DE69628999T2 - ATP-Eliminator und Verfahren zur Bestimmung von biologischen Zellen - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Eliminator von Adenosin-5'-triphosphat (hiernach als ATP bezeichnet) und ein Verfahren zur Messung biologischer Zellen.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Bewertung einer biologischen Kontamination von Proben, wie z. B. Nahrungsmitteln und Getränken durch Behandlung der Proben mit dem ATP-Eliminator und dann Messung von ATP in kontaminierenden Mikroorganismenzellen, die in den Proben enthalten sind, durch das Biolumineszenzverfahren.
  • Beschreibung des verwandten Stands der Technik
  • Die Messung biologischer Zellen, wie z. B. Escherichia coli, Hefen und Milchsäurebakterien ist sehr wichtig auf Gebieten einschließlich der Nahrungsmittelhygiene, der Biotechnologie, klinischen Labortests, der Medizin, hochreinem Wasser und der Umwelt.
  • Biologische Zellen werden allgemein durch verschiedene Verfahren gemessen, wie z. B. mikroskopische Instrumente, mit einem Hämatozytometer (mikroskopisches Verfahren), eine Trübheitsmessung, Gravimetrie, Messverfahren für das Packvolumen und Koloniezählverfahren (hiernach bezeichnet als Gusskulturverfahren).
  • Das mikroskopische Verfahren, die Trübheitsmessung, die Gravimetrie und das Messverfahren für das Packvolumen weisen jedoch Nachteile einer niedrigen Sensibilität oder Unfähigkeit zur Unterscheidung zwischen nicht lebensfähigen Zellen und lebensfähigen Zellen auf, während das Gusskulturverfahren für die Fälle nicht geeignet ist, bei denen das Ergebnis schnell erhalten werden soll, da es die Kultivierung der Zellen notwendig macht und daher in der Regel eine Zeitspanne von einem bis mehreren Tagen benötigt.
  • Das Zählen von Zellen in den vorgenannten Gebieten benötigt eine schnelle Messung mit hoher Sensibilität; die Überprüfung auf mikrobielle Kontamination von Produkten ist im wesentlichen für ihre Verschiffung auf dem Gebiet der Lebensmittelhygiene notwendig. Die Überprüfung wurde konventionell durch das Gusskulturverfahren durchgeführt, das eine Zeitspanne von ein bis mehreren Tagen benötigt, so dass die Produkte in einem Warenhaus gelagert werden müssen, bis die Produkte durch den Test als sicher bezeichnet wurden. Dies löst nicht nur ein Problem im Hinblick auf eine logistische Effizienz aus, jedoch auch ein erhöhtes Risiko einer mikrobiellen Kontamination in Nahrungsmittelprodukten, wie z. B. Milch, aufgrund der verlängerten Lagerungszeit. Zusätzlich liegen Mikroorganismen, die für die Kontamination von Nahrungsmitteln von Bedeutung sind, im allgemeinen auf einem niedrigen Niveau vor, so dass ein Test mit hoher Empfindlichkeit benötigt wird.
  • Das Verfahren zur Messung des Niveaus an Mikroorganismen, das den Anforderungen, die oben beschrieben werden, entspricht, beinhaltet das Biolumineszenzverfahren zur Messung von ATP, das in allen lebensfähigen Mikroorganismen vorliegt. Hier handelt es sich um ein Verfahren zur Messung von Zellen, bei dem eine Probe, die die Zellen enthält, in Kontakt mit einem Extraktionsreagenz gebracht wird, das Tenside, Trichloressigsäure (TCA), einen Tris-Puffer, Ethanol oder ein lytisches Enzym enthält, um das intrazelluläre ATP aus den Zellen freizusetzen, das Kontaktieren des ATP mit einem Lumineszenzreagenz, das Luziferin als Substrat der Lumineszenz bei einem Leuchtkäfer enthält und das Enzym Luziferase zur Erzeugung der Biolumineszenz als Ergebnis der Enzymreaktion von Luziferin, Luziferase und ATP und Messung der Menge der erzeugten Lumineszenz für die Bestimmung von intrazellulärem ATP.
  • Das ATP liegt jedoch ursprünglich in variierenden Mengen in allen biologischen Zellen vor, einschließlich nicht nur der Mikroorganismen, sondern auch einzelliger Organismen wie auch tierischen und pflanzlichen Geweben, wo es in den sogenannten somatischen Zellen vorliegt. Weiterhin liegt ATP auch in freier Form in der Umgebung der biologischen Zellen vor.
  • Daher wird ATP, selbst wenn es beabsichtigt ist, nur das ATP nachzuweisen, das in bestimmten biologischen Zellen einer Probe, die biologische Zellen enthält, nachzuweisen, in den biologischen Zellen zusammen mit freiem ATP in der Nachbarschaft der biologischen Zellen nachgewiesen. Anders ausgedrückt wird das freie ATP, wobei es sich nicht um das oben beschriebene ATP in den biologischen Zellen handelt, als Hintergrundlumineszenzniveau (Basispegel) zusammen mit dem ATP in biologischen Zellen gemessen und auf diese Weise hat die Messung den Nachteil einer Erniedrigung der Detektionsempfindlichkeit von ATP, selbst wenn das ATP als Index für die Messung der biologischen Zellen verwendet werden soll.
  • Als Verfahren zur Eliminierung von freiem ATP werden zur Zeit verschiedene Verfahren verwendet, einschließlich dem Membranfilterverfahren, worin ATP aus der Probe durch einen Membranfilter eliminiert wird, dem Zentrifugationsverfahren, worin es durch Zentrifugation eliminiert wird, einem Verfahren zur Eliminierung von ATP mit einem Enzym, wie z. B. Apyrase, Adenosintriphosphatase (ATPase), Hexokinase oder ATP-Pyrophosphatase (hiernach als enzymatisches Verfahren bezeichnet) (Monthly Food Chemical, SHOKUHIN KAGAKU SHINBUNSHA, Mai 1995, Seiten 55–63; Japanische Patentveröffentlichung Nr. 65800/1990; USP 5,316,907; Analitical Biochemistry, 218, 20–25, 1994; Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, 52 (9), 1695, 1986; PROC. N.A.S. Band 52, 1580–1586, 1964; PCT WO 94/28169 und Marine Ecology-Progress Series, 13, 305–309, 1983).
  • Das Membranfilterverfahren hat jedoch den Nachteil, dass es im Hinblick auf seinen Arbeitsablauf kompliziert ist, im Hinblick auf seine Filtrationsfähigkeit unterlegen und unzureichend im Hinblick auf die ATP eliminierende Wirkung.
  • Das Zentrifugationsverfahren weist ebenfalls den Nachteil auf, dass es im Hinblick auf die Arbeitsschritte kompliziert ist und dass feste Komponenten in den Proben sedimentiert und zusammen mit den Bakterien abgetrennt werden, so dass eine Messung mit hoher Präzision nicht realisiert werden kann.
  • Weiterhin weist das enzymatische Verfahren auch den Nachteil auf, dass es schwierig ist, den Hintergrund aufgrund der Probe zu erniedrigen und dass die ATP-eliminierenden Wirkungen auf einem unzufriedenstellenden Niveau verbleiben.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Hintergrund-ATP-Eliminators zur Messung der biologischen Zellen mit hoher Präzision durch ein Verfahren zur Eliminierung von ATP in Kombination mit dem Biolumineszenzverfahren.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 illustriert eine Kalibrierungskurve von ATP mit einem Luminometer „Lumat LB9501", hergestellt von Berthold.
  • 2 illustriert die Beziehung zwischen der Zeitspanne der Enzymreaktion und der Konzentration von ATP, verbleibend nach der Reaktion bei dem Verfahren zur Eliminierung von ATP mit einem Enzym.
  • Figure 00050001
  • 3 illustriert die Beziehung zwischen der Aktivität von Adenosinphosphatdeaminase und der Konzentration von ATP, verbleibend nach der Reaktion in dem Verfahren zum eliminieren von ATP mit Adenosinphosphatdeaminase in Kombination mit Apyrase.
  • 4 illustriert die Beziehung zwischen der Aktivität von Adenosinphosphatdeaminase und dem Verhältnis von bleibendem ATP bei dem Verfahren zum Eliminieren von ATP mit Adenosinphosphatdeaminase in Kombination mit Apyrase.
  • 5 illustriert die Beziehung zwischen der Aktivität von Apyrase und der Konzentration von ATP, verbleibend nach der Reaktion bei dem Verfahren zum Eliminieren von ATP mit Adenosinphosphatdeaminase in Kombination mit Apyrase.
  • 6 illustriert die Beziehung zwischen der Aktivität von Apyrase und dem Verhältnis von verbleibendem ATP bei dem Verfahren zum Eliminieren von ATP mit Adenosinphosphatdeaminase in Kombination mit Apyrase.
  • 7 illustriert das Verhältnis von Rest-ATP mit dem Zeitverlauf in der Reaktion durch Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von Standard-ATP in Gegenwart von Adenosinphosphatdeaminase in Kombination mit Apyrase.
  • 8 illustriert das Verhältnis zwischen dem pH bei der Enzymreaktion und dem Verhältnis von Rest-ATP nach der Reaktion bei dem Verfahren zum Eliminieren von ATP mit Adenosinphosphatdeaminase in Kombination mit Apyrase.
  • 9 illustriert die Beziehung zwischen den Temperaturen bei der Enzymreaktion und dem Verhältnis des Rest-ATP nach der Reaktion bei dem Verfahren zum Elimieren von ATP mit Adenosinphosphatdeaminase in Kombination mit Apyrase.
  • 10 illustriert die Kalibrierungskurve von ATP mit einem Luminometer „Lumitester-K-100", hergestellt von Kikkoman.
  • 11 illustriert die Beziehung zwischen den Konzentrationen von ATP, abgeleitet von Mikroorganismen gemäß der vorliegenden Erfindung und der Zahl von Zellen, erhalten durch das Gusskulturverfahren.
  • 12 illustriert das Ergebnis der quantitativen Bestimmung von Bacillus subtilis in Koji für Sojasosse, kontaminiert mit B. subtilis.
  • 13 illustriert das Ergebnis einer quantitativen Bestimmung von Milchsäurebakterien in Koji für Sojasosse, kontaminiert mit den Milchsäurebakterien.
  • 14 illustriert das Ergebnis der quantitativen Bestimmung von verschiedenen Keimen in Materialien, die mit Koji für Sojasosse, kontaminiert mit den verschiedenen Keimen, beladen wurden.
  • 15 illustriert die Beziehung zwischen der Reaktionszeit und der Konzentration von ATP bei der Eliminierung von freiem ATP in verdünnten Suspensionen von Tomatenketchup, kontaminiert mit Hefe, durch die Zugabe von Adenosinphosphatdeaminase in Kombination mit Apyrase.
  • 16 illustriert die Beziehung zwischen der Reaktionszeit und der Konzentration von ATP bei der Eliminierung von freiem ATP in verdünnten Suspensionen von Apfelsäften, kontaminiert mit Hefe durch Zugabe von Adenosinphosphatdeaminase in Kombination mit Apyrase.
  • 17 illustriert die Beziehung zwischen der Reaktionszeit und der Konzentration von ATP bei der Eliminierung von freiem ATP in verdünnten Suspensionen von Bohnenquark, kontaminiert mit verschiedenen Keimen durch Zugabe von Adenosinphosphatdeaminase in Kombination mit Apyrase.
  • 18 illustriert die Beziehung zwischen der Reaktionszeit und der Konzentration von ATP bei der Eliminierung von freiem ATP in verdünnten Suspensionen von gekochtem Krebsbeinfleisch-ähnlichen Fischpasten, kontaminiert mit verschiedenen Keimen durch Zugabe von Adenosinphosphatdeaminase in Kombination mit Apyrase.
  • 19 illustriert die Beziehung zwischen der Reaktionszeit und der Konzentration von ATP bei der Eliminierung von freiem ATP in verdünnten Suspensionen von gekochtem Reis, kontaminiert mit verschiedenen Keimen durch Zugabe von Adenosinphosphatdeaminase in Kombination mit Apyrase.
  • 20 illustriert die Korrelation zwischen dem logarithmischen Niveau von ATP verschiedener Keime pro ml der verdünnten Suspensionen von gekochtem Reis (mol/ml) und die logarithmische Zahl verschiedener Keimzellen pro g des gekochten Reis (log KBE/g), erhalten durch das Gusskulturverfahren.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die gegenwärtigen Erfinder haben in ernsthafter Weise eine Untersuchung durchgeführt, um die vorstehenden Probleme zu lösen. Im Ergebnis haben sie festgestellt, dass ATP, das in einer Probe enthalten ist, auf ein minimales Niveau eliminiert werden kann, indem Adenosinphosphatdeaminase in Kombination mit mindestens einem der Folgenden verwendet wird, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Apyrase, alkalischer Phosphatase, saurer Phosphatase, Hexokinase und Adenosintriphosphatase.
  • Sie haben weiterhin ebenfalls festgestellt, dass die Kombination des ATP-Eliminierungsverfahrens und des Biolumineszenzverfahrens genau die Bestimmung der biologischen Zellen durch Eliminieren von freiem ATP, das nicht in den biologischen Zellen vorliegt, realisiert werden kann, um einen Einfluß aufgrund des Hintergrundlumineszenzniveaus (Basislinie) zu entfernen und nur das ATP zu messen, das in den biologischen Zellen enthalten ist.
  • Anders ausgedrückt, ist (1) die vorliegende Erfindung ein Hintergrund-ATP-Eliminator in einem ATP-Biolumineszenzverfahren, der folgendes umfaßt, enthaltend mindestens ein Mitglied, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Apyrase, alkalischer Phosphatase, saurer Phosphatase, Hexokinase und Adenosintriphosphatase und Adenosinphosphatdeaminase als effektive Bestandteile; (2) ist die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Messen biologischer Zellen, das das Eliminieren von freiem ATP in einer Probe umfaßt, enthaltend die biologischen Zellen durch Behandlung der Zellen mit Adenosinphosphatdeaminase und dann Messen von ATP in den biologischen Zellen durch das Biolumineszenzverfahren und (3) ist die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Messen biologischer Zellen, das das Eliminieren von freiem ATP in einer Probe umfaßt, enthaltend die biologischen Zellen, durch Behandlung der Zellen mit mindestens einem Mitglied, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Apyrase, alkalischer Phosphatase, saurer Phosphatase, Hexokinase und Adenosintriphosphatase und Adenosinphosphatdeaminase und dann Messung von ATP in den biologischen Zellen durch das Biolumineszenzverfahren.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail unten beschrieben.
  • Die hier verwendete Adenosinphosphatdeaminase ist ein Enzym, das auch als Adeninnukleotiddeaminase bezeichnet wird. Weiterhin ist das Enzym registriert als „Enzyme Classification (hiernach bezeichnet als E.C.) E.C.3.5.4.17".
  • Dieses Enzym ist eins zur Katalyse einer Deaminierungsreaktion, das anders als die AMP-Deaminase (E.C.3.5.4.6), die spezifisch auf AMP wirkt oder die Adenosindeaminase (E.C.3.5.4.4), die spezifisch auf Adenosin wirkt, auf eine breite Vielzahl von Substraten wirkt, wie z. B. ATP, Adenosindiphosphat (hiernach bezeichnet als ADP), Adenosinmonophosphat (hiernach bezeichnet als AMP), Adenosin und cyclisches AMP, unabhängig von den Phosphatgruppen.
  • Dieses Enzym katalysiert die Herstellung von Inosintriphosphat (hiernach bezeichnet als ITP) bei der Verwendung von ATP als Substrat, Inosindiphosphat (hiernach bezeichnet als IDP) bei der Verwendung von ADP als Substrat und Inosinmonophosphat (hiernach bezeichnet als IMP) bei der Verwendung von AMP als Substrat (siehe Shiro Akahori „ENZYME HANDBOOK", Asakura Shoten, Dez. 1, 1982, Seite 611; Shigeaki Baba et al., Ed., „CLINICAL HANDBOOK", Kodansha, Sep. 10, 1982, Seite 55; The Journal of General and Applied Microbiology, 13, 335–347, 1967) und Agricultural and Biological Chemistry, 29 (6), 508–514, 1965).
  • Es wurde festgestellt, dass die ATP-Deaminase (E.C.3.5.4.18) eine ähnliche Substratspezifität wie die Adenosinphosphatdeaminase aufweist (siehe „ENZYME HANDBOOK", ditto, Seite 611 und The Journal of Biochemistry, 61 (1), 1–9, 1967).
  • Auf diese Weise betrifft die Bezeichnung Adenosinphosphatdeaminase hier die Adenosinphosphatdeaminase und die ATP-Deaminase.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Apyrase (E.C.3.6.1.5) ist ein Enzym, das die Dephosphorylierung von ATP, ADP, ITP und EDP (siehe „ENZYME HANDBOOK", ditto, Seite 617) katalysiert.
  • Die Adenosintriphosphatase E.C.3.6.1.3) ist ein Enzym, das die Dephosphorylierung von ATP katalysiert (sehe „ENZYME HANDBOOK", ditto, Seite 616).
  • Die Hexokinase (E.C.2.7.1.1) ist ein Enzym, das die Erzeugung von D-Hexose-6-phosphat durch Neuanordnung des Phosphatbestandteils in Adenosintriphosphat zu D-Hexose katalysiert (siehe „ENZYME HANDBOOK", ditto, Seite 330).
  • Die Phosphatase ist ein Enzym, einschließlich der sauren Phosphatase (E.C.3.1.3.2) und der alkalischen Phosphatase (E.C.3.1.3.1) und katalysiert die Dephosphorylierung (siehe „ENZYME HANDBOOK", ditto, Seiten 434 bis 435).
  • Die 5'-Nucleotidase (E.C.3.1.3.5) ist ein Enzym, das die Hydrolyse von 5'-Ribonukleotid oder 5'-Deoxyribonukleotid zum Erhalt von Nukleotid und Phosphat katalysiert (siehe „ENZYME HANDBOOK", ditto, Seite 436).
  • Die vorliegende Erfindung kann durch Zugabe zu einer Probe, enthaltend ATP-Adenosinphosphatdeaminase in Kombination mit mindestens einem Enzym, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Apyrase, alkalischer Phosphatase, saurer Phosphatase, Hexokinase und Adenosintriphosphatase durchgeführt werden.
  • Der in der vorliegenden Erfindung verwendete ATP-Eliminator beinhaltet einen, der die Adenosinphosphatdeaminase als effektiven Bestandteil umfaßt und mindestens ein Enzym, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Apyrase, alkalischer Phosphatase, saurer Phosphatase, Hexokinase und Adenosintriphosphatase als effektive Bestandteile.
  • Das Verfahren zur Messung biologischer Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch Vermischen einer Probe, enthaltend biologische Zellen, wie z. B. Bakterien, z. B. E. coli, mikrobielle Zellen der Hefe, Milchsäurebakterien und ähnliches und tierische und pflanzliche Zellen mit Adenosinphosphatdeaminase allein oder in Kombination mit mindestens einem Enzym, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Apyrase, alkalischer Phosphatase, saurer Phosphatase, Hexokinase und Adenosintriphosphatase, zum Eliminieren von freiem ATP in der Probe und dann Messung der Konzentration von ATP in den biologischen Zellen durch das Biolumineszenzverfahren durchgeführt.
  • Spezifische Beispiele der Proben, enthaltend die vorstehenden biologischen Zellen, beinhalten Proben, enthaltend irgendwelche biologischen Zellen bei der Messung des Endpunkts der mikrobiellen Mortalität in der Lebensmittel- und Getränke-Herstellungs-Industrie, der klinischen Testindustrie, der pharmazeutischen Industrie, der Abwasser-Behandlungsindustrie, den mikrobiellen Tests, den antibakteriellen Tests, den Resistenztests, der Messung von MIC und hygienischen Tests durch das Ausstrichverfahren.
  • Proben, enthaltend biologische Zellen in Lebensmitteln und Getränken, beinhalten Lebensmittel- und Getränkeprodukte. Spezifische Beispiele beinhalten Pasten aus Fischereiprodukten und Tierhaltungsprodukte, wie z. B. Schinken; Getränke, wie z. B. Apfelsaft, Tomatensaft und Milch; verarbeitete Produkte von Pflanzenproteinen, wie z. B. Bohnenquark; verarbeitete Produkte aus Früchten und Gemüsen, wie z. B. Tomatenketchup; gebraute Produkte, wie z. B. Sojasosse, Bohnenpaste, Reiswein, Wein und Essig; Gewürzsossen, wie z. B. Worcestersosse, eine Sosse, die Sojasosse und Essig enthält, Sossen, Brühen und Dressings; süße Brote; Nudeln, wie z. B. Udon und Buchweizennudeln (buckwheat noodles); verarbeitete Produkte aus Getreide, wie z. B. gekochter Reis und mikrobielle Kulturprodukte und Verarbeitungsprodukte davon, wie z. B. die Sojasosse Koji und Hefeextrakt.
  • Die Proben in Form einer Flüssigkeit werden in einer bestimmten Menge entnommen und direkt für die Messung verwendet, während diejenigen in Form eines Feststoffs in bestimmter Menge genommen werden, mit sterilem destilliertem Wasser vermischt und in einer Mühle, einer Knetmaschine oder einer Mahlvorrichtung (stomacher) homogenisiert wird.
  • Alternativ wird die Mischung kräftig kontaktgerührt und der flüssige Anteil wird als Probe für die Messung gewonnen.
  • Die Adenosinphosphatdeaminase wird der Probe, die die biologischen Zellen enthält, vorzugsweise in einer endgültigen Konzentration von 0,001 U/ml oder mehr, insbesondere 0,01 bis 0,1 U/ml zugefügt.
  • Die Apyrase wird vorzugsweise in einer endgültigen Konzentration von 0,001 U/ml oder mehr, insbesondere 0,01 bis 0,2 U/ml zugefügt.
  • Jede der alkalischen Phosphatase, sauren Phosphatase, Hexokinase und Adenosintriphosphatase wird vorzugsweise der Probe in einer endgültigen Konzentration von 0,001 U/ml oder mehr, insbesondere 0,01 bis 50 U/ml zugefügt.
  • Die Enzymreaktion wird vorzugsweise bei einem pH im schwach sauren bis schwach alkalischen Bereich durchgeführt.
  • Wenn die Adenosinphosphatdeaminase z. B. ein allein oder in Kombination mit Apyrase verwendet wird, wird die Reaktion vorzugsweise bei einem pH im Bereich von 5,0 bis 8,0 durchgeführt.
  • Die Probe wird mit einem Phosphatpuffer, einem HEPES-Puffer oder einem MES-Puffer auf einen gewünschten pH eingestellt.
  • Die Enzymreaktionszeit, die in einem gewissen Ausmaß von den Arten und Eigenschaften der Probe, die die biologischen Zellen enthalten, den pH-Werten der Reaktion, den Konzentrationen der zugefügten Enzyme und den Reaktionstemperaturen abhängt, liegt vorzugsweise bei ungefähr 2 Stunden, insbesondere 1 bis 30 Minuten. Wenn die Reaktion exzessiv lang fortgeführt wird, können die biologischen Zellen nicht präzise gezählt werden und die Präzision und Verlässlichkeit der Messungen wird aufgrund der Proliferation der Mikroorganismen während der Reaktion, die in der Probe enthalten sind, nachteilig beeinflusst.
  • Die Enzymreaktion wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 30 bis 50°C, insbesondere 40 bis 45°C durchgeführt. Wenn nur ATP eliminiert werden soll, wird die Reaktion vorzugsweise in dem oben beschriebenen Temperaturbereich durchgeführt. Wenn die Reaktion jedoch für eine Probe, enthaltend biologische Zellen, durchgeführt wird, wird es bevorzugt, die Reaktion in einem Temperaturbereich durchzuführen, in dem die Zellen nicht ausgelöscht werden, d. h. von Raumtemperatur bis 40°C, um ein Risiko des Auslöschens der biologischen Zellen bei exzessiv hoher Temperatur zu vermeiden.
  • Das Reagenz zur Messung biologischer Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung wird in derartiger Weise hergestellt, dass die endgültige Konzentration der Adenosinphosphatdeaminase allein oder in Kombination mit mindestens einem Enzym, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Apyrase, alkalischer Phosphatase, saurer Phosphatase, Hexokinase und Adenosintriphosphatase, in der Reaktionslösung in einem Bereich von Konzentrationen der folgenden effektiven Bestandteile liegt.
  • Die bevorzugten Konzentrationen der in Kombination verwendeten Enzyme sind die folgenden:
    Adenosinphosphatdeaminase: mit einer endgültigen Konzentration von 0,001 U/ml oder mehr, insbesondere 0,01 bis 0,1 U/ml;
    Apyrase: mit einer endgültigen Konzentration von 0,001 U/ml oder mehr, insbesondere 0,01 bis 0,2 U/ml;
    alkalische Phosphatase: mit einer endgültigen Konzentration von 0, 001 U/ml oder mehr, insbesondere 0,01 bis 50 U/ml;
    saure Phosphatase: mit einer endgültigen Konzentration von 0,001 U/ml oder mehr, insbesondere 0,01 bis 50 U/ml;
    Hexokinase: mit einer endgültigen Konzentration von 0,001 U/ml oder mehr, insbesondere 0,01 bis 50 U/ml;
    Adenosintriphosphatase: mit einer endgültigen Konzentration von 0,001 U/ml oder mehr, insbesondere 0,01 bis 50 U/ml.
  • Die Kalibrierungskurve des in den Beispielen verwendeten ATP wurde durch das folgende Verfahren hergestellt.
  • Die Messung von ATP wird durch Zugabe eines Luziferin-Luziferase-haltigen Lumineszenzreagenz zu einer ATP-haltigen Probe und quantitative Bestimmung der Menge der freigesetzten Biolumineszenz durchgeführt.
  • Das Reagenzkit zur Messung von ATP als eine Lumineszenzmenge mit dem Luziferin-Luziferase-haltigen Lumineszenzreagenz und die Vorrichtung zur Messung der Lumineszenzmenge sind kommerziell erhältlich und die vorliegende Erfindung kann mit dem kommerziell erhältlichen Kit und der Vorrichtung zur Messung von ATP, enthalten in einem betroffenen Mikroorganismus, als Lumineszenzmenge durchgeführt werden.
  • Ein Beispiel für ein Luziferin-Luziferase-haltiges Lumineszenzreagenz (Reagenz zur Messung von ATP) wird illustrativ unten dargestellt (siehe BUNSEKI KAGAKU, 44 (10), 845–851, teilweise 846 (1995)).
    10 mM Magnesiumsulfat (Mg-Ion),
    0,30 mM D-Luziferin (Lumineszenzmaterial),
    1,0 mM EDTA (Stabilisator),
    1,0 mM Dithiothreitol (Stabilisator),
    0,51 mg/ml Luziferase (von dem Genji Leuchtkäfer) (Lumineszenzenzym),
    0,2% Schweine-Serum-Albumin (BSA) (Stabilisator), in 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,8).
  • Die beispielhafte Herstellung der Kalibrierungskurve von ATP mit einem Luminometer „Lumat LB9501", hergestellt von Berthold, wird unten beschrieben.
  • Hochreines Wasser (100 μl) wurde zu 100 μl einer ATP-Standardlösung mit einer bekannten Konzentration zugefügt, gefolgt von 100 μl eines Luziferin-Luziferasehaltigen Lumineszenzreagenz (hiernach als Lumineszenzreagenz bezeichnet), um die relativen Lichteinheiten S durch Messung der Lumineszenz nach einem Warten für eine Sekunde vor Integration über 3 Sekunden mit dem Luminometer LB9501 zu schätzen.
  • Zum selben Zeitpunkt wurden 100 μl eines Luziferin-Luziferase-haltigen Lumineszenzreagenzes (hiernach bezeichnet als Lumineszenzreagenz) zu 200 μl hochreinem Wasser zugefügt, um die Messung der Lumineszenz zum Schätzen der Lumineszenzmenge R in derselben Weise wie oben durchzuführen und die Messung R wurde als Leerprobe verwendet.
  • Die Differenz S–R ergibt die Nettomenge der Lumineszenz von ATP (Z) und eine Kalibrierungskurve von ATP wurde hergestellt, indem die Y-Achse der Koordinaten als Nettomenge der Lumineszenz Z und die X-Achse als ATP-Konzentration (M = mol/l) wie dargestellt in 1, angeordnet wurden.
  • Als nächstes werden die in den Beispielen der vorliegenden Erfindung verwendeten Enzyme und das Verfahren zur Messung ihrer Enzymaktivitäten unten dargestellt.
  • Zu verwendende Enzymlösungen
  • (a) Adenosinphosphatdeaminase (abgeleitet von der Gattung Aspergillus), 5 U/ml
  • Verfahren zur Messung der Aktivität: ATP wurde zu einem EDTA-haltigen 100 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,0 zugefügt, um eine 80 μM ATP-Lösung zu erhalten, die als Substratlösung verwendet wurde. Ein 100 μl Anteil einer Enzymlösung wurde zu 3 ml der Substratlösung zum Starten der Reaktion bei 30°C für 30 Minuten zugefügt. Ein 100 μl Anteil einer 60%igen Perchlorsäure wurde der Mischung zum Beenden der Reaktion zugefügt und die optische Dichte (OD) der Mischung wurde bei 265 nm gemessen.
  • Die Menge des Enzyms, die die Variation einer OD von 2,4 pro Minute katalysiert, wurde als eine Einheit (U) betrachtet.
  • (b) Apyrase Grad VIII (aus der Kartoffel) (Sigma), 5 U/ml Verfahren zur Messung der Aktivität: die Menge des
  • Enzyms, die die Freisetzung von 1,0 μmol anorganischer Phosphorsäure aus ATP pro Minute unter einer Bedingung von pH 5 und 30°C katalysierte, wurde als eine Einheit betrachtet.
  • (c) Saurer Phosphatase Typ VII (von der weißen Kartoffel) (Sigma) 250 U/ml
  • Verfahren zur Messung der Aktivität: die Menge des Enzyms, die die Hydrolyse von 1,0 μmol p-Nitrophenylphosphat pro Minute unter einer Bedingung von pH 4,8 und 37°C katalysierte, wurde als eine Einheit betrachtet.
  • (d) Adenosindeaminase Typ V (von Rindermilz) (Sigma) 250 U/ml
  • Verfahren zur Messung der Aktivität: die Menge des Enzyms, die die Deaminierung von 1,0 μmol Adenosin zur Bildung von Inosin pro Minute unter der Bedingung von pH 7,5 und 25°C katalysierte, wurde als eine Einheit betrachtet.
  • (e) 5'-Nukleotidase (von Crotalus adamanteus Gift) (Sigma) 250 U/ml
  • Verfahren zur Messung der Aktivität: die Menge des Enzyms, die die Hydrolyse von Adenosin-5'-monophosphat bei pH 9,0 und 37°C zur Freisetzung von 1,0 μmol anorganischer Phosphorsäure pro Minute katalysierte, wurde als eine Einheit angesehen.
  • (f) AMP-Deaminase (aus Kaninchenmuskel) (Sigma) 25,5 U/ml
  • Verfahren zur Messung der Aktivität: die Menge des Enzyms, die die Deaminierung von 1,0 μmol 5'-Adenosinmonophosphat pro Minute unter einer Bedingung von pH 6,5 und 25°C katalysierte, wurde als eine Einheit angesehen.
  • (g) Adenosintriphosphatase (aus cerebralem Cortex des Schweins) (Sigma) 5 U/ml
  • Verfahren zur Messung der Aktivität: die Menge des Enzyms, die die Freisetzung von 1,0 μmol anorganischer Phosphorsäure aus ATP pro Minute in Gegenwart von Na+, K+ und Mg2+ unter einer Bedingung eines pH's von 7,8 und 37°C katalysierte, wurde als eine Einheit angesehen.
  • (h) Alkalische Phosphatase (aus der Intestinalmucosa von Rindern) (Sigma) 250 U/ml
  • Verfahren zur Messung der Aktivität: die Menge des Enzyms, die die Hydrolyse von 1,0 μmol p-Nitrophenylphosphat pro Minute unter der Bedingung eines pH's von 9,8 und 37°C katalysiert, wurde als eine Einheit angesehen.
  • (i) Hexokinase (aus Hefe) (Boehringer Mannheim) 50 U/ml
  • Verfahren zur Messung der Aktivität: die Menge des Enzyms, die die Wiederanordnung von 1,0 μmol Phosphat in ATP zu Glucose pro Minute unter einer Bedingung eines pH's von 7,6 und 25°C katalysiert, wurde als eine Einheit angesehen.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail im Hinblick auf die Beispiele beschrieben.
  • Beispiel 1
  • Ein Beispiel zum Eliminieren von ATP durch Vermischen von Hefeextrakt, enthaltend ATP, mit Adenosindeaminase allein oder in Kombination mit mindestens einem der folgenden Enzyme, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Apyrase, alkalischer Phosphatase, saurer Phosphatase, Hexokinase und Adenosintriphosphatase.
  • Hefeextraktpulver (1 g) (Difco) wurde in 100 ml eines 20 mM HEPES-Puffers (pH 6,8) zur Herstellung eines eigen (G/V) Hefeextrakts gelöst (pH 6,8).
  • Diese Lösung, die durch Filtration durch einen Membranfilter (MILLEX-GS, Porengröße: 0,22 μm, Millipore) sterilisiert worden war, wurde als Probenlösung verwendet, die auf 19 5 ml Anteile verteilt wurde und
    zu dem ersten Anteil (Kontrolle) wurden 50 μl hochreines Wasser zugefügt,
    zu dem zweiten Teil (die vorliegende Erfindung 1) wurden 50 μl einer Adenosinphosphatdeaminase-Enzymlösung zugefügt (endgültige Konzentration 0,05 U/ml),
    zu dem dritten Anteil (die vorliegende Erfindung 2) wurden 50 μl einer Adenosinphosphatdeaminase-Enzymlösung und 50 μl einer Apyrase-Enzymlösung (endgültige Konzentration jeweils 0,05 U/ml) zugefügt,
    zu dem vierten Anteil (die vorliegende Erfindung 3) wurden 50 μl einer Adenosinphosphatdeaminase-Enzymlösung, 50 μl einer Apyrase-Enzymlösung und 50 μl einer sauren Phosphatase-Enzymlösung (endgültige Konzentration jeweils 0,05 U/ml, 0,05 U/ml und 2,5 U/ml) zugefügt,
    zu dem fünften Anteil (die vorliegende Erfindung 4) wurden 50 μl einer Adenosinphosphatdeaminase-Enzymlösung, 50 μl einer Adenosintriphosphatase-Enzymlösung (endgültige Konzentration jeweils 0,05 U/ml) zugefügt,
    zu dem sechsten Anteil (die vorliegende Erfindung 5) wurden 50 μl einer Adenosinphosphatdeaminase-Enzymlösung und 50 μl einer Hexokinase-Enzymlösung (endgültige Konzentration jeweils 0,05 U/ml und 0,5 U/ml) zugefügt,
    zu dem siebenten Anteil (die vorliegende Erfindung 6) wurden 50 μl einer Adenosinphosphatdeaminase-Enzymlösung und 50 μl einer alkalischen Phosphatase-Enzymlösung (endgültige Konzentration jeweils 0,05 U/ml und 2,5 U/ml) zugefügt,
    zu dem achten Anteil (die vorliegende Erfindung 7) wurden 50 μl einer Adenosinphosphatdeaminase-Enzymlösung und 50 μl einer sauren Phosphatase-Enzymlösung (endgültige Konzentration jeweils 0,05 U/ml und 2,5 U/ml) zugefügt,
    zu dem neunten Anteil (Vergleichsbeispiel 1) wurden 50 μl Apyrase-Enzymlösung (endgültige Konzentration 0,05 U/ml) zugefügt,
    zu dem zehnten Anteil (Vergleichsbeispiel 2) wurden 100 μl Apyrase-Enzymlösung (endgültige Konzentration 0,10 U/ml) zugefügt,
    zu dem elften Anteil (Vergleichsbeispiel 3) wurden 50 μl Apyrase-Enzymlösung und 50 μl 5'-Nukleotidase-Enzymlösung (endgültige Konzentration jeweils 0,05 U/ml und 2,5 U/ml) zugefügt,
    zu dem zwölften Anteil (Vergleichsbeispiel 4) wurden 50 μl Apyrase-Enzymlösung, 50 μl 5'-Nukleotidase-Enzymlösung und 50 μl Adenosindeaminase-Enzymlösung (endgültige Konzentration jeweils 0,05 U/ml, 2,5 U/ml und 2,5 U/ml) zugefügt,
    zu dem dreizehnten Anteil (Vergleichsbeispiel 5) wurden 50 μl Apyrase-Enzymlösung und 50 μl saure Phosphatase-Enzymlösung (endgültige Konzentration jeweils 0,05 U/ml und 2,5 U/ml) zugefügt,
    zu dem vierzehnten Anteil (Vergleichsbeispiel 6) wurden 50 μl Apyrase-Enzymlösung, 50 μl saure Phosphatase-Enzymlösung und 50 μl Adenosinphosphatdeaminase-Enzymlösung (endgültige Konzentration jeweils 0,05 U/ml, 2,5 U/ml und 2,5 U/ml) zugefügt,
    zu dem fünfzehnten Anteil (Vergleichsbeispiel 7) wurden 50 μl Apyrase-Enzymlösung und 50 μl AMP-Deaminase-Enzymlösung (endgültige Konzentration jeweils 0,05 U/ml und 0,255 U/ml) zugefügt,
    zu dem sechzehnten Anteil (Vergleichsbeispiel 8) wurden 50 μl Adenosintriphosphatase-Enzymlösung (endgültige Konzentration 0,05 U/ml) zugefügt,
    zu dem siebzehnten Anteil (Vergleichsbeispiel 9) wurden 50 μl Hexokinase-Enzymlösung (endgültige Konzentration 0,5 U/ml) zugefügt,
    zu dem achzehnten Anteil (Vergleichsbeispiel 10) wurden 50 μl alkalische Phosphatase-Enzymlösung (endgültige Konzentration 2,5 U/ml) zugefügt und
    zu dem neunzehnten Anteil (Vergleichsbeispiel 11) wurden 50 μl saure Phosphatase-Enzymlösung (endgültige Konzentration 2,5 U/ml) zugefügt.
  • Jede der Mischungen wurde einer Reaktion bei 30°C unterzogen und Anteile wurden mit Zeitablauf entnommen, um die Lumineszenz zu messen.
  • Verfahren zur Messung der Lumineszenz
  • Hochreines Wasser (100 μl) wurden zu 100 μl der entnommenen Probe zugefügt, gefolgt von 100 μl eines Luziferin-Luziferase-haltigen Lumineszenzreagenzes (hiernach bezeichnet als Lumineszenzreagenz) um die relative Lumineszenzmenge S durch Messung der Lumineszenz zu schätzen, mit einem Warten für eine Sekunde vor der Integration für 3 Sekunden mit dem Luminometer LB9501.
  • Zur selben Zeit wurde eine Lumineszenzmenge in derselben Weise wie oben beschrieben gemessen, außer dass „100 μl hochreines Wasser" anstelle der „entnommenen Probe" verwendet wurde und die Messung wurde als Leerprobe R des Lumineszenzreagenzes verwendet.
  • Die Differenz S–R ergibt die Nettomenge der Lumineszenz A.
  • Die Luziferin-Luziferase-Lumineszenzreaktion wird etwas durch die Bestandteile in der Probe inhibiert und die Menge der Lumineszenz A, die erhalten wird, ist nur ein anscheinender Wert. Die Menge der Lumineszenz A sollte wie folgt korrigiert werden.
  • Das heißt, der Lumineszenz-Koeffizient K wird gemäß der vorliegenden Gleichung erhalten und die Menge der Lumineszenz A wird durch den Lumineszenz-Koeffizienten K geteilt um den korrigierten Wert Y (Nettomenge der Lumineszenz) zu erhalten. Als nächstes wird die Nettokonzentration von ATP unter Verwendung der Kalibrierungskurve der Konzentration von ATP, korrespondierend zu den korrigierten Werten Y erhalten, die vorher hergestellt wurde (1). (Die korrigierten Mengen der Lumineszenz in den unten beschriebenen Bespielen wurden ebenfalls in derselben Weise wie oben erhalten.)
  • Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
  • Verfahren zur Berechnung der korrigierten Menge der Lumineszenz
  • Y (korrigierter Wert der Lumineszenz) = A (anscheinender Wert)/K (Lumineszenz-Koeffizient),
  • K (Lumineszenz-Koeffizient) = [H (interner Standardwert) – A (anscheinender Wert)]/G (tatsächlicher Standardwert),
  • H: ein Wert, der durch Messung der Lumineszenz erhalten wird, durch Zugabe zu jeweils einem 100 μl Anteil von jeder der entnommenen Proben über Zeitablauf von 100 μl einer ATP-Standardlösung (2 × 10-9 mol/l (hiernach bezeichnet als M)), gefolgt von 100 μl des Luziferin-Luziferase-haltigen Lumineszenzreagenzes (interner Standardwert);
  • A: ein wert, der durch Messung der Lumineszenz erhalten wird, durch Zugabe zu jeweils einem 100 μl Anteil von jeder der entnommenen Proben von 100 μl superreines Wasser, gefolgt von 100 μl des Luziferin-Luziferase-haltigen Lumineszenzreagenzes (anscheinender Wert);
  • G: ein Wert, erhalten durch Messung der Lumineszenz durch Zugabe zu 100 μl hochreinem Wasser von 100 μl der ATP-Standardlösung (2 × 10-9 M), gefolgt von 100 μl des Luziferin-Luziferase-haltigen Lumineszenzreagenzes (tatsächlicher Standardwert);
  • K: Lumineszenz-Koeffizient;
  • Y: korrigierter Lumineszenzwert (Nettomessung der Lumineszenz).
  • Es ergibt sich aus dem Ergebnis von 2, dass sowohl im Vergleichsbeispiel 1, worin die Apyrase-Enzymlösung zugefügt wurde, um eine endgültige Konzentration von 0,05 U/ml zu erhalten, als auch im Vergleichsbeispiel 2, worin dieselbe Enzymlösung zugefügt wurde, um eine endgültige Konzentration von 0,10 U/ml zu erhalten, im Vergleichsbeispiel 3, worin die Kombination von Apyrase und 5'-Nukleotidase zugefügt wurde, im Vergleichsbeispiel 4, worin die Kombination von Apyrase, 5'-Nukleotidase und Adenosindeaminase zugefügt wurde, im Vergleichsbeispiel 5, worin die Kombination von Apyrase und saurer Phosphatase zugefügt wurde, im Vergleichsbeispiel 6, worin die Kombination von Apyrase, saurer Phosphatase und Adenosindeaminase zugefügt wurde, im Vergleichsbeispiel 7, worin die Kombination von Apyrase und AMP-Deaminase zugefügt wurde, im Vergleichsbeispiel 8, worin Adenosintriphosphatase zugefügt wurde, im Vergleichsbeispiel 9, worin Hexokinase zugefügt wurde, im Vergleichsbeispiel 10, worin alkalische Phosphatase zugefügt wurde und im Vergleichsbeispiel 11, worin saure Phosphatase zugefügt wurde, die Konzentration von ATP in dem Hefeextrakt in unzufriedenstellender Weise höchstens auf ungefähr 1/10 bis ungefähr 1/100 der anfänglichen Konzentration von ATP (10–9 M) verringert war.
  • Demgegenüber kann die vorliegende Erfindung 1, worin Adenosinphosphatdeaminase allein zugefügt wurde, die Konzentration von ATP auf ungefähr ein bis mehrere 1/1000 der anfänglichen Konzentration von ATP (10–11 M) verringern.
  • Es wurde gezeigt, dass sowohl in der vorliegenden Erfindung 2, worin die Kombination aus Adenosinphosphatdeaminase und Apyrase zugefügt wurde, der vorliegenden Erfindung 3, worin die Kombination von Adenosinphosphatdeaminase, Apyrase und saurer Phosphatase zugefügt wurde, der vorliegenden Erfindung 6, worin die Kombination von Adenosinphosphatdeaminase und alkalischer Phosphatase zugefügt wurde als auch der vorliegenden Erfindung 7, worin die Kombination von Adenosinphosphatdeaminase und saurer Phosphatase zugefügt wurde, die Konzentration von ATP auf 1/100.000 der anfänglichen Konzentration von ATP (10–13 M) reduziert werden konnte. Es wird auch verstanden, dass bei der vorliegenden Erfindung 4, worin die Kombination von Adenosinphosphatdeaminase und Adenosintriphosphatase zugefügt wurde, die Konzentration von ATP auf ungefähr 1/10.000 der anfänglichen Konzentration von ATP reduziert werden konnte und das bei der vorliegenden Erfindung 5, worin die Kombination von Adenosinphosphatdeaminase und Hexokinase zugefügt wurde, die Konzentration von ATP auf ein mehrfaches Zehntausendstel der anfänglichen Konzentration von ATP (10–12 M) reduziert werden konnte.
  • Beispiel 2
  • Ein Beispiel zum Erhalt der optimalen Konzentration von Adenosinphosphatdeaminase bei der Eliminierung von freiem ATP, vorliegend in Hefeextrakt, durch Zufügung einer Kombination von Adenosinphosphatdeaminase und Apyrase zu dem Extrakt.
  • Hefeextraktpulver (Difco) wurde in 1 mM HEPES-Puffer (pH 6,8) gelöst, um eine 1%ige (G/V) Hefeextrakt- (pH 6,8) Lösung herzustellen, die durch Filtration durch einen Membranfilter (MILLEX-GS, Porengröße: 0,22 μm, Millipore) sterilisiert worden war, um einen sterilen Hefeextrakt herzustellen.
  • Diese Lösung wurde in 8 5 ml Teile unterteilt und zu jedem der ersten bis siebenten Anteile wurden Adenosinphosphatdeaminase und Apyrase zugefügt, so dass die Lösung die endgültigen Enzymkonzentrationen wie in 3 dargestellt aufwies, während zu dem achten Anteil zum Vergleich nur Apyrase, jedoch nicht Adenosinphosphatdeaminase zugefügt wurde, so dass die Lösung die in 3 dargestellte endgültige Enzymkonzentration aufwies. Jede der Probenlösungen wurde einer Reaktion bei 37°C für 90 Minuten zur Eliminierung von freiem ATP in dem Hefeextrakt unterzogen und die Lumineszenz der so erhaltenen Probe wurde durch das folgende Verfahren gemessen.
  • Die Messung der Lumineszenz wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, um die ATP-Konzentration zu erhalten. Das Ergebnis ist in 3 dargestellt.
  • Es wurde gemäß dem Ergebnis von 3 gezeigt, dass in dem Anteil, dem nur Apyrase, jedoch nicht Adenosinphosphatdeaminase zugefügt worden war, die Konzentration von ATP auf ein Niveau von ungefähr 10–9 M reduziert werden konnte, während in den Anteilen, in denen die Kombination von Apyrase und Adenosinphosphatdeaminase zugefügt wurden, die Konzentration des ATP's weiter reduziert werden konnte. Die Konzentration von ATP kann weiter reduziert werden, wenn die Konzentration der Adenosinphosphatdeaminase ansteigt. Es kann festgestellt werden, dass die endgültige Konzentration der Adenosinphosphatdeaminase vorzugsweise im Bereich von 0,01 U/ml oder mehr liegt.
  • Beispiel 3
  • Freies ATP in dem Hefeextrakt wird zunächst mit der Kombination von Adenosinphosphatdeaminase und Apyrase eliminiert und ein ATP-Extraktionsmittel, enthaltend eine bestimmte Konzentration ATP, wird dann in Gegenwart beider Enzymaktivitäten zugefügt. Die Mischung wird eine Zeitlang aufrecht erhalten, die im allgemeinen für die Extraktion von ATP benötigt wird, z. B. für 20 Sekunden, bevor das Rest-ATP gemessen wird. Dies ermöglicht es, die Menge einer störenden Eliminierung von ATP, extrahiert aus biologischen Zellen, zu schätzen. Es ist auch möglich, die optimale Konzentration der Adenosinphosphatdeaminase oder Apyrase zu bestimmen.
  • Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 wurde steriler Hefeextrakt in 6 5 ml Anteile geteilt und zu jedem Anteil wurde eine Apyrase-Enzymlösung und eine Adenosinphosphatdeaminase-Enzymlösung zugefügt, so dass die Mischung die in 4 dargestellte endgültige Enzymkonzentration aufwies. Jede der Probenlösungen wurde einer Reaktion bei 37°C für 90 Minuten unterzogen, um ATP in dem Hefeextrakt zu eliminieren.
  • Ein 100 μl Anteil des Hefeextrakts, aus dem freies ATP eliminiert worden war (während die Aktivitäten beider Enzyme erhalten blieben) wurde mit 100 μl einer ATP-Standardlösung vermischt, verdünnt auf eine Konzentration von 2 × 10–11 M mit dem ATP-Extraktionsreagenz (KIKKOMAN) und die Menge der Lumineszenz A wurde schnell auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
  • Zum selben Zeitpunkt wurden 100 μl des Hefeextrakts, aus dem freies ATP eliminiert worden war (während die Aktivitäten beider Enzyme erhalten blieben) mit 100 μl des ATP-Extraktionsreagenzes (KIKKOMAN) vermischt und die Menge der Lumineszenz C wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 schnell gemessen.
  • Außerdem wurden 100 μl des Hefeextrakts, aus dem freies ATP eliminiert worden war (während die Aktivitäten beider Enzyme erhalten blieben) mit 100 μl einer ATP-Standardlösung vermischt, verdünnt auf eine Konzentration von 2 × 10–11 M mit dem ATP-Extraktionsreagenz (KIKKOMAN) und 20 Sekunden vor der Messung aufrechterhalten. Die Menge der Lumineszenz B wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 schnell gemessen.
  • Der prozentuale Anteil der Menge der Lumineszenz der ATP-Standardlösung nach 20 Sekunden (B – C) zu der Menge der Menge der Lumineszenz der anfänglichen ATP-Standardlösung (A – C) wurde berechnet und als die Rate an Rest-ATP angezeigt. Rate an Rest-ATP = 100 × (B – C)/(A – C).
  • Das Ergebnis ist in 4 dargestellt.
  • Es wird durch das Ergebnis gemäß 4 bewiesen, dass bei dem Verfahren zum Eliminieren von ATP mit der Kombination von Adenosinphosphatdeaminase und Apyrase eine hohe Konzentration an Adenosinphosphatdeaminase, d. h. die endgültige Konzentration von 0,5 bis 0,2 U/ml zu einer niedrigen Rate an Rest-ATP in einem Bereich von ungefähr 60% oder weniger führt, während die endgültige Konzentration von 0,1 U/ml oder weniger wenig Abbau an ATP auslöst und daher die Rate von Rest-ATP 70% oder mehr beträgt.
  • Es wird durch die Ergebnisse der 3 und 4 bewiesen, dass, wenn die endgültige Konzentration von Adenosinphosphatdeaminase zu niedrig ist, freies ATP in den Hefeextrakt unzureichend eliminiert wird. Demgegenüber, wenn die endgültige Konzentration zu hoch ist, wird nicht nur freies ATP sondern auch das extrahierte ATP (in diesem Beispiel zugefügtes ATP) abgebaut und eliminiert, so dass die Rate des restlichen ATP's, das extrahiert wird, in nicht wünschenswerter Weise erniedrigt sein kann. Wenn jedoch Adenosinphosphatdeaminase in einer Menge von 0,01 bis 0,1 U/ml zugefügt wird, wird freies ATP in zufriedenstellender Weise eliminiert, während das Enzym das extrahierte ATP kaum angreifen wird und auf diese Weise kann die Rate an Rest-ATP auf einem Niveau von 70% oder mehr erhalten bleiben.
  • Beispiel 4
  • Beispiel zum Erhalt der optimalen Konzentration von Apyrase im Fall einer Eliminierung von freiem ATP, das in Hefeextrakt vorliegt, mit der Kombination von Adenosinphosphatdeaminase und Apyrase.
  • Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 wurde steriler Hefeextrakt hergestellt und in 8 5 ml Teile unterteilt, zu denen Adenosinphosphatdeaminase allein oder die Kombination des Enyzms und Apyrase zugefügt wurden und die Mischung wurde einer Reaktion bei 37°C für 90 Minuten unterzogen, um freies ATP in dem Hefeextrakt zu eliminieren.
  • Die Lumineszenz des Hefeextraktes, aus dem freies ATP eliminiert worden war, wurde gemessen, um die ATP-Konzentration auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 zu erhalten.
  • Das Ergebnis ist in 5 dargestellt.
  • Durch das Ergebnis gemäß 5 wird bewiesen, dass in dem Anteil, zu dem Adenosinphosphatdeaminase allein zugefügt wurde, die ATP-Konzentration auf ein Niveau von ungefähr 10–11 M reduziert werden konnte, während in dem Anteil, zu dem weiterhin Apyrase zusätzlich zu der Adenosinphosphatdeaminase zugefügt wurde, die ATP-Konzentration weiter reduziert werden konnte. Zusätzlich ist es möglich, wenn die endgültige Konzentration von Apyrase höher wird, die ATP-Konzentration zu reduzieren. Die endgültige Konzentration der Apyrase liegt vorzugsweise im Bereich von 0,01 U/ml oder mehr, insbesondere 0,05 bis 0,5 U/ml.
  • Beispiel 5
  • Beispiel für die Messung der Rate an Rest-ATP durch vorheriges Eliminieren von freiem ATP in einem Hefeextrakt mit der Kombination aus Adenosinphosphatdeaminase und Apyrase, dann Zugabe eines ATP-Extraktionsmittels, enthaltend eine bestimmte Konzentration ATP und Erhalt der Mischung für eine Zeitspanne, die allgemein für die Extraktion von ATP benötigt wird, z. B. 20 Sekunden.
  • Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 wurde steriler Hefeextrakt hergestellt und in 8 5 ml Teile unterteilt, zu denen Adenosinphosphatdeaminase und Apyrase zugefügt wurden und die Mischung wurde einer Reaktion bei 37°C für 90 Minuten unterzogen um freies ATP in dem Hefeextrakt zu eliminieren. Die Rate an Rest-ATP wurde mit der Reaktionsmischung, die so erhalten wurde, auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt.
  • Durch das Ergebnis von 6 kann bewiesen werden, dass bei dem Verfahren zum Eliminieren von ATP durch Verwendung einer Kombination von Adenosinphosphatdeaminase und Apyrase die Rate an Rest-ATP auf einem niedrigen Niveau von 60% oder weniger bei einer hohen Konzentration von ATP verbleibt, d. h, der endgültigen Konzentration von 0,5 U/ml, während die Rate an Rest-ATP auf einem hohen Niveau von 70% oder mehr erhalten werden kann, da ATP wenig in der endgültigen Konzentration von 0,2 U/ml oder weniger abgebaut wird.
  • Aus den Ergebnissen der 5 und 6 kann auch festgestellt werden, dass ATP nur in unzureichender Weise in der exzessiv niedrigen endgültigen Konzentration von Apyrase eliminiert wird, während die Rate an Rest-ATP in der exzessiv hohen endgültigen Konzentration der Apyrase erniedrigt ist. Demgegenüber, wenn die endgültige Konzentration der Apyrase bei einem Niveau von 0,01 bis 0,2 U/ml liegt, kann die Rate an Rest-ATP vorzugsweise auf einem hohen Niveau von 70% oder mehr erhalten bleiben und zwar aufgrund der zufriedenstellenden Eliminierung von ATP.
  • Beispiel 6
  • Freies ATP in einem Hefeextrakt wird zunächst mit der Kombination aus Adenosinphosphatdeaminase und Apyrase eliminiert und dann werden ATP-Extraktionsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen ATP in Gegenwart dieser Enzyme zugefügt. Die Mischung wird für die Zeitspanne aufrechterhalten, die allgemein für die Extraktion von ATP benötigt wird, d. h. 10, 20 und 30 Sekunden vor Messung der Rate von Rest-ATP. Die Eliminierungsmengen an ATP bei verschiedenen Konzentrationen, extrahiert aus biologischen Zellen durch den Abbau dieser Enzyme bei einer bestimmten Extraktionszeit, können durch dieses Verfahren geschätzt werden.
  • Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 wurde ein steriler Hefeextrakt hergestellt, zu dem eine Adenosinphosphatdeaminase-Enzymlösung sowie eine Apyrase-Enzymlösung zugefügt wurde, so dass die endgültige Konzentration von jeder der Enzymlösungen auf 0,05 U/ml eingestellt wurde und die Mischung wurde einer Reaktion bei 30°C zum Eliminieren von ATP in dem Hefeextrakt unterzogen.
  • Zu 100 μl des Hefeextrakts, aus dem ATP eliminiert worden war wurden 100 μl der ATP-Standardlösungen hinzugefügt, die mit dem ATP-Extraktionsreagenz (Kikko-Man) verdünnt worden waren, und zwar in den verschiedenen in 7 dargestellten Konzentrationen und die Lumineszenz der Mischung bei 0 Sekunden und nach einem Stehenlassen für 10, 20 und 30 Sekunden wie dargestellt in 7, wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 gemessen um die Rate an Rest-ATP zu erhalten.
  • Die Rate an Rest-ATP wurde gemäß dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gemessen.
  • Das Ergebnis ist in 7 dargestellt.
  • Aus dem Ergebnis von 7 ergibt sich, dass bei dem Verfahren zum Eliminieren von ATP mit der Kombination aus Adenosinphosphatdeaminase und Apyrase ATP fast in einer konstanten und gemäßigten Rate ohne Bezug zu der hohen (2 × 10–9 M) oder niedrigen (2 × 10–13 M) ATP-Konzentration abnimmt und auf einem Niveau von 80% oder mehr nach einem Stehenlassen selbst für 30 Sekunden verbleibt.
  • Das heißt, ATP, das frisch zugefügt wurde, wurde durch ein Stehnlassen von 30 Sekunden nicht substantiell abgebaut, was zu einer Zeitspanne für die Extraktion von ATP aus Mikroorganismen korrespondiert und so kann das extrahierte ATP (in diesem Beispiel zugefügtes ATP) in korrekter Weise bestimmt werden.
  • Es ist so möglich, das von Mikroorganismen extrahierte ATP korrekt zu messen und die Anzahl der Keimzellen korrekt zu bestimmen.
  • Zusätzlich wird kein Unterschied zwischen den Restraten der verschiedenen ATP-Konzentrationen erkannt, so dass das Verfahren das Merkmal aufweist, dass es nicht durch die Konzentration der biologischen Zellen beeinflusst wird und auf diese Weise die Verdünnungsschritte der Proben bei der Messung von biologischen Zellen in vorteilhafter Weise vereinfacht werden können.
  • Beispiel 7
  • Beispiel zum Erhalt eines optimalen pH's bei dem Eliminieren von freiem ATP in einem Hefeextrakt durch Zugabe der Kombination aus Adenosinphosphatdeaminase und Apyrase zu dem Hefeextrakt.
  • Hefeextraktpulver (Difco) wurde zu 5 mM Puffern mit den in 8 dargestellten verschiedenen pH's zugefügt um eine 1%ige (G/V) Lösung zu ergeben, die durch Filtration durch einen Membranfilter sterilisiert wurde, um einen sterilen Hefeextrakt mit dem in 8 dargestellten pH herzustellen.
  • Der Hefeextrakt wurde in 7 5 ml Teile unterteilt, zu denen Adenosinphosphatdeaminase und Apyrase zugefügt wurden, so dass die endgültigen Konzentrationen 0,05 U/ml annahmen und die Mischung wurde einer Reaktion bei 37°C für 30 Minuten vor Messung der Lumineszenz des so erhaltenen Hefeextrakts unter Befolgung des unten beschriebenen Verfahrens unterzogen.
  • Die Lumineszenz wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 zur Bestimmung der ATP-Konzentration gemessen.
  • Das Ergebnis ist in 8 dargestellt.
  • Aus dem Ergebnis von 8 ergibt sich, dass in dem Fall einer Eliminierung von freiem ATP, das im Hefeextrakt vorliegt, mit der Kombination aus Adenosinphosphatdeaminase und Apyrase der pH vorzugsweise im Bereich von 5,0 bis 8,0, insbesondere 5,0 bis 7,0 liegt.
  • Beispiel 8
  • Beispiel zum Erhalt der optimalen Temperatur im Fall eines Eliminierens von freiem ATP im Hefeextrakt mit der Kombination aus Adenosinphosphatdeaminase und Apyrase.
  • Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 wurde ein steriler Hefeextrakt hergestellt, der in 9 5 ml Anteile unterteilt wurde, zu denen Adenosinphosphatdeaminase und Apyrase zugefügt wurden, so dass die endgültige Konzentration jeder der Enzymlösungen 0,05 U/ml betrug und die Mischung wurde einer Reaktion bei der in 9 beschriebenen Temperatur für 30 Minuten unterzogen. Die so erhaltenen Proben wurden einer Lumineszenzmessung durch das folgende Verfahren unterzogen.
  • Die Lumineszenz wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 zum Erhalt der ATP-Konzentration gemessen.
  • Das Ergebnis ist in 9 dargestellt.
  • Es ergibt sich aus dem Ergebnis gemäß 9, dass das in dem Hefeextrakt vorliegende freie ATP mit der Kombination aus Adenosinphosphatdeaminase und Apyrase vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 55°C, noch bevorzugter 35 bis 50°C, besonders bevorzugt 40 bis 45°C eliminiert wird.
  • Die in den folgenden Beispielen der vorliegenden Erfindung verwendete Kalibrierungskurve für ATP wurde als nächstes mit einem Luminometer LUMITESTER K-100 (KIKKOMAN) hergestellt.
  • Das heißt, 100 μl hochreines Wasser wurden zu 100 μl einer ATP-Standardlösung zugefügt, die eine bestimmte Konzentration aufwies, gefolgt von 100 μl eines Luziferin-LUziferase-Lumineszenzreagenzes und die relative Menge der Lumineszenz S wurde mit einem Luminometer LUMITESTER K-100 (KIKKOMAN) gemessen.
  • Zum selben Zeitpunkt wurden 100 μl des Lumineszenzreagenzes zu 200 μl hochreinem Wasser zugefügt und die Lumineszenz wurde in derselben Weise wie oben gemessen, um die Menge der Lumineszenz in dem Lumineszenzreagenz R (Leerprobe) zu erhalten.
  • Die Nettomenge der Lumineszenz Z von ATP wurde aus der Differenz S – R erhalten, so dass die in 10 dargestellte Kalibrierungskurve mit der Nettomenge der Lumineszenz Z als Y-Achse und der ATP-Konzentration als X-Achse der Koordinaten hergestellt wurde.
  • Beispiel 9
  • Beispiel zur Messung der Menge von ATP pro KBE in Staphylococcus aureus unter der Bedingung, dass die Wirkung des ATP-Eliminators entfernt worden war.
  • Die folgenden Schritte wurden in dieser Sequenz zum Zählen der Anzahl der biologischen Zellen in dem Kulturmedium von Staphylocuccus aureus als praktischer Zielmikroorganismus durchgeführt:
    • Schritt 1: Kultivieren des Zielmikroorganismus in einem Standard-Flüssig-Medium zur Herstellung der Kulturlösung,
    • Schritt 2: Eliminieren von freiem ATP aus der Kulturlösung,
    • Schritt 3: Herstellung einer Verdünnung mit einem Standard-Flüssig-Medium,
    • Schritt 4: Herstellung einer Suspension des Zielmikroorganismus durch Verdünnung der Kulturlösung, aus der freies ATP eliminiert worden war,
    • Schritt 5: Messung der Lumineszenz von freiem ATP in der Suspension des Zielmikroorganismus,
    • Schritt 6: Zugabe eines ATP-Extraktionsmittels zu dem Zielmikroorganismus und Messung der Lumineszenz von Gesamt-ATP, bestehend aus freiem ATP, das vor Zugabe des Extraktionsmittels vorliegt und dem extrahierten ATP (ATP in den Zellen),
    • Schritt 7: Berechnung der Menge der Lumineszenz von ATP in den Zellen,
    • Schritt 8: Berechnung der korrigierten Menge von Lumineszenz von ATP in den Zellen,
    • Schritt 9: Berechnung der Konzentration von ATP auf der Basis der korrigierten Menge,
    • Schritt 10: Berechnung von KBE pro ml der Suspension des Zielmikroorganismus durch das Gusskulturverfahren,
    • Schritt 11: Messung der Menge von ATP pro KBE.
  • Schritt 1: Kultivierung des Zielmikroorganismus in einem Standard-Flüssig-Medium zur Herstellung der Kulturlösung.
  • In 8 ml eines Standard-Flüssig-Mediums (0,25% Hefeextrakt, 0,5% Trypton, 0,1% Glucose, pH 7,1) wurde Staphylococcus aureus ATCC 25923 in einer Platinschlaufenmenge inokuliert und stationär bei 35°C über Nacht kultiviert um eine Kulturlösung des Mikroorganismus zu erhalten.
  • Schritt 2: Eliminierung von freiem ATP aus der Kulturlösung.
  • Zu 2 ml der Kulturlösung (enthaltend eine große Menge lebensfähiger Zellen) wurden Apyrase und Adenosinphosphatdeaminase zugefügt, so dass die endgültigen Konzentrationen je 0,05 U/ml betrugen und die Mischung wurde bei 35°C für 30 Minuten behandelt, um vorläufig freies ATP in der Kulturlösung zu eliminieren.
  • Das Leerprobenniveau an ATP kann durch die Behandlung erniedrigt werden.
  • Schritt 3: Herstellung einer Verdünnung mit einem Standard-Flüssig-Medium
  • Zum selben Zeitpunkt wurden Apyrase und Adenosinphosphatdeaminase zu 100 ml des Standard-Flüssig-Mediums zugefügt, das den oben beschriebenen Mikroorganismus nicht inokuliert enthielt, so dass die endgültigen Konzentrationen jeweils 0,05 U/ml betrugen und die Mischung wurde bei 35°C für 90 Minuten umgesetzt, dann in einem Autoklaven bei 120°C für 15 Minuten sterilisiert, um die Enzyme zu deaktivieren und eine Verdünnung herzustellen, umfassend ein steriles Standard-Flüssig-Medium, aus dem freies ATP eliminiert worden war.
  • Schritt 4: Herstellung einer Suspension des Zielmikroorganismus durch Verdünnung der Kulturlösung, aus der freies ATP eliminiert worden war.
  • Die in Schritt 2 hergestellte Kulturlösung wurde mit der in Schritt 3 erhaltenen Verdünnung verdünnt, um die 10.000fache Verdünnung der Mikroorganismen-Suspension herzustellen.
  • Man ließ die Verdünnung bei 35°C für 30 Minuten vor ihrer Verwendung als Probe zur Messung der Lumineszenz stehen.
  • Schritt 5: Messung der Lumineszenz von freiem ATP in der Suspension des Zielmikroorganismus.
  • Zu 100 μl der 10.000fachen Verdünnung der Mikroorganismus-Suspension wurden 100 μl hochreines Wasser zugefügt, gefolgt von 100 μl des Lumineszenzreagenzes und die Mischung wurde einer Messung der Lumineszenz mit dem LUMITESTER K-100 (KIKKOMAN) unterzogen, um die Lumineszenzmenge von freiem ATP in der Verdünnung der Mikroorganismen-Suspension zu bestimmen (hiernach bezeichnet als freie Lumineszenzmenge F).
  • Schritt 6: Zugabe eines ATP-Extraktionsmittel zu dem Zielmikroorganismus und Messung der Lumineszenz des gesamten ATP, bestehend aus freiem ATP, das vor Zugabe des Extraktionsmittels vorliegt und dem extrahierten ATP (ATP in den Zellen).
  • Zu 100 μl der Verdünnung der Mikroorganismen-Suspension wurden 100 μl des ATP-Extraktionreagenzes (KIKKOMAN) zugefügt, gefolgt von 100 μl des Lumineszenzreagenzes nach 20 Sekunden bei Raumtemperatur und die Mischung wurde der Messung der Lumineszenz mit dem Lumitester K-100 (KIKKOMAN) unterzogen, um die Menge der Lumineszenz des gesamten ATP (T) des freien ATP und des aus den Mikroorganismenzellen durch Wirkung des Extraktionsmittels extrahierten ATPs zu bestimmen.
  • Schritt 7: Berechnung der Menge der Lumineszenz von ATP in den Zellen.
  • Die Menge an Lumineszenz von ATP in den Zellen kann korrekt bestimmt werden, indem die freie Lumineszenzmenge (F) von der Gesamtlumineszenzmenge (T) abgezogen wird.
  • Schritt 8: Berechnung der korrigierten Menge der Lumineszenz von ATP in den Zellen.
  • Die oben beschriebene Biolumineszenzreaktion der Luziferin-Luziferase wird etwas durch in der Probe enthaltene Bestandteile inhibiert und muss korrigiert werden, um die Lumineszenzmenge ohne Lumineszenzinhibition zu bestimmen. Die Lumineszenzmenge wurde wie folgt korrigiert: Das heißt, 100 μl einer 2 × 10–10 M ATP-Standardlösung wurden zu 100 μl der Zielmikroorganismus-Suspension zugefügt, gefolgt von 100 μl des Lumineszenzreagenzes nach 20 Sekunden und die Lumineszenzmenge wurde mit dem Lumitester K-100 (KIKKOMAN) gemessen, um die Menge an interner Standard-Lumineszenz H zu bestimmen.
  • Die Lumineszenzmenge wurde gemessen, um die Menge der tatsächlichen Standard-Lumineszenz G in derselben Weise zu bestimmen, wie bei dem Verfahren zur Bestimmung der oben beschriebenen Menge der internen Standard-Lumineszenz, außer dass 100 μl steriles hochreines Wasser anstelle von 100 μl der Zielmikroorganismus-Suspension verwendet wurden.
  • Dann wurde die Lumineszenz Y (korrigierter Wert) an intrazellulärem ATP im Fall von keiner Lumineszenzinhibition aus der folgenden Berechnungsformel bestimmt: Y = (T – F)/K K = (H – F)/G worin H: interne Standard-Lumineszenzmenge
    F: freie Lumineszenzmenge
    G: tatsächliche Standard-Lumineszenzmenge
    K: Lumineszenzrate
    T – F: Lumineszenzmenge von intrazellulärem ATP, erhalten in dem vorherigen Schritt
    T: Gesamt-Lumineszenzmenge.
  • Schritt 9: Berechnung der Konzentration von ATP auf der Basis der korrigierten Menge
  • Die ATP-Konzentration, korrespondierend zu der (korrigierten) Menge der ATP-Lumineszenz in den Zellen in Abwesenheit einer Lumineszenzinhibition wurde gemäß der Kalibrierungskurve, wie dargestellt in 10, die vorher hergestellt worden war, bestimmt .
  • Schritt 10: Berechnung von KBE pro ml der Suspension des Zielmikroorganismus durch das Gusskulturverfahren
  • Eine bestimmte Menge der Zielmikroorganismus-Suspension, in geeigneter Weise verdünnt, wurde zu einer sterilen Platte mit einer sterilen Pipette unter sterilen Bedingungen zugefügt, gefolgt von einer Lösung eines Standard-Agar-Mediums (0,25% Hefeextrakt, 0,5% Trypton, 0,1% Glucose, pH 7,1, 2,0% Agar), abgekühlt auf 50°C und die Platte wurde mit einem Deckel versehen, bewegt und langsam in horizontalen Richtungen rotiert, um die Zielmikroorganismus-Suspension mit dem Medium homogen zu vermischen, und bei 35°C 24 Stunden kultiviert. Die erscheinenenden Kolonien wurden gezählt, um die Anzahl an Mikroorganismen pro ml der Ursprungslösung (Kolonie bildende Einheit: KBE) im Hinblick auf die Verdünnungen zu schätzen.
  • Schritt 11: Messung der ATP-Menge pro KBE
  • Die Messung von ATP pro KBE Staphylococcus aureus wurde durch Teilen der Konzentration von ATP (mol/ml) korrespondierend zu der (korrigierten) Menge der ATP-Lumineszenz in den Zellen in Abwesenheit einer Lumineszenz-Inhibition durch KBE pro ml der Zielmikroorganismus-Suspension, erhalten in Schritte 10 (KBE/ml), bestimmt.
  • Im Ergebnis wurde die Menge an ATP von 2 × 10–17 mol/KBE erhalten.
  • Die oben beschriebenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Menge an ATP pro KBE Staphylococcus aureus (mol/KBE)
    Verdünnung 10.000fach
    gesamte Lumineszenz (T) 16.198
    freie Lumineszenz (F) 905
    T – F Lumineszenz 15.293
    korrigierte Lumineszenz 21.268
    ATP-Konzentration (mol/l) 2,54 × 10–13
    experimenteller Wert (Gusskulturverfahren (KBE/ml) 1,27 × 104
    ATP Menge (mol/KBE) 2,00 × 10–17
  • Beispiel 10
  • Verfahren zur Messung der KBE bei lebensfähigen Zellen in der verdünnten Suspension von Staphylococcus aureus, dessen Aktivität erhalten blieb mit der Messung von ATP pro KBE (ca. 2 × 10–17) in Staphylococcus aureus, erhalten in Beispiel 9, unter dem Einfluß des ATP-Eliminators.
    • Schritt 1: Verdünnung der Kulturlösung auf eine bestimmte Konzentration zur Herstellung der verdünnten Suspension des Zielmikroorganismus,
    • Schritt 2: Eliminieren von freiem ATP aus der verdünnten Suspension des Zielmikroorganismus,
    • Schritt 3: Messung der Lumineszenz von freiem ATP in der verdünnten Suspension des Zielmikroorganismus,
    • Schritt 4: Zugabe eines ATP-Extraktionsmittels zu dem Zielmikroorganismus und Messung der Lumineszenz von Gesamt-ATP, bestehend aus dem freien ATP, das in einer Spurenmenge vorliegt und dem extrahierten ATP (ATP in den Zellen),
    • Schritt 5: Berechnung der Lumineszenzmenge von ATP in den Zellen,
    • Schritt 6: Berechnung der korrigierten Lumineszenzmenge,
    • Schritt 7: Berechnung der ATP-Konzentration auf der Basis der korrigierten Menge,
    • Schritt 8: Berechnung von KBE pro ml der verdünnten Staphylococcus aureus-Suspension,
    • Schritt 9: Vergleichsbeispiel (Berechnung von KBE pro ml der verdünnten Suspension des Zielmikroorganismus durch das Gusskulturverfahren).
  • Schritt 1: Verdünnung der Kulturlösung auf eine bestimmte Konzentration zur Herstellung der verdünnten Suspension des Mikroorganismus
  • Die Kulturlösung von Staphylococcus aureus, wie erhalten in Schritt 1 des vorstehenden Beispiels, wurde auf das 10.000, 100.000, 1.000.000 und 10.000.000fache mit einem Standard-Flüssigmedium, sterilisiert durch Erwärmen in einem Autoklaven (Verdünnungsmittel) verdünnt, um die verdünnten Suspensionen des Zielmikroorganismus zu erhalten.
  • Schritt 2: Eliminieren von freiem ATP aus der verdünnten Suspension des Zielmikroorganismus
  • Apyrase und Adenosinphosphatdeaminase wurden zu den oben beschriebenen verdünnten Suspensionen des Zielmikroorganismus zugefügt, so daß die endgültigen Konzentrationen dieser Enzyme 0,05 U/ml betrugen und die Mischung wurde bei 35°C für 30 Minuten zum Eliminieren von ATP umgesetzt.
  • Schritt 3: Messung der Lumineszenz von freiem ATP in der verdünnten Suspension des Zielmikroorganismus
  • Zu 100 μl der verdünnten Suspension des Zielmikroorganismus wurden 100 μl hochreines Wasser, gefolgt von 100 μl des Lumineszenzreagenzes zugefügt und die Mischung wurde der Messung der Lumineszenz mit dem Lumitester K-100 (KIKKOMAN) unterzogen um die Lumineszenzmenge zu bestimmen. Die Lumineszenzmenge des freien ATP in der Suspension des Zielmikroorganismus (F) kann durch diese Messung bestimmt werden.
  • Schritt 4: Zugabe eines ATP-Extraktionsmittel zu dem Zielmikroorganismus und Messung der Lumineszenz des Gesamt-ATP, bestehend aus freiem ATP, das in einer Spurenmenge vorliegt und dem extrahierten ATP (ATP in den Zellen).
  • Zu 100 μl der verdünnten Suspension des Zielmikroorganismus wurden 100 μl des ATP-Extraktionsreagenzes (KIKKOMAN), gefolgt von 100 μl des Lumineszenzreagenzes nach 20 Sekunden bei Raumtemperatur zugegeben und die Mischung wurde einer Messung der Lumineszenz mit dem Lumitester K-100 (KIKKOMAN) unterzogen, um die Lumineszenzmenge zu bestimmen. Die Summe der Lumineszenzen von ATP in den Zellen, extrahiert durch Wirkung des Extraktionsmittels und des freien ATPs kann durch diese Messung bestimmt werden und wurde so als Gesamtmenge des Lumineszenz (T) angesehen.
  • Schritt 5: Berechnung der Menge der Lumineszenz von ATP in den Zellen
  • Die Lumineszenzmenge von ATP in den Zellen wird korrekt bestimmt durch Subtraktion der freien Lumineszenzmenge (F) von der Gesamt-Lumineszenzmenge (T).
  • Schritt 6: Berechnung der korrigierten Lumineszenzmenge
  • In jedem der oben beschriebenen vorherigen Schritte wird die Biolumineszenzreaktion von Luziferin-Luziferase etwas durch in der Suspension enthaltene Bestandteile inhibiert und wird so durch das folgende Verfahren korrigiert, um die Menge der Lumineszenz ohne Lumineszenzinhibition zu bestimmen.
  • Ein 100 μl Anteil der 2 × 10–10 M ATP-Standardlösung wurden zu 100 μl der verdünnten Suspension des Zielmikroorganismus zugefügt, gefolgt von 100 μl des Lumineszenzreagenzes nach 20 Sekunden und die Menge der internen Standard-Lumineszenz (H) wurde mit dem Lumitester K-100 (KIKKOMAN) bestimmt.
  • Die Menge der tatsächlichen Standard-Lumineszenz (G) wurde auf dieselbe Weise wie in dem Verfahren zur Bestimmung der oben beschriebenen Menge der internen Standard-Lumineszenz (H) bestimmt, außer dass 100 μl steriles hochreines Wasser anstelle von 100 μl der verdünnten Suspension des Zielmikroorganismus verwendet wurden.
  • Dann wurde die Lumineszenz (Y) (korrigierter Wert) von intrazellulärem ATP im Fall von keiner Lumineszenz-Inhibition aus der folgenden Berechnungsformel bestimmt: Y = (T – F)/K K = (H – F)/G worin H: interne Standard-Lumineszenzmenge
    F: freie Lumineszenzmenge
    G: tatsächliche Standard-Lumineszenzmenge
    K: Lumineszenzrate
    T – F: Lumineszenzmenge von intrazellulärem ATP, erhalten in dem vorherigen Schritt
    T: Gesamt-Lumineszenzmenge.
  • Schritt 7: Berechnung der Konzentration von ATP, korrespondierend zu der korrigierten Lumineszenzmenge
  • Die Konzentration an ATP, korrespondierend zu der korrigierten Lumineszenzmenge Y wurde gemäß der in 10 dargestellten Kalibrierungskurve bestimmt, die vorher hergestellt worden war.
  • Schritt 8: Berechnung der Konzentration an KBE pro ml der verdünnten Suspension von Staphylococcus aureus
  • Die ATP-Konzentration (mol/ml), korrespondierend zu der korrigierten Menge der Lumineszenz, wie erhalten in Schritt 7, wurde durch die Menge an ATP (ca. 2 × 10–17 mol) pro KBE Staphylococcus aureus, wie erhalten in Schritt 11 (letzter Schritt) im Beispiel 9 geteilt, um die KBE-Konzentration pro ml der verdünnten Suspension von Staphylococcus aureus zu berechnen.
  • Schritt 9: Vergleichsbeispiel (Berechnung der KBE pro ml der verdünnten Suspension des Zielmikroorganismus durch das Gusskulturverfahren)
  • Eine bestimmte Menge der in geeigneter Weise verdünnten Suspension des Zielmikroorganismus wurde zu einer sterilen Platte mit einer sterilen Pipette unter sterilen Bedingungen zugefügt, gefolgt von der Lösung eines Standard-Agar-Mediums, abgekühlt auf 50°C und die Platte wurde mit einem Deckel versehen, bewegt und langsam in Horizontalrichtung rotiert, um die Zielmikroorganismus-Suspension mit dem Medium homogen zu vermischen und bei 35°C für 24 Stunden kultiviert. Die erscheinenenden Kolonien wurden gezählt, um die Anzahl von Mikroorganismen pro ml der Zielmikroorganismus-Suspension (KBE) in Betrachtung der Verdünnungen zu schätzen.
  • Die so erhaltene KBE-Konzentration wurde als der beobachtete Wert (KBE/ml) betrachtet.
  • Die oben beschriebenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
  • Die Messung der lebensfähigen Keimkonzentration von Staphylococcus aureus (KBE/ml)
    Figure 00460001
  • Beispiel 11
  • Verfahren zur Messung der ATP-Menge pro KBE von Escherichia coli (mol/KBE)
  • Die ATP-Menge pro KBE wurde auf dieselbe Weise wie bei dem Verfahren zur Messung der ATP-Menge pro Staphylococcus aureus von Beispiel 9 gemessen, außer dass Staphylococcus aureus ATCC 25923 durch Escherichia coli NISL B-4300 ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
  • Die ATP-Menge pro KBE Escherichia coli (mol/KBE)
    Figure 00460002
  • Beispiel 12
  • Messung von lebensfähigen Zellen in einer verdünnten Kultursuspension von Escherichia coli (KBE/ml)
  • Die Konzentration an lebensfähigen Zellen (KBE/ml) in der verdünnten Kultursuspension von Escherichia coli wurde auf dieselbe Weise wie bei dem Verfahren zur Messung der Menge der lebensfähigen Zellen von Staphylococcus aureus in Beispiel 10 gemessen, außer dass Staphylococcus aureus ATCC 25923 durch Escherichia coli NISL B-4300 ersetzt wurde.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
  • Die Messung der lebensfähigen Keimkonzentration von Escherichia coli (KBE/ml)
    Figure 00470001
  • Beispiel 13
  • Verfahren zur Messung der ATP-Menge pro KBE Saccharomyces cerevisiae (mol/KBE)
  • Die ATP-Menge pro lebensfähiger Zelle (KBE) von Saccharomyces cerevisiae (mol/KBE) wurde auf dieselbe Weise wie bei dem Verfahren zur Messung der ATP-Menge pro KBE Staphylococcus aureus in Beispiel 9 gemessen, außer dass als Medium ein YM-Medium (1% Glucose, 0,5% Pepton, 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Malzextrakt, pH 6,0) anstelle des Standard-Flüssig-Mediums verwendet wurde und dass ein YM-Medium, enthaltend Agar (1% Glucose, 0,5% Pepton, 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Malzextrakt, 2% Agar, pH 6,0) anstelle des Standard-Agar-Mediums verwendet wurde und dass als Zielmikroorganismus Saccharomyces cerevisiae NISL Y-3398 anstelle von Staphylococcus aureus ATCC 25923 verwendet wurde.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.
  • Tabelle 5 Die ATP-Menge pro KBE Saccharomyces cerevisiae (mol/KBE)
    Figure 00480001
  • Beispiel 14
  • Messung von lebensfähigen Zellen in einer verdünnten Kultursuspension von Saccharomyces cerevisiae (KBE/ml)
  • Die Konzentration an lebensfähigen Zellen (KBE/ml) in der verdünnten Kultursuspension von Saccharomyces cerevisiae wurde auf dieselbe Weise wie bei dem Verfahren zur Messung der Menge der lebensfähigen Zellen von Staphylococcus aureus in Beispiel 10 gemessen, außer dass Staphylococcus aureus ATCC 25923 durch Saccharomyces cerevisiae NISL Y-3398 ersetzt wurde.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt.
  • Tabelle 6 Die Messung der lebensfähigen Keimkonzentration von Saccharomyces cerevisiae (KBE/ml)
    Figure 00490001
  • Es kann durch die Ergebnisse gemäß Tabelle 1 bis 6 bewiesen werden, dass ein Verfahren zur Messung von ATF äquivalent zu dem Gusskulturverfahren, das konventionell als hoch präzise und hoch zuverlässig angesehen wurde, gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden kann. Es ist gemäß der vorliegenden Erfindung auch möglich, einen Kultivierungsschritt zu eliminieren, der für das konventionelle Verfahren nötig ist und den Testzyklus in etwa 10 Minuten abzuschließen, so dass die für die Behandlung benötigte Zeitspanne deutlich im Vergleich mit dem konventionellen Verfahren verkürzt werden kann. Es ist außerdem möglich, die für die Verdünnung benötigte Ausrüstung auszuschließen und Zeit und Arbeit für die Verdünnung und die Herstellung eines Mediums zu sparen.
  • Weiterhin zeigte in dem Standard-Flüssig-Mediums und dem YM-Medium das freie ATP eine relative Lichteinheit (RLE) von 92.100 bzw. 139.350 und so konnte die Anzahl der Zellen nicht gemessen werden.
  • Wenn jedoch das ATP pro KBE in einer relativ großen Menge, wie im Fall von Staphylococcus aureus oder Saccharomyces cerevisiae aufgrund der Abnahme der freien Lumineszenz durch Eliminieren von freiem ATP mit dem ATP-Eliminierungsreagenz vorlag war es möglich, Keime bei einer minimalen Konzentration von einigen 10 KBE/ml nachzuweisen. Wenn ATP pro KBE auf einem relativ niedrigen Niveau vorlag, wie im Fall von Escherichia coli, war es möglich, Keime bei einer minimalen Konzentration von 40 bis 50 KBE/ml nachzuweisen. Auf diese Weise weist die vorliegende Erfindung eine zufriedenstellend hohe Nachweisempfindlichkeit auf, selbst wenn das ATP-Eliminierungsreagenz die Aktivität erhält.
  • In diesem Zusammenhang wird offenbart, dass, wenn der Korrelationskoeffizient zwischen der berechneten Anzahl von Zellen, erhalten durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung (KBE/ml) und der beobachteten Zahl der Zellen, erhalten durch das Gusskulturverfahren, bestimmt wurde, er 0,99 in jedem der Bakterien war und eine extrem hohe Korrelation aufwies und die Anzahl der Zellen korrekt gemessen werden kann, wenn das ATP-Eliminierungsreagenz die Aktivität erhält.
  • Die Beziehung zwischen der Konzentration von ATP (mol/ml), extrahiert aus jedem der Mikroorganismen, die gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt wird und der beobachteten Zellzahl (KBE/ml), die durch das Gusskulturverfahren bestimmt wird, ist in 11 dargestellt.
  • Eine Kalibrierungskurve mit einer guten Linearität für jeden der Mikroorganismen kann aus dieser Beziehung erhalten werden.
  • Es wird so offenbart, dass die Zellzahl korrekt aus der Konzentration (mol/ml) von ATP, extrahiert aus den Mikroorganismen, gemessen werden kann.
  • Beispiel 15
  • Verfahren zum Eliminieren von freiem ATP in dem Flüssignährmedium, SCD-Medium
  • Adenosinphosphatdeaminase wurde zu dem Flüssignährmedium, SCD-Medium zugefügt, so dass die endgültige Konzentration des Enzyms 0,01 U/ml betrug und die Mischung wurde für 120 Minuten bei 35°C erhalten. Proben wurden mit dem Zeitverlauf zur Messung der Lumineszenz entnommen.
  • Zu 100 μl der Probe wurden 100 μl 0,3 mM Phosphatpuffer (pH 7,2) zugefügt, gefolgt von 100 μl LUCIFER LU (ATP-Meßreagenz, KIKKOMAN) und die Lumineszenzmenge wurde mit einem LUMITESTER K-100 (KIKKOMAN) gemessen.
  • Das Ergebnis ist in Tabelle 7 dargestellt.
  • Aus dem Ergebnis von Tabelle 7 lässt sich ablesen, dass die anfängliche ATP-Konzentration in dem SCD-Medium (d. h. die ATP-Konzentration in Abwesenheit der Wirkung von Adenosinphosphatdeaminase) die relative Lumineszenzeinheit von 2718 aufweist, jedoch 60 Minuten später im wesentlichen eliminiert ist, wenn das freie ATP mit Beginn der Wirkung des Enzyms schnell abgebaut wird. Tabelle 7
    Behandlungszeit Relative Lichteinheit
    (min) (RLE)
    0 2718
    30 41
    60 11
    120 7
  • Beispiel 16
  • Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bacillus subtilis in Soja Koji, das damit kontaminiert ist
  • Zu 20 g im wesentlichen sterilem Soja Koji wurde Bacillus subtilis AHU1035 in einer Menge (Zähler/g Koji) wie dargestellt in 12 zugefügt, um Soja Koji zu erhalten, das künstlich mit Bacillus subtilis kontaminiert war.
  • Zu dem Soja Koji wurden 80 ml 0,3 mM Phosphatpuffer (pH 7,2) zugefügt und die Mischung wurde ausreichend gerührt, um eine Suspension herzustellen.
  • Als nächstes wurden 2 ml der SCD-Medium-Präparation wie oben in Beispiel 15 beschrieben mit einer 4fachen Konzentration (6,0% Trypton, 2,0% Soyton, 2,0% NaCl, pH 7,3), sowie 50 μl einer 70%igen ethanolischen Lösung von 2% Nystatin (Wachstumsinhibitor von Koji) und 20 μl (endgültige Konzentration 0,01 U/ml) Adenosinphosphatdeaminase (5 U/ml) zu 8 ml der Suspension zugefügt und nur Bacillus subtilis wurde selektiv bei 35°C stationär kultiviert. Während des Kultivierens wurden die Kulturlösungen in einer Menge von 100 μl mit dem Zeitverlauf entnommen und 100 μl des ATP-Extraktionsreagenz (KIKKOMAN) wurden der Lösung zugefügt, gefolgt von 100 μl Lucifer LU (ATP-Meßreagenz, KIKKOMAN) nach 20 Sekunden, um die Lumineszenz mit einem Lumitester K-100 (KIKKOMAN) zu messen (der gemessene Wert wird durch die relative Lichteinheit dargestellt).
  • Die relative Proliferation von Bacillus subtilis mit dem Zeitverlauf kann durch Messung der Lumineszenzmenge überprüft werden.
  • Die Ergebnisse sind in 12 dargestellt.
  • Wie oben beschrieben, wurde aus dem Ergebnis von Tabelle 7 offenbart, dass freies ATP in hoher Konzentration vorliegt und eine relative Lichteinheit von 2.718 in dem SCD-Medium aufweist. Dieser Wert kann nicht von dem Wert der ATP-Konzentration (relative Lichteinheit = ca. 3.000) von Bacillus subtilis in dem Anteil von 5,0 × 103/g Koji in diesem Beispiel nach 4 Stunden unterschieden werden. Es ist unmöglich, die korrekte Messung von Bacillus subtilis durch das konventionelle Verfahren durchzuführen, worin das freie ATP in dem SCD-Medium nicht eliminiert wird.
  • Demgegenüber ist es, wie sich aus dem Ergebnis gemäß 12 ergibt, möglich, die ATP-Menge von Bacillus subtilis korrekt zu messen, indem zunächst das freie ATP in dem SCD-Medium gemäß der vorliegenden Erfindung eliminiert wird.
  • Beispiel 17
  • Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Milchsäurebakterien in damit kontaminiertem Soja Koji
  • Die quantitative Bestimmung von Milchsäurebakterien in Soja Koji, das damit kontaminiert ist, wurde auf dieselbe Weise durchgeführt wie bei dem Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bacillus subtilis in Soja Koji, das damit kontaminiert wurde, außer dass Bacillus subtilis durch das Milchsäurebakterium Leuconostoc mesenteroides AHU1065 ersetzt wurde.
  • Die Ergebnisse sind in 13 dargestellt.
  • Es ergibt sich aus den Ergebnissen von der 12 und 13, dass sich die relative Lichteinheit in den Anteilen von Bacillus subtilis und den Milchsäurebakterien, die Soja Koji kontaminieren, in einer anfänglichen Konzentration von 5 × 102/g Koji und 4,3 × 102/g Koji selbst nach 4 Stunden nicht wesentlich erhöht.
  • Demgegenüber ist die relative Lichteinheit in den Anteilen der Bakterien, die Soja Koji in der anfänglichen Konzentration von 5 × 103/g Koji bzw. 3,3 × 103/g Koji kontaminieren nach 4 Stunden, deutlich erhöht.
  • Die anfängliche Konzentration der komtaminierenden Bakterien (Bacillus subtilis und Milchsäurebakterien) in den Soja Koji beladenen Materialien können ungefähr quantitativ gemessen werden.
  • Beispiel 18
  • Verfahren zur quantitativen Bestimmung verschiedener Keime in damit kontaminiertem Soja Koji
  • Ein Material zur Herstellung von Koji wurde hergestellt, indem gekochte und enthäutete Sojabohnen mit geröstetem und zerdrücktem Weizen gemäß dem konventionellen Verfahren zur Herstellung von Soja Koji vermischt wurde.
  • Ein Samen Koji für Sojasosse wurde in das Material inokuliert und eine Suspension verschiedener Keime, isoliert aus Haushaltsabfallwasser (lebensfähige Zellen 109/ml) wurde einheitlich daraufgesprüht, um ein Material zur Herstellung von Koji, das mit verschiedenen Keimen kontaminiert ist, zu erhalten.
  • Dieses Material war das Material zur Herstellung von Koji, enthaltend verschiedene Keime (Zähler/g Koji), wie beschrieben in 14.
  • Als nächstes wurden die verschiedenen Keime quantitativ auf dieselbe Weise gemessen, wie bei dem Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bacillus subtilis in Soja Koji, das damit kontaminiert war, wie in Beispiel 1F, außer dass das mit Bacillus subtilis kontaminierte Soja Koji durch das Material zur Herstellung von Koji, kontaminiert mit verschiedenen Keimen, ersetzt wurde.
  • Das Ergebnis ist in 14 dargestellt.
  • Es lässt sich durch das Ergebnis gemäß Figur 14 beweisen, dass eine ungefähre Zählung verschiedener Keime bei der Initiation der Herstellung von Koji geschätzt werden kann.
  • Das heißt, die relative Lumineszenz ist selbst nach 4 Stunden in dem Material mit einer Konzentration verschiedener Keime, die das Material kontaminieren mit 1,5 × 102/g Material, nur wenig erhöht, während es nach 4 Stunden in dem Material deutlicher erhöht ist, das eine Konzentration verschiedener Keime aufweist, die das Material mit 3,2 × 103/g Material kontaminieren. Es ergibt sich damit, dass verschiedene Keime in dem anfänglichen Material zur Herstellung von Koji ungefähr quantitativ bestimmt werden können.
  • Beispiel 19
  • Verfahren zur Messung der Menge von ATP pro KBE Saccharomyces cerevisiae
  • Die folgenden Schritte wurden in dieser Reihenfolge zur Messung der ATP-Menge pro KBE in Saccharomyces cerevisiae durchgeführt:
    • Schritt 1: Herstellung der Kulturlösung von Saccharomyces cerevisiae als Zielmikroorganismus.
    • Schritt 2: Eliminieren von freiem ATP aus der Kulturlösung.
    • Schritt 3: Herstellung eines Phosphatpuffers zur Verdünnung der Kulturlösung des Zielmikroorganismus.
    • Schritt 4: Herstellung einer Suspension des Zielmikroorganismus.
    • Schritt 5: Messung der Lumineszenz von freiem ATP in der Suspension des Zielmikroorganismus.
    • Schritt 6: Zugabe eines ATP-Extraktionsmittels zu der verdünnten Suspension des Zielmikroorganismus und Messung der Lumineszenz des gesamten ATP, bestehend aus freiem ATP, das vor Zugabe des Extraktionsmittels vorliegt und des extrahierten ATPs nach Zugabe des Extraktionsmittels.
    • Schritt 7: Berechnung der Menge der Lumineszenz von ATP in den Zellen.
    • Schritt 8: Berechnung der korrigierten Menge der Lumineszenz von ATP in den Zellen.
    • Schritt 9: Berechnung der ATP-Konzentration, korrespondierend zu der korrigierten Lumineszenzmenge.
    • Schritt 10: Berechnung der KBE pro ml der Suspension des Zielmikroorganismus durch das Gusskulturverfahren.
    • Schritt 11: Messung der ATP-Menge pro KBE.
  • Schritt 1: Herstellung der Kulturlösung von Saccharomyces cerevisiae als Zielmikroorganismus
  • In 8 ml eines YM-Mediums (1% Glucose, 0,5% Pepton, 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Malzextrakt, pH 6,0) wurde Saccharomyces cerevisiae NISL Y-3398 in einer Platinschlaufenmenge inokuliert und über Nacht bei 35°C stationär kultiviert um eine Kulturlösung zu erhalten.
  • Schritt 2: Eliminieren von freiem ATP aus der Kulturlösung des Zielmikroorganismus.
  • Zu 2 ml der Kulturlösung (enthaltend eine grobe Menge lebensfähige Zellen), erhalten in dem vorherigen Schritt, wurden Apyrase und Adenosinphosphatdeaminase so zugefügt, dass die endgültigen Konzentrationen jeweils 0,05 U/ml betrugen und die Mischung wurde für 30 Minuten bei 35°C behandelt um vorläufig freies ATP in der Kulturlösung zu eliminieren.
  • Das Leerniveau von ATP kann durch diese Behandlung erniedrigt werden.
  • Schritt 3: Herstellung eines Phosphatpuffers zur Verdünnung der Kulturlösung des Zielmikroorganismus.
  • Ein Phosphatpuffer, 0,625 mM KH2PO4 (pH 7,2), wurde durch Erwärmen in einem Autoklaven sterilisiert um eine Verdünnung der Kulturlösung, erhalten in dem vorstehenden Schritt, zu erhalten, worin freies ATP eliminiert worden war (hiernach bezeichnet als Phosphatpuffer).
  • Schritt 4: Herstellung einer Suspension des Zielmikroorganismus
  • Die Kulturlösung, worin freies ATP eliminiert worden war, wurde mit dem Phosphatpuffer zur Verdünnung zur Herstellung einer 100.000fach verdünnten Suspension Saccharomyces cerevisiae verdünnt. Man ließ die Verdünnung für 30 Minuten bei 25°C vor der Verwendung als Probe zur Messung der Lumineszenz stehen.
  • Schritt 5: Messung der Lumineszenz von freiem ATP in der Suspension des Zielmikroorganismus
  • Zu 100 μl der 100.000fach verdünnten Suspension des Zielmikroorganismus wurden 100 μl hochreines Wasser zugefügt, gefolgt von 100 μl des Lumineszezreagenzes und die Mischung wurde einer Lumineszenzmessung mit dem LUMITESTER K-100 (KIKKOMAN) zur Bestimmung der Lumineszenzmenge unterzogen.
  • Die Lumineszenzmenge von freiem ATP (hiernach bezeichnet als freie Lumineszenzmenge F) in der verdünnten Suspension des Zielmikroorganismus wird durch diese Messung bestimmt.
  • Schritt 6: Zugabe eines ATP-Extraktionsmittels zu der verdünnten Suspension des Zielmikroorganismus und Messung der Lumineszenz des Gesamt-ATP, bestehend aus freiem ATP, das vor Zugabe des Extraktionsmittels vorliegt und des extrahierten ATPs.
  • Zu 100 μl einer 100.000fachen Verdünnung der Zielmikroorganismus-Suspension wurden 100 μl des ATP-Extraktionsreagenzes (KIKKOMAN), gefolgt von 100 μl des Lumineszenzreagenzes nach 20 Sekunden bei Raumtemperatur zugefügt und die Mischung wurde der Lumineszenzmessung mit dem LUMITESTER K-100 (KIKKOMAN) zur Bestimmung der Lumineszenzmenge unterzogen. Die Lumineszenzmenge des Gesamt-ATP (T) von freiem ATP und ATP, extrahiert aus den Mikroorganismenzellen durch die Wirkung des Extraktionsmittels, wurde durch dieses Verfahren bestimmt.
  • Schritt 7: Berechnung der Lumineszenzmenge von ATP in den Zellen
  • Die Lumineszenzmenge von ATP in den Zellen (T – F) wird korrekt durch Subtraktion der freien Lumineszenzmenge {F) von der Gesamt-Lumineszenzmenge (T) bestimmt.
  • Schritt 8: Berechnung der korrigierten Lumineszenzmenge von ATP in den Zellen
  • Die oben beschriebene Luziferin-Luziferase-Lumineszenz-Reaktion wird etwas durch Bestandteile inhibiert, die in der Zielmikroorganismussuspension enthalten sind und muß korrigiert werden um die Lumineszenzmenge ohne Lumineszenz-Inhibition zu bestimmen.
  • Das heißt, 100 μl einer 2 × 10–10 M ATP-Standardlösung wurden zu 100 μl der Zielmikroorganismus-Suspension, gefolgt von 100 μl des Luminesreagenzes nach 20 Sekunden zugefügt und die Lumineszenzmenge wurde mit dem LUMITESTER K-100 (KIKKOMAN) gemessen um die Menge der internen Standard-Lumineszenz H zu bestimmen.
  • Als nächstes wurde die Lumineszenzmenge gemessen, um die Menge der tatsächlichen Standard-Lumineszenz G zu bestimmen, auf dieselbe Weise wie bei dem Verfahren zur Bestimmung der oben beschriebenen Menge der internen Standard-Lumineszenz, außer dass 100 μl steriles hochreines Wasser anstelle von 100 μl der Zielmikroorganismus-Suspension verwendet wurden.
  • Dann wurde die Lumineszenz Y (korrigierter Wert) von intrazellulärem ATP in dem Fall ohne Lumineszenz-Inhibition aus der folgenden Berechnungsformel bestimmt: Y = (T – F)/K K = (H – F)/G worin H: interne Standard-Lumineszenzmenge
    F: freie Lumineszenzmenge
    G: tatsächliche Standard-Lumineszenzmenge
    K: Lumineszenzrate
    T – F: Lumineszenzmenge von intrazellulärem ATP, erhalten in dem vorherigen Schritt
    T: Gesamt-Lumineszenzmenge.
  • Schritt 9: Berechnung der Konzentration von ATP, korrespondierend zu der korrigierten Lumineszenzmenge
  • Die ATP-Konzentration, korrespondierend zu der (korrigierten) Lumineszenzmenge von ATP in den Zellen in Abwesenheit einer Lumineszenz-Inhibition wurde gemäß der in 10 dargestellten Kalibrierungskurve bestimmt, die vorher hergestellt worden war.
  • Schritt 10: Berechnung der KBE pro ml der Zielmikroorganismus-Suspension durch das Gusskulturverfahren
  • Die Zielmikroorganismus-Suspension wurde mit einem sterilen YM-Medium auf eine geeignete Konzentration verdünnt, auf eine sterile Platte, enthaltend 2% Agar, ausplattiert und über Nacht bei 35°C kultiviert. Die auftretenden Kolonien wurden gezählt um die KBE pro ml der Zielmikroorganismus-Suspension unter Einbeziehung der Verdünnung zu schätzen.
  • Schritt 11: Messung der ATP-Menge pro KBE
  • Die ATP-Menge pro KBE Saccharomyces cerevisiae wurde bestimmt, indem die ATP-Konzentration (mol/ml), korrespondierend zu der (korrigierten) Lumineszenzmenge von ATP in Zellen in Abwesenheit einer Lumineszenz-Inhibition durch die KBE pro ml der Zielmikroorganismus-Suspension, erhalten in Schritt 10 (KBE/ml) geteilt wurde, Im Ergebnis wurde die ATP-Menge mit 3,07 × 10–16 mol/KBE erhalten.
  • Dieses Ergebnis unterscheidet sich etwas von dem Ergebnis gemäß dem vorstehenden Beispiel 11 (1,21 × 10–16 mol/KBE), es wird jedoch angenommen, dass sich dies aus dem Unterschied der verdünnten Suspensionen ergibt.
  • Die oben beschriebenen Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt.
  • Die ATP-Menge pro KBE Saccharomyces cerevisiae (mol/KBE)
    Figure 00610001
  • Die ATP-Menge pro KBE des Zielmikroorganismus Saccharomyces cerevisiae kann einfach aus dem Ergebnis gemäß Tabelle 8 gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt werden.
  • Beispiel 20
  • Verfahren zur Messung der lebensfähigen Zellen von Saccharomyces cerevisiae in Tomatenketchup
  • Die folgenden Schritte wurden in dieser Reihenfolge durchgeführt, um die Konzentration von Saccharomyces cerevisiae in Tomatenketchup zu bestimmen:
    • Schritt 1: Herstellung der verdünnten Suspension von Tomatenketchup, enthaltend Saccharomyces cerevisiae, als Zielmikroorganismus.
    • Schritt 2: Eliminieren von freiem ATP aus der verdünnten Tomatenketchup-Suspension.
    • Schritt 3: Messung der Lumineszenz von freiem ATP in der verdünnten Tomatenketchup-Suspension, worin freies ATP eliminiert wurde.
    • Schritt 4: Zugabe eines ATP-Extraktionsmittels zu der verdünnten Tomatenketchup-Suspension, worin freies ATP eliminiert wurde und Messung der Lumineszenz von Gesamt-ATP, bestehend aus einer Spurenmenge von freiem ATP und dem extrahierten ATP nach Zugabe des Extraktionsmittels.
    • Schritt 5: Messung der Lumineszenzmenge von ATP, extrahiert aus den Zellen.
    • Schritt 6: Berechnung der korrigierten Menge der Lumineszenz von ATP.
    • Schritt 7: Berechnung der ATP-Konzentration, korrespondierend zu der korrigierten Lumineszenzmenge.
    • Schritt 8: Berechnung der KBE pro ml der verdünnten Tomatenketchup-Suspension, enthaltend Saccharomyces cerevisiae.
    • Schritt 9: Vergleichsbeispiel (Berechnung der KBE pro ml der verdünnten Tomatenketchup-Suspension, enthaltend Saccharomyces cerevisiae, durch das Gusskulturverfahren).
  • Schritt 1: Herstellung der verdünnten Suspension von Tomatenketchup, enthaltend Saccharomyces cerevisiae als Zielmikroorganismus
  • 8 μl einer Kulturlösung von Saccharomyces cerevisiae, 10fach mit einem Phosphatpuffer (Verdünnungsmittel) verdünnt, wurden zu 2,0 g eines kommerziell erhältlichen Tomatenketchups zugefügt, gefolgt von 18 ml eines zusätzlichen Verdünnungsmittels und die Mischung wurde homogen vermischt.
  • Als nächstes wurde ein 1 ml Anteil der Mischung entnommen, wozu 19 ml Verdünnungsmittel zugefügt wurden und die Mischung wurde homogen vermischt, um eine 200fache Verdünnung des Tomatenketchups herzustellen, enthaltend den Zielmikroorganismus.
  • Schritt 2: Eliminieren von freiem ATP aus der verdünnten Tomatenketchup-Suspension
  • Zu der verdünnten Tomatenketchup-Suspension wurden Apyrase und Adenosinphosphatdeaminase zugefügt, so dass die endgültigen Konzentrationen jeweils 0,05 U/ml betrugen und die Mischung wurde für 30 Minuten bei 25°C behandelt, um eine verdünnte Tomatenketchup-Suspension herzustellen, aus der freies ATP eliminiert worden war.
  • Als Vergleich wurde freies ATP auf dieselbe Weise wie oben eliminiert, außer dass die Kombination aus Apyrase und Adenosinphosphatdeaminase durch Apyrase allein ersetzt wurde.
  • Die Ergebnisse sind in 15 dargestellt.
  • Es ergibt sich aus dem Ergebnis gemäß 15, dass Apyrase allein das freie ATP in der verdünnten Tomatenketchup-Suspension nicht eliminieren kann, dass jedoch die Kombination aus Apyrase und Adenosinphosphatdeaminase die anfängliche Konzentration des freien ATPs in der verdünnten Suspension auf ein Niveau von ungefähr 1/10.000 erniedrigen kann.
  • Schritt 3: Messung der Lumineszenz von freiem ATP in der verdünnten Tomatenketchup-Suspension, worin freies ATP eliminiert wurde.
  • Zu 100 μl der verdünnten Tomatenketchup-Suspension, aus der freies ATP eliminiert worden war, wurden 100 μl steriles hochreines Wasser und 100 μl des Lumineszenzreagenzes zugefügt und die Mischung wurde einer Lumineszenzmessung von ATP mit einem LUMITESTER K-100 (KIKKOMAN) unterzogen.
  • Die Lumineszenzmenge der Spurenmenge des freien ATP (F) kann durch diese Messung bestimmt werden.
  • Schritt 4: Zugabe eines ATP-Extraktionsmittels zu der verdünnten Tomatenketchup-Suspension, aus der freies ATP eliminiert worden war und Messung der Lumineszenz des Gesamt-ATP, bestehend aus der Spurenmenge von freiem ATP und dem extrahierten ATP aus den Zellen (ATP in den Zellen)
  • Zu 100 μl einer verdünnten Tomatenketchup-Suspension wurden 100 μl des ATP-Extraktionsreagenzes (KIKKOMAN) zugefügt, gefolgt von 100 μl des Lumineszenzreagenzes nach 20 Sekunden bei Raumtemperatur und die Mischung wurde der Lumineszenzmessung mit dem LUMITESTER K-100 (KIKKOMAN) unterzogen.
  • Die Lumineszenzmenge des Gesamt-ATP (T) der Spurenmenge von freiem ATP in der Suspension und ATP, extrahiert aus dem Zellen (ATP in den Zellen) kann durch dieses Verfahren bestimmt werden.
  • Schritt 5: Messung der Lumineszenzmenge von ATP, extrahiert aus den Zellen
  • Die Lumineszenzmenge von ATP, extrahiert aus den Zellen (T – F) wird korrekt durch Subtraktion der freien Lumineszenzmenge F von der Gesamtmenge der Lumineszenz T bestimmt.
  • Schritt 6: Berechnung der korrigierten Lumineszenzmenge
  • Die Luziferin-Luziferase-Lumineszenzreaktion wie oben beschrieben, wird etwas durch Bestandteile inhibiert, die in der Suspension enthalten sind und muß korrigiert werden, um die Lumineszenzmenge ohne Lumineszenz-Inhibition zu bestimmen.
  • Das heißt, 100 μl einer 2 × 10–10 M ATP-Standardlösung wurden zu 100 μl der Suspension zugefügt, gefolgt von 100 μl des Lumineszenzreagenzes nach 20 Sekunden und die Lumineszenzmenge wurde mit dem LUMITESTER K-100 (KIKKOMAN) gemessen, um die Menge der internen Standard-Lumineszenz H zu bestimmen.
  • Als nächstes wurde die Menge der tatsächlichen Standard-Lumineszenz G auf dieselbe Weise wie bei dem Verfahren zur Bestimmung der oben beschriebenen Menge der internen Standard-Lumineszenz H gemessen, außer dass 100 μl steriles hochreines Wasser anstelle von 100 μl der Suspension verwendet wurden.
  • Dann wurde die Lumineszenz Y (korrigierter Wert) von intrazellulärem ATP in dem Fall ohne Lumineszenz-Inhibition aus der folgenden Berechnungsformel bestimmt: Y = (T – F)/K K = (H – F)/G worin H: interne Standard-Lumineszenzmenge
    F: freie Lumineszenzmenge
    G: tatsächliche Standard-Lumineszenzmenge
    K: Lumineszenzrate
    T – F: Lumineszenzmenge von intrazellulärem ATP, erhalten in dem vorherigen Schritt
    T: Gesamt-Lumineszenzmenge.
  • Schritt 7: Berechnung der Konzentration von ATP, korrespondierend zu der korrigierten Lumineszenzmenge
  • Die ATP-Konzentration, korrespondierend zu der (korrigierten) Lumineszenzmenge von ATP in den Zellen in Abwesenheit einer Lumineszenz-Inhibition wurde gemäß der in 10 dargestellten Kalibrierungskurve bestimmt, die vorher hergestellt worden war.
  • Schritt 8: Berechnung von KBE pro ml der verdünnten Tomatenketchup-Suspension, enthaltend Saccharomyces cerevisiae
  • Die ATP-Konzentration, korrespondierend zu der korrigierten Lumineszenzmenge wie erhalten in Schritt 7 dieses Beispiels, wurde durch die Menge von ATP pro KBE Saccharomyces cerevisiae geteilt, 3,07 × 10–16 mol, erhalten in Schritt 11 (letztem Schritt) in Beispiel 19, um die KBE-Konzentration pro ml der verdünnten Tomatenketchup-Suspension, enthaltend Saccharomyces cerevisiae, zu berechnen. Das heißt, das Ergebnis der Schätzung der lebensfähigen Zellen von Saccharomyces cerevisiae in Tomatenketchup wurde erhalten.
  • Schritt 9: Vergleichsbeispiel (Berechnung der KBE pro ml der verdünnten Tomatenketchup-Suspension, enthaltend Saccharomyces cerevisiae)
  • Die verdünnte Tomatenketchup-Suspension, enthaltend Saccharomyces cerevisiae, wurde in geeigneter Weise mit einem YM-Medium verdünnt, auf ein YM-Medium, enthaltend Agar, durch das Gusskulturverfahren ausplattiert und bei 35°C für 24 Stunden kultiviert. Die auftretenden Kolonien wurden gezählt, um die KBE pro ml der verdünnten Suspension unter Einbeziehung der Verdünnung zu schätzen.
  • Die so erhaltene Konzentration der lebensfähigen Zellen wird als der beobachtete Wert, erhalten durch das Gusskulturverfahren (KBE pro ml) betrachtet.
  • Die oben beschriebenen Ergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt.
  • Tabelle 9 Messung der lebensfähigen Zellen von Saccharomyces cerevisiae in Tomatenketchup (mol/KBE)
    Figure 00670001
  • Die Konzentration der lebensfähigen Zellen der verdünnten Tomatenketchup-Suspension, enthaltend Saccharomyces cerevisiae, gemäß dem Ergebnis der Tabelle 9 gemäß der vorliegenden Erfindung beträgt 9,23 × 10 KBE/ml, was vergleichbar ist mit 8,15 × 10 KBE/ml, erhalten durch das Gusskulturverfahren, von dem konventionell angenommen wurde, dass es eine hohe Präzision und hohe Verlässlichkeit bei der Messung aufweist.
  • Es ergibt sich außerdem, dass die lebensfähigen Zellen von Saccharomyces cerevisiae in 1 g Tomatenketchup 1,85 × 104 ausmachen, was durch Multiplikation der Konzentration der lebensfähigen Zellen (berechnet) mit der Verdünnungsrate, 200fach, erhalten wird.
  • Es ergibt sich dadurch, dass die lebensfähigen Zellen von Saccharomyces cerevisiae in Tomatenketchup schnell gemessen werden können.
  • Beispiel 21
  • Eliminieren von freiem ATP in einer verdünnten Apfelsaft-Suspension, kontaminiert mit Saccharomyces cerevisiae
  • Eine verdünnte Apfelsaft-Suspension, kontaminiert mit Saccharomyces cerevisiae, wurde auf dieselbe Weise wie bei dem Verfahren gemäß Beispiel 20 (Verfahren zur Messung der Konzentration der lebensfähigen Zellen von Saccharomyces cerevisiae in Tomatenketchup) hergestellt, außer, dass der Tomatenketchup durch eine 100%ige Apfelsaft-Suspension ersetzt wurde und Schritt 1 „Herstellung der verdünnten Suspension von Tomatenketchup, enthaltend Saccharomyces cerevisiae als Zielmikroorganismus" durch den folgenden ersetzt wurde: „Schritt 1: Herstellung der verdünnten Suspension von Apfelsaft, enthaltend Saccharomyces cerevisiae als Zielmikroorganismus. Ein 5 μl Teil einer Saccharomyces cerevisiae Kulturlösung wurde mit 5 ml einer kommerziell erhältlichen 100%igen Apfelsaft-Suspension zugefügt und homogen vermischt. Zu 1 ml der entnommenen Mischung wurden 19 ml eines Verdünnungsmittels (Phosphatpuffer) zugefügt, um eine 20fache Verdünnung einer Apfelsaft-Suspension, kontaminiert mit Saccharomyces cerevisiae, herzustellen." Zu der verdünnten Apfelsaft-Suspension wurden Apyrase und Adenosinphosphatdeaminase zugefügt, so dass die endgültigen Konzentrationen jeweils 0,05 U/ml betrugen und die Mischung wurde bei 25°C für 35 Minuten behandelt, um das freie ATP zu eliminieren.
  • Als Vergleich wurde das freie ATP auf dieselbe Weise wie oben eliminiert, außer dass die Kombination aus Apyrase und Adenosinphosphatdeaminase durch Apyrase allein in einer endgültigen Konzentration von 0,05 U/ml ersetzt wurde.
  • Die Ergebnisse sind in 16 dargestellt.
  • Es ergibt sich aus der 16, dass der Anteil, zu dem Apyrase allein im Vergleichsbeispiel zugefügt wurde, das freie ATP nur in einer geringen Menge aus dem Apfelsaft eliminieren kann, der Anteil, zu dem die Kombination aus Apyrase und Adenosinphosphatdeaminase gemäß der vorliegenden Erfindung zugefügt wurde, die Konzentration des anfänglichen freien ATPs in dem Apfelsaft auf ein Niveau von ungefähr einigen Millionstes erniedrigen kann.
  • Beispiel 22
  • Messung der Konzentration der lebensfähigen Zellen von Saccharomyces cerevisiae in Apfelsaft
  • Eine verdünnte Apfelsaft-Suspension, enthaltend den Zielmikroorganismus, wurde auf dieselbe Weise wie bei dem Verfahren gemäß Beispiel 20 „Verfahren zur Messung der Konzentration der lebensfähigen Zellen von Saccharomyces cerevisiae in Tomatenketchup" erhalten, außer dass der Tomatenketchup durch eine 100%ige Apfelsaft-Suspension ersetzt wurde und Schritt 1 durch den folgenden ersetzt wurde:
  • "Schritt 1: Herstellung der verdünnten Suspension von Apfelsaft, enthaltend Saccharomyces cerevisiae als Zielmikroorganismus. Ein 5 μl Anteil einer Saccharomyces cerevisiae Kulturlösung wurde zu 5 ml einer kommerziell erhältlichen 100%igen Apfelsaft-Suspension zugefügt und damit homogen vermischt. Zu einem entnommenen ml der Mischung wurden 19 ml eines Verdünnungsmittels (Phosphatpuffer) zur Herstellung einer 20fachen Verdünnung einer Apfelsaft-Suspension, kontaminiert mit Saccharomyces cerevisiae zugefügt." "Die Konzentration der lebensfähigen Zellen von Saccharomyces cerevisiae in dem Apfelsaft wurde gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 dargestellt.
  • Tabelle 10 Messung der lebensfähigen Zellen von Saccharomyces cerevisiae in Apfelsaft (mol/KBE)
    Figure 00700001
  • Die Konzentration der lebensfähigen Zellen der 20fachen Verdünnung der Apfelsaft-Suspension, enthaltend Saccharomyces cerevisiae (KBE/ml), aus dem Ergebnis gemäß Tabelle 10 gemäß der vorliegenden Erfindung beträgt 2,47 × 103, was vergleichbar ist zu den 1,47 × 103, erhalten durch das Gusskulturverfahren, von dem konventionell angenommen wurde, dass es die höchste Präzision wie auch Verlässlichkeit der Messung aufweist.
  • Es ergibt sich außerdem, dass die lebensfähigen Zellen von Saccharomyces cerevisiae in 1 g Apfelsaft 4,93 × 104 annehmen, was durch Multiplikation der Konzentration der lebensfähigen Zellen (berechnet) mit der Verdünnungsrate, 20fach, erhalten wird.
  • Es ergibt sich so, dass die lebensfähigen Zellen von Saccharomyces cerevisiae in dem Apfelsaft schnell gemessen werden können.
  • Beispiel 23
  • Eliminieren von freiem ATP in einer Bohnenquark-Suspension, kontaminiert mit verschiedenen Keimen
  • Eine verdünnte, Seide-gefilterte Bohnenquark-Suspension, kontaminiert mit verschiedenen Keimen, wurde auf dieselbe Weise wie bei dem Verfahren gemäß Beispiel 20 hergestellt (Verfahren zur Messung der Konzentration der lebensfähigen Zellen von Saccharomyces cerevisiae in Tomatenketchup), außer, dass der Tomatenketchup durch einen kommerziell erhältlichen Seide-gefilterten Bohnenquark ersetzt wurde und Schritt 1 wurde durch das Folgende ersetzt:
  • „Schritt 1: Herstellung der verdünnten Suspension von Seide-gefiltertem Bohnenquark, enthaltend verschiedene Keime.
  • Ein kommerziell erhältlicher frischer Seide-gefilterter Bohnenquark wurde mit einer geeigneten Menge einer Keimsuspension vermischt, die vorher aus Haushaltsabfallwasser abgetrennt worden war, um einen Bohnenquark, kontaminiert mit verschiedenen Keimen zu ergeben. Zu 10 g des Bohnenquarks wurden 90 ml eines Phosphatpuffers (Verdünnungsmittel) zugefügt und mit einer Mahlvorrichtung STOMACHER 400-T (Organo) zur Herstellung einer verdünnten Suspension des Bohnenquarks gemahlen. Zu einem 1 ml Anteil der Suspension wurden 39 ml des Verdünnungsmittels zugefügt und die Mischung wurde homogen verrührt um schließlich eine 400fach verdünnte Bohnenquark-Suspension herzustellen.
  • Zu der verdünnten Bohnenquark-Suspension wurden Apyrase und Adenosinphosphatdeaminase zugefügt, so dass die endgültigen Konzentrationen je 0,05 U/ml betrugen und die Mischung wurde für 35 Minuten bei 25°C behandelt, um das freie ATP zu eliminieren.
  • Die Ergebnisse sind in 17 dargestellt.
  • Es ergibt sich aus dem Ergebnis gemäß 17, dass der Teil, zu dem die Apyrase allein in dem Vergleichsbeispiel zugefügt wurde, das freie ATP auf ein Niveau von ungefähr einem Zehntausendstel eliminieren konnte, während in dem Teil, zu dem die Kombination aus Apyrase und Adenosinphosphatdeaminase gemäß der vorliegenden Erfindung zugefügt wurde, die Konzentration des anfänglichen freien ATPs auf ein Niveau von ungefähr einigen Hunderttausendstel erniedrigt werden konnte.
  • Beispiel 24
  • Messung der Konzentration der lebensfähigen Zellen von kontaminierenden Keimen in Bohnenquark
  • Ein Seide-gefilterter Bohnenquark, kontaminiert mit verschiedenen Keimen, wurde auf dieselbe Weise wie bei dem Verfahren von Beispiel 20 hergestellt „Verfahren zur Messung der Konzentration der lebensfähigen Zellen von Saccharomyces cerevisiae in Tomatenketchup", außer, dass der Tomatenketchup durch einen Seide-gefilterten Bohnenquark ersetzt wurde und dass Schritt 1 durch den folgenden ersetzt wurde:
  • Schritt 1: Herstellung einer verdünnten Seide-gefilterten Bohnenquark-Suspension, kontaminiert mit verschiedenen Keimen
  • Ein kommerziell erhältlicher frischer Seide-gefilterter Bohnenquark wurde mit einer geeigneten Menge einer Keimsuspension vermischt, die vorher aus Haushaltsabfallwasser abgetrennt worden war, um einen Bohnenquark, kontaminiert mit verschiedenen Keimen zu ergeben. Zu 10 g des Bohnenquarks wurden 90 ml eines Phosphatpuffers (Verdünnungsmittel) zugefügt und mit einer Mahlvorrichtung STOMACHER 400-T (Organo) zur Herstellung einer verdünnten Suspension des Bohnenquarks gemahlen. Zu einem 1 ml Anteil der Suspension wurden 39 ml des Verdünnungsmittels zugefügt und die Mischung wurde homogen verrührt um schließlich eine 400fach verdünnte Bohnenquark-Suspension herzustellen.
  • Die Konzentration der lebensfähigen Zellen des verschiedenen Keime in dem Seide-gefilterten Bohnenquark wurde gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 dargestellt.
  • (1) Der in Tabelle 11 angegebene beobachtete Wert wird durch das folgende Verfahren bestimmt.
  • Berechnen von KBE pro ml der Zielmikroorganismus-Suspension durch das Gusskulturverfahren
  • Die Zielmikroorganismus-Suspension wurde in geeigneter Weise mit einem sterilen Standard-Flüssig-Medium verdünnt, auf einem sterilen Standard-Agar-Medium ausplattiert, enthaltend 2 Agar und für 2 Tage bei 35°C kultiviert. Die erscheinenenden Kolonien wurden gezählt, um die KBE pro ml der verdünntem Suspension unter Einbeziehung der Verdünnung zu schätzen.
  • (2) Die Anzahl der lebensfähigen Zellen in der verdünnten Zielmikroorganismus-Suspension wurde bestimmt, indem die ATP-Menge in den lebensfähigen Zellen durch die ATP-Menge pro KBE, wie vorläufig erhalten, geteilt wurde und in diesem Beispiel wurde die Konzentration der lebensfähigen Zellen in dem Bohnenquark unter Verwendung der Menge von ATP pro KBE von allgemein lebensfähigen Bakterien, 3 × 10–18 mol/KBE, bestimmt.
  • Das Ergebnis ist in Tabelle 11 dargestellt. Tabelle 11 Messung der verschiedenen Bakterien in Bohnenquark
    Figure 00740001
  • Die Konzentration (berechnet) von lebensfähigen Zellen in der 400fach verdünnten Suspension, kontaminiert mit verschiedenen Keimen (KBE/ml) gemäß der vorliegenden Erfindung aus dem Ergebnis von Tabelle 11 beträgt 2,60 × 104. Dies ist vergleichbar mit den 2,32 × 104, erhalten durch das Gusskulturverfahren, von dem konventionell angenommen wurde, dass es die höchste Präzision und Verlässlichkeit der Messung aufwies. Es ergibt sich außerdem, dass die lebensfähigen Zellen der kontaminierenden Bakterien in 1 g Bohnenquark 1,04 × 107 beträgt, was durch Multiplikation der Konzentration der lebensfähigen Zellen (berechnet) mit der Verdünnungsrate, 400fach, erhalten wird.
  • Beispiel 25
  • Eliminieren von ATP in einer Krebsbeinfleisch-ähnlichen, gekochten Fischpaste, kontaminiert mit verschiedenen Keimen
  • Eine verdünnte, Krebsbeinfleisch-ähnliche, gekochte Fischpasten-Suspension, kontaminiert mit verschiedenen Keimen, wurde auf dieselbe Weise wie bei dem Verfahren gemäß Beispiel 20 hergestellt (Verfahren zur Messung der Konzentration der lebensfähigen Zellen von Sacharomyces cerevisiae in Tomatenketchup), außer dass der Tomatenketchup durch eine Krebsbeinfleisch-ähnliche, gekochte Fleischpaste-Suspension ersetzt wurde und Schritt 1 durch den Folgenden ersetzt wurde:
  • Schritt 1: Herstellung der verdünnten Suspension einer Krebsbeinfleisch-ähnlichen, gekochten Fischpaste, kontaminiert mit dem Zielmikroorganismus
  • Eine Krebsbeinfleisch-ähnliche, gekochte Fischpaste, kontaminiert mit verschiedenen Keimen, wurde erhalten, indem eine kommerziell erhältliche Krebsbeinfleisch-ähnliche, gekochte Fischpaste mit einer geeigneten Menge einer Suspension verschiedener Keime besprüht wurde, die vorher aus Haushaltsabfallwasser isoliert worden waren. Zu 10 g der Paste wurden 90 ml eines Phosphatpuffers als Verdünnungsmittel zugefügt und die Mischung wurde mit einer Druck-Mahl-Vorrichtung STOMACHER 400-T (Organo) aufgebrochen, um eine verdünnte Suspension einer Krebsbeinfisch-ähnlichen, gekochten Fischpaste herzustellen. Zu 1 ml des Überstands der Suspension wurden 9 ml Verdünnungsmittel zugefügt und die Mischung wurde homogen gemischt, um schließlich eine 100fach verdünnte Suspension einer Krebsbeinfleisch-ähnlichen, gekochten Fischpaste herzustellen.
  • Zu der verdünnten Suspension wurden Apyrase und Adenosinphosphatdeaminase zugefügt, so dass die endgültigen Konzentrationen je 0,05 U/ml betrugen und die Mischung wurde für 30 Minuten bei 25°C behandelt, um das freie ATP zu eliminieren.
  • Die Ergebnisse sind in 18 dargestellt.
  • Es ergibt sich aus 18, dass der Anteil, zu dem Apyrase in dem Vergleichsbeispiel allein zugefügt wurde, das freie ATP der Suspension nur in unzureichender Weise eliminieren kann, während in dem Anteil, in dem die Kombination aus Apyrase und Adenosinphosphatdeaminase zugefügt wurde, gemäß der vorliegenden Erfindung, die Konzentration des anfänglichen freien ATPs auf ein Niveau von ungefähr einigen Hunderttausendsteln erniedrigt werden konnte.
  • Beispiel 26
  • Messung der Konzentration der lebensfähigen Zellen von kontaminierenden Bakterien in Krebsbeinfleisch-ähnlicher, gekochter Fischpaste
  • Eine verdünnte Krebsbeinfleisch-ähnliche, gekochte Fischpasten-Suspension, kontaminiert mit verschiedenen Keimen, wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 20 hergestellt (Verfahren zur Messung der Konzentration der lebensfähigen Zellen von Saccharomyces cerevisiae in Tomatenketchup), außer dass der Tomatenketchup durch eine Krebsbeinfleisch-ähnliche, gekochte Fischpasten-Suspension ersetzt wurde und Schritt 1 durch den Folgenden ersetzt wurde:
  • Schritt 1: Herstellung der verdünnten Suspension einer Krebsbeinfleisch-ähnlichen, gekochten Fischpaste, kontaminiert mit dem Zielmikroorganismus
  • Eine Krebsbeinfleisch-ähnliche, gekochte Fischpaste, kontaminiert mit verschiedenen Keimen, wurde erhalten, indem eine kommerziell erhältliche Krebsbeinfleisch-ähnliche, gekochte Fischpaste mit einer geeigneten Menge einer Suspension verschiedener Keime besprüht wurde, die vorher aus Haushaltsabfallwasser isoliert worden waren. Zu 10 g der Paste wurden 90 ml eines Phosphatpuffers als Verdünnungsmittel zugefügt und die Mischung wurde mit einer Druck-Mahl-Vorrichtung STOMACHER 400-T (Organo) aufgebrochen, um eine verdünnte Suspension einer Krebsbeinfsch-ähnlichen, gekochten Fischpaste herzustellen. Zu 1 ml des Überstands der Suspension wurden 9 ml Verdünnungsmittel zugefügt und die Mischung wurde homogen gemischt, um schließlich eine 100fach verdünnte Suspension einer Krebsbeinfleisch-ähnlichen, gekochten Fischpaste herzustellen.
  • Die Konzentration der lebensfähigen Zellen der verschiedenen Keime in der Krebsbeinfleisch-ähnlichen, gekochten Fischpaste wurden gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 dargestellt,
  • (1) Der in Tabelle 12 angegebene beobachtete Wert wird durch das folgende Verfahren bestimmt.
  • Berechnung von KBE pro ml der Zielmikroorganismus-Suspension durch das Gusskulturverfahren
  • Die Zielmikroorganismus-Suspension wurde in geeigneter Weise mit einem sterilen Standard-Flüssig-Medium verdünnt, auf einem sterilen Standard-Agar-Medium ausplattiert, enthaltend 2% Agar und für 2 Tage bei 35°C kultiviert. Die erscheinenenden Kolonien wurden gezählt, um die KBE pro ml der verdünnten Suspension unter Einbeziehung der Verdünnung zu schätzen.
  • (2) Die Anzahl der lebensfähigen Zellen in der verdünnten Zielmikroorganismus-Suspension wurde bestimmt, indem die ATP-Menge in den lebensfähigen Zellen durch die ATP-Menge pro KBE, wie vorläufig erhalten, geteilt wurde und in diesem Beispiel wurde die Konzentration der lebensfähigen Zellen in der Krebsbeinfleisch-ähnlichen, gekochten Fischpaste unter Verwendung der Menge von ATP pro KBE von allgemein lebensfähigen Bakterien, 3 × 10–18 mol/KBE, bestimmt.
  • Das Ergebnis ist in Tabelle 12 dargestellt.
  • Tabelle 12 Messung der verschiedenen Keime in der Krebsbeinfleisch-ähnlichen, gekochten Fischpaste
    Figure 00780001
  • Die Konzentration (berechnet) von lebensfähigen Zellen in der 100fach verdünnten Suspension, der Krebsbeinfeisch-ähnlichen gekochten Fischpaste, kontaminiert mit verschiedenen Keimen (KBE/ml) gemäß der vorliegenden Erfindung aus dem Ergebnis von Tabelle 12 beträgt 4,27 × 104. Dies ist vergleichbar mit den 6,18 × 104, erhalten durch das Gusskulturverfahren, von dem konventionell angenommen wurde, dass es die höchste Präzision und Verlässlichkeit der Messung aufwies.
  • Es ergibt sich außerdem, dass die lebensfähigen Zellen der kontaminierenden Bakterien in 1 g Krebsbeinfleisch-ähnlicher, gekochter Fischpaste 4,27 × 106 beträgt, was durch Multiplikation der Konzentration der lebensfähigen Zellen (berechneter Wert mit der Verdünnungsrate, 200fach, erhalten wird.
  • Es ergibt sich dadurch, dass verschiedene Keime in der Krebsbeinfleisch-ähnlichen, gekochten Fischpaste schnell durch die vorliegende Erfindung gemessen werden können.
  • Beispiel 27
  • Eliminieren von freiem ATP in einer verdünntem Suspension von gekochtem Reis, kontaminiert mit verschiedenem Keimen
  • Eine verdünnte Suspension von gekochtem Reis, kontaminiert mit verschiedenen Keimen, wurde auf dieselbe Weise wie bei dem Verfahren gemäß Beispiel 20 hergestellt „Verfahren zur Messung der Konzentration der lebensfähigen Zellen von Saccharomyces cerevisiae in Tomatenketchup", außer dass der Tomatenketchup durch gekochten Reis ersetzt wurde und Schritt 1 durch den Folgenden ersetzt wurde:
  • Schritt 1: Herstellung der verdünnten Suspension von gekochtem Reis, kontaminiert mit verschiedenen Keimen.
  • Gewöhnlicher gekochter Reis wurde in viele 10 g Anteile unterteilt und mit einer Suspension von Bakterien besprüht, die vorher aus Haushaltsabfallwasser isoliert worden waren, um einen gekochten Reis zu erhalten, der mit verschiedenen Keimen kontaminiert war.
  • Ein Anteil von 3 g des gekochten Reis, kontaminiert mit verschiedenen Keimen, wurde in ein steriles Plastikrohr gegeben (Innendurchmesser: 25 mm, Länge: 110 mm, Volumen: 50 ml) (FALCON TUBE, Becton Dickinson), gefolgt von 6 ml eines Phosphatpuffers (Verdünnungsmittel), und die Mischung wurde künstlich ungefähr eine Minute geschüttelt. Der Überstand (3 ml) wurde als verdünnte Suspension aus gekochtem Reis verwendet.
  • Apyrase und Adenosinphosphatdeaminase wurden der verdünnten Suspension aus gekochtem Reis zugefügt, so dass die endgültige Konzentration jeweils 0,05 U/ml betrug und die Mischung wurde für 30 Minuten bei 25°C zum Eliminieren von freiem ATP umgesetzt.
  • Die Ergebnisse sind in 19 dargestellt.
  • Es ergibt sich aus 19, dass der Anteil, zu dem nur Apyrase in dem Vergleichsbeispiel zugefügt wurde, das freie ATP nur unzureichend eliminieren konnte, während der Anteil, zu dem eine Kombination aus Apyrase und Adenosinphosphatdeaminase gemäß der vorliegenden Erfindung zugefügt wurde, die Konzentration des anfänglichen freien ATPs auf ein Niveau von einigen Tausendsteln erniedrigen konnte.
  • Beispiel 28
  • Messung der Konzentration von lebensfähigen Zellen von kontaminierenden Bakterien in gekochtem Reis
  • Eine verdünnte Suspension von gekochtem Reis, kontaminiert mit verschiedenen Keimen, wurde auf dieselbe Weise wie bei dem Verfahren gemäß Beispiel 20 hergestellt „Verfahren zur Messung der Konzentration der lebensfähigen Zellen von Saccharomyces cerevisiae in Tomatenketchup", außer dass der Tomatenketchup durch gekochten Reis ersetzt wurde und Schritt 1 mit dem folgenden ersetzt wurde.
  • Schritt 1: Herstellung der verdünnten Suspension von gekochtem Reis, kontaminiert mit verschiedenen Keimen.
  • Gewöhnlicher gekochter Reis wurde in viele 10 g Anteile unterteilt und mit einer Suspension von Bakterien besprüht, die vorher aus Haushaltsabfallwasser isoliert worden waren, um einen gekochten Reis zu erhalten, der mit verschiedenen Keimen kontaminiert war.
  • Ein Anteil von 3 g des gekochten Reis, kontaminiert mit verschiedenen Bakterien, wurde in ein steriles Plastikrohr gegeben (Innendurchmesser: 25 mm, Länge: 110 mm, Volumen: 50 ml) (FALCON TUBE, Becton Dickinson), gefolgt von 6 ml eines Phosphatpuffers (Verdünnungsmittel), und die Mischung wurde künstlich ungefähr eine Minute geschüttelt. Der Überstand (3 ml) wurde als verdünnte Suspension aus gekochtem Reis verwendet.
  • Zusätzlich folgte, dass 1 ml der verdünnten Suspension verschiedene Keime enthielt, angehaftet an 0,5 g gekochten Reis.
  • Als nächstes wurde die Konzentration der lebensfähigen Zellen verschiedener Keime als Kontamination in dem gekochten Reis bestimmt. Die Korrelation zwischen dem logarithmischen Niveau von ATP der verschiedenen Keime pro ml der verdünnten Suspensionen des gekochten Reis (mol/ml) und die logarithmische Zahl der verschiedenen Keimzellen pro g des gekochten Reis (log KBE/g), erhalten durch das Gusskulturverfahren, wurden überprüft.
  • Die so erhaltenen Ergebnisse sind in 20 dargestellt.
    • (1) Die Anzahl der verschiedenen Keime durch das Gusskulturverfahren wurde durch das folgende Verfahren bestimmt.
  • Berechnung von KBE pro ml der Zielmikroorganismus-Suspension durch das Gusskulturverfahren
  • Die Zielmikroorganismus-Suspension wurde in geeigneter Weise mit einem sterilen Standard-Flüssig-Medium verdünnt, auf ein steriles Standard-Agar-Medium, enthaltend 2 Agar, ausplattiert und für 2 Tage bei 35°C kultiviert. Die erscheinenenden Kolonien wurden gezählt, um die KBE pro ml der verdünnten Suspension unter Einbeziehung der Verdünnung zu schätzen. Der erhaltene Wert wurde dann verdoppelt, um die verschiedenen Keimzellen pro g gekochtem Reis zu erhalten.
  • Es ergibt sich aus 20, dass bei einer Zahl von verschiedenen Keimen von 100 KBE/g oder mehr (d. h. bei einem Teilen von 2 oder mehr auf der Y-Achse), das ATP-Niveau verschiedener Keime pro ml der verdünnten Suspensionen von gekochtem Reis auf der Basis von logarithmischen mol/ml und der logarithmischen Zahlen der verschiedenen Keimzellen pro g des gekochten Reis (log KBE/g), erhalten durch das Gusskulturverfahren, eine positive Beziehung besteht (Korrelationskoeffizient 0,976) und dass so verschiedene Keime in dem gekochten Reis quantitativ einfach und schnell mit guter Empfindlichkeit bestimmt werden können.

Claims (7)

  1. Hintergrund-ATP-Eliminator in einem ATP-Biolumineszenzverfahren, der mindestens ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Apyrase, alkalischer Phosphatase, saurer Phosphatase, Hexokinase und Adenosintriphosphatase, in Kombination mit einer Adenosinphosphatdeaminase als wirksame Bestandteile, umfasst.
  2. Verfahren zum Eliminieren von ATP in einem ATP-Biolumineszenzverfahren, umfassend die Zugabe einer Adenosinphosphatdeaminase zu einer ATP-haltigen Probe.
  3. Verfahren gemäss Anspruch 2, umfassend die Zugabe von mindestens einem Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Apyrase, alkalischer Phosphatase, saurer Phosphatase, Hexokinase und Adenosintriphosphatase, in Kombination mit einer Adenosinphosphatdeaminase zu einer ATP-haltigen Probe.
  4. Verfahren zur Messung biologischer Zellen, umfassend die Umsetzung einer Adenosinphosphatdeaminase mit einer biologischen-Zell-haltigen Probe zum Eliminieren von freiem ATP in der Probe und dann Messung von ATP in den biologischen Zellen durch ein Biolumineszenzverfahren.
  5. Verfahren gemäss Anspruch 4, umfassend das Umsetzen von mindestens einem Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Apyrase, alkalischer Phosphatase, saurer Phosphatase, Hexokinase und Adenosintriphosphatase in Kombination mit Adenosinphosphatdeaminas mit einer biologischen-Zell-haltigen Probe zum Eliminieren von freiem ATP in der Probe, und darauffolgend Messen von ATP in den biologischen Zellen durch ein Biolumineszenzverfahren.
  6. Verfahren gemäss Anspruch 4 oder 5, wobei ein ATP-Eliminator, umfassend Adenosinphosphatdeaminase und ein ATP-Extraktionsreagens für tierische und pflanzliche Zellen, zunächst einer Probe zugefügt wird, die tierische oder pflanzliche Zellen und Mikroorganismuszellen enthält, extrahiertes ATP und anderer Hintergrund werden durch den ATP-Eliminator eliminiert und das ATP in den Mikroorganismuszellen wird unter Verwendung des Biolumineszenzverfahrens bestimmt.
  7. Verfahren zur Messung biologischer Zellen gemäss Ansprüchen 4 oder 5, wobei die biologische Zellen enthaltende Probe ein Nahrungsmittel und/oder Trinkprodukt ist.
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