DE3715857A1

DE3715857A1 - Kontinuierliches verfahren zur herstellung von mikrobiellen stoffwechselprodukten

Info

Publication number: DE3715857A1
Application number: DE19873715857
Authority: DE
Inventors: Walter Dr Rer Nat Troesch; Martin Dipl Ing Schroeder; Elisabeth Dipl Biol Durst
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 1987-05-12
Filing date: 1987-05-12
Publication date: 1988-12-01

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein kontinuierliches Ver fahren zur Herstellung von mikrobiellen Stoffwechselproduk ten durch Einwirkung von Mikroorganismen auf ein Substrat in einem Bioreaktor.

Die Biotechnologie befindet sich derzeit in einer Phase stürmischer Entwicklung, und bei ihr steht die technische und wirtschaftliche Realisierung eines mikrobiologischen Vorgangs im Vordergrund. Die Biotechnologie hat das Ziel, die technische Nutzung des Potentials der Mikroorganismen, Zell- und Gewebekulturen zu erreichen. Zahlreiche wichtige Produkte, wie Arzneimittel, insbesondere Antibiotika und Hormone, werden heute auf biochemischem Weg hergestellt.

Es ist ein bekannter Nachteil der heutigen mikrobiologi schen Verfahren, insbesondere der Fermentationstechnik, daß sie im Vergleich zu rein chemischen Verfahren mit ausge sprochen dünnen Lösungen arbeiten. Dieser Umstand ist für die hohen Aufarbeitungskosten mitverantwortlich und be dingt somit die hohen Kosten der Endprodukte. Ein häufiger Grund für die niedrigen Raum-Zeit-Ausbeuten ist die niedrige Konzentration der Mikroorganismen. Eine Möglich keit zur Beseitigung dieses Nachteils besteht in der Immo bilisierung des biologischen Materials.

In der letzten Zeit wurde der Immobilisierung von Enzymen, Bakterien und tierischen Zellen große Aufmerksamkeit gewid met, und es wurden verschiedene Trägermaterialien und Trä gerformen entwickelt. Es bleiben jedoch zahlreiche verfah renstechnisch relevante Fragen der Haftung von biologi schem Material auf Oberflächen ungeklärt.

In der DE-OS 34 10 650 werden Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen und tierischen Zellen an porösen anor ganischen Trägerkörpern beschrieben. Als Trägerkörper wer den poröse Sinterkörper mit einer Porendoppelstruktur ver wendet. Diese bekannten Trägerkörper besitzen Makroporen und Mikroporen und liegen in Form von Raschig-Ringen vor. Die Makroporen haben einen Durchmesser von 20 bis 500 µm, und die Mikroporen besitzen einen Durchmesser von 1 bis 100 µm. Diese mit Mikroorganismen bewachsenen anorganischen Träger werden zur Abwasserreinigung eingesetzt.

Die Herstellung von Sekundärmetaboliten mit diesen Trägern ist zwar prinzipiell möglich, jedoch treten dabei die fol genden Nachteile auf: Raschig-Ringe sind für Festbettreak toren konzipiert, im Wirbelbett zeigt sich starker Abrieb. Der zentrale Hohlzylinder wird dicht bewachsen und kann nicht abgerieben werden. Es ist keine gleichmäßige Versor gung der Mikroorganismen möglich.

W. Bauer und L. Röttenbacher beschreiben die Herstellung von Ethanol unter Verwendung von Glucose als Substrat und Hefeagglomeraten als Mikroor ganismen. Bei diesem bekannten Verfahren wird ein Wirbel schichtreaktor verwendet. Es ist jedoch ein Nachteil dieses Verfahrens, daß es nicht kontinuierlich durchgeführt werden kann.

Eine Zusammenfassung des heutigen Standes der Technik auf dem Gebiet der Biotechnologie gibt M. Zlokarnik in "Biotech- Forum", Intern. Zeitschrift für Biotechnologie, 2. Jahrgang, 1985, Heft 4, Seite 1. Derselbe Autor beschreibt die Immo bilisierung ganzer Zellen in der Literaturstelle BTF-Bio tech-Forum 3, 1986, Seite 4f.

In der zuerst genannten Literaturstelle, insbesondere auf Seite 4, rechte Spalte, wird ausgeführt, daß es eines der Hauptprobleme der Bioreaktionstechnik ist, ein biologi sches Verfahren kontinuierlich durchzuführen. Die konti nuierliche Produktionsweise bringt große Schwierigkeiten mit sich, und die einzige bisher technisch durchgeführte biologische Großproduktion in kontinuierlichem Betrieb ist die biologische Abwasserreinigung, die jedoch mit Mischkul turen unter nichtsterilen Bedingungen arbeitet. Auf Seite 10, linker Absatz, wird ausgeführt, daß es eines der wesent lichsten Versäumnisse der Grundlagenforschung war, die wis senschaftlichen Voraussetzungen zur Durchführung mikrobiel ler Prozesse nicht zu erarbeiten.

Es besteht daher ein großer Bedarf an biotechnologischen Verfahren, die kontinuierlich durchgeführt werden können.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein kontinuierli ches Verfahren zur Herstellung von mikrobiellen Stoffwech selprodukten zur Verfügung zu stellen. Bei dem erfindungsgemä ßen Verfahren soll der Stofftransport, wie die Versorgung mit Substrat, der Abtransport von Bioprodukten und die Zu fuhr von Sauerstoff, ohne Schwierigkeit erfolgen können. Die Zellen sollen leicht zurückgehalten werden können, und es soll eine beliebige Zellkonzentration einstellbar sein. Weiterhin sollen Mischkulturen und reine Kulturen verwendet werden können, die Zellen sollen keine Einbuße an katalyti scher Aktivität erleiden, und der Feststoffgehalt im System soll sich nicht erhöhen. Die quantitative Ausbeute an dem gewünschten Produkt soll, verglichen mit bekannten Verfah ren, höher sein, wodurch die Herstellungskosten verringert werden können.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren soll eine konstante Menge an Biomasse im Fermenter verbleiben, und die Biomas se soll auf der Oberfläche des Trägermaterials fixiert sein. Die Viskosität der Flüssigkeit soll sich während der Fermen tation nicht ändern, so daß gleichbleibende Betriebspara meter zur Versorgung der Mikroorganismen eingehalten werden können. Die kontinuierliche Produktion soll über einen lan gen Zeitraum hinweg möglich sein.

Gegenstand der Erfindung ist ein kontinuierliches Verfahren zur Herstellung mikrobieller Stoffwechselprodukte durch Ein wirkung von Mikroorganismen auf ein Substrat in einem Bio reaktor, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in einen Wirbelschichtreaktor poröses, teilchenförmiges kugelförmi ges oder fast kugelförmiges Trägermaterial einführt, eine Nährlösung für die Mikroorganismen kontinuierlich durch die Wirbelschicht leitet, mit einer Vorkultur der Mikroorganis men beimpft, die Mikroorganismen anzüchtet, während man die Nährlösung im Bioreaktor kontinuierlich zirkulieren läßt, durch die Zirkulation eine Wirbelschicht aus dem teilchen förmigen Trägermaterial erzeugt, wobei gegebenenfalls Sauer stoff in den Reaktor eingeleitet wird oder gegebenenfalls der Nährlösung Sauerstoff beigemischt wird, gegebenenfalls in den Reaktor eine wäßrige Lösung oder Suspension des Sub strats, auf das die Mikroorganismen einwirken, kontinuier lich einleitet oder die wäßrige Lösung oder Suspension des Substrats, auf das die Mikroorganismen einwirken, der Nähr lösung beimischt und nach Einstellung eines stationären Gleichgewichts kontinuierlich eine Lösung oder Suspension, die die mikrobiellen Stoffwechselprodukte enthält, aus dem Bioreaktor entnimmt und die gewünschten mikrobiellen Stoff wechselprodukte in an sich bekannter Weise isoliert.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können auf einfache Weise mikrobielle Stoffwechselprodukte hergestellt werden. Hierin werden unter "mikrobiellen Stoffwechselprodukten" Primär- und Sekundärmetabolite verstanden. Beispiele für Primärmetabolite sind Milchsäure, Propionsäure, Ethanol, Aceton, Butanol, Nucleinsäuren, Aminosäuren und Enzyme. Beispiele für Sekundärmetaboliten sind Arzneimittel, Anti biotika, Steroide, Hormone und Vitamine.

Der Primärstoffwechsel der Zellen dient zur Gewinnung von Energie, die zur Erhaltung des Lebendzustands sowie zur Neu synthese von Zellbestandteilen notwendig ist. Bakterien und Pilze produzieren jedoch eine Fülle von Stoffen, denen kei ne unmittelbare Bedeutung für den Produzenten zugeschrieben werden kann. Sie werden gemeinsam mit den "sekundären Pflan zenstoffen" als sekundäre Metabolite bezeichnet. Viele die ser Stoffe spielen als Therapeutika, Stimulantien, Futter mittelzusätze usw. eine große Rolle (Schlegel, H.G.: Allge meine Mikrobiologie, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1981). Die Bildungsgeschwindigkeit von Sekundärmetaboliten hängt entscheidend von bestimmten Wachstumsphasen ab. Die Produkt bildung setzt im allgemeinen nach Abschluß des Wachstums ein. Ist der das Wachstum limitierende Nährstoff aufge braucht, so wird das Wachstum abgebrochen, und die restli chen Nährstoffe werden zur Bildung von Sekundärmetaboliten verwendet (Einsele, Finn, Samhaber: Mikrobiologische und biochemische Verfahrenstechnik, VCH Verlagsgesellschaft Weinheim, 1985).

Durch diese Trennung in eine Wachstums- und eine Produk tionsphase (in der kein Wachstum mehr stattfindet) ist ei ne kontinuierliche Fermentationsführung zur Produktion von Antibiotika ohne Zellrückhaltung nur schwer durchführbar.

Eine Möglichkeit zur Zellrückhaltung bietet die Immobili sierung der Mikroorganismen auf Trägermaterial. In der er sten Phase der Fermentation werden den Mikroorganismen Wachstumsbedingungen angeboten. Neben dem Wachstum der sub mers verteilten Biomasse kann auch eine Besiedelung des Trä germaterials durch die Zellen beobachtet werden. Beginnt man nun mit dem kontinuierlichen Zuführen von Produktionsme dium, wird die submers verteilte Biomasse langsam ausgewa schen, während die auf den Trägern immobilisierte Biomasse zunächst noch zunimmt (bis das Wachstum vollständig durch Produktionsmedium ersetzt ist) und dann auf einem konstan ten Wert bleibt (s. Fermentationsverlauf).

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es überraschender weise möglich, Sekundärmetabolite kontinuierlich herzustel len. Das Verfahren ist allgemein anwendbar; man kann jegli che Art von Sekundärmetaboliten, wie wertvolle Arzneimit tel, Antibiotika, Steroide, Hormone, Vitamine, Mutterkorn alkaloide oder deren Vorstufen, herstellen. Dadurch werden die Produktionskosten erheblich herabgesetzt. Anwendungsbe reiche sind insbesondere:

- Antibiotikaproduktion: Streptomyces tendae gehört zur Gattung der Streptomyce ten. Mehr als 50% der heute bekannten Antibiotika wer den von Streptomyceten gebildet;
- allgemein: Produktion von Sekundärmetaboliten, deren Produzenten eine Trennung in eine Wachstums- und eine Produktionsphase aufweisen;
- Produktion von Primärstoffwechselprodukten bei erhöhter Zelldichte und/oder sehr hohen Durchflußraten.

Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt die folgenden Vortei le:
Eine konstante Menge an Biomasse bleibt im Fermenter.
Die Biomasse ist auf die Oberfläche des Trägermaterials fixiert; hierdurch wird die Aufarbeitung des Produkts wesentlich erleichtert.
Die Viskosität des Mediums ändert sich während der Fer mentation nicht. Hierdurch wird eine gleichbleibende Sauerstoffversorgung der Mikroorganismen ermöglicht.
Durch Vermischen des Mediums mit Luft mittels eines statischen Mischers vor dem eigentlichen Reaktionsraum ist eine sehr gute Sauerstoffversorgung der Zellen ge geben (Belüftung im Wirbelschichtreaktor mit 0,15 bis 0,25 vvm; im Rührkessel wird üblicherweise mit 0,1 bis 1 vvm belüftet).
Die kontinuierliche Produktion ist über einen langen Zeitraum möglich.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird als poröses Träger material ein teilchenförmiges kugelförmiges oder fast ku gelförmiges Material verwendet. Dieses Material wird in dem Wirbelschichtreaktor durch Durchleiten von Nährlösung für die Mikroorganismen aufgewirbelt. Die eingesetzten porösen kugelförmigen Träger weisen Kanäle auf und besitzen einen Durchmesser im Bereich von 1 bis 10 mm und Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 50 bis 500 µm. Es ist bevorzugt, daß das offene Porenvolumen im Bereich zwischen 40 und 75 Vol.-% liegt. Die porösen Träger, die in der deutschen Pa tentanmeldung P 36 39 153 beschrieben werden, sind für das erfindungsgemäße Verfahren besonders gut geeignet.

Nach dem Animpfen der Nährlösung wachsen in die Kanäle der mikroporösen Träger die Mikroorganismen ein. Der an der Oberfläche der Kugeln anhaftende Mikroorganismus wird durch Zusammenstoß mit anderen Kugeln abgeschabt. Die Menge an Mikroorganismen, die im Innern der Kugel eingeschlossen ist, bleibt somit konstant. Durch diese Verfahrensweise ist es möglich, die Wachstumsbedingungen für die Mikroorganismen genau zu definieren. Die Biomasse pro Gramm Träger ist so mit bestimmbar und bleibt konstant.

In den Reaktor oder in die Nährlösung wird dann eine Lösung oder Suspension des Produkts, auf welches die Mikroorganis men einwirken sollen, geleitet. Diese Lösung oder Suspen sion wird zusammen mit der Nährlösung durch den Reaktor zir kuliert. Es stellt sich ein stationäres Gleichgewicht ein, und nach einer ausreichenden Verweilzeit wird aus dem Reak tor eine Lösung bzw. Suspension entnommen, die verdünnte Nährlösung gegebenenfalls Substrat und Produktlösung ent hält. Aus dieser Lösung kann das Produkt in an sich bekann ter Weise, beispielsweise durch Ausfällung, Chromatographie ren, Absetzen, Extraktion, Kristallisation etc. isoliert werden. Die verbleibende Lösung oder Suspension kann gege benenfalls in den Reaktor recyclisiert werden. Die geeigne ten Fermentationsbedingungen werden in Abhängigkeit von den verwendeten Mikroorganismen ausgewählt. Beispielsweise kann man einen Wirbelschichtreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 420 ml, gefüllt mit 100 ml offenporigem Sinterglas, mit ei ner Vorkultur von Streptomyces tendae 10% beimpfen. Die Wachstumsphase wird zunächst während einer Zeit von 47 Stun den durchgeführt. Die submers gewachsene Biomasse wird an schließend mit Wachstumsmedium verdünnt. Es folgt eine wei tere Wachstumsphase. Nach 96 Stunden wird mit einer konti nuierlichen Zuführung von Produktmedium mit einer Zuflußra te von 40 ml pro Stunde begonnen. Nach einer Zeit von etwa 200 Stunden stellt sich ein Gleichgewicht ein, und der Bio reaktor wird etwa 10 Tage lang betrieben, ohne daß die Pro duktausbeute abnimmt.

Anhand der beigefügten Zeichnungen wird die Erfindung näher erläutert; es zeigen:

Fig. 1 ein Fließschema eines Wirbelschichtreaktors;

Fig. 2 den Phosphatverbrauch im Wirbelschichtreaktor;

Fig. 3 die kontinuierliche Fermentation im Wirbel schichtreaktor; und

Fig. 4 die Produktion von Nikkomycin im Wirbelschicht reaktor.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel Allgemeine Fermentationsbedingungen

Wachstumsmedium:
40 gGlucose 10 gHefeextrakt 5 gSojapepton ad 1 ldestilliertes Wasser pH 6,0

Produktionsmedium:
20,0 gGlucose 1,6 gAsparagin 2,0 gMorpholinoethansulfonsäure (10 mmol) 10,0 mgCuSO₄ · 5 H₂O 100,0 mgMgSO₄ · 7 H₂O 20,0 mgFeSO₄ · 7 H₂O 100,0 mgKCl 100,0 mgCaCl₂ ad 1 ldestilliertes Wasser pH 5,5

Arbeitsvolumen des Fermenters: 420 ml
Füllmenge an Trägermaterial: 100 ml
Vorkultur: 10% des Arbeitsvolumens
Zuflußrate des Produktionsmediums: 40 ml/h
Verweilzeit: 10,5 h
Begasungsrate: 0,25 vvm
Temperatur: 28°C

Arbeitsbedingungen

In den Wirbelschichtreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 0,42 l werden 100 ml Sinterglaskugeln mit einem Durchmesser von 1,6 bis 2,5 mm eingefüllt. Die Porosität der Kugeln be trägt 60% bei einer Porengröße von 125 bis 315 µm.

Der Wirbelschichtreaktor wird autoklaviert und mit steri lem Wachstumsmedium gefüllt. Anschließend wird mit einer Vorkultur von Streptomyces tendae (10% des Arbeitsvolumens) beimpft. Der Reaktor wird mit 28°C temperiert und mit einer Begasungsrate von 0,25 vvm belüftet.

Nach der Wachstumsphase der Mikroorganismen wird mit der kontinuierlichen Zufuhr von Produktionsmedium unter gleich zeitigem Abpumpen der gleichen Menge der Flüssigkeit mit der kontinuierlichen Fermentation begonnen. Die Zuflußrate be trägt 40 ml/h. Die Wachstums- und Produktionsmedien besit zen die zuvor angegebene Zusammensetzung.

Die Darstellung der Verhältnisse von submers verteilter und immobilisierter Biomasse zeigt, daß bei kontinuierlicher Fermentationsweise mit Produktionsmedium die submers ver teilte Biomasse ausgewaschen wird, während die immobilisier te Biomasse konstant bleibt.

Der Anstieg der immobilisierten Biomasse zu Beginn der kon tinuierlichen Fermentation ist darauf zurückzuführen, daß noch Wachstumsbedingungen gegeben sind, bis das Wachstums medium vollständig durch Produktionsmedium ersetzt ist. Die se vor allem an der Oberfläche der Träger wachsenden Zellen werden durch Erhöhen der Pumpendrehzahl abgeschert und wie submers verteilte Biomasse ausgewaschen.

Aus der abgezogenen Flüssigkeit wird Nikkomycin in an sich bekannter Weise, zum Beispiel durch Chromatographie, iso liert.

Claims

1. Kontinuierliches Verfahren zur Herstellung von mikro biellen Stoffwechselprodukten durch Einwirkung von Mikroor ganismen auf ein Substrat in einem Bioreaktor, dadurch ge kennzeichnet, daß man in einen Wirbelschichtreaktor poröses teilchenförmiges, kugelförmiges oder fast kugelför miges Trägermaterial einführt, eine Nährlösung für die Mi kroorganismen kontinuierlich durch die Wirbelschicht lei tet, mit einer Vorkultur der Mikroorganismen beimpft, die Mikroorganismen anzüchtet, während man die Nährlösung kontinuierlich zirkulieren läßt, durch die Zir kulation eine Wirbelschicht aus dem teilchenförmigen Träger material erzeugt, wobei gegebenenfalls Sauerstoff in den Reaktor eingeleitet wird oder gegebenenfalls der Nährlösung Sauerstoff beigemischt wird, gegebenenfalls in den Reaktor eine wäßrige Lösung oder Suspension des Substrats, auf das die Mikroorganismen einwirken, kontinuierlich einleitet oder die wäßrige Lösung oder Suspension des Substrats, auf das die Mikroorganismen einwirken, der Nährlösung beimischt und nach Einstellung eines stationären Gleichgewichts kon tinuierlich eine Lösung oder Suspension, die die mikrobiel len Stoffwechselprodukte enthält, aus dem Bioreaktor ent nimmt und die gewünschten mikrobiellen Stoffwechselproduk te in an sich bekannter Weise isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß als mikrobielle Stoffwechselproduk te Arzneimittel, Antibiotika, Steroide, Hormone, Vitamine, Mutterkornalkaloide, Enzyme oder deren Vorstufen, Milchsäu re, Propionsäure, Ethanol, Aceton, Butanol, Nucleinsäuren und Aminosäuren hergestellt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge kennzeichnet, daß als mikrobielle Stoffwechsel produkte Nikkomycin, Milchsäure, Propionsäure, Glutaminsäu re und Amylase hergestellt werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als poröses Trägermate rial ein teilchenförmiges kugelförmiges oder fast kugelför miges Material verwendet wird, welches aus keramischen Mas sen, anorganischem Glas, organischem Glas oder deren Kombi nationen oder einem offenporigen Sinterkörper besteht.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die teilchenför migen porösen Träger einen Durchmesser im Bereich von 1 bis 10 mm aufweisen.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die porösen Trä ger Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 50 µm bis 500 µm aufweisen und daß das offene Porenvolumen im Bereich zwischen 40 und 75 Vol.-% liegt.

7. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Beendigung der Wachstumsphase der Mikroorganismen die Präsenz der Mikroorganismen auf die Träger beschränkt bleibt, da die submers verteilten und die in der Wirbel schicht abgescherten Zellen durch den kontinuierlichen Be trieb ausgewaschen werden.

8. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im Gegensatz zu Submersverfahren und anderen Verfahren mit im mobilisierter Biomasse die auf porösen Trägern in der Wir belschicht immobilisierte Biomasse gleichmäßig mit Substra ten und gegebenenfalls Sauerstoff versorgt werden können.

9. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Actinomyceten, Chlostridien oder Pilze verwendet.

10. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährlösung mit einer Vorkultur von Mikroorganismen zwischen 10⁶ und 10⁹ Bakterien/ml in einer Konzentration von 2% bis 20%, bezogen auf das Arbeitsvolumen, beimpft wird.

11. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mittlere Verweildauer der Flüssigkeit bei der Züchtung der Mikroorganismen im Reaktor 30 Minuten bis 10 Tage beträgt.

12. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nährlösung verwendet wird, welche eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle sowie gegebenenfalls Mineralsalze, Vitamine, Induktoren und gegebenenfalls Vorstufen des Pro dukts enthält.

13. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zirkulation im Bioreaktor in Anwesenheit eines Inertgases durchgeführt wird.