CN1850302A - 一种人造皮肤用细菌纤维素湿膜的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人造皮肤用细菌纤维素湿膜的制备方法，包括如下步骤：(1)用无菌吸管吸取0.2～0.6ml液体培养基，移植于斜面培养基上，在25～33℃培养1～3天，将其转移到同样的斜面培养基上，每隔1～3天转移一次，如此重复6～10次，完成菌种的活化过程；(2)取一环活化好的斜面菌种接入种子培养基，于25～33℃在转速为400～450rpm/min的磁力搅拌器下搅拌培养20～25h，再接入液体培养基中培养6～10天；(3)将纤维素湿膜快速分离提纯后，放冰箱内保存。有益效果是：合成过程中的无杂菌污染环境，降低了细菌纤维素作为人造皮肤的潜在病毒入侵隐患。可以做出任意形状的细菌纤维素膜，其柔软性接近人的皮肤，韧性和贴附性好，保存方便。
Description
技术领域
本发明涉及一种细菌纤维素湿膜的制备方法，特别是涉及一种人造皮肤用细菌纤维素湿膜的制备方法
背景技术
纤维素是天然植物纤维的主要成分，细菌纤维素是由微生物产生的一类纤维素，从纤维素的分子组成看，二者都是由β-D-葡萄糖通过β-1，4-葡萄糖苷键结合成的直链，直链间彼此平行，不呈螺旋构象，无分支结构，又称β-1，4-葡萄糖。细菌纤维素和植物纤维素在化学性质上是相同的，但细菌纤维素作为一种新型生物材料，有许多独特的性质。(1)高杨氏模量、高抗张强度和极佳的形状维持能力。(2)超细(纳米级)，细菌纤维丝带的形成过程如下：木醋杆菌细胞壁侧的小孔分泌出的纤维素微纤丝直径为1.78nm，相邻几根微纤维丝间由氢键相互联接形成的微纤束直径为3～4nm，而由微纤维束联接成的纤维丝带宽度为30～100nm厚度为3～8nm。(3)高纯纤维网状结构。(4)有较高的生物适应性和良好的生物可降解性。
细菌纤维素作为烧伤病人和慢性皮肤溃烂患者的生物敷料，有利于皮肤组织生长和限制感染。J.D.Fontana用静态法生产的细菌纤维素膜经干燥后制成一种生物末(商品注册名为BioFill)，可作为临时皮肤替代物，用于烧伤、溃疡和移植。Ciechanska Danuta通过改变培养基的组成，来改良细菌纤维素的性能，根据对改良细菌纤维素物理化学性质、机械性能和生物医学测试的结果，表明它具有一些良好的独特性质，如生物活性、生物可降解性、生物适应性和无过敏反应，尤其是良好的机械韧性，可作为极佳的生物医学材料。
据了解，仅在中国，每年因意外事故或疾病导致皮肤缺损的病患者人数就高达320万。目前国内大多采用猪皮、异体人皮材料(由多聚物结合其他化学物质—包括从鲨鱼软骨中提取的物质制造而成)等治疗皮肤缺损，这些生物敷料功能单一、应用范围较窄，且存在易感染细菌或病毒、易产生排斥反应等隐患。美国、日本等国虽然成功找到了利用胶原蛋白或甲壳素等原材料生产生物敷料的方法，但由于价格昂贵等问题，目前难以在中国和世界其他地区大规模应用。并且用于人造皮肤的这些材料，其形状结构都需要进行多种工序的加工及消毒处理，有的还要进行加工成型处理，制作工艺的复杂性更易导致潜在的病毒入侵及成本的昂贵。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种人造皮肤用细菌纤维素湿膜的制备方法，以弥补现有技术的不足或缺陷，满足医疗和某些特定人群的需要。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种人造皮肤用细菌纤维素湿膜的制备方法，包括如下步骤：(1)用无菌吸管吸取0.2～0.6ml液体培养基，滴入盛菌株的安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，吸取全部菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，在25～33℃培养1～3天，将其转移到同样的斜面培养基上，每隔1～3天转移一次，如此重复6～10次，完成菌种的活化过程；(2)取一环活化好的斜面菌种接入种子培养基，于25～33℃在转速为400～450rpm/min的磁力搅拌器下搅拌培养20～25h，再接入液体培养基中培养6～10天；(3)将纤维素湿膜快速分离提纯后，放冰箱内保存。
作为优选的技术方案：步骤(2)中接入液体培养基中的培养方案为以1～10％的不同接种量，接入5.0～7.0的相同PH值的液体培养基中培养6～10天；以5～9％的相同接种量，接入5.0～7.0的相同PH值的液体培养基中观察6～10天；以5～9％的相同接种量，10～1000cm2的相同液面表面积，5.0～7.0的相同PH值，接入1～30cm的不同培养液深度的液体培养基中培养6～10天或以5～9％的相同接种量，4～10cm的相同液面深度，5.0～7.0的相同PH值，接入10～1000cm2的不同液面表面积的液体培养基中培养6～10天四中方案中的一种。
所述的产细菌纤维素的菌种包括包括木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、产醋杆菌(A.acetigenum)、醋化杆菌(Acetobacter aceti)、巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)、葡萄糖杆菌(Gluconobater spp)、农杆菌(Agrobaterium tumefaciens)、根瘤菌(Rhizobium trifolii)、八叠球菌(Sarcina ventriculi)、洋葱假单胞菌(Seudomonas cepacia)、椰毒假单胞菌(P.cocovenenans)、空肠弯曲菌(Campylobater je juni)中的一种或几种。
所述的斜面培养基成分为：1L水中含葡萄糖10～120g、酵母膏1～20g、CaCO31～30g、琼脂1～30g。
所述的液体培养基成分为：1L水中含葡萄糖10～120g、酵母膏1～20g、CaCO31～30g、蛋白胨1～20g、柠檬酸1～10g、Na2HPO4 1～10g、KH2PO4 1～10g。
所述的种子培养基成分为：1L水中含葡萄糖10～100g、蔗糖10～50g、酵母膏1～10g、蛋白胨1～20g、柠檬酸1～10g、Na2HPO4 1～10g、KH2PO4 1～10g、MgSO4 1～10g。整个培养及接种过程是在无菌室中完成的。
本发明的原理是：从细菌纤维素生物合成的初步阶段着手，在菌种优化的基础上，严格控制培养液的灭菌过程及细菌纤维素膜的无杂菌培养环境。使合成的细菌纤维素膜形态结构、比表面积基本满足用于人造皮肤骨架的结构特点，通过控制不同的接种量、PH值、培养液深度、培养液表面积、发酵时间等条件，获得不同结构特征的细菌纤维素湿膜，找出其内在的规律性，反复进行大量的试验获得各个条件的技术指标。
本发明的有益效果是：
(1)总结细菌纤维素形态结构的可控性操作，从而有目的地指导今后细菌纤维素膜的合成。
(2)精确了解细菌生物合成初步条件对产生的细菌纤维素膜的影响，可以指导我们进行大规模的细菌纤维素膜用于人造皮肤研究。
(3)细菌纤维素膜整个合成过程中的无杂菌污染环境，及合成路线中没有诸如加工成型等操作工序的引入，这些都大大降低了细菌纤维素作为人造皮肤的潜在病毒入侵隐患。
(4)熟悉合成条件之后可以做出任意形状的细菌纤维素膜，这些膜柔软性接近人的皮肤，韧性和贴附性都非常好，保存办法简单。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细阐述。
实施例1：
(1)用无菌吸管吸取0.2mL液体培养基，滴入盛木醋杆菌(Acetobacter xylinum)菌株的安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，吸取全部菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，在25℃培养1天，将其转移到同样的斜面培养基上，每隔3天转移一次，如此重复6次，完成菌种的活化过程；
(2)取一环活化好的斜面菌种接入种子培养基，于25℃在转速为400rpm/min的磁力搅拌器下搅拌培养20h，再接入液体培养基中，改变接种量(3％～9％)，其他条件不变，接入液体培养基，第7天观察，细菌纤维素的厚度在接种量7％时达到最大值2.3mm，此后出现厚度减小的趋势。
(3)将纤维素湿膜快速分离提纯后，放冰箱内保存。
实施例2：
(1)用无菌吸管吸取0.6ml液体培养基，滴入盛葡萄糖杆菌(Gluconobater spp)菌株的安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，吸取全部菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，在33℃培养3天，将其转移到同样的斜面培养基上，每隔1转移一次，如此重复10次，完成菌种的活化过程；
(2)取一环活化好的斜面菌种接入种子培养基，于33℃在转速为450rpm/min的磁力搅拌器下搅拌培养25h，再接入液体培养基中，改变PH值(5.0～7.0)，其它条件不变，接入液体培养基，第7天观察，细菌纤维素膜的厚度在PH值为5.6时达到最大值2.2mm，此后出现厚度减小的趋势。
(3)将纤维素湿膜快速分离提纯后，放冰箱内保存。
实施例3：
(1)用无菌吸管吸取0.4ml液体培养基，滴入盛根瘤菌(Rhizobium trifolii)菌株的安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，吸取全部菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，在30℃培养2天，将其转移到同样的斜面培养基上，每隔2天转移一次，如此重复8次，完成菌种的活化过程；
(2)取一环活化好的斜面菌种接入种子培养基，于30℃在转速为420rpm/min的磁力搅拌器下搅拌培养22h，再接入液体培养基中，改变液面深度(4～10cm)，其他条件不变，接入液体培养基，第7天观察，细菌纤维素膜的厚度在液面深度4cm时达到最大值2.6mm，此后出现厚度减小的趋势。
(3)将纤维素湿膜快速分离提纯后，放冰箱内保存。
实施例4：
(1)用无菌吸管吸取0.3mL液体培养基，滴入盛木醋杆菌(Acetobacter xylinum)菌株的安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，吸取全部菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，在28℃培养1天，将其转移到同样的斜面培养基上，每隔3天转移一次，如此重复6次，完成菌种的活化过程；
(2)取一环活化好的斜面菌种接入种子培养基，于28℃在转速为400rpm/min的磁力搅拌器下搅拌培养20h，再接入液体培养基中，改变液面表面积(10～1000cm2)，其他条件不变，接入液体培养基，第7天观察，细菌纤维素膜的厚度在基本保持不变为2.0mm。
(3)将纤维素湿膜快速分离提纯后，放冰箱内保存。
实施例5：
(1)用无菌吸管吸取0.6mL液体培养基，滴入盛木醋杆菌(Acetobacter xylinum)菌株的安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，吸取全部菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，在25℃培养3天，将其转移到同样的斜面培养基上，每隔3天转移一次，如此重复7次，完成菌种的活化过程；
(2)取一环活化好的斜面菌种接入种子培养基，于25℃在转速为450rpm/min的磁力搅拌器下搅拌培养25h，再接入液体培养基中，改变液面表面积(10～1000cm2)，其他条件不变，接入液体培养基，第7天观察，细菌纤维素膜的比表面积基本保持不变为218.6m2/g。
(3)将纤维素湿膜快速分离提纯后，放冰箱内保存。
Claims (7)
1、一种人造皮肤用细菌纤维素湿膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)用无菌吸管吸取0.2～0.6ml液体培养基，滴入盛菌株的安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，吸取全部菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，在25～33℃培养1～3天，将其转移到同样的斜面培养基上，每隔1～3天转移一次，如此重复6～10次，完成菌种的活化过程；
(2)取一环活化好的斜面菌种接入种子培养基，于25～33℃在转速为400～450rpm/min的磁力搅拌器下搅拌培养20～25h，再接入液体培养基中培养6～10天；(3)将纤维素湿膜快速分离提纯后，放冰箱内保存。
2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中接入液体培养基中的培养方案为以1～10％的不同接种量，接入5.0～7.0的相同PH值的液体培养基中培养6～10天；以5～9％的相同接种量，接入5.0～7.0的相同PH值的液体培养基中观察6～10天；以5～9％的相同接种量，10～1000cm2的相同液面表面积，5.0～7.0的相同PH值，接入1～30cm的不同培养液深度的液体培养基中培养6～10天或以5～9％的相同接种量，4～10cm的相同液面深度，5.0～7.0的相同PH值，接入10～1000cm2的不同液面表面积的液体培养基中培养6～10天四中方案中的一种。
3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的产细菌纤维素的菌种包括木醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌、空肠弯曲菌中的一种或几种。
4、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的斜面培养基成分为：1L水中含葡萄糖10～120g、酵母膏1～20g、CaCO31～30g、琼脂1～30g。
5、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的液体培养基成分为：1L水中含葡萄糖10～120g、酵母膏1～20g、CaCO31～30g、蛋白胨1～20g、柠檬酸1～10g、Na2HPO41～10g、KH2PO41～10g。
6、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的种子培养基成分为：1L水中含葡萄糖10～100g、蔗糖10～50g、酵母膏1～10g、蛋白胨1～20g、柠檬酸1～10g、Na2HPO41～10g、KH2PO41～10g、MgSO41～10g。
7、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：整个培养及接种过程是在无菌室中完成的。
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