus durch eine oben bereits beschriebene Öffnung im Gehäuse eingeschleust werden kann. In beiden
Varianten ist das Template vorzugsweise bereits in die Vorrichtung eingesetzt, wenn diese sterilisiert wird. Ansonsten müsste das Template ebenfalls getrennt sterilisiert und anschließend in die sterilisierte Vorrichtung eingesetzt werden.
Die Zeiten des in Kontakt Bringens der Oberfläche eines Gegenstands (Schritt a) mit einem Gemischvorrat und des in Kontakt Bringens des in Schritt c) erzeugten mikrobiellen Polymers mit dem Gemischvorrat (Schritt d) werden als„Benetzungszeiten" bezeichnet. Die Zeiten des in Kontakt Bringens des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre (Schritte c und f)) werden als„Verweilzeiten" bezeichnet. Benetzungszeiten und Verweilzeiten können von einander unabhängig gesteuert werden.
In einer Ausführungsform des Verfahrens wird der Gegenstand zumindest während Schritt c), vorzugsweise auch während Schritt a) und b) um eine oder mehrere Raumachsen rotiert. Wenn die optionalen Schritte d), e) und f) einmal oder mehrmals ausgeführt werden, dann wird in einer weiteren Ausführungsform der Gegenstand zumindest während dem Schritt f), oder einem oder mehreren der Schritte f), wenn der Schritt f) mehrmals durchgeführt wird, um eine oder mehrere Raumachsen rotiert. Der Gegenstand kann auch während Schritt d) und e), um eine oder mehrere Raumachsen rotiert werden, wenn eine Rotation während des Schrittes f) erfolgt.
Die Gesamtkultivierungszeit beträgt vorzugsweise 1 -7 Tage. Die Gesamtkultivierungszeit entspricht der gesamten Prozesszeit, innerhalb welcher alle Schritte des Verfahrens, wie Dreh-, Benetzungs- und sonstige Schritte ablaufen. Die Dauer des Verfahrens bestimmt die Dicke des auf dem Template gebildeten Polymers, die der Wandstärke des isolierten Hohlkörpers entspricht.
Das Verfahren wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 bis 40 ^ durchgeführt.
Die mit dem Verfahren erhaltenen Hohlkörper können ohne Trocknung nach einem Reinigungsprozess als feuchte Implantate eingesetzt werden. Die Hohlkörper können gereinigt werden, um Reste und Bestandteile des Kulturmediums und Mikroorganismen zu entfernen. Die Reinigung erfolgt vorzugsweise mit Wasser, wässriger saurer oder alkalischer Lösung, oder einem organischen Lösungsmittel, oder einer Kombination davon.
Andererseits können die Hohlkörper zur Lagerung, beispielsweise durch Gefriertrocknung oder Kritischpunkttrocknung, schonend getrocknet werden, wobei die Struktur und die Wiederquellbarkeit von Nanocellulose erhalten bleiben. Vor einer chirurgischen
Anwendung kann das Implantat beispielsweise in physiologischer Kochsalzlösung oder auch patienteneigenem oder allogenem (pharma-grade) Serum wieder gequollen werden.
Mit der vorliegenden Vorrichtung und dem Verfahren hergestellte Hohlkörper können in medizinischen Anwendungen als innere Hohlstrukturen und -gefäße, wie Blutgefäße, Speiseröhre, Verdauungstrakt, Luftröhre, Harnröhre, Gallengang, Harnleiter,
Lymphgefäße oder als Manschette (cuff) zur Umhüllung von körpereigenen Strukturen wie Hohlorganen oder Nervenfasern, oder als Interponat eingesetzt werden, wobei die Hohkikörper direkt oder nach Adaption an die Organspezifik eingesetzt werden können. Weitere Verwendungen sind die Verwendung als medizinisches Übungsmaterial, insbesondere für das realitätsnahe Training chirurgischer Techniken, in der
cardiovaskulären Medizin und der Viszeralchirurgie, wozu die Hohlkörper auch mechanisch bearbeitet werden kann. Von der Erfindung werden anderem auch folgende Gegenstände, Verfahren und
Kombinationen angegeben, wobei zur Erläuterung von nachfolgend genannten
Merkmalen auf die obige Beschreibung verwiesen wird. Die in Klammern angegebenen Bezugszeichen stellen lediglich einen beispielhaften Bezug zu den im Beispielteil angegeben Figuren und Erläuterungen her, ohne die Gegenstände und Verfahren auf spezielle Ausführungsformen des Beispielteils oder der Figuren zu beschränken.
1 . Vorrichtung (1 ) zur Herstellung von Hohlkörpern aus einem mikrobiellen Polymer, insbesondere mikrobieller Cellulose, aufweisend
- ein Template (3), das die Negativform des Hohlraums des herzustellenden
Hohlkörpers und der inneren Wände des Hohlraums ist,
- ein erstes Reservoir (2), das mit einem Gemisch (10), welches ein flüssiges Kulturmedium und einen Polymer-bildenden Mikroorganismus umfasst, befüllbar ist,
- eine Benetzungseinrichtung (6, 7) zur Benetzung des Templates (3) mit dem in das Reservoir eingebrachten Gemisch (10),
- ein Gehäuse (15), welches zumindest das Template (3) und das Reservoir (2) so umschließt, dass ein Stoffaustausch mit der Umgebung (18) des Gehäuses verhinderbar ist. 2. Vorrichtung nach Punkt 1 , wobei das Gehäuse (15) eine verschließbare Öffnung (17) aufweist, durch welche ein Stoffaustausch mit der Umgebung (18) erfolgen kann.
3. Vorrichtung nach Punkt 1 oder 2, wobei das Gehäuse (15) insgesamt oder teilweise durchsichtig ist. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Punkte, aufweisend eine
Bewegungseinrichtung (5) womit das Template (3) um eine oder mehrere
Raumachsen (1 1 ) rotierbar ist. Vorrichtung nach Punkt 4, wobei die Bewegungseinrichtung (5) so ausgestaltet ist, dass damit das Template um eine oder mehrere Raumachsen rotierbar ist, die quer zu einer Längsachse des Templates stehen. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Punkte, wobei das Template eine Oberfläche hat, die Strukturen im Millimeter-, Mikrometer- und/oder
Nanometerbereich aufweist.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Punkte, wobei das Template eine Oberfläche aus Holz, Metall, Kunststoff, Keramik, synthetischem Polymer, Papier Textilgewebe oder Glas hat.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Punkte, aufweisend eine Anordnung aus mehreren Templates (3).
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Punkte, die sterilisierbar ist, insbesondere durch Hitze, Dampf, Strahlung und/oder Chemikalien.
Vorrichtung nach einem der Punkte 1 -9, wobei die Benetzungseinrichtung (6, 7) so ausgestaltet ist, dass damit das Template (3) in das Gemisch (10), welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, ein- und ausgetaucht werden kann. Vorrichtung nach einem der Punkte 1 -9, wobei die Benetzungseinrichtung (6, 7) so ausgestaltet ist, dass damit das Gemisch (10), welches das Kulturmedium und den
Mikroorganismus umfasst, aus dem ersten Reservoir (2) über das Template (3) gegossen werden kann.
Vorrichtung nach Punkt 1 1 , die ein zweites Reservoir (2') aufweist, wobei nach dem Gießen des Gemisches (10), welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, über das Template nicht an der Oberfläche des Templates verbleibendes Gemisch (10') in dem zweiten Reservoir (2') auffangbar ist. Vorrichtung nach Punkt 12, wobei die Benetzungseinrichtung (6, 7) so ausgestaltet ist, dass damit das Gemisch (10'), welches das Kulturmedium und den
Mikroorganismus umfasst, aus dem zweiten Reservoir (2') über das Template (3) gegossen werden kann und wobei nach dem Gießen des Gemisches (10') über das Template nicht an der Oberfläche des Templates verbleibendes Gemisch (10) in dem ersten Reservoir (2) aufgefangen werden kann. Verfahren zur Herstellung eines Hohlkörpers aus einem mikrobiellen Polymer oder zur Beschichtung eines Gegenstands mit einem mikrobiellen Polymer, wobei das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte umfasst:
a) das in Kontakt bringen der Oberfläche eines Gegenstands (3),
mit einem Gemischvorrat (10), der ein flüssiges Kulturmedium und einen mikrobielles Polymer bildenden Mikroorganismus umfasst,
b) die Unterbrechung des Kontakts zwischen dem Gegenstand (3) und dem
Gemischvorrat (10), wobei auf der Oberfläche des Gegenstands (3) ein
Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den
Mikroorganismus umfasst,
c) das in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen
Atmosphäre und die Bildung mikrobiellen Polymers in und/oder auf dem
Flüssigkeitsfilm, und optional, die Trennung des Gegenstands (3) von dem gebildeten Polymer, wobei ein Hohlkörper aus mikrobiellem Polymer erhalten wird. Verfahren nach Punkt 14, wobei der Gegenstand (3) zumindest während Schritt c) um eine oder mehrere Raumachsen (1 1 ) rotiert wird. Die Erfindung wird nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen
Fig. 1 eine erste Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dynamischer Anordnung des Templates und eine statische Anordnung des Gemisches, in einer Schnittansicht
Fig. 2 eine alternative Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dynamischer Anordnung des Templates und dynamischer Anordnung des Gemisches, in einer Schnittansicht
Fig. 3 rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahme eines erfindungsgemäßen BNC- Hohlzylinder-Querschnitts mit 3-Phasenaufbau
Fig. 4 REM-Aufnahme des BNC-Netzwerks der Phase a
Fig. 5 REM-Aufnahme des BNC-Netzwerks der Phase b
Fig. 6 REM-Aufnahme des BNC-Netzwerks der Phase c
Beispiel 1 : Aufbau und Funktionsweise von Vorrichtungen zur Durchführung des
Verfahrens
In der Ausführungsform der Fig.1 ist die erfindungsgemäße Vorrichtung 1 als Bioreaktor ausgeführt, mit einem Gehäuse 15, welches aus einem Gefäß 9 und einer Abdeckung 8 besteht und den Innenraum 14 umschließt. Das Gefäß 9 ist mit der Abdeckung 8 verschließbar und hier im geschlossenen Zustand gezeigt. Das Gefäß 9 und die
Abdeckung 8 können aus Edelstahl sein. In dem Bioreaktor befindet sich ein separates Reservoir 2 für das Gemisch 10, bestehend aus einer Kulturlösung und einem
Mikroorganismus. Das Reservoir 2 und das Gemisch 10 können durch die Öffnung 17 des Gefäßes 9 eingebracht werden, wenn die Abdeckung 8 vom Gefäß 9 entnommen wird. Eine weitere verschließbare Öffnung 19 ist in der Abdeckung 8 vorgesehen und mit einem Verschluss 20 verschlossen. Alternativ ist es daher auch möglich, das Reservoir 2 in das Gefäß 9 einzusetzen, die Abdeckung 8 zu schließen und die Kulturlösung bzw. das Gemisch durch die Öffnung 19 zuzugeben.
Mehrere Templates 3, hier Zylinder aus Metall oder Holz, sind zwischen zwei
Einspannvorrichtungen 4 eingespannt und bilden eine Anordnung aus mehreren
Templates (Template-Matrix). Die Templates 3 sind über eine Kupplung 6, hier stabförmig, mit einem Motor 7 verbunden. Der Motor 7 kann den Stab 6 und die Templates 3 absenken und in das Gemisch 10 in dem Reservoir 2 eintauchen. In einer Gegenbewegung können die Templates wieder angehoben und ausgetaucht werden. Beim Austauchen verbleibt ein Film aus dem Gemisch 10 auf den Templates 3. Der Motor 7 und die Kupplung 6 bilden eine Benetzungseinrichtung. In der hier gezeigten schematischen und nicht
maßstäblichen Darstellung ist die Kupplung 6 nur verkürzt gezeichnet. Sie ist so lang ausgeführt, dass die Eintauch- und Austauchbewegung möglich ist. Diese
Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist durch eine dynamische
Anordnung der Templates 3 und eine statische Anordnung des Gemisches 10 aus Kulturlösung und Mikroorganismus gekennzeichnet: Das Gemisch 10 wird nicht bewegt, während zur Benetzung die Templates 3 durch eine Ab- und Aufwärtsbewegung in das Gemisch 10 ein- und ausgetaucht werden. Die Ein- und Austauchbewegung erfolgt translatorisch entlang der dargestellten Z-Achse. Die Kupplung 6 ist durch die Öffnung in der Abdeckung 8 geführt. Der Spalt zwischen dem Rand der Öffnung und dem Stab ist durch die Dichtung 16 verschlossen, sodass der Innenraum 14 gegen die Umgebung 18 dicht verschlossen ist.
Durch eine schematisch dargestellte Bewegungseinrichtung 5 wird eine Bewegung der Template 3 innerhalb des Innenraums 14 realisiert. Der Antrieb der
Bewegungseinrichtung erfolgt mit dem Motor 7 über die Kupplung 6. In der gezeigten Ausführungsform wird die Kupplung 6 um ihre Längsachse rotiert und hat dadurch die Funktion einer Welle. Die Welle ist mit einem (nicht dargestellten) Getriebe verbunden, welches ein Teil der Bewegungseinrichtung 5 ist und der Zusammenbau aus
Einspannvorrichtungen 4 und Templates 3 im Uhrzeigersinn dreht, dargestellt durch einen Pfeil. Der Zusammenbau aus Einspannvorrichtungen 4 und Templates 3 wird um eine Raumachse gedreht, die senkrecht zur Zeichnungsebene steht (X Achse). Die X-Achse steht senkrecht zu den Längsachsen der Templates 3, die längs in Richtung der eingezeichneten Z-Achse ausgerichtet sind. Die Bewegungseinrichtung kann so ausgestaltet sein, dass der Zusammenbau statt um die X-Achse, oder zusätzlich dazu, um die eingezeichnete Y-Achse, oder um weitere Achsen, rotierbar ist. Denkbar ist beispielsweise eine kardanische Aufhängung des Zusammenbaus.
In einer in Fig. 2 gezeigten weiteren Ausführungsform ist die Vorrichtung 1 als Bioreaktor ausgeführt, mit einem Gehäuse 15, welches aus einem Gefäß 9 und einer Abdeckung 8 besteht und den Innenraum 14 umschließt. Im Innenraum 14 befinden sich der
Zusammenbau aus Einspannvorrichtungen 4 und Templates 3, ein erstes Reservoir 2 und ein zweites Reservoir 2' für das Gemisch 10. Das erste Reservoir 2 und das zweite Reservoir 2' sind gegenüber liegend, beidseitig des Zusammenbaus aus
Einspannvorrichtungen 4 und Templates 3 angeordnet. Die Reservoire 2, 2' können in Richtung der Templates geöffnet werden. Mit Verschlusseinrichtungen 13, 13' können die Öffnungen der Reservoire 2, 2' wahlweise geöffnet oder geschlossen werden. Die
Verschlusseinrichtungen 13, 13' sind kein zwingendes Merkmal der erfindungsgemäßen Vorrichtung, aber vorteilhaft um ein ungewolltes Austreten von Gemisch 10, 10' aus den Reservoiren 2, 2' zu verhindern. Die schematisch dargestellten Verschlusseinrichtungen 13, 13' können beispielsweise mechanisch oder elektromagnetisch gesteuerte Ventile sein.
Der Zusammenbau aus Einspannvorrichtungen 4 und Templates 3, das erste Reservoir 2, das zweite Reservoir 2' und die Verschlusseinrichtungen 13, 13' sind von einer Umhüllung 12 umgeben und relativ zu dieser und relativ zueinander fixiert. Die
Bewegungseinrichtung 5 greift an der Umhüllung 12 an.
Der Antrieb der Bewegungseinrichtung 5 erfolgt mit dem Motor 7 über die Kupplung 6. In der gezeigten Ausführungsform wird die Kupplung 6 um ihre Längsachse rotiert und hat dadurch die Funktion einer Welle. Die Welle ist mit einem (nicht dargestellten) Getriebe verbunden, welches ein Teil der Bewegungseinrichtung 5 ist und der Zusammenbau aus Hülle 12, Einspannvorrichtungen 4, Templates 3, Reservoirs 10, 10' im Uhrzeigersinn dreht, dargestellt durch einen Pfeil. Die Einspannvorrichtung 4 mit den Templates 3 werden um eine Raumachse gedreht, die senkrecht zur Zeichnungsebene steht (X Achse). Die X-Achse steht senkrecht zu den Längsachsen der Templates 3, die längs in Richtung der eingezeichneten Z-Achse ausgerichtet sind.
Im dargestellten Zustand der Vorrichtung ist das erste Reservoir 2 mit Gemisch 10 gefüllt. Bei einer Drehung im Uhrzeigersinn um 180° um die X-Achse wird das erste Reservoir 2 mitsamt Gemisch 10 in die obere Stellung bewegt, wo sich in dieser Darstellung noch das Reservoir 2' befindet. Dabei wird die Verschlusseinrichtung 13 geöffnet und das Gemisch 10 ergießt sich über die Templates 3. Nicht an der Oberfläche der Templates 3
verbleibendes Gemisch ergießt sich in das in die untere Stellung bewegte zweite
Reservoir 2', dessen Verschlusseinrichtung 13' ebenfalls geöffnet wurde, und wird darin als Gemisch 10' aufgefangen (in der Darstellung der Fig. 2 bezeichnet 10' noch den Raum in den das Gemisch 10' fließt, noch nicht das Gemisch selbst). An der Oberfläche der Templates 3 verbleibendes Gemisch bildet dort einen Film aus. Der beschriebene Vorgang kann beliebig oft wiederholt werden und findet bei der nächsten Drehung um die X-Achse um 180° in umgekehrter Richtung statt: das Gemisch 10', wird aus dem zweiten Reservoir 2' über die Templates 3 gegossen und nicht an der Oberfläche der Templates 3 verbleibendes Gemisch wird in dem ersten Reservoir 2 aufgefangen.
Die Benetzungseinrichtung 6, 7 und die Bewegungseinrichtung 5, welche die Templates 3 dreht, sind in der Ausführungsform der Fig. 2 zusammen gefasst: Die
Bewegungseinrichtung 5 dreht die Reservoirs 2, 2' und die Templates 3 wie oben angegeben, wodurch wie erläutert eine Benetzung erfolgt. Zusätzlich zu der erwähnten Drehung um die X-Achse können die Templates 3 und die Reservoirs 2, 2' auch um weitere Raumachsen gedreht werden, beispielsweise um die Y-Achse. In den Zeiträumen zwischen den Benetzungsvorgängen werden die Reservoirs 2, 2' mittels der
Verschlusseinrichtungen 13, 13' verschlossen und die Templates 3 können mit der Bewegungseinrichtung 5 gedreht werden, ohne dass sich Gemisch 10 über die Templates ergießt. In dieser Zeit wird in und/oder auf dem Film auf der Oberfläche der Templates 3 Polymer, zum Beispiel Cellulose, gebildet.
Die Ausführungsform der Fig. 2 ist durch eine dynamische Anordnung des Templats und eine dynamische Anordnung der Kulturlösung gekennzeichnet. Die Vorrichtung ermöglicht ein Verfahren zum Aufbau von BNC-Implantaten bei dem gleichzeitig die Templates 3 und das Gemisch 10 periodisch bewegt werden. Beispiel 2: Verfahren - Herstellung eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose: Allgemeines Vorgehen:
Zur Herstellung der Produkte werden Templates 3 zwischen Einspannvorrichtungen 4 angeordnet und in die Bewegungseinrichtung 5 eingesetzt. Der Reaktor wird daraufhin mit der Abdeckung 8 verschlossen und sterilisiert. Nach erfolgter Sterilisation des gesamten Reaktors wird/werden das Reservoir 2 oder die Reservoire 2, 2' unter sterilen
Bedingungen mit einem Gemisch 10 aus Cellulose bildende Mikroorganismen und getrennt sterilisierter Kulturlösung 10 befüllt.
Mikroorganismus: 247,5 ml einer Vorkultur eines Bakteriums der Gattung
Gluconacetobacter.
Kulturlösung: 4950 ml Nährlösung, die pro Liter deionisiertem Wasser 20,00 g Glucose wasserfrei, 5,00 g Bactopepton, 5,00 g Hefeextrakt, 3,40 g di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat und 1 ,15 g Citronensäure-Monohydrat enthält sowie einen pH-Wert zwischen 6,0 und 6,3 aufweist (Hestrin-Schramm-Medium, dampfsterilisiert bei 121 <C für 20min im Autoklaven).
Es ist auch möglich, das Reservoir 2 / die Reservoire 2, 2' vor dem Sterilisationsvorgang mit Kulturlösung zu befüllen und zusammen mit allen anderen Einbauten im Bioreaktor zu sterilisieren und anschließend Mikroorganismen zuzugeben, beispielsweise durch eine verschließbare Öffnung im Gehäuse unter sterilen Bedingungen.
Die Bedingungen im Reaktorinnenraum Temperatur, Druck, Atmosphärenzusammensetzung werden entsprechend den Kultivierungsbedingungen eingestellt.
Durch das Gehäuse 15 ist jeglicher unkontrollierter Stoffaustausch mit der Umgebung unmöglich, wodurch die Sterilität über den gesamten Kultivierungsprozess sichergestellt wird.
Daraufhin wird der Motor 7 gestartet, und dadurch die Bewegungseinrichtung 5 und die Benetzungseinrichtung 6, 7 in Bewegung gesetzt und die Template-Matrix 3, 4
entsprechend den vorgegebenen Kultivierungsbedingungen bewegt. Die Bewegungsarten der verschiedenen Ausführungsformen einer Vorrichtung wurden in Beispiel 1 erläutert. Die Bewegung erfolgt vorzugsweise diskontinuierlich mit Frequenzen vorzugsweise kleiner 0,01 Hz dahingehend, dass die Templates auf definierte Weise mit Kulturmedium 10 benetzt werden. Daraufhin oder gleichzeitig sorgt die Bewegungseinrichtung 5 durch gezielt überlagerte Bewegungen für eine definierte Verteilung des Flüssigkeitsfilmes.
Während dieser Bewegung erfolgt die Kultivierung der bakteriellen Nanocellulose auf dem Template 3 an der Grenzfläche zwischen Flüssigkeitsfilm und sauerstoffhaltiger
Atmosphäre im Innenraum 14. Dieser Vorgang wird so lange wiederholt, bis das Produkt die gewünschte Form angenommen hat.
Sodann kann der Reaktor geöffnet, die Templates 3 mit den darauf gebildeten
Hohlkörpern aus bakterieller Nanocellulose entnommen und der Aufarbeitung zugeführt werden. Die Hohlkörper werden von den Templates abgestreift, gereinigt und feucht gelagert oder getrocknet, wie im allgemeinen Beschreibungsteil beschrieben.
Mit einer abgewandelten Vorrichtung ist es auch möglich die Sterilisation und
Aufarbeitung der synthetisierten Hohlkörper im Reaktor derart vorzunehmen, dass beim Öffnen des Reaktors das fertige Produkt entnommen werden kann. Durch eine nicht gezeigte Einrichtung könnte durch eine weitere Öffnung das Kulturmedium 10 durch entsprechende Reinigungs- bzw. Spülflüssigkeiten ersetzt werden.
Methoden: i) Nahtausreißfestigkeit:
Durch die Wandung eines rohrförmigen Cellulosehohlkörpers wie im Bespiel beschrieben werden mit chirurgischem Nahtmaterial (z.B. PROLENE 5/0 (1 metric)) Schlingen derart angebracht, dass von der Au ßenseite in Richtung Lumen durch die Wandung des Hohlkörpers gestochen, das Nahtmaterial hindurchgezogen und danach verknotet wird. Dieses Vorgehen entspricht der Herstellung einer sog. Einzelknopfnaht. Dieser Vorgang wird einige Mal (z.B. sechs Mal) wiederholt, so dass auf dem Umfang des Hohlkörpers sechs Schlingen angebracht sind.
In einer Zugprüfmaschine wird das den Schlingen entgegengesetzte Ende des
Hohlkörpers fixiert und eine der Schlingen mit einem Haken erfasst, welcher mit dem Kraftaufnehmer der Prüfmaschine verbunden ist. Die Prüfmaschine wird in Funktion gesetzt, so dass sich Kraftaufnehmer und Fixierungspunkt voneinander entfernen. Hierbei ergibt sich ein Zug an der eingehängten Schlinge, welche beim Überschreiten einer bestimmten Zugkraft aus dem Hohlkörper herausgerissen wird. Diese Kraft wird an der Prüfmaschine abgelesen und der Versuch zur statistischen Absicherung des Meßwertes mit allen weiteren Schlingen in der beschriebenen Weise wiederholt. Der Mittelwert der ermittelten Kräfte ist die Nahtausreißfestigkeit des Hohlkörpers. ii) Berstdruck
Ein rohrförmiger Cellulosehohlkörper wie im Bespiel beschrieben wird waagerecht auf zwei Schlaucholiven mit Kabelbindern derart fixiert, dass eine abrutschsichere und weitgehend flüssigkeitsdichte Verbindung gegeben ist. Der Abstand der Oliven beträgt 100 mm. Eine der Schlaucholiven ist mit mit einem Ventil verbunden, die andere mit einem Reservoir, welches Wasser enthält und durch Druckluft mit Druck beaufschlagt werden kann. Der Druck in diesem Reservoir wird auf 200 mbar (ü) erhöht, bis der Celluloshohlkörper vollständig mit Wasser gefüllt ist. Danach wird das Ventil geschlossen und der Druck im Reservoir in einer Geschwindigkeit von 0,1 -0,2 bar/s erhöht, bis der Cellulosehohlkörper versagt, was an einem starken Austritt von Wasser an einer eng begrenzen Stelle erkennbar ist. Der zum Zeitpunkt des Versagens im System
herrschende Druck wird an einem Manometer abgelesen.
iii) REM
REM-Untersuchungen wurden durchgeführt, um den biomimetischen Aufbau der BNC- Hohlzylinder zu belegen, dafür wurde das Material für 24 Stunden einer Gefriertrocknung unterzogen und mit Gold besputtert.
Beispiel 2.1 4950 ml Nährlösung, die pro Liter deionisiertem Wasser 20,00 g Glucose wasserfrei, 5,00 g Bactopepton, 5,00 g Hefeextrakt, 3,40 g di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat und 1 ,15 g Citronensäure-Monohydrat enthält sowie einen pH-Wert zwischen 6,0 und 6,3 aufweist (Hestrin-Schramm-Medium) und bei 121 °C für 20 min im Autoklaven dampfsterilisiert wurde, wurden mit 247,5 ml einer Vorkultur eines Bakteriums der Gattung Gluconacetobacter beimpft. Die sterilisierte Vorrichtung 1 wurde mit dem so hergestellten Gemisch befüllt.
Als Template 3 wurde ein bakteriophiles Rundmaterial (Holz) mit einem Durchmesser von 5 mm verwendet. Das periodische Benetzen die in einer Matrix-Anordnung
zusammengefassten Templates mit der Kulturlösung, enthaltend den Mikroorganismus, wurde mit Hilfe des Motors 7 realisiert. Während des Kultivierungsprozesses wurden die in einer Matrix-Anordnung zusammengefassten Templates in einem Zeitintervall von 10 Minuten benetzt. Die überlagerte Drehbewegung um die Drehachsen 1 1 erfolgte nach jedem Benetzungsvorgang.
Nach Ablauf des Biosynthesezeitraums von 6 Tagen wurde der Bioreaktor 1 einschließlich Template-Matrix demontiert, die hergestellten BNC-Hohlzylinder von ihren Templates 3 isoliert, sterilisiert und gereinigt.
Die Synthese lieferte BNC-Hohlzylinder mit einem inneren Durchmesser von 5 mm, einer Wandstärke von 5 mm und einer Länge von 15 cm.
Die Struktur des erhaltenen BNC Hohlzylinders ist in den Fig. 3, 5-9 gezeigt, die rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen darstellen.
Fig. 3 zeigt die REM-Aufnahme des Querschnitts eines BNC-Hohlzylinders in der Übersicht. Der Hohlzylinder ist aus 3 parallelen rotationssymmetrisch zur Achse gelegenen und untereinander fest verbundenen Schichten (a, b, c), hier bezeichnet als Phasen (a, b, c), aufgebaut. Die Phasenübergänge sind deutlich erkennbar.
Die Phase a weist die innere Oberfläche (hohlraumseitige Oberfläche) der Wand auf und wird auch als„Lumen-seitige Phase" bezeichnet. Die Phase c weist die äußere
Oberfläche der Wand auf und wird auch als„außenseitige Phase" bezeichnet.
Bei der Lumen-seitigen Phase a ist sowohl die Querschnittsfläche als auch die dazu abgewinkelte Seitenfläche, die an die Phase b angrenzt, sichtbar. Der Schriftzug„Phase a" ist auf die Querschnittsfläche gezeichnet. Die Seitenfläche der Phase a befindet sich rechts angrenzend dazu. Von den Phasen b und c sind nur Querschnittsflächen sichtbar, welche bei diesem Präparat gegenüber der Querschnittsfläche der Phase a nach hinten, in die Bildebene hinein, versetzt sind. Der Streifen rechts der Phase c ist ein Präparations- Artefakt und kein Teil der Wand oder einer Oberfläche davon. Der BNC-Hohlzylinder ist durch 2 Schichten/Grenzflächen hoher Oberflächenqualität begrenzt. Fig. 4-6 zeigen REM-Aufnahmen der Fasernetzwerkstrukturen der den BNC-Hohlzylinder aufbauenden Phasen a-c. Alle Phasen zeichnen sich durch einen sehr gleichmäßigen Faseraufbau ähnlicher Faserdichte aus. Alle drei Phasen a, b, c weisen eine ähnliche räumliche Porosität auf, definiert als Hohlraumvolumen/Gesamtvolumen. Der Aufbau der BNC-Hohlzylinder ist vergleichbar mit dem der Tunica media herznaher Arterien aus wechselnden Lagen elastischer (die von uns beschriebenen Phasenübergänge) und muskulärer Bauelemente (die von uns beschriebenen Phasen).
Die lumenseitige Phase a weist die innere lumenseitige Oberfläche des Hohlkörpers auf, und die äu ßere Phase c weist die äußere Oberfläche des Hohlkörpers auf. Aufgrund des sehr gleichmäßigen Faseraufbaus und der ähnlichen Faserdichte der Phasen a und c weisen sehr wahrscheinlich die innere lumenseitige Oberfläche des Hohlzylinders und die äußere Oberfläche eine ähnliche Porosität und eine ähnliche Bedeckung mit Fasern auf, wobei bezüglich der Oberflächen die Porosität zweidimensional definiert ist wie in der Beschreibung angegeben.
Anwendunqstests:
Die beabsichtigte Verwendung ist die Verwendung als Gefäßprothese. Untersuchungen zur Berstfestigkeit der Gefäßprothese ergaben Berstdrücke im Bereich von 800mmHg und höher. Die Nahtausreißfestigkeit lag im Bereich von 8-10N.
Die Blutverträglichkeit der Gefäßprothese aus Beispiel 2.1 wurde durch einen
tierexperimentellen Test beurteilt, in dem Teile der Arteria carotis communis von Schafen mit dem hergestellten BNC-Implantat ersetzt wurden. Die BNC-Implantate überzeugten im chirurgischen Handling. Sie zeichneten sich durch vollständige Stabilität im Hochdrucktier aus (keine Risse oder Rupturen). Unmittelbar nach der Operation konnte ein
ungehinderter Blutfluss beobachtet werden. Nach 3 Monaten wurde das künstliche Blutgefäß entnommen, das durch die Einbettung in Bindegewebe und die Ausbildung kleiner Blutgefäße innerhalb des Bindegewebes sehr gut in den tierischen Körper integriert war. Histologisch konnte eine„Biologisierung" des Implantatmaterials nachgewiesen werden.
Lichtmikroskopische Untersuchungen nach tierexperimenteller Testung zeigen einen 3- Schichten-Wandaufbau des entnommenen BNC-Implantat-Komplexes, wobei die BNC als Media erhalten blieb, sich eine innere Endothelschicht und eine äu ßere
Bindegewebsschicht ausbildeten.
Beispiel 2.2
4950 ml Nährlösung, die pro Liter deionisiertem Wasser 20,00 g Glucose wasserfrei, 5,00 g Bactopepton, 5,00 g Hefeextrakt, 3,40 g di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat und 1 ,15g Citronensäure-Monohydrat enthält sowie einen pH-Wert zwischen 6,0 und 6,3 aufweist (Hestrin-Schramm-Medium) und bei 121 °C für 20min im Autoklaven
dampfsterilisiert wurde, wurden mit 247,5 ml einer Vorkultur eines Bakteriums der Gattung Gluconacetobacter beimpft. Die sterilisierte Vorrichtung 1 wurde mit dem so hergestellten Gemisch befüllt. Als Templates (3) wurde ein bakteriophiles Rundmaterial (Holz) mit einem Durchmesser von 5mm verwendet. Das periodische Benetzen der in einer Matrix-Anordnung zusammengefassten Templates 3 mit der Kulturlösung, enthaltend den Mikroorganismus, wurde mit Hilfe des Motors 7 realisiert. Während des Kultivierungsprozesses wurden die in einer Matrix-Anordnung
zusammengefassten Templates 3 in einem Zeitintervall von 30 Minuten benetzt. Die überlagerte Drehbewegung um die Drehachsen 1 1 erfolgte nach jedem 30sten
Benetzungsvorgang. Nach Ablauf des Biosynthesezeitraums von 10 Tagen wurde der Bioreaktor 1
einschließlich Template-Matrix demontiert, die hergestellten BNC-Hohlzylinder von ihren Templates 3 isoliert, sterilisiert und gereinigt. Die Synthese lieferte Gefäßprothesen mit einem inneren Durchmesser von 5 mm, einer Wandstärke von 3 mm und einer Länge von 15 cm. Untersuchungen zur Berstfestigkeit der Gefäßprothese ergaben Berstdrücke größer 800mm Hg.
Bezuqszeichenliste:
1 Vorrichtung
2 Reservoir für Kulturlösung/Gemisch
3 Templat/Gegenstand
4 Einspannvorrichtungen
5 Bewegungseinrichtung
6 Kupplung
7 Motor
8 Abdeckung
9 Gefäß
10 Gemisch, enthaltend Kulturlösung und Mikroorganismus
1 1 Drehachsen
12 Umhüllung
13 Verschlusseinrichtung
14 Innenraum (mit sauerstoffhaltiger Atmosphäre)
15 Gehäuse
16 Dichtung
17 Öffnung
18 Umgebung
19 Öffnung
20 Verschluss

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Herstellung eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose, oder eines Vorprodukts eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose, das die folgenden Schritte umfasst:
a) das in Kontakt bringen der Oberfläche eines Templates,
das eine Negativform des Hohlraums des herzustellenden Hohlkörpers und der inneren Wände des Hohlraums ist,
mit einem Gemischvorrat, der ein flüssiges Kulturmedium und einen Cellulose bildenden Mikroorganismus umfasst,
b) die Unterbrechung des Kontakts zwischen dem Template und dem
Gemischvorrat, wobei auf der Oberfläche des Templates ein Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, c) das in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen
Atmosphäre und die Bildung mikrobieller Cellulose in und/oder auf dem
Flüssigkeitsfilm,
d) das in Kontakt bringen der in Schritt c) erhaltenen mikrobiellen Cellulose mit dem Gemischvorrat,
e) die Unterbrechung des Kontakts zwischen der mikrobiellen Cellulose und dem Gemischvorrat wobei auf der Oberfläche der mikrobiellen Cellulose ein
Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den
Mikroorganismus umfasst,
f) das in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen
Atmosphäre und die Bildung mikrobieller Cellulose in und/oder auf dem
Flüssigkeitsfilm, wobei die Folge der Schritte d), e) und f) optional ein- oder mehrmals wiederholt wird, g) optional die Trennung der mikrobiellen Cellulose von dem Template.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das Template zumindest während Schritt c) und/oder dem Schritt f), und/oder einem oder mehreren der Schritte f), wenn der Schritt f) mehrmals durchgeführt wird, um eine oder mehrere Raumachsen rotiert wird.
3. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Template eine Oberfläche hat, die Strukturen im Millimeter-, Mikrometer- und/oder
Nanometerbereich aufweist.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Template eine Oberfläche aus Holz, Metall, Kunststoff, Keramik, synthetischem Polymer, Papier Textilgewebe oder Glas hat.
5. Hohlkörper aus mikrobieller Cellulose, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 -4.
6. Hohlkörper nach Anspruch 5, aufweisend eine Wand mit einer inneren Oberfläche und einer äu ßeren Oberfläche, wobei die innere Oberfläche und die äußere
Oberfläche einen identischen oder ähnlichen Grad Bedeckung durch Fasern aus mikrobieller Cellulose pro Flächeneinheit aufweisen.
7. Hohlkörper nach Anspruch 5 oder 6, aufweisend eine Wand mit einer inneren
Oberfläche und einer äußeren Oberfläche, wobei die Wand mehrere Schichten aus mikrobieller Cellulose umfasst, wobei die Schichten parallel zur der inneren und äu ßeren Oberfläche der Wand verlaufen.
8. Hohlkörper nach Anspruch 7, wobei die Schichten in ihrer Dichte über die gesamte Schichtdicke homogen sind.
9. Hohlkörper nach Anspruch 7 oder 8, wobei eine Schicht die innere Oberfläche der Wand aufweist und eine weitere Schicht die äußere Oberfläche der Wand aufweist und wobei diese beiden Schichten eine identische oder ähnliche Porosität aufweisen.
10. Hohlkörper nach einem der Ansprüche 7-9, wobei die Schichten so fest miteinander verbunden sind, dass sie bei mechanischer Beanspruchung in einem Zugversuch nicht voneinander delaminieren.
1 1 . Hohlkörper nach einem der Ansprüche 5-10, der eine oder mehrere Öffnungen aufweist, durch die der Hohlraum des Hohlkörpers zugänglich ist.
12. Hohlkörper nach einem der Ansprüche 5-1 1 , der ausgewählt ist aus einer Röhre oder einem Hohlzylinder.
13. Hohlkörper nach Anspruch 12, der eine oder mehrere Verzweigungen aufweist.
14. Künstliches biologisches Gefäß, insbesondere Implantat, aufweisend einen Hohlkörper nach einem der Ansprüche 5-13.
15. Verwendung eines Hohlkörpers nach einem der Ansprüche 5-13 oder eines Gefäßes nach Anspruch 14 als medizinisches Implantat, insbesondere als Hohlgefäß, Blutgefäß, Speiseröhre, Verdauungstrakt, Luftröhre, Harnröhre, Gallengang, Harnleiter, Lymphgefäß oder Manschette.
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