CN103146777A - 一种动态制备异型空腔细菌纤维素材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种动态制备异型空腔细菌纤维素材料的方法，包括：将细菌纤维素生产菌株接入液体培养基扩培后，将其转移到配备有特定形状模具的发酵装置中动态扰动培养，培养后即可收获空腔异形纤维素材料。本发明制备的异型空腔BC材料相较于其他物理化学的方法，保留了其独特的三维网状纳米结构、高化学纯度、高结晶度、高聚合度、高强度以及良好的生物相容性等优点；且制备方法简便易行，成本低廉，生产效率高，适合大规模工业化生产。

Description

一种动态制备异型空腔细菌纤维素材料的方法

本申请为申请号为201010271720.3、申请日为2010-09-02、名称为动态制备异型空腔细菌纤维素材料的装置及方法的分案申请。 

技术领域

本发明属于细菌纤维素材料的制备领域，特别涉及一种动态制备异型空腔细菌纤维素材料的方法。 

背景技术

细菌纤维素（Bacterial Cellulose，简称BC）是一类由微生物产生的纯纤维素。细菌纤维素和植物纤维一样都是由β-D-葡萄糖通过β-1，4-葡萄糖苷键结合成的直链，直链间彼此平行，不呈螺旋构象，无分支结构，又称为β-1,4-葡聚糖。细菌纤维素由于具有独特的生物亲和性、生物相容性和无过敏反应，以及高的持水性、聚合度、结晶度，良好的三维纳米纤维网络结构、高的张力和强度，尤其是良好的机械韧性，因此在人工血管、组织工程支架、人工皮肤以及治疗皮肤损伤等方面具有广泛的用途，是国际生物医用材料研究的热点之一。 

目前细菌纤维素材料的制备一般采用常规静置培养法，获得的是一张纤维素膜。用常规液体深层桨叶垂直搅拌技术会引起木醋杆菌的变异退化，导致其不再合成纤维素，而目前常用的较少引起菌种退化的动态发酵技术（在气升式发酵罐中）仅能制备颗粒状的细菌纤维素材料，由于纤维素可溶于某些化学试剂，因此很早就有人希望将细菌纤维素溶液灌注模具来“铸造”有形状的空腔生物材料。然而效果却并不理想，所获得的纤维素产品不具有原细菌纤维素的优良特性，这可能是由于它的物理结构被改变而导致性能劣化。由于木醋杆菌合成纤维素是一个耗氧的次级代谢过程，纤维素易形成于空气与培养液的交界处，因此氧气是纤维素形成的重要因素。已有的研究表明，只要在静置发酵液中提供表面透氧性能良好、具有一定形状的模具，在模具表面就可以形成该形状的纤维素膜，这样利用细菌在线发酵制备有形生物医用材料就成为可能。 

首次利用该原理成功制备有形状的细菌纤维素产品是一个手套形状的人工皮肤（UK Patent 12,169,543；White and Brown，1989）。该技术是利用能透氧气的手形微型织造物（microwoven textiles）作为模具，静态条件下培养。1990和1991年日本人Yamanaka根据同样的原理，利用一个能透氧的空腔圆管，如玻璃纸、特富龙、硅胶、陶瓷等制作的模具，通过注入含活细菌的培养液在静态发酵条件下制备人工血管获得了成功（EP Patent 是BC管始终保持良好的通畅度。2001和2003年德国Klemm等人将一个内部是玻璃圆柱而外部是玻璃圆管组成的模具浸入细菌培养液中，通过静态发酵制备成功小直径人工血管（1～3mm内径）（商品名为BASYC），并经老鼠动物实验证明该人工血管抗血栓效果很好（WO Patent 0,161,026，US Patent 2,003,013,163）。大白鼠没有经任何抗凝药物处理，观察到颈动脉-BC管复合体被结缔组织包裹，上面布满类似血管滋养管的小血管，BC管完全被活体组织包裹没有任何排斥反应。所有植入的BC管在手术后都保持100%的畅通率，而且没有血栓凝结或者组织增生的现象。由此可见，中空细菌纤维素管是制备<6mm人工血管的良好材料。此外，该空腔纤维管还可以作为气管、输尿管、软骨支架、覆盖神经纤维的护套，以及某些空腔器官的替代物等（WO Patent 0,161,026；US Patent 2,003,013,163）。2005年美国和瑞典国际合作小组的Svensson等人报道了以细菌纤维素作为软骨组织工程支架的实验结果，并指出效果较好。2006年Backdahl等人通过研究细菌纤维素的机械性能以及与人平滑肌细胞的相互作用指出该材料今后可以用于组织工程血管。以上研究证明了凝胶状的管状BC材料以其高的机械强度、大的持水力、十分规则的内表面和极好的生物相容性等特点，在显微外科手术中作为血管组织替代物具有巨大的应用前景。 

BC除了用于人造血管等医用材料外，还可以用于人工皮肤等伤科敷料。微生物纤维素独特三维网状结构内部有很多“孔道”，有良好的透气、透水性能，能吸收60～700倍于其干重的水份，这些水分是以自由水的形式存在。使用BC作为伤口敷料能够迅速吸收伤口血液和组织液，防止伤口感染化脓，又能为慢性伤口附近的组织再生提供湿润的环境促进伤口愈合和减轻疼痛。同时纤维素不会和伤口粘连，不会造成二次伤害，剥离时也不会有残留。首次利用能透氧的手形微型织造物为模具静态培养成功制备的手套形状的人工皮肤在治疗大面积烧伤/烫伤的手部皮肤时具有良好效果。自1987年以来，巴西连续报道了400多例应用细菌纤维素膜对烧伤、烫伤、褥疮、冻伤、皮肤移植和慢性皮肤溃疡等治疗效果良好的实例。现已有用其制成的人工皮肤（商品名为BioFill）、纱布、绷带和“创口贴”等伤科敷料商品上市。另外一种叫做Xcell的BC创伤敷料也被用来促进慢性创伤的愈合，同样也表现出很好的治疗效果。研究显示这种BC敷料在慢性创伤的应用方面较之其他材料的敷料能够更有效地促进伤口愈合。与其它人工皮肤和伤科敷料相比，该膜的主要特点是在潮湿情况下机械强度高、对液、气及电解物有良好的通透性、与皮肤相容性好，无刺激性，可有效缓解疼痛，防止细菌的感染和吸收伤口渗出的液体，促进伤口的快速愈合，有利于皮肤组织生长。此膜作为缓释药物的载体携带各种药物，利于皮肤表面给药，促使创面的愈合和康复。因此，该纤维素作为一种极具应用潜力的生物材料具有广阔的市场应 用前景。 

但是现有技术方法的不足之处在于需要特定的透氧模具和静态发酵制备，生产周期长，生产成本高，生产效率低，无法进行工业化生产和应用。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种动态制备异型空腔细菌纤维素材料的方法，该方法制备的异型空腔BC材料不仅其尺寸和形状是可控的，而且发酵装置的模具可拆卸，重复使用，且制备方法简便易行，成本低廉，生产效率高，适用于工业化生产；该异型空腔BC材料可广泛应用于人工血管、神经纤维导管等中空器官的替代品，还可作为食品包裹材料如肉制品肠衣、果冻外衣等。 

本发明的一种动态制备异型空腔细菌纤维素材料的装置，包括温度计口，酸液碱液添加口，把手，通气口，pH计口，营养补料口，转轴，发酵罐，马达，水浴装置，模具，其特征是：所述的转轴一端连接固定马达输出轴，转轴另一端从发酵罐一端面中心位置伸入发酵罐内；在发酵罐内的转轴上固定有模具。 

所述的转轴在发酵罐内腔安装固定有转盘，转轴通过转盘圆周边缘对称固定有2个以上模具。 

所述的模具为棍形或手套形模具。 

所述的模具为手套形模具，其中，手套形模为依次在转轴上穿入1个以上手套形模具。 

所述模具的横截面形状为圆形、方形、椭圆形、三角形、心形或五角星形。 

所述的模具为实心或者中空结构。 

所述的温度计口、酸液碱液添加口、pH计口、营养补料口、通气口、把手均位于发酵罐的外表面上。 

所述的发酵罐为任意形状。 

所述的模具的材料为玻璃、陶瓷、紫砂、金属、硅胶、木材、纤维素、橡胶、涤纶、尼龙（Nylon）、奥纶（Orlon）、聚乙烯醇（PVA）、聚乙烯乙醇（Ivalon）、涤纶（Dacron）、特氟纶（Teflon）、膨体聚四氟乙烯（ePTFE）和真丝等高分子材料以及塑料等无机有机材料的一种或几种组合。 

本发明的一种动态制备异型空腔细菌纤维素材料的方法，包括： 

（1）菌种培养 

将细菌纤维素生产菌株接入液体培养基扩培，于20-30℃、100-250r/min条件下摇床 培养或者静置培养12~48h后备用； 

（2）异性空腔BC材料的发酵制备 

将步骤（1）制备的含生产菌株的液体培养基转移到上述发酵装置中，然后旋转模具以3-20rpm的转速进行扰动培养，于20~32℃动态培养4-20天后，即可收获空腔异形纤维素材料； 

（3）材料处理 

将制备的中空异形细菌纤维素材料从模具上取下，然后浸泡于0.5~2wt%的NaOH溶液中，70-100℃水浴处理30-120min，使细菌纤维素材料呈白色半透明后即可；然后洗涤至中性，即得异形细菌纤维素产品。 

所述步骤（1）中的BC生产菌株为醋酸菌属(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter sp.）、葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter sp.)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、八叠球菌属(Sarcina sp.)、假单胞菌属(Pseudomounas sp.)、无色杆菌属(Achromobacter sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、固氮菌属(Azotobacter sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、洋葱假单胞菌（Seudomonas cepacia）、空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）或红茶菌（kombucha）；其中优选菌株为木醋杆菌(Acetobacter xylinum)或红茶菌； 

其中，除红茶菌以外的菌种按2~3接种环的接种量接入液体种子培养基；红茶菌按接入1-10片直径0.5cm圆片含菌BC膜的接种量接入液体种子培养基； 

或者先制备生产菌的液体种子，再转接入液体发酵培养基；除红茶菌以外的菌种按2~3接种环的接种量接入液体种子培养基制备种子液，然后按3vol%~20vol%的接种量转接到液体发酵培养基；红茶菌按接入1-10片直径0.5cm圆片含菌BC膜的接种量接入液体种子培养基，以及按1~10片直径0.5-1cm圆片含菌BC膜的接种量转接到液体发酵培养基。 

所述的除了红茶菌以外的液体种子培养基和液体发酵培养基的组分均为：每1L水中，甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖或果糖20-200g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，pH3.0-7.5，121℃灭菌20min；或甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20-200g，酵母浸膏5g，蛋白胨或胰蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na₂HPO₄2.7g，水1L，pH3.0-7.5，121℃灭菌20min； 

红茶菌液体种子培养基和液体发酵培养基，其组成均为：（1）每1L水中，绿茶或者红茶1-10g（茶叶5g时最优），葡萄糖、蔗糖或者果糖10~200g、蛋白胨或者胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，pH3.0-7.5，巴氏灭菌30min；（2）将葡萄糖、蔗糖或果糖、绿茶或红茶、以 及水配成培养基，其中糖、茶、水的质量比为5：0.1-0.4：100-200，pH3.0-7.5，巴氏灭菌30min；或者（3）每1L水中，甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20-200g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，pH3.0-7.5，121℃灭菌20min；其中，最优培养基为（1）的配方。 

所述步骤（2）中的含生产菌株的液体培养基为步骤（1）制备的含生产菌株的液体种子培养基或含生产菌株的液体发酵培养基。 

此外，为加速在模具上形成纤维素膜，可以在转轴或模具内腔中注入含氧量为1-100vol%的空气，当含氧量为100vol%时，通入的是纯氧。 

目前已有的BC中空异形材料的制备技术一般采用单层透氧模具制备，效率低且外表面或者内表面粗糙，本发明利用细菌纤维素在液体中易缠绕的特性，在水平扰动的生物反应器中，通过转盘上模具围绕着转轴轴心的转动，使得模具在液体培养基中进行缓慢且循环浸没的扰动培养方式，缠绕和吸附发酵液中的细菌纤维素而在模具表面形成一定形状的中空细菌纤维素材料。 

由于是亚静态培养（转轴的转速很缓慢，<20rpm，菌体在亚静态的环境下生长），可以使模具在液体培养基和含氧介质中不停地交替，既给液体培养基提供足够的溶解氧，促进液体中菌体的快速繁殖和产生纤维素，从而利于模具的缠绕；又有利于已固定在模具上的纤维素膜中的菌体可以接触到营养，同时使得菌体充分接触氧，从而促使菌体大量繁殖和分泌纤维素，高效制备细菌纤维素材料。多种因素促使生产效率大大提升。 

根据所需制备的BC材料的尺寸和形状，选择合适的模具材料，制备出横截面形状为圆形、方形、椭圆形、三角形、心形、五角星形等异形BC材料。 

本发明制备得到异型空腔细菌纤维素材料作为一种新型纳米生物材料不仅可以用于人工血管、覆盖神经纤维的护套，还可用于人造气管、输尿管、组织工程支架、人工皮肤、脑膜，以及某些中空器官的替代品；或者可作为一种可食用的食品包裹材料（如肉制品肠衣、果冻外衣等）等，具有非常广阔的应用范围和美好的应用前景。 

有益效果 

（1）本发明制备的异型空腔BC材料相较于其他物理化学的方法，保留了其独特的三维网状纳米结构、高化学纯度、高结晶度、高聚合度、高强度以及良好的生物相容性等优点；且制备方法简便易行，成本低廉，生产效率高，适合大规模工业化生产； 

（2）本发明制备的异型空腔BC材料的长度、内径、厚度等尺寸和形状均不受限制，可以人工调控，而且材料内外均具有光滑平整的表面； 

（3）发酵装置的模具可拆卸，重复使用，所制备的各种异形BC材料可以在表面毫无损伤 的情况下剥离出来；为了进一步提高异形BC材料的制备效率，在水平生物反应器中可配备多个模具以提高产量。 

附图说明

图1a为制备管状细菌纤维素材料的发酵装置示意图，其中模具为棍子或者管子，模具内腔可以充满氧气或空气； 

图1b为制备手形细菌纤维素材料的发酵装置示意图，其中模具为手形，模具内腔可以充满氧气或空气； 

图2为用于制备管状细菌纤维素材料的转盘结构设计模型； 

图3为不同棒状模具材料制备得到的细菌纤维素结果，上为硅胶棒，中为木棒，下为磨砂玻璃棒； 

图4为制备管状细菌纤维素材料的配备磨砂玻璃棒模具的发酵装置实拍图； 

图5为发酵5-7天制备的管形细菌纤维素材料的实物图； 

图6为发酵5天制备的管形细菌纤维素材料的电镜图；其中A为外表面，B为内表面，C为与管中心轴方向垂直截面（横截面），D为沿管中心轴方向截面（纵截面）； 

图7为发酵5天制备的管形细菌纤维素材料的轴向和径向的强力测试示意图；其中A为轴向强力测试，B为径向强力测试； 

图8为发酵1~8天制备的细菌纤维素管沿管中心轴方向测试的绝对拉力（轴向拉力）随时间变化的曲线图； 

图9为发酵1~8天制备的细菌纤维素管沿与管中心轴垂直方向测试的绝对拉力（径向拉力）和相对干重拉力随时间变化的曲线图。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

以管状BC材料的制备为例 

实施例1 

1.发酵装置的设计组装 

1.1 设计思想 

由于Acetobacter xylinum属于好氧性细菌，在长期的发酵代谢过程中需要大量的氧气， 细菌纤维素的生长属于吸附式生长并且必须要有培养基的支持，因此要让细菌纤维素按照一定的形状生长成形，细菌纤维素就必须在特定形状的模具材料上进行好氧生长。如果要制备的细菌纤维素材料为管状材料，则要考虑采用棍形、棒形或管状模具，不仅让细菌纤维素在这些模具上生长，而且还必须提供足够的氧气，为此我们设计了采用一个配备棍形模具的水平生物反应器，让模具在液体培养基中进行缓慢循环反复浸没的方式进行扰动培养，这样培养基中产生细菌纤维素就可以缠绕吸附在模具上，时而浸没在培养基中补充营养，时而暴露在空气或氧气中的循环反复操作，直到培养形成所需的管状细菌纤维素材料。为加快以固定在模具上菌体的生长和合成分泌纤维素，模具中充满1-100%氧气或者空气有很大帮助。 

1.2 水平扰动生物反应器的结构特点 

反应器由上下两个半圆柱体或其它形状的玻璃容器组成，生物反应器的体积为1000mL，有效体积为500mL，转盘由电机带动，反应器的装液量为300-350mL，设备示意图如图1a-b所示：顶部开有直径为1cm大小的开口，分别进行温度，通气和补料操作。反应器中发酵液浸没转盘的2/5左右，确保当某根棍形模具旋转达到最低端时，整个模具可以完全浸没在发酵液中。 

1.3 生物反应器的转盘结构设计 

利用模具进行一定转速的旋转，将细菌纤维素缠绕在模具上，因此本实验的最重要的部件在转盘固定的棒状模具上。 

采用两种不同类型结构的转盘，一种为模具夹在两个转盘之间，另一个为转盘都在模具一端，另一端留出一定长度的模具（见图2），所需要的管状细菌纤维素主要生长缠绕于模具上，两个转盘主要对模具起支撑作用。 

1.4 反应器转盘和棒形模具材料的筛选 

考虑到本试验制备的是管状细菌纤维素材料，所以转盘圆片由无毒的聚乙烯塑料片或其它无毒性的材料组成，转轴则由玻璃棒或不锈钢棒等有一定刚性的材料组成。由于考虑到模具材料的毒性、对细菌纤维素的吸附性、机械强度以及加工的难易程度等因素，因此可以是玻璃、陶瓷、紫砂、金属、硅胶、木材、纤维素、橡胶、涤纶、尼龙（Nylon）、奥纶（Orlon）、聚乙烯醇（PVA）、聚乙烯乙醇（Ivalon）、涤纶（Dacron）、特氟纶（Teflon）、膨体聚四氟乙烯（ePTFE）和真丝等高分子材料以及塑料等无机有机材料的一种或几种组合。本实验重点选择了木质、玻璃、硅胶进行研究。将三种不同类型的材料分别装在转盘上，进行培养，观察纤维素的生长成形情况（见图3）。实验结果表明在相同天数内，形 成的管状材料由厚到薄依次为木棒、磨砂玻璃棒、硅胶管。以磨砂玻璃棒为模具的生物反应器实拍图见图4。制备得到的不同尺寸的细菌纤维素管实物图见图5。 

实施例2 

如图1a、图1b所示，一种动态制备异型空腔细菌纤维素材料的装置，一种简便高效动态生产异型空腔细菌纤维素材料的发酵装置，包括温度计口1，酸液碱液添加口2，把手3，通气口4，pH计口5，营养补料口6，转轴8，发酵罐9，马达10，水浴装置11，模具，其特征是：所述的转轴8一端连接固定马达10输出轴，转轴8另一端从发酵罐9一端面中心位置伸入发酵罐9内；在发酵罐9内的转轴8上固定有模具。 

模具12的材料选自玻璃、陶瓷、紫砂、金属、硅胶、木材、纤维素、橡胶、涤纶、尼龙、奥纶、聚乙烯醇、聚乙烯乙醇、涤纶、特氟纶、膨体聚四氟乙烯、真丝、塑料中的一种或几种组合。 

转轴8在发酵罐9内腔靠近发酵罐9一端面一侧安装固定有转盘7，转轴8通过转盘7圆周边缘对称固定有棍形管形模具12，且棍形管形模具12为实心或中空结构。 

温度计口1、酸液碱液添加口2、pH计口5、营养补料口6、通气口4、把手3均位于发酵罐9的外表面上。 

棍形管形模具12的横截面形状为圆形、方形、椭圆形、三角形、心形或五角星形。 

使用时，通过将含生产菌株的液体培养基转移到本发明的发酵装置中，然后旋转模具以3-20rpm的转速进行扰动培养，即可收获空腔异形纤维素材料。 

实施例3 

如图2所示，本实施例与实施例2的区别仅在于： 

（1）模具的形状不同，本实施例中模具为手套形模具12，且手套形模具12为实心或中空结构，手套形模具12的横截面形状为圆形、方形、椭圆形、三角形、心形或五角星形； 

（2）本实施例的装置中不需要转盘对手套形模具进行固定，只需在转轴上依次穿入1个以上手套形模具即可。 

实施例4 

本实施例与实施例2的区别仅在于： 

模具的形状不同，本实施例中模具为手套形模具12，且转轴8通过转盘7圆周边缘对称固定有2个以上手套形模具；手套形模具12为实心或中空结构，手套形模具12的横截面形状为圆形、方形、椭圆形、三角形、心形或五角星形。 

实施例5 

（1）菌种培养 

将木醋杆菌（Acetobacter xylinum）接入300mL液体培养基（本实施例以下面培养基配方为例：每1L水中，甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖或果糖20-200g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，pH3.0-7.5，121℃灭菌20min；或甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20-200g，酵母浸膏5g，蛋白胨或胰蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na₂HPO₄2.7g，水1L，pH3.0-7.5，121℃灭菌20min）扩培，于20-30℃、100-250r/min条件下摇床培养或者静置培养12~48h后备用； 

（2）中空异形细菌纤维素材料的发酵制备 

将步骤（1）制备的含生产菌株的液体培养基转移到配备有棒状模具的生物反应器中，然后旋转模具以7、15、30和60rpm的转速进行扰动培养，于30℃动态培养4-20天后，即可收获空腔异形纤维素材料； 

或者取步骤（1）活化好的菌种以10%的接种量接入到300mL发酵培养基中，置于500mL锥形瓶中，在30℃和160rpm的条件下培养4小时，然后再将发酵液转移到生物反应器中，然后旋转模具以7、15、30和60rpm的转速进行扰动培养，于30℃条件下分别培养不同的天数，制备得到不同厚度的管状细菌纤维素材料。 

该发酵装置由一个水平搅拌反应器和在转盘上固定若干棍状模具的转轴组成，形成了一个水平扰动的生物反应器。通过转盘上模具围绕着转轴轴心的转动，使得模具缠绕发酵液中的细菌纤维素而在模具表面形成一定形状的中空细菌纤维素材料。 

由于木醋杆菌属于好氧性微生物且对外界的剪切力敏感，因此，在对生物反应器设计时不仅要考虑氧气的供应，而且还要考虑剪切力（即转速）对菌体和细菌纤维素缠绕成形的影响，本实验分别选取了7、15、30、60rpm四个较低的转速，研究转速对纤维素成形的影响。 

表1转速对管状材料成形的影响 

由表1可知，在7rpm和15rpm时，管状材料可以成形，而当增加到30rpm或者以上的时候，管状材料较难形成。当转速为7rpm时，发酵过程中在生物反应器底部会有较多类似凝胶状的纤维素形成，而在转速为15rpm以及更高时形成较少。这是由于当转速较慢时，生物反应器内剪切力不足，导致纤维素聚集在一起，纤维素的聚集对于管状材料的成形是不利的。 

（3）材料处理 

将制备的空腔异形BC材料从模具上取下，蒸馏水多次冲洗后，然后浸泡于0.5~2wt%的NaOH溶液中，70-100℃水浴处理30-120min，使BC管状材料呈白色半透明后即可，先用含0.5mol/L的醋酸的水溶液洗涤4~5次，再用纯水反复洗涤至中性，然后冷藏，即得异形细菌纤维素产品。 

（4）管状BC材料的表征 

A、管状细菌纤维素的扫描电镜观察 

对冷冻干燥得到的样品分别进行管外表面、管内表面、与管中心轴方向垂直截面（横截面），沿管中心轴方向截面（纵截面）四个部分的扫描电镜（SEM）观察（图6）。 

由管状细菌纤维素的电镜扫描照片可以看出，木醋杆菌动态合成的细菌纤维素与静态制备的膜一样具有超微网络结构，由高密度微纤维互相交联形成。照片中显示，外表面具有相对规则的走势，但不明显。从图（6A）中可以看到细菌纤维素的生长有向着某个方向延伸的趋势。在图（6B）管状细菌纤维素的内表面SEM照片中可以发现，纤维素的生长方向基本无规律性，这个可能是前期细菌纤维素的生长主要是靠吸附生长在玻璃柱上，生长不规则。由管状细菌纤维素材料的横截面和纵截面的电镜照片（图6C和6D）可以看出，纤维素的生长具有明显的规律性，纤维素向着某个方向交织生长，纤维素的每一层之间也有交织，形成了一个空间立体的网状结构，这个结果与静态培养的管状纤维素材料明显不同，在静态培养下细菌纤维素的截面电镜明显出现分层现象。而本实验的动态法制备的管 状材料没有出现分层。 

B、X-射线衍射分析 

采用日本RIGAKU公司X-射线衍射仪对静态膜试样和动态管试样进行X-射线衍射分析。经计算得静态发酵制备的细菌纤维素膜的结晶度为86.54%，动态发酵制备的细菌纤维素管的结晶度为89.36%。 

C、力学性能测定 

将制备得到的管状细菌纤维素，利用万能材料测试仪分别进行轴向和径向的强力测试。（A）轴向强力测试（图7）：将样品切成4cm长的管状，设定两夹头之间的夹距为3cm，移动速率为100mm/min，测试机的探头最大测定强力为10N。（B）径向强力测试（图7）：将样品切成1cm长的管状，采用两个U型铁丝（直径为

3mm）穿过BC管，设定两夹头之间的夹距为5cm，移动速率为100mm/min。测试机的探头最大测定强力为10N。 

图8显示反应器发酵制备的材料轴向强力随着培养天数的增加不断提高，这是由于随着培养天数的增加，细菌纤维素的厚度也会随之增加，生成的纤维素的量也更多。通过过程观察可以发现，管状材料的生长速率是随着细菌纤维素在玻璃棒上的缠绕逐渐加快的。在第一天时纤维素的缠绕量比较少，但是一天后，当玻璃棒上缠绕有一定量的细菌纤维素时，细菌纤维素的生长明显具有加快的趋势，第二天缠绕的厚度明显大于第一天，依次类推，这可能是因为培养刚开始时，玻璃棒不利于纤维素的缠绕，而当玻璃棒上具有一些纤维素时则缠绕变得容易，缠绕增厚速度也就变快。 

图9显示径向强力的变化规律与轴向强力结果具有一定的相似性。随着培养天数的增加管状材料的径向强力逐渐加强，而且后期材料强力的增加量相对于前期的要大，这与前面提出的管状材料随着天数的增加，厚度的增加量明显加大相一致。图中N/g代表测得的实际力与纤维素干重的比值。由于管状材料的干重相对很小，只有不到10mg，所以相对于干重的强力的变化就会相对比较大，导致了它的偏差也相对较大。 

实施例5 

（1）菌种培养 

将红茶菌（kombucha）按接入1-10片直径0.5cm圆片含菌BC膜的接种量接入300mL液体种子培养基（本实施例以下面培养基配方为例：每1L水中，绿茶或者红茶1-10g（茶叶5g时最优），葡萄糖、蔗糖或者果糖10~200g、蛋白胨或者胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g， pH3.0-7.5，巴氏灭菌30min；每1L水中，甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20-200g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，pH3.0-7.5，121℃灭菌20min）扩培，于20-30℃、100-250r/min条件下摇床培养或者静置培养12~48h后备用； 

（2）中空异形细菌纤维素材料的发酵制备 

将步骤（1）制备的含生产菌株的液体培养基转移到配备有棒状模具的生物反应器中，然后旋转模具以10rpm的转速进行扰动培养，于30℃动态培养4-20天后，即可收获空腔异形纤维素材料； 

或者取步骤（1）活化好的菌种按1~10片直径0.5-1cm圆片含菌BC膜的接种量转接到300mL液体发酵培养基中，置于500mL锥形瓶中，在30℃和160rpm的条件下培养4小时，然后再将发酵液转移到生物反应器中，，然后旋转模具以10rpm的转速进行扰动培养，于30℃条件下分别培养不同的天数，可制备得到不同厚度的管状细菌纤维素材料。 

该发酵装置由一个水平搅拌反应器和在转盘上固定若干手套形模具的转轴组成，形成了一个水平扰动的生物反应器。通过转盘上模具围绕着转轴轴心的转动，使得模具缠绕发酵液中的细菌纤维素而在模具表面形成一定形状的中空细菌纤维素材料。获得的产品与图5中类似。 

（3）材料处理 

将制备的空腔异形BC材料从模具上取下，蒸馏水多次冲洗后，然后浸泡于0.5~2wt%的NaOH溶液中，70-100℃水浴处理30-120min，使BC管状材料呈白色半透明后即可，用纯水反复洗涤至中性，然后冷冻干燥，即得异形细菌纤维素产品。 

Claims (7)

1.一种动态制备异型空腔细菌纤维素材料的方法，包括：

（1）菌种培养

将细菌纤维素生产菌株接入液体培养基扩培，于20-30℃、100-250r/min条件下摇床培养或者静置培养12~48h后备用；

（2）异型空腔BC材料的发酵制备

将步骤（1）制备的含生产菌株的液体培养基转移到上述发酵装置中，然后旋转模具以3-20rpm的转速进行扰动培养，于20~32℃动态培养4-20天后，即可收获空腔异形纤维素材料；

（3）材料处理

将制备的中空异形细菌纤维素材料从模具上取下，然后浸泡于0.5~2wt%的NaOH溶液中，70-100℃水浴处理30-120min，使细菌纤维素材料呈白色半透明后即可，然后洗涤至中性，即得异形细菌纤维素产品。

2.根据权利要求1所述的一种动态制备异型空腔细菌纤维素材料的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的BC生产菌株为醋酸菌属Acetobacter sp.、葡萄糖酸杆菌属Gluconobactersp.、葡糖酸醋杆菌属Gluconacetobacter sp.、根瘤菌属Rhizobium sp.、八叠球菌属Sarcinasp.、假单胞菌属Pseudomounas sp.、无色杆菌属Achromobacter sp.、产碱菌属Alcaligenes sp.、气杆菌属Aerobacter sp.、固氮菌属Azotobacter sp.、土壤杆菌属Agrobacterium sp.、洋葱假单胞菌Seudomonas cepacia、空肠弯曲菌Campylobacterjejuni或红茶菌kombucha。

3.根据权利要求2所述的一种动态制备异型空腔细菌纤维素材料的方法，其特征在于：所述BC生产菌株为木醋杆菌Acetobacter xylinum或红茶菌kombucha。

4.根据权利要求1或2所述的一种动态制备异型空腔细菌纤维素材料的方法，其特征在于：

除红茶菌以外的菌种按2~3接种环的接种量接入液体种子培养基；红茶菌按接入1-10片直径0.5cm圆片含菌BC膜的接种量接入液体种子培养基；

或者先制备生产菌的液体种子，再转接入液体发酵培养基，具体步骤如下：

除红茶菌以外的菌种按2~3接种环的接种量接入液体种子培养基制备种子液，然后按3vol%~20vol%的接种量转接到液体发酵培养基；红茶菌按接入1-10片直径0.5cm圆片含菌BC膜的接种量接入液体种子培养基，以及按1~10片直径0.5-1cm圆片含菌BC膜的接种量转接到液体发酵培养基。

5.根据权利要求1所述的一种动态制备异型空腔细菌纤维素材料的方法，其特征在于：所述的除了红茶菌以外的液体种子培养基和液体发酵培养基的组分均为：每1L水中，甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖或果糖20-200g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，pH3.0-7.5，121℃灭菌20min；或甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20-200g，酵母浸膏5g，蛋白胨或胰蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na₂HPO₄2.7g，水1L，pH3.0-7.5，121℃灭菌20min；

红茶菌液体种子培养基和液体发酵培养基，其组成均为：（1）每1L水中，绿茶或者红茶1-10g，葡萄糖、蔗糖或者果糖10~200g、蛋白胨或者胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，pH3.0-7.5，巴氏灭菌30min；（2）将葡萄糖、蔗糖或果糖、绿茶或红茶、以及水配成培养基，其中糖、茶、水的质量比为5：0.1-0.4：100-200，pH3.0-7.5，巴氏灭菌30min；或者（3）每1L水中，甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20-200g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，pH3.0-7.5，121℃灭菌20min。

6.根据权利要求1所述的一种动态制备异型空腔细菌纤维素材料的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的含生产菌株的液体培养基为步骤（1）制备的含生产菌株的液体种子培养基或含生产菌株的液体发酵培养基。

7.根据权利要求1所述的一种动态制备异型空腔细菌纤维素材料的方法，其特征在于：在异型空腔BC材料的发酵制备的过程中，通过在转轴或模具内腔中注入含氧量为1-100vol%的空气，以加速纤维素膜在模具上形成。

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