DE2320946B2

DE2320946B2 - Vorrichtung für mikrobiologisches Arbeiten

Info

Publication number: DE2320946B2
Application number: DE2320946A
Authority: DE
Inventors: Ronald Elkhart Freake; Billy Harper Rochester Haden
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1972-04-26
Filing date: 1973-04-25
Publication date: 1974-11-28
Also published as: SE418868B; FR2182073A1; HU167342B; FR2182073B1; US3843452A; JPS5323397B2; GB1423051A; AU5370473A; CA994221A; DE2320946A1; JPS4920385A

Description

ao Kissen mit dem Nährmedium durch einfaches Befestigen oder auf andere physikalische Weise miteinanbd id ^J^JZl'

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung für mikro- der verbunden sind

biologische Arbeiten, bestehend aus einem absorbie- US-PS Z 6//4Ji aas r . , . . _Knnt...

renden Material mit einer im wesentlichen flachen und die Membran in fluss^eiteleitendem Kontakt

Oberfläche und einer darüberiiegenden mikroporö- a₅ miteinander verbunden, wobei ein Halter und Klam-

sen Membran, wobei das absorbierende Material und mern verwendet werden.

die Membran durch eine Zwischenschicht miteinan- Was die Anwendbarkeit derartiger bekannter Pruf-

der verbunden sind. mittel betrifft, hat es sich gezeigt, daß sie bestimmte

Die Untersuchung bestimmter Körperflüssigkeiten Nachteile besitzen. Zum Beispiel nei^ die Membran

auf das Vorhandensein von Mikroorganismen, wie 30 im Kontakt mit dem nassen, das Nahrmedmm^enthal-

der Nachweis bzw. die Bestimmung von Bakterien im tenden Kissen dazu, sich zu verziehen und Falten _zu

Urin, ergibt eine wertvolle Information für den Arzt bilden. Wenn das passiert, sind keine quanmativ^n

oder Mikrobiologen zur Diagnose bestimmter Krank- Ergebnisse mehr möglich, da die, Mikroigamsmen

heiten, und zu diesem Zwecke v. .,rden innerhalb der die sich direkt über einem freien Raum zw.schen

letzten Jahre zahlreiche Testsysteme und Prüfmittel 35 dem Kissen und der Membran befinde^ n.chtwach-

zum Nachweis von Bakterien und Pilzen entwickelt. sen, da sie kerne Nährstoffe erhalten..Das heißt, die

Derartige Nachweismittel finden auch Verwen- Nährstoffe können nicht durch die Membran nach

dung zur Untersuchung von Arzneimitteln, Nah- außen diffundieren und mit dem Mikroorganismus 1 η

rungsmitteln, Wasservorräten, Schwimmbecken und Kontakt kommen, wodurch an der Stelle keine KoIo-

anderen Bereichen, wo bestimmte Arten von Mi- 40 nienbildung eintritt. Dadurch ist die erhaltene Zah-

kroorganismen schädlich sind oder zu einer Gesund- lung nicht mehr quantitativ. Außerdem ne gen, wenn

heitsgefährdung führen, eine Faltenbildung der Membran eintritt, die Mi-

EiL ausführliche Beschreibung des Standes der kroorganismen dazu zu den niedrigen Punkten,an

Technik bezüglich dem Nachweis und der Bestim- der Ob,.fläche der Membran zu Hießen und es treten

mung von bakterien und Mikroorganismen ginge 45 »Nester« von Kolonien auf, die eine Zahlung außer-

über den Rahmen dieser Beschreibung hinaus. Kurz ordentlich schwer machen. ......

kann jedoch gesagt werden, daß zum Erreichen eines In der DT-OS 2 115 674 ist eine Vorrichtung von

bestimmten Grades an Genauigkeit und Zuverlässig- Aufsammeln und Zuchten von Mikroorganismen be-

keit derartige Verfahren im allgemeinen das Beimp- schrieben, bei den em Filter bzw. eine Membran m.t

fen eines speziell zubereiteten Wachstumsmediums 50 einer zur Zurückhaltung der Mikroorganismen geeig-

mit der zu untersuchenden Flüssigkeit, Inkubieren neten Porengröße auf der einen Seite mit einem Ab-

dieses Systems unter standardisierten Bedingungen sorptions-Kissen verbunden ist, das Nährstoffe fur

und Beobachtung der Bildung von Bakterien oder die Mikroorganismen enthalt. Dabei sind das Kissen

anderen Mikroorganismenkolonien, die darauf wach- und die Membran flächenhaft miteinander verbun-

sen, umfasst. Die üblichen und klassischen Verfahren 55 den. Diese Verbindung wird gebildet durch ein poro-

zum Inkubieren derartiger Testsubstanzen mit dem ses Haftmittel, insbesondere durch eine Schicht aus

zubereiteten Wachstumsmedium umfassen die Ver- Polymer-Fasern, die bei relativ niedrigen Temperatu-

wendung von Petrischalen, in denen Agargel abge- ren angeschmolzen werden können. E.ne solche

schieden ist. Solche Verfahren sind selbstverständlich Haftmittelschicht besitzt notwendigerweise Zwi-

zeitraubend und erfordern erfahrenes Laborpersonal 6₀ schenräume zwischen den einzelnen Fasern, die die

und eine komplette Laboreinrichtung, um solche Schicht ausmachen. Durch diese Zwischenräume tritt

Prüfmittel herzustellen und die damit erhaltenen Er- ebenfalls der für die oben angegebenen Kissen be-

gebnisse zu analysieren. schriebene Nachteil auf, das heißt wenn sich ein

Vor einiger Zeit wurden Verfahren bekannt, bei Mikroorganismus oberhalb eines solchen Zwiscnen-

denen das Agargel ersetzt worden ist durch ein mit 6_S raumes in der Klebemittelschicht befindet, wird die

dem Nährmedium imprägniertes Kissen. Ein derarti- entstehende Kolonie von einer geringeren Menge

ges Kissen kann ein saugfähiges Material, wie Papier, Nährstoffen erreicht, und es bildet sich an dieser

umfassen, in das das Nährmedium in trockenem Zu- Stelle eine kleinere oder in manchen Fallen gar keine

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Kolonie. Dadurch werden etou Auszahlung der KoIo- verschiedenen Reagenzien und/oder Kulturmedien

nien und eine quantitative Bestimmung offensichtlich imprägniert sind, wie spater naher beschrieben wird,

sehr erschwert, zumal die Gefahr besteht, daß besen- Auf die laminierte Struktur 13 eind GitternetzJinien

ders kleine Kolonien durch eine falsche morphologi- 17 aufgedruckt oder auf andere Weise aufgebracht,

sehe Interpretation als Kolonien eines anderen Mi- 5 die die Zahlung der Kolonien erleichtern,

kroorganismus angesehen werden. Ferner kann die Fig.2 zeigt die laminierte Struktur 14, bestehend

Haftmittelschicbt selbst eine nachteilige Wirkung auf aus einem absorbierenden Material 20 wie Papier,

das Wachstum der Mikroorganismen ausüben und mit dem die mikroporöse Membran 23 über eine

schließlich ist die Herstellung derartiger Prüfmittel, Grenzschicht 21, die aus dem absorbierenden Mate-

bei denen zunächst der Filter und das Kissen ge- ίο rial 20 und der Membran 23 besteht, verbunden ist

trennt hergestellt und anschließend über eine Klebe- In dem Basisteil 12 können Löcher 22 vorgesehen

mittelschicht miteinander verbunden werden müssen, sein, die es ermöglichen, daß die Flüssigkeit in die

ziemlich aufwendig. Vertiefungen 18 eindringt und in dem Material 20

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, bakte- absorbiert wird.

riologische Prüfmittel mit verbesserten Ableseeigen- 15 Die Fig.3, 4 und5 sind Draufsichten auf rechtekschaften zu entwickeln, die bequemer in der Anwen- Idge laminierte Strukturen 14 a, 146 und 14 c, die dung sind und leichter ansprechen und bei denen das der Struktur 14 entsprechen und mit der auf den Mi-Wachstum des Mikroorganismus über den gesamten kroorganismengehalt zu untersuchenden Flüssigkeit Bereich des Prüfmittels gleichmäßig ist. in Berührung gewesen sind, wodurch Bakterienkolo-

Diese Aufgabe wird erfindimgsgemäß gelöst durch ^ao nien 30 a, 30 b und 30 c darauf gewachsen sind. Die

eine Vorrichtung für mikrobiologische Arbeiten, be- Fig.3 zeigt Kolonien 30α, ύ'.ϊ ein Hinweis sind auf

stehend aus einem absorbierenden Materal mit einer 10³ Bakterien/cm⁸ der untersuchen Flüssigkeit, wäh-

im wesentlichen flachen Oberfläche und einer dar- rend die F i g. 4 und 5 Kolonien 30 b und 30 c zeigen,

überliegenden mikroporösen Membran, wobei das die ein Hinweis sind auf 10⁴ bzw. 10⁵ Bakterien/cm³

absorbierende Material und die Membran durch eine »5 der untersuchten Flüssigkeit.

Zwischenschicht miteinander verbunden sind, die da- la den F i g. 6 und 7 ist ein Prüfmittel 31 gezeigt,

durch gekennzeichnet ist, daß die Zwischenschicht das aus einem länglichen Streifen einer Plastikfolie

eine kontinuierliche Grenzschicht ist, bestehend aus 34 besteht, die als Handgriff für eine rechteckige Ia-

dem adsorbierenden Material, in das eine bestimmte minierte Struktur 35 dient, die an einem Ende davon

Menge des Membran-Materials eingedrungen ist. 30 befestigt und mit einem Kulturmedium imprägniert

Beim erfindungsgemäßen Prüfmittel kann in oder ist. Eine solche Imprägnierung wird später näher be-

auf der Membran oder dem Material eine Testsub- schrieben. Wie aus der Abbildung hervorgeht, ist das

stanz wie ein chemisches oder biochemisches Rea- Prüfmittel 31 lose in einer dicht verschlossenen

genz oder eine biologische Substanz enthalten sein. transparenten Kunststoffteile 32 eingeschlossen, die

Die Erfindung wird durch die Zeichnungen näher 35 eine ineinandergreifende Verschlußleiste 33 besitzt,

erläutert. Dabei ist Nachdem das Prüfmittel 31 in die Hülle 32 gebracht

Fig. 1 eine perspektivische Draufsicht auf ein und die Verschlußleiste 33 verschlossen worden ist,

erfindungsgemäßes Prüfmittel mit der laminierten wird das Prüfmittel sterilisiert. Dabei wrd die Hülle

Struktur, mit dem Inhalt z.B. einer baktericiden elektroma-

F i g. 2 ein Querschnitt durch das Prüfmittel der 4c gnetischen Strahlung ausgesetzt, oder einem bakteri-

F i g. 1 entlang der Linie 2-2, ciden Gas, das die Hülle 32 durchdringen kann.

F i g. 3, 4 und 5 Draufsichten auf die Prüfmittel, In F i g. 7 ist die laminierte Struktur 35 gezeigt, be-

die die Stellen der Bakterienkolonien zeigen, stehend aus einem absorbierenden Material 36 und

F i g. 6 eine Draufsicht auf ein erfindungsgemäßes einer mikroporösen Membran 39, die über eine zu-Prüfmittel, das in einem transparenten Behälter ent- 45 sammenhängende Grenzschicht 37 miteinander verhalten ist, bunden sind.

F i g. 7 ein vergrößerter teilweiser Querschnitt des F i g. 8 ist eine perspektivische Ansicht einer schei-

Prüfmittels und Behälters der F i g. 6 entlang der Li- benförmigen laminierten Struktur 41, deren Ober-

nie7-7, fläche eine Membran mit einem hydrophilen Mittel-

F i g. 8 eine perspektivische Ansicht eines schei- 50 teil 46 und einem umlaufenden Rand 44 umfaßt, der

benförmigen Prüfmittels, das die erfindungsgemäße am besten durch Behandlung mit Siliconöl oder

laminierte Form besitzt, durch Erhitzen hydrophob gemacht worden ist. Dei

F i g. 9 ein senkrechter Schnitt entlang der Linie hydrophile Mittelteil 46 ist mit dem getrockneten

9-9 der F i g. 8 und Rückstand 53 einer Kultursuspsnsioa für Mikroorga-

Fi g. 10 eine Draufsicht auf ein erfindungsgemäßes 55 nismen bedeckt.

Prüfmittel, das die Kolonien oder Stellen, an denen F i g. 9 stellt einen senkrechten Schnitt durch das

sich die Mikroorganismen entwickelt haben, zeigt. scheibenföimige Prüfmittel 41 der F i g. 8 entlang dei

Bei den Zeichnungen zeigt Fig. 1 ein mehrteiliges Linie 9-9 dar. In dieser Figur ist die Scheibe 41 ge-

Prüfmittel 10, umfassend ein längliches Basisteil 12 zeigt, die ein saugfähiges Material 42 umfaßt, das mil

mit einer Reihe ähnlicher, rechteckiger, darin gebil- 60 Nährstoffen für Mikroorganismen imprägniert seir

deter Vertiefungen 18. Das Basisteil 12 kann aus kann. Dieses Material 42 ist mit einer mikroporöser

einem geformten Kunststoff wie Polystyrol bestehen Membran 4? über die Grenzschicht 45 verbunden

und kann eine Verlängerung 19 mit einem aufge- Der umlaufende Rand 44 der Oberfläche der Scheib«

rauhten Oberflächenteil 11 besitzen. Die Verlange- 41 ist hydrophob gemacht und der Mittelteil mit den

rung 19 dient dabei als Handgriff, um die Handha- 65 getrockneten Rückstand 53 einer Mikroorganis

bung mit den Fingern zu erleichtern. Die Vertiefun- men-Kultur-Suspension bedeckt, wie oben angege

gen 18 enthalten jev*eils rechteckige laminierte Struk- ben, und später in den Beispielen näher beschrieben

türen 13. 14. 15 und 16, die mit den gleichen oder Die F i g. 10 zeigt ein laminiertes scheibenförmige

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Prüfmittel 61, das dem scheibenförmigen Prüfmittel det werden kann. In diesem Zusammenhang können 41 der Fig.8 und9 ähnlich ist, nachdem die Nähr- verschiedene Nährstoffe oder Nährmedien verwendet stoffe in dem Prüfmittel mit destilliertem Wasser re- werden, wie Actinomycesbrühe, Rinderlactose, Hirnkonstruiert worden sind und das anschließend inku- und Herzauszüge, Aziddextrose, Christen$,ens-Mebiert worden ist und worauf sich Kolonien der Mi- 5 dium, Tryptose-Blut-Agar, Formiat-Ricinoleatkroorganismen 63 entwickelt haben. Brühe, Loefflers-Medium, MacConkeys-Medium,

Die absorbierenden Materialien 20, 36 und 42 der M-Hefebrühe, Sabourand-Medium, Nickersons-Zu-Prüfmittel 10, 31 bzw. 41 können Papier, Stoff, Holz bereitung usw., und Variationen davon können in oder irgendein anderes geeignetes Material sein, das oder auf die mikroporöse Membran und/odeir das abeine Lösung oder Suspension absorbieren und als io sorbierende Material ein- oder aufgebracht werden. Flüssigkeit eine Zeitlang festhalten kann oder das die Solche Nälirstoffzubereitungen oder deren Variatiotrockenen Feststoffe festhalten kann, die verbleiben, nen können gewählt werden, daß entweder ein im nachdem das Material mit einer Lösung oder Sus- wesentlichen universelles Wachstumsmedium zum pension imprägniert und getrocknet worden ist. Nachweis des Wachstums aller Mikroorganismen er-

Die mikroporösen Membranen 23, 39 und 43 der 15 halten wird, oder ein für einen Mikroorganismus spe-Prüfmittel 10, 31 bzw. 41 bestehen vorzugsweise aus zifisches Wachstumsmedium. Variationen von Staneinem polymeren Material wie einem Celluloseester dardnährlösungen können erforderlich sein, um das und können nach einem Verfahren hergestellt wer- Plattensystem an das hier beschriebene wasserfreie den, wie es z. B. in der US-PS 1421 341 oder in dem System aus absorbierendem Material und Membran Artikel von Zsigmondy und Bachmann in ao anzupassen. Zum Beispiel hat es sich gezeigt, daß Anorg. Allgem. Chem., 103, 119 (1918) angegeben eine geeignete Variation von Nickersons-ZubereUung ist. Spezielle polymere Substanzen, die zur Herstel- zur Verwendung in einem wasserfreien System aus lung der mikroporösen Membranen geeignet sind, absorbierendem Material und Membran als isolierensind Cellulosetriacetat, Cellulosenitrat, regenerierte <J*r, quantitativer Nachweis für Candida Monilia Cellulose, Polyvinylchlorid, Nylon usw. as dient. Außerdem kann die laminierte Struktur ver-

Die zusammengesetzte Struktur aus Membran und schiedene Mikroorganismen umfassen wie Staphylo-

absorbierendem Material wird hergestellt, indem coccus aureus, Streptococcus pyrogenes, Sireptococ-

man das polymere Material in einem geeigneten Lö- cus feacalis, Diplococcus pneumoniae, Haejaophilius

sungsmittel löst und auf das absorbierende Material influenzae, Klebsiella pneumoniae, Escherkhia coli,

aufgießt, so daß eine bestimmte Menge des gelösten 30 Proteus mirabilis, Salmonella sp., »O« Stamm von

polymeren Materials in das absorbierende Material Coli, Hefepilze und ähnliche, wodurch es möglich

eindringt und eine zusammenhängende Grenzschicht wird, leicht Vergleichskulturen in stabiler Form an-

zwischen der Membran und dem absorbierenden Ma- zuwenden,

terial bildet. Es hat sich gezeigt, daß es besonders günstig ist,

Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen lami- 35 wenn zusammen mit den Reagenzien bestimmte Stanierten Strukturen hat es sich gezeigt, daß eine zu- bilisierungs- bzw. Fixierungsmittel enthalten sind, sammenhängende Grenzschicht von ungefähr 1 bis 5 Diese Stabilisierungsmittel dienen dazu, die Einlage-μΐη Dicke am besten ist. Außerdem wird die Porosi- rung einer vorher bestimmten Zahl von Mikroorgatät der Membran so eingestellt, daß der Durchgang nismen oder von bestimmten Konzentrationen des der zu bestimmenden Mikroorganismen verhindert 40 Mediums sowie die Rehydratisierung des Reagenzes wird, während Nährstoffe und andere Lösungen frei nach der Berührung mit der zu untersuchenden Flüsdurch die Membran dringen können. In diesem Falle sigkeit zu erleichtern. Dabei kann irgendeine mikroist, da die kleinsten Bakterien einen Durchmesser biologisch inerte kolloidale Substanz angewjindt wervon ungefähr 0,22 μιη besitzen, eine Membran am den. Es ist günstig, eine solche Konzentration an Stagünstigsten, die eine Porengröße von ungefähr 0,0t 45 bilisierungsmittel anzuwenden, daß dieses kein Gel bis 0,2 μιη oesitzt. Es ist jedoch selbstverständlich, bildet. Die genaue Konzentration hängt ab von den daß, wenn größere Mikroorganismen, wie Hefen, be- speziellen Verdickungseigenschaften des Mittels. Im stimmt werden und/oder eine höhere Fließgeschwm- allgemeinen liegt die Menge des Stabilisierungsmitdigkeit der Lösung durch die Membran erwünscht tels, wenn das Reagenz in Form einer wäßrigen Susist, eine Membram mit einer Porengröße von mehr 50 pension vorliegt, ungefähr bei 1,0 bis 2,0 Gewichtsais 0,2 μιη und bis zu ungefähr 2,0 μιη günstig sein prozent. Dieser Wert kann jedoch mit der jeweiligen kann. Zubereitung des Mediums variieren, und es können

Bezüglich der mikroporösen Membran der lami- in einigen Fällen 0,1 bis 8 °/o angewandt wenden,
nierten Struktur hat es sich gezeigt, daß eine Mem- Geeignete inerte kolloidale Stabilisierungsmittel bran mit einer Dicke von ungefähr 3 bis 10 μιη be- 55 sind unter anderem die sauren Polysaccharide mit sonders günstig ist. Die Form und Größe des absor- veresterten oder freien Carboxylgruppen und anders bierenden Materials hängt offensichtlich von den komplexe Polysaccharide sowie Gelatine and ähnspeziellen Eigenschaften des Prüfmittels ab. Es kann liehe Proteinabbauprodukte, inerte natürliche Gumjedoch ein Kissen von ungefähr 1 bis 2 mm Dicke men, Zellulosegummen und kolloidales Siliciumdiogünstig verwendet werden. 60 xid. Als besonders geeignet erwiesen haben sich was-

Wie oben angegeben, wird ein besonders günstiges serlösliche Alginate, besonders das Algin genannte

Prüfmittel erhalten, wenn man in die laminierte Natriumalginat. Dabei sind Mengen von ungefähr 1,0

Struktur Testsubstanzen wie chemische, biochemi- bis 2,0 Gewichtsprozent und vorzugsweise l,25^e/o

sehe und/oder biologische Substanzen einbaut, so Natriumalginat besonders geeignet,

daß die Struktur als Prüfmfttel oder sonstiges Mittel 65 Die laminierte Struktur wird üblicherweise mit

zur Bestimmung der Art und/oder Menge an Mi- Hilfe eines Gießverfahrens hergestellt, d. h.., das po-

kroorganismen oder als Mittel zur Lieferung, Lage- lymere Membranmaterial wird in einem geeigneten

rung und Anwendung von Mikroorganismen verwen- nicht toxischen flüchtigen Lösungsmittel gelöst und

unter geregelten Bedingungen ein flüssiger Film auf dem absorbierenden Material abgeschieden. Je nach der Viskosität des flüssigen Films sowie den angewandten Trocknungsbedingungen dringt eine bestimmte Menge des Polymers in das absorbierende. Material ein und bildet eine zusammenhängende Grenzschicht zwischen der mikroporösen Membran und dem absorbierenden Material. Das Lösungsmittel wird dann entfernt, wobei sowohl eine mikroporöse Membranstruktur als auch eine kontinuierliche Grenzschicht zwischen dem absorbierenden Material und der Membran gebildet werden.

Wie oben gesagt, finden die erfindungsgemäßen laminierten Strukturen Anwendung auf verschiedenen Gebieten der Mikrobiologie. Sie können angewandt werden einfach zu Lagerung, Lieferung und Anwendung von Mikroorganismen wie zur Qualitätskontrolle, oder sie können als nährmediumhaltige mikrobiologische Prüfmittel angewandt werden. Bei der Anwendung zur Qualitätskontrolle ist daran gedacht, daß eine Reihe von Standardprüfmitteln angewandt wird, um Ansätze von Medien, Agrargel u. ä. zu untersuchen und daß die kleineste Zahl von Organismen, die erforderlich ist, um ein Wachstum einzuleiten, festgestellt wird. Diese kleinste Zahl wird als »Isolierungskoeffizient« für das spezielle System oder Medium, das untersucht wird, bezeicluiet. Zum Beispiel kann ein neuer Ansatz eines Mediums hergestellt und mit einer Reihe Standards untersucht werden, die zwischen 5 und 100 Kolonien pro Standard variieren. Unter Standardwachstumsbedingungen wird das Medium das Wachstum des Mikroorganismus nur einleiten und unterstützen, wenn eine ausreichende Anzahl solcher Mikroorganismen in dem Standard enthalten ist. So kann bei Anwendung einer Reihe Standards mit einer bekannten unterschiedlichen Anzahl von Mikroorganismen der Isolierungskoeffizient eines Mediums leicht bestimmt werden durch Feststellung des Standards innerhalb der Reihe, die ein Kolonienwachstum unter standardisierten Bedingungen zeigen, der die geringste Anzahl Mikroorganismen enthält. Die Anzahl Mikroorganismen, die zu dem Isoüerungskoeffizienten führen, kann auch als minimale Impfmenge bezeichnet werden.

Wenn sie als Prüfmittel verwendet wird, wird die laminierte Struktur mit einem spezifischen Nährmedium versehen und getrocknet. Solche Nährstoffe werden ausgewählt je nach dem speziellen Mikroorganismen, der nachgewiesen werden soll, und können entweder in dem absorbierenden Material oder der mikroporösen Membran oder beiden enthalten sein. Bei »Eintauch-Inkubier-Ablese-Untersuchungen wird das Prüfmittel durch augenblickliches Eintauchen in die auf das Vorhandensein von Mikroorganismen zu untersuchende Flüssigkeit beimpft. Die überschüssige Flüssigkeit läßt man von der Oberfläche abfließen, und das Prüfmittel wird eine vorher bestimmte Zeit unter Standartbedingungen inkubiert. Andere mögliche Prüfverfahren umfassen die Rehydratisierung der Struktur mit einer sterilen Flüssigkeit und anschließendes Beimpfen der Membranoberfläche durch »Aufstreichen« oder Aufwischen und anschließendes Inkubieren unter Standardbedingungen. Weitere Möglichkeiten des Beimpfens umfassen ein Zusammenbringen der Membranoberfläche mit auf Mikroorganismenwachstum zu untersuchendes Gewebe. Die Membran dient als Pufferzone, die ein Beimpfen der Oberfläche der Membran erlaubt, während ein mögliches Auslaugen der Reagenzien aus dem absorbierenden Material und auf das zu untersuchende Gewebe verzögert wird. Dieses Verfahren ist beson-

S ders geeignet, wenn man ein für einen Mikroorganismus spezifisches Nährmedium, wie oben beschrieben, in das Prüfmittel einbaut, wodurch man ein Prüfmittel erhält zum Nachweis eines speziellen Mikroorganismus, das man direkt mit dem zu untersuchenden Gewebe in Berührung bringen kann.

Das Prüfmittel wird während der Inkubationszeit am besten in einen Behälter oder eine Hülle gegeben, um ein Verdampfen der Flüssigkeit zu vermeiden. Während der Inkubationszeit dringt Flüssigkeit aus

dem absorbierenden Material, enthaltend die Nährstoffe, durch die Membran an die Oberfläche, und etwaige vorhandene aus der zu untersuchenden Flüssigkeit stammende Mikroorganismen wachsen iu kreisförmigen bzw. runden Kolonien auf der Ober-

M fläche der Membran, da die Porosität einer derartigen Membran dazu führt, daß die Kolonien auf der Oberfläche festgehalten werden. Nach der Inkubationszeit werden die Kolonien einfach gezählt oder mit einer Graphik oder einem Foto verglichen, das

•5 eine Reihe von Standards umfaßt, die eine verschiedene Anzahl von Kolonien zeigen.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

B e i s ρ i e 1 1

Es wurde eine Polymerlösung hergestellt durch vollständiges Lösen von 7 g Cellulosenitrat in 100 cm³ eines Gemisches aus 50% Äther und 5O°/o Alkohol. Es wurde destilliertes Wasser zugegeben, bis die Lösung trüb wurde und die Lösung anschließend über Nacht gerührt. Ein flüssiger Film aus dieser gerührten Polymerlösung wurde auf die Oberfläche eines Blattes Papier aufgebracht. Das Filterpapier und der Flüssigkeitsfilm wurden sofort bei Raumtemperatür 1 h getrocknet, wobei man eine laminierte Struktur mit einer mikroporösen Membran mit einem mittleren Porendurchmesser von ungefähr 0,1 μπι und einer Grenzschicht von ungefähr 5 μηι Dicke erhielt.

Beispiele 2bis5

Die entsprechend Beispiel 1 hergestellte laminierte Struktur wurde in Rechtecke von ungefähr 2 X 2 cm geschnitten, wie sie in F i g. 1 als Nr. 13, 14, 15 und 16 angegeben sind. Die Rechtecke wurden folgendermaßen mit Nährmedien imprägniert.

Tabelle 1	⁵⁵ T> · · , Beispiel	Nährmedium	Nachzuweisender Mikroorganismus
2	Hefemedium	Candida
6o 3	Nährmedium mit Indikator	allgemein alle üblichen patho- genen Mikro organismen
65 ⁴	Tellurit-Glycin- Medium	Staphylococcus
5	S und S-Medium	Salmonella und Shigella

409548/X

2 230 946

Jedes der Rechtecke der Beispiele 2, 3, 4 und 5 wurde in den Basisteil 12 des Prüfmittels 10 der F i g. 1 gelegt. Das Prüfmittel wurde augenblicklich in eine Urinprobe getaucht, die auf das Vorhandensein von Bakterien untersucht werden sollte, geschüttelt, um überflüssigen Urin zu entfernen, in eine Petrischale gelegt und 18 bis 24 h bei 37° C inkubiert. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Tabelle 2

Beispiet

2
3
4
5

Ergebnis

braune erhabene Hefekolonien rote erhabene Kolonien schwarze erhabene Kolonien schillernde erhabene Kolonien

Beispiel 6

Die laminierte Struktur des Beispiels 1 wurde in kreisförmige Scheiben mit einem Durchmesser von 12 mm geschnitten. Ein 1 mm breiter umlaufender Rand des Membranteils der Scheibe wurde dann durch Erhitzen hydrophob gemacht. Das absorbierende Material wurde dann mit der folgenden Nährstoffzubereitung imprägniert und getrocknet.

Gewichtsprozent

Pepton 0,3

Natriumchlorid 0,5

Tryptose 1,0

Eine Kultur von Escherichia coli wurde hergestellt, indem damit ein stabilisiertes Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung beimpft wurde:

Pepton 0,5 g

Natriumalginat 0,5 g

Steriles, destilliertes Wasser .. auf 100,0 cm³

Die Kultur wurde über Nacht bei 37° C inkubiert.

Am nächsten Morgen wurden 10 cm³ der Kultur

sorgfältig 2 min mit Hilfe einer Mischvorrichtung

vermischt, 3 min gewartet, um die Luftblasen zum

S Verschwinden zu bringen und ein zweites Glas mit dem oben angegebenen Kulturmedium mit 0,01 cm³ der ersten Kultur beimpft. Diese zweite Kultur (Subkultur) wurde 8 h bei 37° C inkubiert. Eine dritte Kultur wurde in der obenbeschriebenen Weise herge-

ie stellt und über Nacht bei 37° C inkubiert.

Unter Verwendung der dritten Kultur wurde eine Kultur hergestellt, indem erneut 0,01 cm³ davon zu 10,0 cm³ des stabilisierten Kulturmediums gegeben und genau 8 h bei 37° C inkubiert wurde. Eine verdünnte stabilisierte Bakteriensuspension wurde dann hergestellt, indem man 0,01 cm³ dieser letzten Kultur zu 15,0 cm³ eines Suspendierungs-Lyophilisierungs-Mediums der folgenden Zusammensetzung gab.

Pepton

0,5 g

Natriumalginat 0,5 g

Glucose 7,5 g

as Steriles, destilliertes Wasser .. auf 100,0 cm³

Mit Hilfe einer Präzisions-Mikrozugabevorrichtung wurden 0,02 cm³ der oben angegebenen verdünnten Bakteriensuspension auf die Oberfläche der mikroporösen Membran des scheibenförmigen Prüfmittels gegeben. Die auf die Scheibe aufgebrachte Suspension bildete ein rundes Muster von 11mm Durchmesser und wurde gefriergetrocknet und anschließend die Scheibe in einen Behälter gegeben und

unter Vakuum gehalten.

Das Nährstoffkissen wurde dann mit destilliertem Wasser imprägniert und das Prüfmittel 12 h bei 37° C inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit erhielt man 30 Kolonien.

Derartige Prüfmittel dienen zur Untersuchung der Lebensfähigkeit von Mikroorganismen, die auf mikroporösen Membranen festgehalten sind, und bilden gleichzeitig ein bequemes stabiles Mittel, um Kulturen zu lagern und zur Verfügung zu stellen.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

stand eingebaut ist. Neben dem Kissen umfassen derartige Prufroittel im allgemeinen Membranen in Ver-

Patentanspruch: bindung mit dem mit dem Nährmedium imprägnier

ten Kissen.

*S»J5. S28S*!?JSÄS ⁵ JSrJSSS f££ ÄrS,

einer darüberiiegenden mikroporösen Membran, fläche des P™to«fs nut^ PFgSSBe

wobei das absorbierende Material und die Mem- FHissigkert bestrecht, «e unter stolzierten Be-

brau durch eine Zwischenschicht miteinander « dingungen »k^^o&^ufff £.1^.

verbunden sind, dadurch gekenuzeich- kroorganismen ^^g 2672431 267243?

net, daß die Zwischenschicht eine kontinuter- beobachtet. §^ *» J⁰⁸"¹^ ₇61813 2923669

liehe Grenzschicht ist, bestehend aus dem absor- 2677649, 2.677_647, 2761^U, IM669

bierenden Material, in das eine bestimmte Menge 2 954 327, 3 ² _ρ ⁴?.^_νί1^_η™ d :_vorrichLSn

des Membran-Materials eingedrungen ist ,5 vers^edene ^^SS^SSS

und mit Nahrmedium imprägnierten Kissen für mikrobiologische Testsysteme umfassen. Solche Prüf-

mittel sind so konstruiert, daß die Membran und das