JPH09182600A - Ａｔｐ消去剤、ａｔｐ消去法、それを用いた生物細胞測定試薬及び生物細胞測定法 - Google Patents

Ａｔｐ消去剤、ａｔｐ消去法、それを用いた生物細胞測定試薬及び生物細胞測定法

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JPH09182600A
JPH09182600A JP7352423A JP35242395A JPH09182600A JP H09182600 A JPH09182600 A JP H09182600A JP 7352423 A JP7352423 A JP 7352423A JP 35242395 A JP35242395 A JP 35242395A JP H09182600 A JPH09182600 A JP H09182600A
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Noriaki Hatsutori
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Abstract

(57)【要約】 【課題】検体試料液のＡＴＰを効率よく強力に消去する
方法を提供する。またこの消去法と生物発光法を組合わ
せ、簡便迅速に、精度よく、飲食品などに含まれる生物
細胞を測定する方法、並びに測定試薬を提供する。 【解決手段】■アデノシンリン酸デアミナ−ゼを単独で
使用するか、または■該アデノシンリン酸デアミナ−ゼ
と共にアピラ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、酸性ホス
ファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ及びアデノシントリホスフ
ァタ−ゼからなる群より選ばれる少なくとも一種を併用
するＡＴＰの消去法、ＡＴＰ消去剤、それを用いた生物
細胞の測定試薬及び生物細胞の測定法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アデノシン−５´−三
リン酸の（以下ＡＴＰという）消去剤、ＡＴＰ消去法、
それを用いた生物細胞測定試薬及び生物細胞測定法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】大腸菌、酵母菌、乳酸菌及びその他の生
物細胞の測定は、食品衛生、バイオ、臨床検査、医学、
超純水、環境などの分野において非常に重要である。一
般に生物細胞の測定は、血球計算盤による顕微鏡下での
計測法（顕鏡法）、濁度測定法、重量測定法、パックド
・ボリウム（ｐａｃｋｅｄ ｖｏｌｕｍｅ）測定法及び
コロニ−計測法（以下混釈培養法という）等が知られて
いる。しかしながら、検鏡法、濁度測定法、重量測定法
及びパックド・ボリウム測定法は、感度が低い、死菌体
と生菌体の区別ができない問題を有し、混釈培養法は細
胞の培養を必要とするので、測定に通常１日以上の時間
を要し、迅速に結果を得たい場合には適さない。ところ
で、上記分野における細胞数測定には、迅速且つ高感度
の測定が要求され、例えば食品衛生の分野では、製品出
荷のために製品の微生物汚染の検査は必要不可欠であ
り、従来、この検査は混釈培養法により行なわれている
が、検査に１日以上を要するために、結果が出るまで製
品を倉庫に保管しておかなければならない。このため流
通効率の点で問題があるだけでなく、牛乳などの製品で
は保管時間が長くなるにつれて微生物汚染の可能性が高
くなる。また食品で汚染を問題にする微生物濃度は総じ
て低濃度であるため、高感度な検査が要求される。
【０００３】上記の要求を満たす微生物濃度測定法とし
て、生きた微生物には必ず存在するＡＴＰを生物発光法
を用いて測定する方法が知られている。この方法は細胞
を含む試料を、界面活性剤、トリクロロ酢酸（ＴＣ
Ａ）、トリス緩衝液、エタノ−ル又は溶菌酵素等を含ん
だ抽出試薬と接触させて、細胞内ＡＴＰを細胞外に抽出
した後、抽出したＡＴＰを蛍の発光の基質であるルシフ
ェリンと酵素であるルシフェラ−ゼを含んだ発光試薬と
接触し、ルシフェリン、ルシフェラ−ゼ及びＡＴＰによ
る酵素反応により生物発光させ、その生成した発光量を
測定して細胞内ＡＴＰを測定し、細胞の測定を行う方法
である。ところが、ＡＴＰは本来、その量の差こそあ
れ、すべての生物の細胞内に含まれるもので、微生物ば
かりでなく、単細胞生物にも、そして動植物組織の細胞
にもいわゆる体細胞として存在し、またさらに生物細胞
の周辺にはフリ−（遊離）のＡＴＰが存在する。従っ
て、ある生物細胞を含有する試料から生物細胞だけに存
在するＡＴＰを検出しようとしても、生物細胞中のＡＴ
Ｐと、その周辺に存在する遊離ＡＴＰが一緒になって検
出されてくる。即ち、生物細胞の測定にＡＴＰを指標に
しようと思っても今述べた生物細胞以外の遊離ＡＴＰが
バックグランド発光量（ノイズ）として同時に測定さ
れ、検出感度の低下を招来する欠点を有する。
【０００４】この遊離のＡＴＰを除去するための技術と
して、試料よりメンブレンフィルタ−を用いて除去する
メンブレンフィルタ−法、遠心分離により分離する遠心
分離法、アピラ−ゼ、アデノシントリホスファタ−ゼ
（ＡＴＰａｓｅ）、ヘキソキナ−ゼまたはＡＴＰピロホ
スファタ−ゼ等を用いて分解消去する方法（以下酵素法
という）（月刊フ−ドケミカル、食品化学新聞社発行、
９５年５月号、第５５〜６３ペ−ジ；特開平２−６５８
００；ＵＳＰ５，３１６，９０７、アナリティカル・バ
イオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）第２１８巻 ２０−２５ページ １９
９４年；ビュレティン・オブ・ザ・ジャパニーズ・ソサ
イアティー・オブ・サイエンティフィック・フィッシャ
リーズ（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎ
ｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ） 第５２巻 ９号 １６９５ペ
ージ１９８６年；及びマリン・エコロジー−プログレス
・シリーズ（ＭａｒｉｎｅＥｃｏｌｏｇｙ−Ｐｒｏｇｒ
ｅｓｓ Ｓｅｒｉｅｓ） １３巻 ３０５−３０９ペー
ジ １９８３年）等が知られている。
【０００５】しかしながら、メンブレンフィルタ−法は
操作が煩雑で、試料によっては濾過性が非常に悪く、Ａ
ＴＰ除去効果も十分でないという問題点を有している。
また、遠心分離法は操作が煩雑で、試料中の固形分も同
時に沈降して菌体とともに分離されるため、精度良く測
定できない欠点を有している。また酵素法は、検体のも
つバックグランドをなかなか下げることが難しく、ＡＴ
Ｐ除去効果が十分でないという問題点を有していた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、生物
細胞を含有する試料から遊離ＡＴＰを極力低くできるよ
うな新規なＡＴＰの消去法を提供し、これと生物発光法
とを組合わせて、精度良く生物細胞を測定できる方法を
提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するため鋭意研究を重ねた結果、アデノシンリン酸
デアミナ−ゼに着目し、これを単独で、もしくはこれと
アピラ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、酸性ホスファタ
−ゼ、ヘキソキナ−ゼ及びアデノシントリホスファタ−
ゼからなる群より選ばれた少なくとも一種とを併用する
ことにより、試料に含まれるＡＴＰを極力低い値に消去
できることを発見した。またこのＡＴＰ消去法と生物発
光法を組合わせるときは、生物細胞以外の遊離ＡＴＰを
極力低い値まで消去し、バックグランド発光量（ノイ
ズ）の影響を取り除いて、生物細胞のもつＡＴＰのみを
測定することにより、精度良く生物細胞の推定が可能と
なることを知り、これらの知見に基ずいて本発明を完成
した。
【０００８】即ち本発明は（１）アデノシンリン酸デア
ミナ−ゼを有効成分として含有することを特徴とするＡ
ＴＰ消去剤であり、また本発明は（２）アピラ−ゼ、ア
ルカリホスファタ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘキソキ
ナ−ゼ及びアデノシントリホスファタ−ゼからなる群よ
り選ばれる少なくとも一種とアデノシンリン酸デアミナ
−ゼとを有効成分として含有することを特徴とするＡＴ
Ｐ消去剤であり、また本発明は（３）アデノシンリン酸
デアミナ−ゼを添加することを特徴とするＡＴＰ消去法
であり、また本発明は（４）アピラ−ゼ、アルカリホス
ファタ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ及び
アデノシントリホスファタ−ゼからなる群より選ばれる
少なくとも一種とアデノシンリン酸デアミナ−ゼとを併
用添加することを特徴とするＡＴＰ消去法であり、また
本発明は（５）アデノシンリン酸デアミナ−ゼを有効成
分として含有することを特徴とする生物細胞測定試薬で
あり、また本発明は（６）アピラ−ゼ、アルカリホスフ
ァタ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ、アデ
ノシントリホスファタ−ゼからなる群より選ばれた少な
くとも一種とアデノシンリン酸デアミナ−ゼとを有効成
分として含有することを特徴とする生物細胞測定試薬で
あり、また本発明は（７）生物細胞を含有する試料にア
デノシンリン酸デアミナ−ゼを作用させ該試料中の遊離
ＡＴＰを消去し、次いで該生物細胞内のＡＴＰを生物発
光法を用いて測定することを特徴とする生物細胞測定法
であり、また本発明は（８）生物細胞を含有する試料に
アピラ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、酸性ホスファタ
−ゼ、ヘキソキナ−ゼ、アデノシントリホスファタ−ゼ
からなる群より選ばれる少なくとも一種とアデノシンリ
ン酸デアミナ−ゼとを作用させ該試料中の遊離ＡＴＰを
消去し、次いで該生物細胞内のＡＴＰを生物発光法を用
いて測定することを特徴とする生物細胞測定法である。
【０００９】以下本発明を詳細に説明する。本発明に用
いるアデノシンリン酸デアミナ−ゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎ
ｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）は、別
名アデニンヌクレオチドデアミナ−ゼ（Ａｄｅｎｉｎｅ
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）とも称
される酵素である。なおこの酵素は「エンザイム・クラ
シフィケイション（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ）（以下ともＥ．Ｃ．と略記する）Ｅ．Ｃ．
３．５．４．１７」と登録されている。この酵素はＡＭ
Ｐに対して特異的に作用するＡＭＰデアミナ−ゼ（Ｅ．
Ｃ．３．５．４．６）や、アデノシンに対して特異的に
作用するアデノシンデアミナ−ゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ
Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．３．５．４．４）と
は異なり、ＡＴＰ、アデノシン二リン酸（以下、ＡＤＰ
という）、アデノシン一リン酸（以下、ＡＭＰとい
う）、アデノシン、サイクリックＡＭＰ等、リン酸基の
数にかかわらず、広い基質に対して作用し、脱アミノ反
応を触媒する酵素である。本酵素は、基質としてＡＴＰ
を用いたときはイノシン三リン酸（以下ＩＴＰと略記す
る）を生成し、ＡＤＰを用いたときはイノシン二リン酸
（ＩＤＰ）を生成し、ＡＭＰを用いたときはイノシンモ
ノリン酸（ＩＭＰ）を生成する。（赤堀四郎編「酵素ハ
ンドブック」朝倉書店１９８２年１２月１日発行、第６
１１ペ−ジ；馬場茂明ら編集、「臨床酵素ハンドブッ
ク」講談社１９８２年９月１０日発行、第５５頁参照；
及びザ・ジャ−ナル・オブ・ジェネラル・アンド・アプ
ライド・マイクロバイオロジ−（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第１３巻、３３５〜３４７ペ
−ジ、１９６７年参照）並びにアグリカルチュラル・ア
ンド・バイオロジカル・ケミストリ−（Ａｇｒｉｃｕｌ
ｔｕｒａｌ ａｎｄ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）第２９巻、６号、５０８〜５１４ペ−ジ、１
９６５年）。
【００１０】なお、ＡＴＰデアミナ−ゼ（ＡＴＰ Ｄｅ
ａｍｉｎａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．３．５４．１８）（同「酵
素ハンドブック」第６１１ペ−ジ、及びザ・ジャーナル
・オブ・バイオケミストリー Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第６１巻、第１
号、１〜９ペ−ジ、１９６７年参照）もアデノシンリン
酸デアミナ−ゼと同様な基質特異性を有することが判明
した。したがって、本発明のアデノシンリン酸デアミナ
−ゼとは、アデノシンリン酸デアミナ−ゼ及びＡＴＰデ
アミナ−ゼを意味する。
【００１１】本発明において用いるアピラ−ゼ（Ａｐｙ
ｒａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．３．６．１．５）は、ＡＴＰ、Ａ
ＤＰ、ＩＴＰ、ＩＤＰからの脱リン酸反応を触媒する酵
素である（同「酵素ハンドブック」第６１７ペ−ジ参
照）
【００１２】またアデノシントリホスファタ−ゼ（Ａｄ
ｅｎｏｓｉｎｅ Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）
（Ｅ．Ｃ．３．６．１．３）は、ＡＴＰからの脱リン酸
を触媒する酵素である（同「酵素ハンドブック」第６１
６ペ−ジ参照）。
【００１３】またヘキソキナ−ゼ（Ｈｅｘｏｋｉｎａｓ
ｅ）（Ｅ．Ｃ．２．７．１．１）は、アデノシン三リン
酸のリン酸をＤ−ヘキソ−スに転移してＤ−ヘキソ−ス
−６−リン酸を生成する酵素である（同「酵素ハンドブ
ック」第３３０ペ−ジ参照）。
【００１４】またホスファタ−ゼは、酸性ホスファタ−
ゼ（Ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．
３．１．３．２）、アルカリホスファタ−ゼ（Ａｌｋａ
ｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．３．
１．３．１）などであって、脱リン酸を触媒する酵素で
ある（同「酵素ハンドブック」第４３４〜４３５ペ−ジ
参照）。
【００１５】なお、比較例において使用される５’−ヌ
クレオチダ−ゼ（５’−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ）
（Ｅ．Ｃ．３．１．３．５）は５’−リボヌクレオチド
または５’−デオキシリボヌクレオチドを加水分解して
ヌクレオシドおよびリン酸を生成する酵素である（同
「酵素ハンドブック」第４３６ペ−ジ参照）。
【００１６】本発明を実施するには、ＡＴＰ含有試料
に、アデノシンリン酸デアミナ−ゼを単独で添加する
か、または該酵素と共にアピラ−ゼ、アルカリホスファ
タ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ及びアデ
ノシントリホスファタ−ゼからなる群より選ばれる少な
くとも一種とを併用添加する。これにより、該試料中の
ＡＴＰが効率よく強力に消去される。
【００１７】本発明において用いられるＡＴＰ消去剤と
しては、アデノシンリン酸デアミナ−ゼを有効成分とし
て含有するか、または該酵素とアピラ−ゼ、アルカリホ
スファタ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ及
びアデノシントリホスファタ−ゼからなる群より選ばれ
る少なくとも一種とを有効成分として含有するＡＴＰ消
去剤が挙げられる。
【００１８】本発明の生物細胞の測定法は、大腸菌等の
細菌、酵母菌、乳酸菌等の微生物細胞、植物細胞及び動
物細胞等の生物細胞を含有する試料に、アデノシンリン
酸デアミナ−ゼを単独で、又はこれにアピラ−ゼ、アル
カリホスファタ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ
−ゼ及びアデノシントリホスファタ−ゼからなる群より
選ばれる少なくとも一種とを併用添加して該試料中の遊
離ＡＴＰを予め消去し、次いで該生物細胞内のＡＴＰを
生物発光法を用いて測定することにより行なわれる。
【００１９】上記生物細胞を含有する試料の具体例とし
ては、飲食品製造工業、臨床検査工業、医薬品工業、排
水処理工業、細菌検査、抗菌性テスト、抵抗性テスト等
の微生物の生死のエンドポイントの測定、ＭＩＣ測定、
その他ふき取り法による清浄度テスト等における任意の
生物細胞を含有する試料を挙げることができる。そして
飲食品における生物細胞を含有する試料としては、飲食
品、その半製品またはその素材等が挙げられる。その具
体例としては蒲鉾、ハム等の魚介畜肉練製品；リンゴジ
ュ−ス、トマトジュ−ス、牛乳等の飲料；豆腐などの植
物蛋白加工食品；トマトケチャップ等の果物、野菜加工
食品；醤油、味噌、清酒、ワイン、食酢等の醸造食品、
ウスタ−ソ−ス、ポン酢醤油、つゆ、たれ、ドレッシン
グ等の調味料、菓子パン、ウドン、蕎等の麺類、炊飯米
等の穀類加工食品及び醤油麹、酵母エキス等の微生物培
養物、その処理物等が挙げられる。該試料が液体のもの
はそのまま一定量を、固体のものでは、その一定量をと
って滅菌蒸留水を加え、粉砕機、マスティケ−タ−ある
いはストマッカ−等にかけてホモジナイズする。あるい
は強力に接触攪拌し、液体部分を回収して試料とする。
清浄度テストの場合は、綿棒のような拭き取りスティッ
クを無菌水で湿らせ検査箇所を拭き取った後に、無菌水
又は試薬液をいれた試験官の中ですすぎ、その液体部分
を試料とする。
【００２０】生物細胞を含有する試料に対し添加される
アデノシンリン酸デアミナ−ゼは、終濃度で０．００１
Ｕ／ｍｌ以上、特に０．０１〜０．１Ｕ／ｍｌが好まし
い。また、アピラ−ゼは、終濃度で０．００１Ｕ／ｍｌ
以上、特に０．０１〜０．２Ｕ／ｍｌが好ましい。ま
た、アルカリホスファタ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘ
キソキナ−ゼ及びアデノシントリホスファタ−ゼの添加
量は、それぞれ終濃度で０．００１Ｕ／ｍｌ以上、特に
０．０１〜５０Ｕ／ｍｌが好ましい。
【００２１】上記酵素の反応時におけるｐＨは、弱酸性
〜弱アルカリ性の範囲において行うことが好ましい。例
えば、アデノシンリン酸デアミナ−ゼ単独、またはこれ
にアピラ−ゼ併用の場合は、ｐＨ５．０〜８．０が好ま
しい。試料のｐＨの調整には、リン酸緩衝液、ヘペス
（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、メス（ＭＥＳ）緩衝液などを使
用することが好ましい。
【００２２】上記酵素の反応時間は、生物細胞を含有す
る試料の種類・性状、反応時のｐＨ、酵素の添加濃度、
反応温度により多少異なるが、約２時間以内、特に１〜
３０分が好ましい。反応時間が長過ぎると、試料に含ま
れる微生物がその間に増殖するので、目的とする生物細
胞数の正確な測定ができなくなり、測定値の精度・信頼
性が損なわれる。
【００２３】上記酵素の反応温度は、３０〜５０℃、特
に４０〜４５℃が好ましい。ＡＴＰ消去だけを目的とす
る場合は、上記温度範囲を採用することが好ましいが、
生物細胞を含有する試料を対象とする場合は、温度が高
すぎると該生物細胞が死滅する危険性を有するので、死
滅しない温度範囲、即ち室温〜４０℃を採用することが
好ましい。
【００２４】本発明の生物細胞の測定試薬は、アデノシ
ンリン酸デアミナ−ゼを単独で、又は該酵素とアピラ−
ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘ
キソキナ−ゼ及びアデノシントリホスファタ−ゼからな
る群より選ばれる少なくとも１種とを併用して、反応液
中における終濃度が以下の有効成分となるよう調製す
る。併用する酵素の好適な濃度範囲を以下に示す。 アデノシンリン酸デアミナ−ゼ；終濃度で０．００１Ｕ／ｍｌ以上、特に０． ０１〜０．１Ｕ／ｍｌとなる濃度。 アピラ−ゼ； 終濃度で０．００１Ｕ／ｍｌ以上、特に０． ０１〜０．２Ｕ／ｍｌとなる濃度。 アルカリホスファタ−ゼ； 終濃度で０．００１Ｕ／ｍｌ以上、特に０． ０１〜５０Ｕ／ｍｌとなる濃度 酸性ホスファタ−ゼ； 同上 ヘキソキナ−ゼ； 同上 アデノシントリホスファタ−ゼ；同上
【００２５】次に本発明の実施例において用いるＡＴＰ
検量線を下記により作成した。ベルト−ルド（Ｂｅｒｔ
ｈｏｌｄ）社製ルミノメ−タ− ルマット（Ｌｕｍａ
ｔ）ＬＢ９５０１によるＡＴＰ検量線の作成を以下に示
す。既知濃度のＡＴＰ標準液１００μｌに超純水１００
μｌを添加し、ルシフェリン−ルシフェラ−ゼ含有発光
試薬（以下発光試薬ということがある）を１００μｌ添
加し、ルミノメ−タ− ＬＢ９５０１にて、１秒待ち３
秒積算して相対発光量Ｓを求める、発光測定を行なっ
た。一方、超純水２００μｌにルシフェリンルシフェラ
−ゼ発光試薬（以下発光試薬という）を１００μｌ添加
し、同様に発光量Ｒを求める発光測定を行い、この測定
値を試薬のブランク値Ｒとした。Ｓ−Ｒを求めて、ＡＴ
Ｐの正味の発光量Ｚが求められるので、座標のＹ軸を正
味の発光量Ｚとし、Ｘ軸をＡＴＰ濃度（Ｍ＝ｍｏｌ／
ｌ）として、図１に示すＡＴＰ検量線を作成した。
【００２６】次に、本発明の実施例において使用する酵
素とその酵素活性の測定法を以下に示す。 （使用する酵素液） （ａ）アデノシンリン酸デアミナ−ゼ（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ属由来）５Ｕ／ｍｌ 活性の測定法；１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む）（ｐＨ５．０）にＡＴＰを８０μ
Ｍとなるように溶解したものを基質溶液とした。基質液
３ｍｌに酵素液１００μｌを添加し、３０℃で３０分間
反応した後に６０％過塩素酸１００μｌを添加して、反
応を停止し、２６５ｎｍの吸光度ＯＤを測定した。そし
てＯＤ値が１分間当り２．４変化する酵素量を１ユニッ
ト（Ｕ）とした。
【００２７】（ｂ）アピラ−ゼ ｇｒａｄｅ VIII（ｆ
ｒｏｍ ｐｏｔａｔｏ）（シグマ社）５Ｕ／ｍｌ 活性の測定法；ｐＨ６．５、３０℃において、ＡＴＰか
ら１分間当り１．０μｍｏｌの無機リン酸を遊離する酵
素量を１ユニットとした。
【００２８】（ｃ）酸性ホスファタ−ゼ ｔｙｐｅ VII
（ｆｒｏｍ ｗｈｉｔｅ ｐｏｔａｔｏ）（シグマ社
製）２５０Ｕ／ｍｌ 活性の測定法；ｐＨ４．８、３７℃において、１分間当
り１．０μｍｏｌのパラニトロフェニルリン酸（ｐ−ｎ
ｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を加水分
解する酵素量を１ユニットとした。
【００２９】（ｄ）アデノシンデアミナ−ゼ ｔｙｐｅ
Ｖ（ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｌｅｅｎ）（シグ
マ社製）２５０Ｕ／ｍｌ 活性の測定法；ｐＨ７．５、２５℃において、１分間当
り１．０μｍｏｌのアデノシンを脱アミノしてイノシン
に変換するする酵素量を１ユニットとした。
【００３０】（ｅ）５´−ヌクレオチダ−ゼ（ｆｒｏｍ
ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｄａｍａｎｔｅｕｓ ｖｅｎｏ
ｍ）（シグマ社製）２５０Ｕ／ｍｌ 活性の測定法；ｐＨ９．０、３７℃において、アデノシ
ン ５′−モノリン酸を加水分解して、１分間当り１．
０μｍｏｌの無機リン酸を遊離する酵素量を１ユニット
とした。
【００３１】（ｆ）ＡＭＰデアミナ−ゼ（ｆｒｏｍ Ｒ
ａｂｂｉｔ ｍｕｓｃｌｅ）（シグマ社製）２５．５Ｕ
／ｍｌ 活性の測定法；ｐＨ６．５、２５℃において、１分間当
り１．０μｍｏｌの５′−アデノシンモノリン酸を脱ア
ミノして、５′−イノシンモノリン酸に変換する酵素量
を１ユニットとした。
【００３２】（ｇ）アデノシントリホスファタ−ゼ（ｆ
ｒｏｍ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｃｏｒｔ
ｅｘ）（シグマ社製）５Ｕ／ｍｌ 活性の測定法；ｐＨ７．８、３７℃において、Ｎａ+ 、
Ｋ+ 、Ｍｇ2+の存在下で、ＡＴＰから１分間当り１．０
μｍｏｌの無機リン酸を遊離する酵素量を１ユニットと
した。
【００３３】（ｈ）アルカリホスファタ−ゼ（ｆｒｏｍ
ｂｏｖｉｎｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｕｃｏｓ
ａ）（シグマ社製）２５０Ｕ／ｍｌ 活性の測定法；ｐＨ９．８、３７℃において、１分間当
り１．０μｍｏｌのパラニトロフェニルリン酸（ｐ−ｎ
ｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を加水分
解する酵素量を１ユニットとした。
【００３４】（ｉ）ヘキソキナ−ゼ（ｆｒｏｍ ｙｅａ
ｓｔ）（ベ−リンガ− マンハイム社製）５０Ｕ／ｍｌ 活性の測定法；ｐＨ７．６、２５℃において、１分間当
たり１．０μｍｏｌのＡＴＰのリン酸をグルコースに転
移する酵素量を１ユニットとした。
【００３５】次に実施例を示して本発明をより具体的に
説明する。
【実施例１】（ＡＴＰを含有する酵母エキスに、アデノ
シンリン酸デアミナ−ゼを単独で添加し、また該酵素と
共にアピラ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、酸性ホスフ
ァタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ及びアデノシントリホスファ
タ−ゼからなる群より選ばれる少なくとも一種とを併用
添加して該ＡＴＰを消去する例）。
【００３６】ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製粉末状酵母エ
キス１ｇを２０ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ
６．８）１００ｍｌに溶解して、１％（Ｗ／Ｖ）酵母エ
キス（ｐＨ６．８）を調製した。これを試料液として各
５ｍｌづつ１９区分に分け、第一区分（対照）には、超
純水５０μｌを、第二区分（本発明１）には、アデノシ
ンリン酸デアミナ−ゼ酵素液５０μｌ（終濃度０．０５
Ｕ／ｍｌ）を、第三区分（本発明２）には、アデノシン
リン酸デアミナ−ゼ酵素液５０μｌ及びアピラ−ゼ酵素
液５０μｌ（終濃度、それぞれ０．０５Ｕ／ｍｌ）を、
第四区分（本発明３）には、アデノシンリン酸デアミナ
−ゼ酵素液５０μｌ、アピラ−ゼ酵素液５０μｌ、及び
酸性ホスファターゼ酵素液５０μｌ（終濃度、それぞれ
０．０５Ｕ／ｍｌ、０．０５Ｕ／ｍｌ及び２．５Ｕ／ｍ
ｌ）を、第五区分（本発明４）には、アデノシンリン酸
デアミナ−ゼ酵素液５０μｌ及びアデノシントリホスフ
ァタ−ゼ５０μｌ（終濃度、それぞれ０．０５Ｕ／ｍ
ｌ）を、第六区分（本発明５）には、アデノシンリン酸
デアミナ−ゼ５０μｌ及びヘキソキナ−ゼ酵素液５０μ
ｌ（終濃度それぞれ０．０５Ｕ／ｍｌ及び０．５Ｕ／ｍ
ｌ）を、第七区分（本発明６）にはアデノシンリン酸デ
アミナーゼ酵素液５０μｌ、アルカリホスファターゼ酵
素液５０μｌ（終濃度、それぞれ０．０５Ｕ／ｍｌ、
２．５Ｕ／ｍｌ）を、第八区分（本発明７）には、アデ
ノシンリン酸デアミナーゼ酵素液５０μｌ、酸性ホスフ
ァターゼ酵素液５０μｌ（終濃度、それぞれ０．０５Ｕ
／ｍｌ、２．５Ｕ／ｍｌ）を第九区分（比較例１）に
は、アピラ−ゼ酵素液５０μｌ（終濃度０．０５Ｕ／ｍ
ｌ）を、第十区分（比較例２）には、同酵素液１００μ
ｌ（終濃度０．１０Ｕ／ｍｌ）を、第十一区分（比較例
３）には、アピラ−ゼ酵素液５０μｌ及び、５’−ヌク
レオチダ−ゼ酵素液５０μｌ（終濃度、それぞれ０．０
５Ｕ／ｍｌ及び２．５Ｕ／ｍｌ）を、第十二区分（比較
例４）には、アピラ−ゼ酵素液５０μｌ、５’−ヌクレ
オチダ−ゼ酵素液５０μｌ及び、アデノシンデアミナ−
ゼ酵素液５０μｌ（終濃度、それぞれ０．０５Ｕ／ｍ
ｌ、２．５Ｕ／ｍｌ及び２．５Ｕ／ｍｌ）第十三区分
（比較例５）には、アピラ−ゼ酵素液５０μｌ及び酸性
ホスファタ−ゼ酵素液５０μｌ（終濃度、それぞれ０．
０５Ｕ／ｍｌ及び２．５Ｕ／ｍｌ）を、第十四区分（比
較例６）には、アピラ−ゼ酵素液５０μｌ、酸性ホスフ
ァタ−ゼ酵素液５０μｌ及びアデノシンデアミナ−ゼ酵
素液５０μｌ（終濃度、それぞれ０．０５Ｕ／ｍｌ、
２．５Ｕ／ｍｌ及び２．５Ｕ／ｍｌ）を、第十五区分
（比較例７）には、アピラ−ゼ酵素液５０μｌ及びＡＭ
Ｐデアミナーゼ酵素液５０μｌを（終濃度、それぞれ
０．０５Ｕ／ｍｌ及び０．２５５Ｕ／ｍｌ）を、第十六
区分（比較例８）には、アデノシントリホスファターゼ
酵素液５０μｌ（終濃度、０．０５Ｕ／ｍｌ）を、第十
七区分（比較例９）には、ヘキソキナーゼ酵素液５０μ
ｌ（終濃度０．５Ｕ／ｍｌ）を、第十八区分（比較例１
０）には、アルカリホスファターゼ酵素液５０μｌ（終
濃度２．５Ｕ／ｍｌ）を、第十九区分（比較例１１）に
は、酸性ホスファタ−ゼ酵素液５０μｌ、（終濃度２．
５Ｕ／ｍｌ）を、それぞれ添加し、３０℃で反応させ経
時的に採取を行い、以下の方法により発光測定を行なっ
た。
【００３７】（発光測定法）採取した試料１００μｌに
超純水１００μｌを添加し、ルシフェリン、ルシフェラ
−ゼを含む発光試薬を１００μｌ添加して、発光量Ｓを
発光測定装置（ルミノメ−タ− ＬＢ９５０１）を用い
て、１秒待ち３秒積算し計測した。一方上記計測法にお
いて「採取した試料１００μｌ」の代わりに「超純水１
００μｌ」を用いる以外は全く同様にして発光量を測定
し、この値を発光試薬のブランク値Ｒとした。そしてＳ
−Ｒを求めて正味の発光量Ａとした。
【００３８】次にルシフェリン−ルシフェラ−ゼ発光反
応は、試料中の成分により多少の発光阻害を受けるた
め、得られる発光量Ａは見かけ値である。そこで発光量
Ａを以下のように補正する必要がある。即ち、先ず下記
式により発光率Ｋを求め、前記発光量Ａを発光率Ｋで除
することにより補正値Ｙ（真の発光量）を求め、この補
正値Ｙに対応するＡＴＰ濃度を予め作成した検量線（図
１）を利用して、真のＡＴＰ濃度を求めた（後述する実
施例における補正発光値も、同様にして求めたものであ
る）。その結果を、図２に示す。
【００３９】補正発光値Ｙの求め方。 Ｙ（補正発光値）＝ Ａ（見かけ値）／Ｋ（発光率） Ｋ（発光率）＝「Ｈ（内標準値）−Ａ（見かけ値）」／
Ｇ（本標準値） Ｈ；経時的に採取し得られた各試料１００μｌにＡＴＰ
標準液２×１０-9ｍｏｌ／ｌ（以下Ｍと略記する）１０
０μｌを添加し、ルシフェリン−ルシフェラ−ゼ含有発
光試薬１００μｌを添加し、発光測定を行い得られた値
（内標準値）。 Ａ；上記各試料１００μｌに超純水１００μｌを添加
し、同様に発光試薬１００μｌを添加し発光測定を行い
得られた値（見かけ値）。 Ｇ；超純水１００μｌにＡＴＰ標準液２×１０-9Ｍ １
００μｌを添加し、発光試薬１００μｌを添加し、発光
測定を行い得られた値（本標準値）。 Ｋ；発光率 Ｙ；補正発光値（真の発光測定値）
【００４０】図２の結果から、アピラ−ゼ酵素液を、終
濃度で０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加した比較例１
及び同酵素液を０．１０Ｕ／ｍｌとなるように添加した
比較例２、アピラ−ゼ及び５’−ヌクレオチダ−ゼを併
用添加した比較例３、アピラ−ゼ、５’−ヌクレオチダ
−ゼ及びアデノシンデアミナ−ゼを併用添加した比較例
４、アピラ−ゼ及び酸性ホスファタ−ゼを併用添加した
比較例５、アピラ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ及びアデノ
シンデアミナ−ゼを併用添加した比較例６、及びアピラ
−ゼ及びＡＭＰデアミナ−ゼを併用添加した比較例７、
アデノシントリホスファタ−ゼを添加した比較例８、ヘ
キソキナ−ゼを添加した比較例９、アルカリホスファタ
−ゼを添加した比較例１０、酸性ホスファタ−ゼを添加
した比較例１１は、いずれも酵母エキス中の初発のＡＴ
Ｐ濃度を約１／１０〜約１／１００に低減（１０-9Ｍ）
するに止まり十分とは言えないことが判る。
【００４１】これに対しアデノシンリン酸デアミナーゼ
を単独で添加した本発明１は、初発のＡＴＰ濃度を約数
千分の一（１０-11 Ｍ）まで低減することができ。また
アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加
した本発明２、アデノシンリン酸デアミナ−ゼ、アピラ
−ゼ、及び酸性ホスファタ−ゼを併用添加した本発明
３、アデノシンリン酸デアミナーゼとアルカリホスファ
ターゼとを併用添加した本発明６及びアデノシンリン酸
デアミナーゼと酸性ホスファターゼとを併用添加した本
発明７は、約１０万分の一（１０-13Ｍ）に低減するこ
とができることが判る。またアデノシンリン酸デアミナ
−ゼとアデノシントリホスファターゼを併用添加した本
発明４は、約１万分の一に低減することができ、またア
デノシンリン酸デアミナ−ゼとヘキソキナーゼを併用添
加した本発明５は、約数万分の一（１０-12Ｍ）に低減
することができることが判る。
【００４２】
【実施例２】 （酵母エキス中にアデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピ
ラ−ゼを併用添加して、該エキス中に存在する遊離ＡＴ
Ｐを消去する場合の、該アデノシンリン酸デアミナ−ゼ
の好適濃度を求める例）
【００４３】ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製粉末酵母エキ
スを１ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．８）
に１％（Ｗ／Ｖ）添加溶解して、メンブレンフィルタ−
（ミリポア社製ＭＩＬＬＥＸ−ＧＳ、孔径０．２２μ
ｍ）で除菌濾過して無菌酵母エキス（ｐＨ６．８）とし
た。この試料液を５ｍｌづつ８区分に分け、図３に示す
ごとく第１〜７の各区分に対しアデノシンリン酸デアミ
ナ−ゼとアピラ−ゼを各終濃度となるように添加し、ま
た比較のため第８区分にはアデノシンリン酸デアミナ−
ゼを添加することなくアピラ−ゼのみを図３に示す終濃
度となるように添加し、それぞれ３７℃で９０分反応さ
せ、酵母エキスの遊離ＡＴＰを消去し、得られた試料に
ついて、以下の方法により発光測定を行なった。発光測
定は、実施例１と同様にしてＡＴＰ濃度を求めた。その
結果を図３に示す。
【００４４】図３の結果から、アデノシンリン酸デアミ
ナ−ゼを添加することなくアピラ−ゼのみを添加した区
分では、ＡＴＰ濃度が１０-9Ｍ程度まで低減できるが、
アピラ−ゼにアデノシンリン酸デアミナ−ゼを併用添加
するときは、ＡＴＰ濃度をさらに低減することができ、
アデノシンリン酸デアミナ−ゼの濃度が増すにつれてＡ
ＴＰの濃度を低減することができる。そして、その終濃
度は、０．０１Ｕ／ｍｌ以上が好ましいことが判る。
【００４５】
【実施例３】 （アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用し
て予め酵母エキスの遊離ＡＴＰを消去し、次いで両酵素
活性の存在下で既知濃度のＡＴＰを含むＡＴＰ抽出剤と
を添加する。そして通常のＡＴＰ抽出に要するといわれ
る時間、例えば２０秒間保持し、ＡＴＰの残存率を測定
する。これにより生物細胞から抽出されるＡＴＰは、該
抽出時間中にどれだけ分解消去されるかを推定すること
ができる。また該アデノシンリン酸デアミナ−ゼ又は該
アピラ−ゼの好適な濃度を求めることができる）
【００４６】実施例２と同様にして、無菌の酵母エキス
を５ｍｌづつ６区分に分け、各区分に図４に示す各終濃
度となるように、アピラ−ゼ酵素液とアデノシンリン酸
デアミナ−ゼ酵素液を入れ、３７℃で９０分反応させ、
酵母エキス中のＡＴＰを消去した。得られた遊離ＡＴＰ
を消去した酵母エキス（両酵素の活性はそのまま維持）
１００μｌに、キッコ−マン社製ＡＴＰ抽出試薬を用い
て希釈した２×１０-11 ＭのＡＴＰ標準液を１００μｌ
加え、速やかに実施例１と同様にして発光測定を行な
い、その発光量Ａを求めた。一方上記遊離ＡＴＰを消去
した酵母エキス１００μｌ（同上）にキッコ−マン社製
ＡＴＰ抽出試薬１００μｌを添加し、速やかに実施例１
と同様にして発光測定を行ない、その発光量Ｃを求め
た。一方また上記遊離ＡＴＰを消去した酵母エキス（同
上）１００μｌに、キッコ−マン社製ＡＴＰ抽出試薬を
用いて希釈した２×１０-11 ＭのＡＴＰ標準液を１００
μｌ加え、２０秒間保持した後実施例１と同様にして発
光測定を行ない、その発光量Ｂを求めた。初発のＡＴＰ
標準液の発光量（Ａ−Ｃ）に対する２０秒経過後のＡＴ
Ｐ標準液の発光量（Ｂ−Ｃ）の百分率％「１００×（Ｂ
−Ｃ）／（Ａ−Ｃ）」を求めた。それをＡＴＰ残存率と
して表示した。その結果を図４に示す。
【００４７】図４の結果から、アデノシンリン酸デアミ
ナ−ゼとアピラーゼを併用添加するＡＴＰ消去法におい
て、アデノシンリン酸デアミナ−ゼの濃度が高いとき、
即ち終濃度が０．５〜０．２Ｕ／ｍｌであるときは、Ａ
ＴＰ残存率が低く、約６０％以下となるが、終濃度が
０．１Ｕ／ｍｌ以下の濃度であるときは、殆どＡＴＰが
分解されることはなく、従ってＡＴＰ残存率を７０％以
上保持することができることが判る。そして、図３およ
び図４の結果から、アデノシンリン酸デアミナ−ゼの終
濃度は、低過ぎると酵母エキスの遊離ＡＴＰ消去が充分
ではなく、反対に高過ぎると遊離ＡＴＰばかりでなく、
抽出されたＡＴＰ（この実施例においては添加したＡＴ
Ｐ）をも分解消去し、そのため抽出されたＡＴＰの残存
率が低下する危険性を有するので好ましくない。しか
し、アデノシンリン酸デアミナ−ゼを０．０１〜０．１
Ｕ／ｍｌ添加するときは遊離ＡＴＰ消去が充分に行なわ
れ、しかも該酵素は抽出されたＡＴＰに対しては殆ど影
響をもたず、その残存率を７０％以上に保持することが
できることが判る。
【００４８】
【実施例４】 （酵母エキス中にアデノシンリン酸デアミナーゼとアピ
ラーゼを併用添加して、該エキス中に存在する遊離ＡＴ
Ｐを消去する場合において、該アピラ−ゼの好適濃度を
求める例）
【００４９】実施例２と同様にして、無菌の酵母エキス
を調製し、この酵母エキスを５ｍｌづつ８区分に分け、
各区分に図５に示す各終濃度となるようにアデノシンリ
ン酸デアミナ−ゼまたは、該酵素及びアピラ−ゼとを入
れ、３７℃で９０分反応させ、該酵母エキスの遊離ＡＴ
Ｐを消去した。遊離ＡＴＰを消去し得られた酵母エキス
の発光測定を行ない、実施例１と同様にしてＡＴＰ濃度
を求めた。その結果を図５に示す。
【００５０】図５の結果から、アデノシンリン酸デアミ
ナ−ゼ単独添加区分では、ＡＴＰ濃度が１０-11 Ｍ程度
まで低減できるが、これにアピラ−ゼを併用添加すると
きは、ＡＴＰ濃度をさらに低減することができ、その終
濃度が増すにつれてＡＴＰの濃度を低減することができ
る。そして、アピラ−ゼの終濃度は、０．０１Ｕ／ｍｌ
以上、特に０．０５〜０．５Ｕ／ｍｌが好ましいことが
判る。
【００５１】
【実施例５】 （アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用し
て予め酵母エキスの遊離ＡＴＰを消去し、次いで両酵素
の活性が持続している状態において、既知濃度のＡＴＰ
を含むＡＴＰ抽出剤を添加し、通常のＡＴＰ抽出に必要
と言われる時間、例えば２０秒間保持したとき、該ＡＴ
Ｐがどれほど残存するを求めた例）
【００５２】実施例２と同様にして得られた無菌の酵母
エキスを５ｍｌづつ８区分に分け、各区分に図６に示す
各終濃度となるように、アデノシンリン酸デアミナ−ゼ
酵素液とアピラ−ゼ酵素液を入れ、３７℃で９０分反応
させ、酵母エキスの遊離ＡＴＰを消去し、得られた反応
液を用いてＡＴＰの残存率を測定した。ＡＴＰ残存率の
測定は、実施例３に記載された方法により行なった。そ
の結果を図６に示す。
【００５３】図６の結果から、アデノシンリン酸デアミ
ナ−ゼにアピラ−ゼを併用添加するＡＴＰ消去法におい
て、アピラ−ゼの濃度が高いとき、即ち終濃度０．５Ｕ
／ｍｌであるときは、ＡＴＰ残存率が低く、６０％以下
となるが、終濃度が０．２Ｕ／ｍｌ以下であるときは、
殆どＡＴＰが分解されることはなく、従ってＡＴＰ残存
率を７０％以上保持することができることが判る。そし
て、図５および図６の結果から、アピラ−ゼの終濃度
は、低過ぎるときはＡＴＰ消去が充分ではなく、反対に
高過ぎるときはＡＴＰ残存率が低下する。これに対し
て、０．０１〜０．２Ｕ／ｍｌであるときはＡＴＰ消去
が充分に行なわれ、しかもＡＴＰ残存率を７０％以上保
持することができるので、好ましいことが判る。
【００５４】
【実施例６】 （アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用し
て予め酵母エキスの遊離ＡＴＰを消去し、次いで両酵素
活性の存在下で様々な濃度のＡＴＰを含むＡＴＰ抽出剤
を添加する。そして通常のＡＴＰ抽出に要するといわれ
る時間、１０秒、２０秒及び３０秒間保持し、ＡＴＰの
残存率を測定する。これにより生物細胞から抽出される
様々な濃度のＡＴＰは、所定の抽出時間帯に両酵素によ
ってどれだけ分解消去されるかを推定することができ
る）
【００５５】実施例２と同様にして無菌の酵母エキスを
調製し、この酵母エキスにアデノシンリン酸デアミナ−
ゼ酵素液とアピラ−ゼ酵素液を入れ、終濃度がそれぞれ
０．０５Ｕ／ｍｌとなし、３０℃で１８０分反応させ、
酵母エキス中のＡＴＰを消去した。このＡＴＰを消去し
た酵母エキス１００μｌに、キッコ−マン社製ＡＴＰ抽
出試薬を用いて希釈した、図７に示すごとき様々な濃度
のＡＴＰ標準液１００μｌを加え、図７に示す如き、初
発、１０秒、２０秒及び３０秒保持したものについて、
実施例１と同様にして発光測定を行ない、ＡＴＰの残存
率を測定した。ＡＴＰ残存率の測定は、実施例３に記載
された方法により行なった。その結果を図７に示す。
【００５６】図７の結果から、アデノシンリン酸デアミ
ナ−ゼにアピラ−ゼを併用添加するＡＴＰ消去法におい
て、添加されたＡＴＰ濃度は、高い（２×１０-9Ｍ）、
低い（２×１０-13 Ｍ）に拘らず、ＡＴＰはほぼ同じ割
合で減少し、またその減少は緩やかで、３０秒保持後に
おいても８０％以上残存することことが判る。即ち、新
たに添加されたＡＴＰは、微生物からのＡＴＰ抽出時間
帯に相当する３０秒間保持しても殆ど分解されないた
め、抽出された（本実施例では添加された）ＡＴＰの正
確な測定が可能となることが判る。従って、微生物から
抽出されたＡＴＰの正確な測定が可能となり、微生物の
菌数の正確な測定が可能となる。また、ＡＴＰ濃度によ
り残存率の差は認められないので、生物細胞の濃度によ
り影響は受けない特徴を有し、このことから、生物細胞
の測定に際し、検体の希釈操作が簡略化できる効果を奏
する。
【００５７】
【実施例７】 （酵母エキス中にアデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピ
ラ−ゼを併用添加して、該エキス中に存在する遊離ＡＴ
Ｐを消去する場合の、好適ｐＨを求める例）
【００５８】ディフコ社製粉末酵母エキスを図８に記載
の如く、各ｐＨを有する５ｍＭの緩衝液に１％（Ｗ／
Ｖ）添加溶解してメンブレンフィルタ−で除菌濾過して
各ｐＨを有する無菌の酵母エキスを調製した。この酵母
エキスを５ｍｌづつ７区分に分け、各区分に対しアデノ
シンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを各終濃度が０．
０５Ｕ／ｍｌとなるように添加し、それぞれ３７℃で３
０分反応させ、得られた酵母エキスについて、以下の方
法により発光測定を行なった。発光測定は、実施例１と
同様にして行いＡＴＰ濃度を求めた。その結果を図８に
示す。
【００５９】図８の結果から、酵母エキス中にアデノシ
ンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加して、該
エキス中に存在する遊離ＡＴＰを消去する場合のｐＨ
は、５．０〜８．０が好ましく、特に５．０〜７．０が
より好ましいことが判る。
【００６０】
【実施例８】 （酵母エキス中にアデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピ
ラ−ゼを併用添加して、該エキスの遊離ＡＴＰを消去す
る場合の好適温度を求める例）
【００６１】実施例２と同様にして無菌の酵母エキスを
調製し、これを５ｍｌづつ９区分に分け、各区分に対し
アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを各終濃度
が０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加し、それぞれ図９
に記載の如き各反応温度で３０分反応させ、得られたサ
ンプルについて、以下の方法により発光測定を行なっ
た。発光測定は、実施例１と同様にして行いＡＴＰ濃度
を求めた。その結果を図９に示す。
【００６２】図９の結果から、酵母エキス中にアデノシ
ンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加して該エ
キスの遊離ＡＴＰを消去する場合の好適温度は、２５〜
５５℃、より好ましくは３５〜５０℃、最も好ましくは
４０〜４５℃であることが判る。
【００６３】さて、ここで以下の本発明の実施例におい
て採用するＡＴＰ検量線を、キッコーマン社製ルミノメ
ーター、ルミテスタ−Ｋ−１００を用いて作成した。即
ち、既知濃度のＡＴＰ標準液１００μｌに超純水１００
μｌを添加し、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬
を１００μｌ添加し、キッコーマン社製ルミノメータ
ー、ルミテスターＫ−１００にて相対発光量Ｓを測定し
た。一方、超純水２００μｌに発光試薬を１００μｌ添
加し、同様に発光測定を行い、これを発光試薬の発光量
Ｒ（ブランク値）を求めた。Ｓ−ＲによりＡＴＰによる
正味の発光量Ｚが求められるので、座標のＹ軸を正味の
発光量Ｚの値、Ｘ軸をＡＴＰの濃度（Ｍ＝ｍｏｌ／ｌ）
として、図１０に示す検量線を作成した。
【００６４】
【実施例９】 （ＡＴＰ消去剤の影響を取り除いた状態で、スタフィロ
コッカス・アウレウスにおけるＣＦＵ当りのＡＴＰ量を
測定した例）
【００６５】以下の各工程をこの順序で行い、実際の被
検微生物スタフィロコッカス・アウレウスの培養液の生
物細胞数の測定を行った。 第一工程；被検微生物を標準液体培地で培養して、培養
液を調製する。 第二工程；培養液から遊離ＡＴＰの消去 第三工程；標準液体培地を利用した希釈液の調製 第四工程；遊離ＡＴＰを消去した培養液を希釈液で希釈
し被検微生物懸濁液の調製 第五工程；被検微生物懸濁液の遊離ＡＴＰの発光測定 第六工程；被検微生物懸濁液にＡＴＰ抽出剤を添加し、
該抽出剤添加前から存在する遊離ＡＴＰと、抽出された
ＡＴＰ（菌体内ＡＴＰ）からなるト−タルＡＴＰの発光
測定 第七工程；菌体内ＡＴＰの発光量算出 第八工程；菌体内ＡＴＰの発光量の補正値の算出 第九工程；補正値に対するＡＴＰ濃度の算出 第十工程；混釈培養法により、被検微生物懸濁液のｍｌ
当たりのＣＦＵの算出 第十一工程；ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量の測定
【００６６】（第一工程；被検微生物を標準液体培地で
培養して、培養液を調製する）オ−トクレ−ブにより滅
菌処理した標準液体培地（０．２５％酵母エキス、０．
５％トリプトン、０．１％ブドウ糖、ｐＨ７．１）８ｍ
ｌにスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ ２５９２３
を一白金耳接種し、３５℃で一晩静置培養して、被検微
生物の培養液を得た。
【００６７】（第二工程；培養液から遊離ＡＴＰの消
去）該培養液（生菌体を多量に含有する）２ｍｌに、ア
ピラ−ゼ及びアデノシンリン酸デアミナ−ゼをそれぞれ
終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加し、３５℃で
３０分間処理して、培養液の遊離ＡＴＰを予め消去し
た。これによりＡＴＰのブランク値を低下させることが
できる。
【００６８】（第三工程；標準液体培地を利用した希釈
液の調製）一方上記微生物を接種しない標準液体培地１
００ｍｌにアピラ−ゼ及びアデノシンリン酸デアミナ−
ゼをそれぞれ終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加
して、３５℃で９０分反応して遊離ＡＴＰを消去し、つ
いでオ−トクレ−ブで１２０℃１５分間滅菌処理して両
酵素を失活させ、遊離ＡＴＰが消去された無菌標準液体
培地からなる希釈液を調製した。
【００６９】（第四工程；遊離ＡＴＰを消去した培養液
を希釈液で希釈して被検微生物懸濁液の調製）第二工程
で得られた、遊離ＡＴＰを消去した培養液に第三工程で
得られた希釈液を添加して、被検微生物の１００００倍
希釈懸濁液を調製した。これを３５℃で３０分間保持し
て発光測定用の試料とした。
【００７０】（第五工程；被検微生物懸濁液の遊離ＡＴ
Ｐの発光測定）被検微生物の１００００倍希釈懸濁液１
００μｌに、滅菌超純水１００μｌを添加し発光試薬１
００μｌを添加し、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−
１００にて発光測定した。この測定により被検微生物の
希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの発光量（以下フリ−の発光量
Ｆという）を求める。
【００７１】（第六工程；被検微生物の懸濁液にＡＴＰ
抽出剤を添加し、該抽出剤添加前から存在する遊離ＡＴ
Ｐと、抽出されたＡＴＰ（菌体内ＡＴＰ）からなるト−
タルＡＴＰの発光測定）被検微生物の希釈懸濁液１００
μｌにキッコ−マン社製ＡＴＰ抽出試薬１００μｌを添
加して室温で２０秒経過後に、発光試薬を１００μｌを
添加して、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００に
て、発光測定した。この測定によって試料の遊離ＡＴＰ
と抽出剤の作用により微生物菌体外に抽出されたＡＴＰ
（菌体内ＡＴＰ）とのト−タルＡＴＰの発光量（Ｔ）を
求めた。
【００７２】（第七工程；菌体内ＡＴＰの発光量算出）
前工程のト−タル発光量（Ｔ）からフリ−発光量（Ｆ）
を減ずることにより、菌体内ＡＴＰの正確な発光量を求
めることができる。
【００７３】（第八工程；菌体内ＡＴＰの発光量の補正
値の算出）ここに至るまでにおけるルシフェリン−ルシ
フェラ−ゼの生物発光反応は、試料に含まれる成分によ
り多少の阻害を受けるため、発光阻害を受けないときの
発光量を得るには補正をしなければならない。補正は以
下のようにした行なった。即ち、被検微生物懸濁液１０
０μｌに２×１０-10ＭのＡＴＰ標準液１００μｌを添
加し、２０秒後に発光試薬を１００μｌ添加して、キッ
コ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００にて発光量を測定
し、内標準発光量Ｈを求めた。上記内標準発光量の測定
法において、被検微生物懸濁液１００μｌを使用する代
わりに滅菌超純水１００μｌを使用する以外は、全く同
様にして発光量を測定し、本標準発光量Ｇを求めた。内
標準発光量Ｈからフリ−発光量Ｆを差引いた値を本標準
発光量Ｇで除することにより、発光率Ｋを求め、第七工
程で得られた菌体内ＡＴＰの発光量（Ｔ−Ｆ）を前記発
光率Ｋで除することにより、発光阻害がないときの菌体
内ＡＴＰの発光量Ｙ（補正値）を求めた。 Ｙ＝（Ｔ−Ｆ）／Ｋ Ｋ＝（Ｈ−Ｆ）／Ｇ
【００７４】（第九工程；補正値に対応するＡＴＰ濃度
の算出）発光阻害がないときの菌体内ＡＴＰの発光量
（補正値）に対応するＡＴＰ濃度を予め作成した図１０
に示す検量線に従い求めた。
【００７５】（第十工程；混釈培養法により、被検微生
物懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵの算出）滅菌シャ−レに
適宜希釈した被検微生物懸濁液の一定量を滅菌ピペット
で無菌的に加え、約５０℃に冷却した溶解済みの標準寒
天培地（０．２５％酵母エキス、０．５％トリプトン、
０．１％ブドウ糖、ｐＨ７．１、２．０％寒天）を加
え、シャ−レの蓋をして、前後左右にゆるく動かし、か
つ回すようにして被検微生物懸濁液と培地とを均一に混
和し、３５℃で２４時間培養して、出現したコロニ−数
を計測し、希釈率から原液１ｍｌ当り存在する微生物数
（Ｃｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ（ＣＦ
Ｕ））を推定する。
【００７６】（第十一工程；ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量の
測定）発光阻害がないときの菌体内ＡＴＰの発光量（補
正値）に対応するＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／ｍｌ）を第十工
程で求めた被検微生物懸濁液ｍｌ当たりのＣＦＵ（ＣＦ
Ｕ／ｍｌ）で除することにより、スタフィロコッカス・
アウレウスの１ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量を求めた。その
結果、２×１０-17ｍｏｌ／ＣＦＵを得た。以上の結果
をまとめて表１に示す。
【００７７】 表１ スタフィロコッカス・アウレウスのＣＦＵ当りのＡＴＰ量（ｍｏｌ／ＣＦＵ） 希釈率 10,000倍 ト−タル発光値（Ｔ） 16,198 フリ−発光値（Ｆ） 905 Ｔ−Ｆ発光値 15,293 補正発光値 21,268 ＡＴＰ濃度（mol/ml） 2.54×10-13 実測値（混釈培養法）（CFU/ml） 1.27×104 ＡＴＰ量（mol/CFU） 2.00×10-17
【００７８】
【実施例１０】 （実施例９において得られたスタフィロコッカス・アウ
レウスにおけるＣＦＵ当りのＡＴＰの測定値（約２×１
０-17ｍｏｌ）を用いてＡＴＰ消去剤の影響下、その活
性を保持した状態でスタフィロコッカス・アウレウス培
養液の希釈懸濁液の生菌体ＣＦＵの測定法） 第一工程；培養液を希釈液で所定濃度まで希釈し、被検
微生物の希釈懸濁液の調製。 第二工程；被検微生物の希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの消
去。 第三工程；被検微生物の希釈懸濁液に微存する遊離ＡＴ
Ｐの発光測定 第四工程；被検微生物の希釈懸濁液にＡＴＰ抽出剤を添
加し、微存する遊離ＡＴＰと抽出されたＡＴＰ（菌体内
ＡＴＰ）からなるト−タルＡＴＰの発光測定 第五工程；菌体内ＡＴＰの算出 第六工程；補正発光量の算出 第七工程；補正発光量に対応するＡＴＰ濃度の算出 第八工程；スタフィロコッカス・アウレウスの希釈懸濁
液のｍｌ当りのＣＦＵ濃度を算出。 第九工程；比較例（混釈培養法による被検微生物の希釈
懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵの算出）
【００７９】（第一工程；培養液を希釈液で所定濃度ま
で希釈し、被検微生物の希釈懸濁液の調製）前記実施例
の第一工程で得られたスタフィロコッカス・アウレウス
の培養液を、オ−トクレ−ブにより加熱滅菌処理した標
準液体培地（希釈液）で、１万倍、１０万倍、１００万
倍、１０００万倍に希釈し、被検微生物の希釈懸濁液を
得た。
【００８０】（第二工程；被検微生物の希釈懸濁液の遊
離ＡＴＰの消去）上記被検微生物の希釈懸濁液にアピラ
−ゼとアデノシンリン酸デアミナ−ゼをそれぞれ終濃度
０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加して、３５℃で３０
分反応して、ＡＴＰを消去した。
【００８１】（第三工程；被検微生物の希釈懸濁液の遊
離ＡＴＰの発光量測定）被検微生物の希釈懸濁液１００
μｌに滅菌超純水１００μｌを添加し、発光試薬１００
μｌを添加し、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１０
０にて、発光量を測定した。この測定により被検微生物
懸濁液の遊離ＡＴＰの発光量（Ｆ）を求めることができ
る。
【００８２】（第四工程；被検微生物の希釈懸濁液にＡ
ＴＰ抽出剤を添加し、遊離ＡＴＰと抽出されたＡＴＰ
（菌体内ＡＴＰ）からなるト−タルＡＴＰの発光量を求
める）被検微生物の希釈懸濁液１００μｌにキッコ−マ
ン社製ＡＴＰ抽出試薬１００μｌを添加して室温で２０
秒経過後に、発光試薬を１００μｌを添加して、キッコ
−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００にて、発光量を測定
した。この測定により、抽出剤の作用により抽出された
菌体内ＡＴＰの発光量および懸濁液の遊離ＡＴＰの発光
量の和を求めることができるので、これをト−タル発光
量Ｔとした。
【００８３】（第五工程；菌体内ＡＴＰの算出）このト
−タル発光量Ｔからフリ−発光量Ｆを減ずることによ
り、菌体内ＡＴＰの正確な発光量を求める。
【００８４】（第六工程；補正発光量の算出）ここに至
る各工程においてルシフェリン−ルシフェラ−ゼによる
生物発光反応は、懸濁液に含まれる成分により多少の阻
害を受けるため、以下の方法により補正し阻害を受けな
い場合の発光量を求める。被検微生物の希釈懸濁液１０
０μｌに２×１０-10ＭのＡＴＰ標準液１００μｌを添
加し、２０秒後に発光試薬を１００μｌ添加して、キッ
コ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００にて内標準発光量
Ｈを求めた。上記内標準発光量Ｈの測定において、被検
微生物の希釈懸濁液１００μｌを使用する代わりに滅菌
超純水１００μｌを使用する以外は、全く同様にして本
標準発光量Ｇを求めた。内標準発光量Ｈからフリ−発光
量Ｆを差引いた値を本標準発光量Ｇで除することにより
発光率Ｋを求め、菌体内ＡＴＰの発光量（Ｔ−Ｆ）を前
記発光率Ｋで除することにより、補正発光量Ｙを求め
る。 Ｙ＝（Ｔ−Ｆ）／Ｋ Ｋ＝（Ｈ−Ｆ）／Ｇ
【００８５】（第七工程；補正発光量に対応するＡＴＰ
濃度の算出）補正発光量Ｙに対応するＡＴＰ濃度を予め
作成した図１０に示す検量線に従い求める。
【００８６】（第八工程；スタフィロコッカス・アウレ
ウスの希釈懸濁液のｍｌ当りのＣＦＵ濃度を算出）第七
工程で求めた補正発光量に対応するＡＴＰ濃度（ｍｏｌ
／ｍｌ）を前記実施例９の第十一工程（最終工程）で求
めたスタフィロカッカス・アウレウスのＣＦＵ当たりの
ＡＴＰ量、約２×１０-17ｍｏｌで除することにより、
スタフィロコッカス・アウレウスの希釈懸濁液のｍｌ当
りのＣＦＵ濃度を算出した。
【００８７】第九工程；比較例（混釈培養法による被検
微生物の希釈培養液のｍｌ当たりのＣＦＵの算出）滅菌
シャ−レに適宜希釈した被検微生物浮遊液の一定量を滅
菌ピペットで無菌的に予め加え、約５０℃に冷却した溶
解済みの標準寒天培地を加え、シャ−レの蓋をして、前
後左右にゆるく動かし、かつ回すようにして被検微生物
浮遊液と培地とを均一に混和し、３５℃で２４時間培養
して、出現したコロニ−数を計測し、希釈率から被検微
生物浮遊液のｍｌ中に存する微生物数（ＣＦＵ）を測定
した。こうして求めたＣＦＵ濃度を混釈法により求めた
実測値（ＣＦＵ／ｍｌ）とした。以上の結果をまとめて
表２に示す。
【００８８】 表２ スタフィロコッカス・アウレウスの生菌数濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）の測定 希釈率（倍） 10,000 100,000 1,000,000 10,000,000 ト−タル発光値 （Ｔ） 10,520 1,212 125 23 フリ−発光値 （Ｆ） 27 18 12 13 Ｔ−Ｆ発光値 10,493 1,194 113 10 補正発光値 22,493 2,558 243 23 ＡＴＰ濃度 （mol/ml） 2.68×10-13 3.05×10-14 2.90×10-15 2.68×10-16 計算値（本実施例） （CFU/ml） 1.34×104 1.53×103 1.45×102 1.34×10 実測値（混釈培養法） （CFU/ml） 1.11×104 1.34×103 1.07×102 1.00×10
【００８９】
【実施例１１】 （エセリシア・コリのＣＦＵ当りのＡＴＰ量（ｍｏｌ／
ＣＦＵ）の測定法）実施例９のスタフィロコッカス・ア
ウレウスのＣＦＵ当りのＡＴＰ量（ｍｏｌ／ＣＦＵ）の
測定法において、「スタフィロコッカス・アウレウス
（Ｓｔａｐｈｙlｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＡＴ
ＣＣ ２５９２３」を用いる代わりに、「エセリシア・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）ＮＩＳＬ Ｂ
−４３００」を用いる以外は、全く同様にしてＣＦＵ当
りのＡＴＰ量を測定した。その結果をまとめて表３に示
す。
【００９０】 表３ エセリシア・コリのＣＦＵ当りのＡＴＰ量（ｍｏｌ／ＣＦＵ） 希釈率 10,000倍 ト−タル発光値（Ｔ） 10,495 フリ−発光値（Ｆ） 948 Ｔ−Ｆ発光値 9,547 補正発光値 13,277 ＡＴＰ濃度（mol/ml） 1.58×10-13 実測値（混釈培養法）（CFU/ml） 3.58×104 ＡＴＰ量（mol/CFU） 4.42×10-18
【００９１】
【実施例１２】 （エセリシア・コリ培養液の希釈懸濁液の生菌数（ＣＦ
Ｕ／ｍｌ）の測定）実施例１０のスタフィロコッカス・
アウレウスの生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の測定法におい
て、被検微生物として「スタフィロコッカス・アウレウ
ス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ａ
ＴＣＣ ２５９２３」を用いる代わりに、「エセリシア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）ＮＩＳＬ
Ｂ−４３００」を用いる以外は、全く同様にしてエセリ
シア・コリ培養液の希釈懸濁液の生菌数濃度（ＣＦＵ／
ｍｌ）を測定した。その結果をまとめて表４に示す。
【００９２】 表４ エセリシア・コリの生菌数濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）の測定 希釈率（倍） 10,000 100,000 1,000,000 10,000,000 ト−タル発光値 （Ｔ） 7,553 902 138 29 フリ−発光値 （Ｆ） 45 31 18 18 Ｔ−Ｆ発光値 7,508 871 120 11 補正発光値 16,168 1,874 258 24 ＡＴＰ濃度 （mol/ml） 1.93×10-13 2.23×10-14 3.08×10-15 2.82×10-16 計算値（本実施例） （CFU/ml） 4.37×104 5.05×103 6.97×102 6.38×10 実測値（混釈培養法） （CFU/ml） 4.86×104 4.80×103 4.29×102 4.20×10
【００９３】
【実施例１３】（サッカロミセス・セレビシエのＣＦＵ
当りのＡＴＰ量（ｍｏｌ／ＣＦＵ）の測定法）実施例９
のスタフィロコッカス・アウレウスのＣＦＵ当りのＡＴ
Ｐ量（ｍｏｌ／ＣＦＵ）の測定法において、培地として
「標準液体培地」を用いる代わりに「ＹＭ培地（ブドウ
糖１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、モル
トエキス０．３％、ｐＨ６．０）」を用い、また「標準
寒天培地」を用いる代わりに「寒天入りＹＭ培地（ブド
ウ糖１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、モ
ルトエキス０．３％、寒天２％、ｐＨ６．０）」を用
い、また使用する被検微生物として「スタフィロコッカ
ス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒ
ｅｕｓ）ＡＴＣＣ ２５９２３」を用いる代わりに「サ
ッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＮＩＳＬＹ−３３９８」
を用いる以外は、全く同様にしてサッカロミセス・セレ
ビシエの生菌数（ＣＦＵ）当りのＡＴＰ量（ｍｏｌ／Ｃ
ＦＵ）を測定した。その結果をまとめて表５に示す。
【００９４】 表５ サッカロミセス・セレビシエのＣＦＵ当りのＡＴＰ量（ｍｏｌ／ＣＦＵ） 希釈率 10,000倍 ト−タル発光値（Ｔ） 20,015 フリ−発光値（Ｆ） 1,119 Ｔ−Ｆ発光値 18,896 補正発光値 29,894 ＡＴＰ濃度（mol/ml） 3.56×10-13 実測値（混釈培養法）（CFU/ml） 2.95×103 ＡＴＰ量（mol/CFU） 1.21×10-16
【００９５】
【実施例１４】 （サッカロミセス・セレビシエ培養液の希釈懸濁液の生
菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の測定）実施例１０のスタフィロ
コッカス・アウレウスの生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の測定
法において、被検微生物として「スタフィロコッカス・
アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅ
ｕｓ）ＡＴＣＣ ２５９２３」を用いる代わりに、「サ
ッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＮＩＳＬ Ｙ−３３９
８」を用いる以外は、全く同様にしてサッカロミセス・
セレビシエ培養液の希釈懸濁液の生菌数濃度（ＣＦＵ／
ｍｌ）を測定した。その結果をまとめて表６に示す。
【００９６】 表６ サッカロミセス・セレビシエの生菌数濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）の測定 希釈率（倍） 10,000 100,000 1,000,000 ト−タル発光値 （Ｔ） 15,871 1,522 184 フリ−発光値 （Ｆ） 17 11 10 Ｔ−Ｆ発光値 15,854 1,511 174 補正発光値 36,032 3,434 395 ＡＴＰ濃度 （mol/ml） 4.30×10-13 4.09×10-14 4.71×10-15 計算値（本実施例） （CFU/ml） 3.55×103 3.38×102 3.89×10 実測値（混釈培養法） （CFU/ml） 4.05×103 3.35×102 3.40×10
【００９７】表１〜表６の結果から、本発明の方法によ
れば、従来最も精度が高く、測定値の信頼性が高いと言
われている、混釈培養法に匹敵するＡＴＰの測定法を提
供することができる。そして、本発明によれば従来法が
必要としていた培養工程を省略することが可能となり、
検査に要する時間が数十分にて完了できるので、処理時
間を従来法に比べて大幅に短縮することができる。ま
た、希釈するための実験器具、希釈したり培地を調製す
るための時間と労力を大幅に軽減することができること
が判る。また標準液体培地及びＹＭ培地において、遊離
ＡＴＰはそれぞれ相対発光値（ＲＬＵ）で９２１００及
び１３９３５０もあり、菌数の測定はできなかった。し
かし、ＡＴＰ消去試薬により遊離のＡＴＰを消去し、フ
リー発光値を低下させることにより、スタフィロコッカ
ス アウレウスや、サッカロミセス セレビシエのよう
に１ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量が比較的多い場合では、数
１０ＣＦＵ／ｍｌから検出が可能であり、エセリシア
コリのように、１ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量が比較的少な
い場合では、４０から５０ＣＦＵ／ｍｌから検出が可能
となった。よって、ＡＴＰ消去試薬が活性を保持した状
態でも、検出感度が十分に高いことが判る。なお、本発
明の方法によって得られた計算値の菌数（ＣＦＵ／ｍ
ｌ）と、混釈培養法によって得られた実測値の菌数（Ｃ
ＦＵ／ｍｌ）の相関係数を求めたところ、いずれの菌の
場合も０．９９であり、極めて良好な相関を示し、ＡＴ
Ｐ消去試薬が活性を保持した状態でも、正確な菌数の測
定が可能であることが判る。また、本発明により求めら
れた各微生物から抽出されたＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／ｍ
ｌ）と混釈培養法により求められた実測値の菌数（ＣＦ
Ｕ／ｍｌ）との関係をまとめて図１１に示す。この図か
ら、いずれの微生物の場合も良好な検量線（直線性）を
描くことができる。以上のことから、本発明により求め
た微生物から抽出されたＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／ｍｌ）か
ら菌数の正確な測定が可能であることが判る。
【００９８】
【実施例１５】 （液体栄養培地ＳＣＤ培地の遊離ＡＴＰ消去法）液体栄
養培地ＳＣＤ培地（トリプトン１．５％、ソイトン０．
５％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．３）にアデノシンリ
ン酸デアミナ−ゼを終濃度０．０１Ｕ／ｍｌとなるよう
に加え、３５℃で１２０分保持し、経時的に試料を採取
し、発光測定を行なった。発光測定は試料１００μｌに
０．３ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を１００μｌ
添加し、さらにキッコ−マン社製ルシフェ−ルＬＵ（Ａ
ＴＰ測定試薬）１００μｌを添加し、同社製ルミテスタ
−Ｋ−１００にて発光量を測定した。その結果を表７に
まとめて示した。表７の結果から、初発（即ちアデノシ
ンリン酸デアミナ−ゼの作用がない）場合のＳＣＤ培地
におけるＡＴＰ濃度は、相対発光量値で２７１８も存在
するが、該酵素の作用が開始されると遊離ＡＴＰが速や
かに減少し、６０分で殆ど消去されることが判る。
【００９９】
【実施例１６】 （バチルス・ズブチリスに汚染された醤油麹の該汚染菌
の定量法）実質的に無菌の醤油麹２０ｇにバチルス・ズ
ブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＨ
Ｕ１０３５を図１２に示す添加量（個／麹ｇ）となるよ
うに添加し、人為的にバチルス・ズブチリスに汚染され
た醤油麹を得た。この醤油麹に０．３ｍＭのリン酸緩衝
液（ｐＨ７．２）を８０ｍｌ添加して、よく攪拌し懸濁
液を調製した。次いで、前記懸濁液８ｍｌに、上記実施
例１５に記載したＳＣＤ培地の４倍濃度調製液（トリプ
トン６．０％、ソイトン２．０％、ＮａＣｌ２．０％、
ｐＨ７．３）２ｍｌ及び２％ナイスタチン（麹菌の生育
阻害剤）の７０％エタノ−ル溶液５０μｌ、アデノシン
リン酸デアミナ−ゼ５Ｕ／ｍｌを２０μｌ（終濃度０．
０１Ｕ／ｍｌ）を加えて３５℃でバチルス・ズブチリス
のみを選択的に静置培養し、この培養の途中において培
養液を経時的に１００μｌづつ採取して、キッコ−マン
製ＡＴＰ抽出試薬１００μｌ添加し、２０秒後にキッコ
−マン製ルシフェ−ルＬＵ（ＡＴＰ測定試薬）の１００
μｌを添加し、キッコ−マン製ルミテスタ−Ｋ−１００
で発光測定（数値は相対発光量で示した）を行なった。
この発光量を測定することにより、バチルス・ズブチリ
スの経時的な相対増殖量を調べることができる。その結
果を図１２に示す。
【０１００】前述したように表７の結果からＳＣＤ培地
には高濃度の遊離ＡＴＰが存在し、相対発光量値は２７
１８を示す。この値は本実施例の５．０×１０3個／ 麹
ｇの区分における４時間経過後のバチルス・ズブチリス
由来のＡＴＰ濃度（相対発光量＝約３０００）と区別で
きない。そのため、ＳＣＤ培地の遊離ＡＴＰを消去しな
い従来法においてはバチルス・ズブチリスの正確な測定
ができないことが判明した。これに対し本発明によれ
ば、図１２の結果から明らかなように、予めＳＣＤ培地
の遊離ＡＴＰを消去することにより、バチルス・ズブチ
リス由来の正確なＡＴＰ量の測定ができることが判る。
【０１０１】
【実施例１７】 （乳酸菌に汚染された醤油麹の該汚染菌の定量法）実施
例１６のバチルス・ズブチリスに汚染された醤油麹の該
汚染菌の定量法において、「バチルス・ズブチリス」の
代わりに「乳酸菌ロイコノストック・メッセンテロイデ
ス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ Ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄ
ｅｓ ＡＨＵ１０６５」を用いる以外は、全く同様にし
て、乳酸菌に汚染された醤油麹の該乳酸菌の定量法を実
施した。結果を図１３に示す。
【０１０２】図１２及び図１３の結果から、醤油麹に混
入したバチルス・ズブチリス及び乳酸菌の初発濃度がそ
れぞれ５×１０2個／ｇ麹及び４．３×１０2個／ｇ麹の
区分においては４時間経過後においても相対発光量が殆
ど増大しない。これに対し、初発濃度がそれぞれ５×１
０3個／ｇ麹及び３．３×１０3個／ｇ麹の区分において
は相対発光量が４時間後において著しく増大することが
判る。この結果から、醤油麹の盛込原料の初発の汚染細
菌（バチルス・ズブチリス及び乳酸菌）のおおまかな定
量が可能であることが判る。
【０１０３】
【実施例１８】 （雑細菌に汚染された製麹原料の該雑細菌の定量法）通
常の醤油麹の製造法に従って、蒸煮した脱脂大豆に炒熬
割砕した小麦を混和して製麹原料を調製した。これに醤
油用種麹を接種し、生活雑廃水から分離された各種雑細
菌の懸濁液（生菌数１０9／ｍｌ）を均一に噴霧して、
雑細菌に汚染された製麹原料を得た。この原料は図１７
に記載の如き雑細菌（個／ｇ麹）を有する製麹原料であ
った。次いで、実施例１６のバチルス・ズブチリスに汚
染された醤油麹の該汚染菌の定量法において、「バチル
ス・ズブチリスに汚染された醤油麹」を用いる代わり
に、上記「雑細菌に汚染された製麹原料」を用いる以外
は、全く同様にして該雑細菌の定量を実施した。結果を
図１７に示す。
【０１０４】図１７の結果から、一般の醤油麹の製造に
際し、製麹開始時の雑細菌のおおまかな菌数の推定が可
能であることが判る。即ち、製麹原料に混入した各種雑
細菌濃度が、１．５×１０2個／ ｇ原料においては４時
間経過後においても相対発光量が殆ど増大しないが、
３．２×１０3個／ｇ原料においては４ 時間後において
相対発光量が著しく増大することから初発の製麹原料の
各種雑細菌のおおまかな定量が可能であることが判る。
【０１０５】
【実施例１９】 （サッカロミセス・セレビシエのＣＦＵ当りのＡＴＰ量
の測定法）以下の各工程をこの順序で行い、サッカロミ
セス・セレビシエのＣＦＵ当りのＡＴＰ量の測定を行っ
た。 第一工程；被検微生物サッカロミセス・セレビシエの培
養液の調製 第二工程；被検微生物培養液から遊離ＡＴＰの消去 第三工程；被検微生物培養液の希釈用リン酸緩衝液の調
製 第四工程；被検微生物懸濁液の調製 第五工程；被検微生物懸濁液の遊離ＡＴＰの発光測定 第六工程；被検微生物の希釈懸濁液にＡＴＰ抽出剤を添
加し、該抽出剤添加前の遊離ＡＴＰと、添加後抽出され
た菌体内ＡＴＰからなるト−タルＡＴＰの発光測定 第七工程；菌体内ＡＴＰの発光量の算出 第八工程；菌体内ＡＴＰの発光量の補正値の算出 第九工程；補正発光値に対応するＡＴＰ濃度の算出 第十工程；混釈培養法による被検微生物懸濁液のｍｌ当
たりのＣＦＵの算出 第十一工程；ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量の測定
【０１０６】第一工程；被検微生物サッカロミセス・セ
レビシエの培養液の調製 オ−トクレ−ブにより加熱殺菌処理したＹＭ培地（ブド
ウ糖１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、モ
ルトエキス０．３％、ｐＨ６．０）８ｍｌにサッカロミ
セス・セレビシエ、ＮＩＳＬ Ｙ−３３９８を一白金耳
接種し、３５℃で一晩静置培養して培養液を得た。
【０１０７】第二工程；被検微生物培養液から遊離ＡＴ
Ｐの消去 前工程で得た培養液（生菌体を多量に含有する）２ｍｌ
に、アピラ−ゼ及びアデノシンリン酸デアミナ−ゼをそ
れぞれ終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加し、３
５℃で３０分間処理して、培養液の遊離ＡＴＰを予め消
去した。これによりＡＴＰのブランク値を低下させるこ
とができる。
【０１０８】第三工程；被検微生物培養液の希釈用リン
酸緩衝液の調製 ０．６２５ｍＭ・ＫＨ2ＰＯ4リン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）をオ−トクレ−ブで加熱殺菌して、前工程で得た遊
離ＡＴＰ消去済培養液の希釈液（以下リン酸緩衝液とい
う）を調製した。
【０１０９】第四工程；被検微生物懸濁液の調製。 遊離ＡＴＰを消去した培養液に希釈用リン酸緩衝液を添
加して、被検微生物サッカロミセス・セレビシエの１０
０，０００倍希釈液を調製し、２５℃で３０分放置して
これを発光測定用の試料とした。
【０１１０】第五工程；被検微生物懸濁液の遊離ＡＴＰ
の発光測定 被検微生物サッカロミセス・セレビシエの１００，００
０倍希釈懸濁液１００μｌに滅菌超純水１００μｌ及び
発光試薬１００μｌを添加し、キッコ−マン社製ルミテ
スタ−Ｋ−１００にて、発光量を測定した。この測定に
より被検微生物の希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの発光量（以
下フリ−の発光量Ｆという）を求める。
【０１１１】第六工程；被検微生物の希釈懸濁液にＡＴ
Ｐ抽出剤を添加し、該抽出剤添加前の遊離ＡＴＰと、添
加後抽出されたＡＴＰからなるト−タルＡＴＰの発光測
定 被検微生物の１００，０００倍希釈懸濁液１００μｌに
キッコ−マン社製ＡＴＰ抽出試薬１００μｌを添加して
室温で２０秒経過後に、発光試薬を１００μｌを添加し
て、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００にて、発
光量を測定した。この測定法により、試料の遊離ＡＴＰ
と抽出剤の作用により微生物菌体外に抽出されたＡＴＰ
（菌体内ＡＴＰ）とのト−タルＡＴＰの発光量（Ｔ）を
求めた。
【０１１２】第七工程；菌体内ＡＴＰの発光量の算出 前工程で得たト−タル発光量（Ｔ）からフリ−発光量
（Ｆ）を減ずることにより菌体内ＡＴＰの正確な発光量
（Ｔ−Ｆ）を求める。
【０１１３】第八工程；菌体内ＡＴＰの発光量の補正値
の算出 これまでのルシフェリン−ルシフェラ−ゼ発光反応は、
被検微生物懸濁液に含まれる種々の成分により多少の阻
害を受けるため、真の発光測定値（即ち発光阻害を受け
ないときの発光量）を得るため以下に記載の通り補正を
行なった。被検微生物１００μｌに２×１０-10ＭのＡ
ＴＰ標準液１００μｌを添加し、２０秒後に発光試薬を
１００μｌ添加して、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ
−１００にて測定して、発光量を測定し、内標準発光量
Ｈを求めた。次に、上記内標準発光量の測定法におい
て、被検微生物懸濁液１００μｌを使用する代わりに、
滅菌超純水１００μｌを使用する以外は、全く同様にし
て発光量を測定し、本標準発光量Ｇを求めた。内標準発
光量Ｈからフリ−発光量Ｆを差引いた値を本標準発光量
Ｇで除することにより、発光率Ｋを求め、第七工程で得
られた菌体内ＡＴＰの発光量（Ｔ−Ｆ）を前記発光率Ｋ
で除することにより、発光阻害がないときの菌体内ＡＴ
Ｐの発光量（補正値）Ｙを求めた。 Ｙ＝（Ｔ−Ｆ）／Ｋ Ｋ＝（Ｈ−Ｆ）／Ｇ
【０１１４】第九工程；補正発光値に対応するＡＴＰ濃
度の算出 発光阻害がないときの菌体内ＡＴＰの発光量（補正値）
に対応するＡＴＰ濃度を予め作成した図１０に示す検量
線に従い求めた。
【０１１５】第十工程；混釈培養法による被検微生物懸
濁液のｍｌ当たりのＣＦＵの算出 被検微生物懸濁液を滅菌処理したＹＭ培地で適宜濃度と
なるように希釈し、滅菌処理した、寒天２％を含有する
ＹＭ培地に混釈培養法によりプレ−ティングして、３５
℃で一晩培養し、出現したコロニ−数を計測し、希釈率
から被検微生物懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵを算出し
た。
【０１１６】第十一工程；ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量の測
定 発光阻害がないときの菌体内ＡＴＰの発光量（補正値）
に対応するＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／ｍｌ）を第十工程で求
めた被検微生物懸濁液ｍｌ当たりのＣＦＵ（ＣＦＵ／ｍ
ｌ）で除することにより、被検微生物サッカロミセス・
セレビシエの１ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量を求めた。その
結果、３．０７×１０-16ｍｏｌ／ＣＦＵを得た。な
お、この結果は先の実施例１１のそれ（１．２１×１０
-16ｍｏｌ／ＣＦＵ）と若干相違するが、これは希釈懸
濁溶液の相違に基ずくものであると判断される。以上の
結果をまとめて表８に示す。
【０１１７】 表８ サッカロミセス・セレビシエの菌体当りのＡＴＰ量（ｍｏｌ／ＣＦＵ）の測定 希釈率 100,000倍 ト−タル発光値（Ｔ） 5,506 フリ−発光値（Ｆ） 91 Ｔ−Ｆ発光値 5,415 補正発光値 5,471 ＡＴＰ濃度（mol/ml） 8.94×10-14 実測値（混釈培養法）（CFU/ml） 2.91×102 ＡＴＰ量（mol/CFU） 3.07×10-16
【０１１８】表８の結果から本発明によれば容易に被検
微生物サッカロミセス・セレビシエのＣＦＵ当たりのＡ
ＴＰ量を求めることができる。
【０１１９】
【実施例２０】 （ケチャップに混入したサッカロミセス・セレビシエの
生菌体濃度の測定法）以下の各工程をこの順序で行い、
ケチャップに混入したサッカロミセス・セレビシエの生
菌体濃度の測定を行なった。 第一工程；被検微生物サッカロミセス・セレビシエを含
有するトマトケチャップの希釈懸濁液の調製 第二工程；トマトケチャップ希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの
消去 第三工程；遊離ＡＴＰを消去したトマトケチャップ希釈
懸濁液の遊離ＡＴＰの発光量の測定 第四工程；遊離ＡＴＰを消去したトマトケチャップ希釈
懸濁液にＡＴＰ抽出剤を添加し、微存する遊離ＡＴＰと
菌体から抽出されたＡＴＰ（菌体内ＡＴＰ）からなるト
−タルＡＴＰの発光量を求める 第五工程；菌体外に抽出されたＡＴＰの発光量の測定 第六工程；補正発光量の算出 第七工程；補正発光量に対応するＡＴＰ濃度の算出 第八工程；サッカロミセス・セレビシエを含有するトマ
トケチャップの希釈懸濁液のｍｌ当りのＣＦＵ濃度を算
出 第九工程；比較例（混釈培養法によるサッカロミセス・
セレビシエを含有するトマトケチャップの希釈懸濁液の
ｍｌ当たりのＣＦＵの算出）
【０１２０】第一工程；被検微生物サッカロミセス・セ
レビシエを含有するトマトケチャップの希釈懸濁液の調
製 市販のトマトケチャップ２．０ｇに、サッカロミセス・
セレビシエの培養液をリン酸緩衝液（希釈液）で１０倍
に希釈したもの８μｌを添加した。さらに同希釈液１８
ｍｌを添加し均一に混和した。次いで、そのうちの１ｍ
ｌを採取し同希釈液１９ｍｌを添加し均一に混和して、
被検微生物を含むトマトケチャップの２００倍希釈懸濁
液を調製した。
【０１２１】第二工程；トマトケチャップ希釈懸濁液の
遊離ＡＴＰの消去 トマトケチャップ希釈懸濁液にアピラ−ゼとアデノシン
リン酸デアミナ−ゼをそれぞれ終濃度０．０５Ｕ／ｍｌ
となるように添加して、２５℃で３０分反応して、遊離
ＡＴＰを消去したトマトケチャップ希釈懸濁液を得た。
また比較のため、本実施例においてアピラ−ゼとアデノ
シンリン酸デアミナ−ゼを併用添加する代わりに、アピ
ラ−ゼを単独で終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように用
いる以外は全く同様にして遊離ＡＴＰを消去した。それ
らの結果をまとめて、図１５に示す。
【０１２２】図１５の結果から、アピラ−ゼを単独では
トマトケチャップの希釈懸濁液の遊離ＡＴＰを消去でき
ないが、アピラ−ゼとアデノシンリン酸デアミナ−ゼを
併用添加するときは、該希釈懸濁液の初発遊離ＡＴＰ濃
度を約１万分の一にまで低減できることが判る。
【０１２３】第三工程；遊離ＡＴＰを消去したトマトケ
チャップ希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの発光量の測定 遊離ＡＴＰを消去したトマトケチャップ希釈懸濁液１０
０μｌに、滅菌超純水１００μｌ及び発光試薬１００μ
ｌを添加し、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００
にて遊離ＡＴＰの発光量を測定した。この測定により、
かすかに残存する遊離ＡＴＰの発光量（Ｆ）を求めるこ
とができる。
【０１２４】第四工程；遊離ＡＴＰを消去したトマトケ
チャップ希釈懸濁液にＡＴＰ抽出剤を添加し、微存する
遊離ＡＴＰと菌体から抽出されたＡＴＰ（菌体内ＡＴ
Ｐ）からなるト−タルＡＴＰの発光量を求める 遊離ＡＴＰを消去したトマトケチャップ希釈懸濁液１０
０μｌにキッコ−マン社製ＡＴＰ抽出試薬１００μｌを
添加して室温で２０秒経過後に、発光試薬を１００μｌ
を添加して、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００
にて、発光量を測定した。この測定により、該懸濁液に
かすかに残存する遊離ＡＴＰと菌体から抽出されたＡＴ
Ｐ（菌体内ＡＴＰ）からなるト−タルＡＴＰの発光量
（Ｔ）を求めることができる。
【０１２５】第五工程；菌体外に抽出されたＡＴＰの発
光量の測定 このト−タル発光値Ｔからフリ−発光値Ｆを差引くこと
により、菌体外に抽出されたＡＴＰ由来の正確な発光量
（Ｔ−Ｆ）を求めることができる。
【０１２６】第六工程；補正発光量の算出 ここに至る各工程においてルシフェリン−ルシフェラ−
ゼによる生物発光反応は、懸濁液に含まれる成分により
多少の阻害を受けるため、以下の方法により補正し、阻
害を受けない場合の真の発光量を求める。即ち、該懸濁
液１００μｌに２×１０-10ＭのＡＴＰ標準液１００μ
ｌを添加し、２０秒後に発光試薬を１００μｌ添加し
て、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００にて内標
準発光量Ｈを求めた。上記内標準発光量Ｈの測定におい
て、懸濁液１００μｌを使用する代わりに滅菌超純水１
００μｌを使用する以外は、全く同様にして本標準発光
量Ｇを求めた。内標準発光量Ｈからフリ−発光量Ｆを差
引いた値を本標準発光量Ｇで除することにより発光率Ｋ
を求め、菌体内ＡＴＰの発光量（Ｔ−Ｆ）を前記発光率
Ｋで除することにより、補正発光量Ｙを求めた。 Ｙ＝（Ｔ−Ｆ）／Ｋ Ｋ＝（Ｈ−Ｆ）／Ｇ
【０１２７】第七工程；補正発光量に対応するＡＴＰ濃
度の算出 補正発光量Ｙに対応するＡＴＰ濃度を予め作成した図１
０に示す検量線に従い求めた。
【０１２８】第八工程；サッカロミセス・セレビシエを
含有するトマトケチャップの希釈懸濁液のｍｌ当りのＣ
ＦＵ濃度を算出 本実施例の第七工程で求めた補正発光量に対応するＡＴ
Ｐ濃度（ｍｏｌ／ｍｌ）を前記実施例１９の第十一工程
（最終工程）で求めたサッカロミセス・セレビシエのＣ
ＦＵ当たりのＡＴＰ量、３．０７×１０-16ｍｏｌで除
することにより、サッカロミセス・セレビシエを含有す
るトマトケチャップの希釈懸濁液のｍｌ当りのＣＦＵ濃
度を算出した。即ち、トマトケチャップ中のサッカロミ
セス・セレビシエ生細菌の算出結果を得た。
【０１２９】第九工程；比較例（混釈培養法によるサッ
カロミセス・セレビシエを含有するトマトケチャップの
希釈懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵの算出） サッカロミセス・セレビシエを含有するトマトケチャッ
プの希釈懸濁液をＹＭ培地で適宜濃度となるように希釈
し、寒天入りＹＭ培地に混釈培養法によりプレ−ティン
グして、３５℃で２４時間培養し、出現したコロニ−数
を計測し、希釈率から希釈懸濁液ｍｌ当たりのＣＦＵを
算出した。こうして求めた生菌数濃度を混釈培養法によ
りもとめた実測値（ＣＦＵ／ｍｌ）とした。以上の結果
を表９にまとめて示す。
【０１３０】 表９ トマトケチャップ中のサッカロミセス・セレビシエの生菌数の測定 希釈率 ２００倍 ト−タル発光値（Ｔ） 1,332 フリ−発光値（Ｆ） 107 Ｔ−Ｆ発光値 1,225 補正発光値 1,734 ＡＴＰ濃度（mol/ml） 2.83×10-14 計算値（本実施例）（CFU/ml） 9.23×10 実測値（混釈培養法）（CFU/ml） 8.15×10 計算値（本実施例）（CFU/g） 1.85×104 実測値（混釈培養法）（CFU/g） 1.63×104
【０１３１】表９の結果から本発明の方法により得られ
たサッカロミセス・セレビシエを含有するトマトケチャ
ップの希釈懸濁液（トマトケチャップの２００倍希釈
液）の生菌数濃度（計算値）は９．２３×１０ＣＦＵ／
ｍｌであって、従来最も精度が高く測定値の信頼性が高
いと言われる混釈培養法により得られたそれ８．１５×
１０ＣＦＵ／ｍｌにほぼ匹敵する値が容易に得られる。
また本発明によって得られた生菌数濃度（計算値）に希
釈率２００倍をかけることによりトマトケチャップ１ｇ
中のサッカロミセス・セレビシエ生菌数は１．８５×１
０4個であることが判る。これにより迅速にトマトケチ
ャップのサッカロミセス・セレビシエ生菌数の測定がで
きることが判る。
【０１３２】
【実施例２１】 （サッカロミセス・セレビシエの混入したりんごジュ−
ス希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの消去）上述の実施例２０
（トマトケチャップに混入したサッカロミセス・セレビ
シエの生菌体濃度の測定法）において、「トマトケチャ
ップ」の代わりに市販の「１００％混濁タイプのりんご
ジュ−ス」を用い、第一工程の「被検微生物サッカロミ
セス・セレビシエを含有するりんごジュ−ス希釈懸濁液
の調製」を以下とする以外は、全く同様にして、サッカ
ロミセス・セレビシエの混入したりんごジュ−ス希釈懸
濁液を調製した。 「第一工程；被検微生物サッカロミセス・セレビシエを
含有するリンゴジュ−スの希釈懸濁液の調製 市販の１
００％混濁タイプリンゴジュ−ス５ｍｌにサッカロミセ
ス・セレビシエの培養液を５μｌ添加し均一に混和した
後、その１ｍｌを採取し、これに希釈液（リン酸緩衝
液）１９ｍｌを添加して、サッカロミセス・セレビシエ
を含有するリンゴジュ−スの２０倍希釈懸濁液を調製し
た。」 そして、このりんごジュ−ス希釈懸濁液にアピラ−ゼと
アデノシンリン酸デアミナ−ゼをそれぞれ終濃度０．０
５Ｕ／ｍｌとなるように添加して、２５℃で３０分反応
して、遊離ＡＴＰを消去した。また比較のため、本実施
例においてアピラ−ゼとアデノシンリン酸デアミナ−ゼ
を併用添加する代わりに、アピラ−ゼを単独で終濃度
０．０５Ｕ／ｍｌとなるように用いる以外は全く同様に
して遊離ＡＴＰを消去した。それらの結果をまとめて、
図１６に示す。
【０１３３】図１６の結果から、比較例のアピラ−ゼを
単独で添加する区分はリンゴジュ−スの遊離ＡＴＰを僅
かしか消去することはできないが、本発明のアピラ−ゼ
とアデノシンリン酸デアミナ−ゼを併用添加する区分
は、りんごジュ−スの初発の遊離ＡＴＰ濃度を約数百分
の一にまで低減できることが判る。
【０１３４】
【実施例２２】 （りんごジュ−スに混入したサッカロミセス・セレビシ
エの生菌体濃度の測定）実施例２０の「ケチャップに混
入したサッカロミセス・セレビシエの生菌体濃度の測定
法」において、「トマトケチャップ」を用いる代わりに
市販の「１００％混濁タイプりんごジュ−ス」を用い、
また第一工程を次の通りとする以外は同様にして被検微
生物を含有するりんごジュ−ス希釈懸濁液を調製した。 「第一工程；被検微生物サッカロミセス・セレビシエを
含有するリンゴジュ−スの希釈懸濁液の調製 市販の１００％混濁タイプリンゴジュ−ス５ｍｌにサッ
カロミセス・セレビシエの培養液を５μｌ添加し均一に
混和した後、その１ｍｌを採取し、これに希釈液（リン
酸緩衝液）１９ｍｌを添加して、サッカロミセス・セレ
ビシエを含有するリンゴジュ−スの２０倍希釈懸濁液を
調製した。」 そして、りんごジュ−スに混入したサッカロミセス・セ
レビシエの生菌体濃度の測定を行なった。その結果を表
１０に示す。
【０１３５】 表１０ りんごジュ−ス中のサッカロミセス・セレビシエの生菌数の測定 希釈率 ２０倍 ト−タル発光値（Ｔ） 21,175 フリ−発光値（Ｆ） 4,182 Ｔ−Ｆ発光値 16,993 補正発光値 46,340 ＡＴＰ濃度（mol/ml） 7.57×10-13 計算値（本実施例）（CFU/ml） 2.47×103 実測値（混釈培養法）（CFU/ml） 1.47×103 計算値（本実施例）（CFU/g） 4.93×104 実測値（混釈培養法）（CFU/g） 2.94×104
【０１３６】表１０の結果から、本発明の方法により得
られたサッカロミセス・セレビシエを含有するリンゴジ
ュ−スの２０倍希釈懸濁液の生菌数濃度（ＣＦＵ／ｍ
ｌ）（計算値）は２．４７×１０3であって、従来最も
精度が高く、測定値の信頼性が高いと言われている、混
釈培養法により得られたそれ（実測値）１．４７×１０
3にほぼ匹敵する値が容易に得られる。また本発明によ
って得られた生菌数濃度（計算値）に希釈率２０倍をか
けることによりリンゴジュ−ス１ｇ中のサッカロミセス
・セレビシエ生細菌は４．９３×１０4個であることが
判る。これにより、迅速にリンゴジュ−スのサッカロミ
セス・セレビシエ生細菌数の測定ができることが判る。
【０１３７】
【実施例２３】 （雑菌に汚染された豆腐希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの消
去）上述の実施例２０（トマトケチャップに混入したサ
ッカロミセス・セレビシエの生菌体濃度の測定法）にお
いて、「トマトケチャップ」の代わりに市販の「絹ごし
豆腐」を用い、また第一工程を以下とする以外は、全く
同様にして、雑細菌の混入した絹ごし豆腐希釈懸濁液を
調製した。 「第一工程；雑細菌の混入した絹ごし豆腐希釈懸濁液の
調製 市販の新鮮な「絹ごし豆腐」に、予め生活雑廃水から分
離された細菌懸濁液を適当量添加して、雑菌に汚染され
た豆腐を得、この１０ｇにリン酸緩衝液（希釈液）９０
ｍｌを添加して、押圧破砕機「ストマッカ− ４００−
Ｔ（オルガノ社製）」にて、豆腐の希釈懸濁液を調製し
た。これを１ｍｌ採り、これに同希釈液３９ｍｌを添加
して、均一に混和し最終的に４００倍豆腐希釈懸濁液を
調製した。」 そして、この豆腐希釈懸濁液にアピラ−ゼとアデノシン
リン酸デアミナ−ゼをそれぞれ終濃度０．０５Ｕ／ｍｌ
となるように添加して、２５℃で３０分反応して、遊離
ＡＴＰを消去した。この結果を図１７に示す。
【０１３８】図１７の結果から、アピラ−ゼを単独で添
加する比較例の区分は３０分間保持すると約一万分の一
まで消去することができるが、アピラ−ゼとアデノシン
リン酸デアミナ−ゼを併用添加する本発明の区分は、初
発の遊離ＡＴＰ濃度を約数十万分の一にまで消去できる
ことが判る。
【０１３９】
【実施例２４】 （豆腐に混入した汚染細菌の生菌体濃度の測定）実施例
２０の「ケチャップに混入したサッカロミセス・セレビ
シエの生菌体濃度の測定法」において、「トマトケチャ
ップ」を用いる代わりに市販の「絹ごし豆腐」を用い、
また第一工程を以下とする以外は全く同様にして、雑細
菌の混入した絹ごし豆腐希釈懸濁液を調製した。 「第一工程；雑細菌の混入した絹ごし豆腐希釈懸濁液の
調製 市販の新鮮な「絹ごし豆腐」に、予め生活雑廃水から分
離された細菌懸濁液を適当量添加して、雑菌に汚染され
た豆腐を得、この１０ｇにリン酸緩衝液（希釈液）９０
ｍｌを添加して、押圧破砕機「ストマッカ− ４００−
Ｔ（オルガノ社製）」にて、豆腐の希釈懸濁液を調製し
た。これを１ｍｌ採り、これに同希釈液３９ｍｌを添加
して、均一に混和し最終的に４００倍豆腐希釈懸濁液を
調製した。」 そして、絹ごし豆腐に混入した雑菌の生菌体濃度の測定
を行なった。その結果を表１１に示す。 （１）なお表１１に記載の実測値（混釈培養法）は以下
のようにして求めたものである。 （混釈培養法による被検微生物懸濁液のｍｌ当たりのＣ
ＦＵの算出）被検微生物懸濁液を滅菌処理した「標準液
体培地」で適宜希釈し、滅菌処理した、寒天２％を含有
する「標準寒天培地」に混釈培養法によりプレ−ティン
グして、３５℃で２日培養し、出現したコロニ−数を計
測し、希釈率から被検微生物懸濁液のｍｌ当たりのＣＦ
Ｕを算出した。 （２）また被検微生物希釈懸濁液の生菌数の算出には、
当該生菌体のＡＴＰを予め求めたおいたＣＦＵ当たりの
ＡＴＰ量で除することにより求めたが、本実施例では一
般の生細菌のＣＦＵ当りのＡＴＰ量、３×１０-18ｍｏ
ｌ／ＣＦＵを利用して、豆腐に混入した生菌体の濃度を
求めた 。その結果を表１１に示す。
【０１４０】 表１１ 豆腐中の雑細菌数の測定 希釈率 ４００倍 ト−タル発光値（Ｔ） 3,325 フリ−発光値（Ｆ） 49 Ｔ−Ｆ発光値 3,276 補正発光値 5,164 ＡＴＰ濃度（mol/ml） 7.79×10-14 計算値（本実施例）（CFU/ml） 2.60×104 実測値（混釈培養法）（CFU/ml） 2.32×104 計算値（本実施例）（CFU/g） 1.04×107 実測値（混釈培養法）（CFU/g） 9.28×106
【０１４１】表１１の結果から、本発明の方法により得
られた雑細菌で汚染された豆腐の４００倍希釈懸濁液の
生菌数濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）（計算値）は２．６０×１
０4であって、従来最も精度が高く、測定値の信頼性が
高いと言われている、混釈培養法により得られたそれ
（実測値）２．３２×１０4にほぼ匹敵する値が得られ
る。また、本発明によって得られた生菌数濃度（計算
値）に希釈率４００倍をかけることにより豆腐１ｇの汚
染細菌数は１．０４×１０7であることが判る。これに
より、迅速に豆腐の汚染細菌の測定ができることが判
る。
【０１４２】
【実施例２５】 （雑菌に汚染されたカニ足肉様蒲鉾のＡＴＰの消去法）
上述の実施例２０（トマトケチャップに混入したサッカ
ロミセス・セレビシエの生菌体濃度の測定法）におい
て、「トマトケチャップ」の代わりに市販の「カニ足肉
様蒲鉾」を用い、また第一工程を以下とする以外は、全
く同様にして、雑細菌の混入したカニ足肉様蒲鉾希釈懸
濁液を調製した。 「第一工程；被検微生物の混入したカニ足肉様蒲鉾希釈
懸濁液の調製 市販の新鮮な「カニ足肉様蒲鉾」に予め生活雑廃水から
分離された雑細菌懸濁液を適当量散布して、雑菌に汚染
されたカニ足肉様蒲鉾を得、この１０ｇに希釈用リン酸
緩衝液９０ｍｌを添加して、押圧破砕機「ストマッカ−
４００−Ｔ（オルガノ社製）」にて破壊し、カニ足肉様
蒲鉾の希釈懸濁液を調製した。この上澄み液１ｍｌを採
り、これに同希釈液９ｍｌを添加して、均一に混和し最
終的にカニ足肉様蒲鉾１００倍希釈懸濁液を調製した。
そして、この希釈懸濁液にアピラ−ゼとアデノシンリン
酸デアミナ−ゼをそれぞれ終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとな
るように添加して、２５℃で３０分反応して、遊離ＡＴ
Ｐを消去した。この結果を図１８に示す。
【０１４３】図１８の結果から、比較例のアピラ−ゼを
単独で添加する区分では、懸濁液の遊離ＡＴＰを十分に
消去できないが、本発明のＡＴＰ消去酵素アピラ−ゼと
アデノシンリン酸デアミナ−ゼを併用添加する区分は、
初発の遊離ＡＴＰ濃度を約数十万分の一に消去できるこ
とが判る。
【０１４４】
【実施例２６】 （カニ足肉様蒲鉾に混入した汚染細菌の生菌体濃度の測
定）実施例２０の「ケチャップに混入したサッカロミセ
ス・セレビシエの生菌体濃度の測定法」において、「ト
マトケチャップ」を用いる代わりに市販の「カニ足肉様
蒲鉾」を用い、また第一工程を以下とする以外は全く同
様にして、雑細菌の混入したカニ足肉様蒲鉾希釈懸濁液
を調製した。 「第一工程；被検微生物の混入したカニ足肉様蒲鉾希釈
懸濁液の調製 市販の新鮮な「カニ足肉様蒲鉾」に予め生活雑廃水から
分離された雑細菌懸濁液を適当量散布して、雑菌に汚染
されたカニ足肉様蒲鉾を得、この１０ｇに希釈用リン酸
緩衝液９０ｍｌを添加して、押圧破砕機「ストマッカ−
４００−Ｔ（オルガノ社製）」にて破壊し、カニ足肉様
蒲鉾の希釈懸濁液を調製した。この上澄み液１ｍｌを採
り、これに同希釈液９ｍｌを添加して、均一に混和し最
終的にカニ足肉様蒲鉾１００倍希釈懸濁液を調製し
た。」 そして、カニ足肉様蒲鉾に混入した雑菌の生菌体濃度の
測定を行なった。その結果を表１２に示す。 （１）なお表１２に記載の実測値（混釈培養法）は以下
のようにして求めたものである。 （混釈培養法による被検微生物懸濁液のｍｌ当たりのＣ
ＦＵの算出）被検微生物懸濁液を滅菌処理した「標準液
体培地」で適宜濃度となるように希釈し、滅菌処理し
た、寒天２％を含有する「標準寒天培地」に混釈培養法
によりプレ−ティングして、３５℃で２日培養し、出現
したコロニ−数を計測し、希釈率から被検微生物懸濁液
のｍｌ当たりのＣＦＵを算出した。 （２）また被検微生物希釈懸濁液の生菌数の算出には、
当該生菌体のＡＴＰを予め求めたおいたＣＦＵ当たりの
ＡＴＰ量で除することにより求めたが、本実施例では一
般の生細菌のＣＦＵ当りのＡＴＰ量、３×１０-18ｍｏ
ｌ／ＣＦＵを利用して、カニ足肉様蒲鉾に混入した生菌
体の濃度を得る。その結果を表１２に示した。
【０１４５】 表１２ 蟹足肉様カマボコ中の雑細菌の測定 希釈率 １００倍 ト−タル発光値（Ｔ） 5,768 フリ−発光値（Ｆ） 81 Ｔ−Ｆ発光値 5,687 補正発光値 8,500 ＡＴＰ濃度（mol/ml） 1.28×10-13 計算値（本実施例）（CFU/ml） 4.27×104 実測値（混釈培養法）（CFU/ml） 6.18×104 計算値（本実施例）（CFU/g） 4.27×106 実測値（混釈培養法）（CFU/g） 6.18×106
【０１４６】表１２の結果から雑細菌に汚染されたカニ
足肉様蒲鉾の接触液を１００倍希釈した液中の生菌数濃
度（ＣＦＵ／ｍｌ）（計算値）は４．２７×１０4であ
って、従来最も精度が高く、測定値の信頼性が高いと言
われている、混釈培養法により得られたそれ（実測値）
６．１８×１０4にほぼ匹敵する値が得られる。また本
発明によって得られた生菌数濃度（計算値）に希釈率１
００倍をかけることによりカニ足肉様蒲鉾の１ｇ中の雑
細菌数は４．２７×１０6であることが判る。そして、
本発明によれば迅速なカニ足肉様蒲鉾中の雑細菌の測定
ができることが判る。
【０１４７】
【実施例２７】 （雑菌に汚染された米飯希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの消
去）上述の実施例２０（トマトケチャップに混入したサ
ッカロミセス・セレビシエの生菌体濃度の測定法）にお
いて、「トマトケチャップ」の代わりに「米飯」を用
い、また第一工程を以下とする以外は、全く同様にし
て、雑細菌の混入した米飯希釈懸濁液を調製した。 「第一工程；雑細菌の混入した炊飯希釈懸濁液の調製 通常の「炊飯米」を１０ｇづつ多数区分に分け、予め生
活雑廃水から分離された細菌懸濁液を噴霧して、雑菌に
汚染された米飯を得た。滅菌処理したプラスチックチュ
−ブ（内径約２５ｍｍ、長さ１１０ｍｍ、容量５０ｍ
ｌ）（ファルコンチュ−ブ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉ
ｎｓｏｎ社製）に上記雑菌汚染炊飯米３ｇを入れ、また
リン酸緩衝液（希釈液）６ｍｌを添加して、人為的に約
１分振盪して、この上澄み液３ｍｌを採取し、米飯の希
釈懸濁液を調製した。そして、米飯希釈懸濁液にアピラ
−ゼとアデノシンリン酸デアミナ−ゼをそれぞれ終濃度
０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加して、２５℃で３０
分反応して、遊離ＡＴＰを消去した。この結果を図１９
に示す。
【０１４８】図１９の結果から、比較例のアピラ−ゼを
単独で添加する区分は、３０分保持しても充分には消去
することができないが、本発明のアピラ−ゼとアデノシ
ンリン酸デアミナ−ゼを併用添加する区分は、初発の遊
離ＡＴＰ濃度を、約数千分の一にまで消去できることが
判る。
【０１４９】
【実施例２８】 （米飯に混入した汚染細菌の生菌体濃度の測定）実施例
２０の「ケチャップに混入したサッカロミセス・セレビ
シエの生菌体濃度の測定法」において、「トマトケチャ
ップ」を用いる代わりに「炊飯米（米飯）」を用い、ま
た第一工程を以下とする以外は全く同様にして、雑細菌
の混入した米飯希釈懸濁液を調製した。 「第一工程；雑細菌の混入した米飯希釈懸濁液の調製 通常の「炊飯米」を１０ｇづつ多数区分に分け、予め生
活雑排水から分離された細菌懸濁液を噴霧して、雑菌に
汚染された米飯を得た。滅菌処理したプラスチックチュ
−ブ（内径約２５ｍｍ、長さ１１０ｍｍ、容量５０ｍ
ｌ）（ファルコンチュ−ブ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉ
ｎｓｏｎ社製）に上記雑菌汚染炊飯米３ｇを入れ、また
リン酸緩衝液（希釈液）６ｍｌを添加して、人為的に約
１分振盪して、この米飯３ｇに付着する雑菌を２倍量の
希釈液６ｍｌに回収した。そしてその上澄み液３ｍｌを
採取し、米飯の希釈懸濁液を調製した。なお、この希釈
懸濁液１ｍｌには０．５ｇの米飯に付着していた雑菌が
回収されていることになる。」 そして、米飯に混入した雑菌の生菌体濃度の測定を行な
った。こうして得られた米飯の希釈懸濁液１ｍｌ当りの
雑細菌のＡＴＰ量の対数ｌｏｇ ｍｏｌ／ｍｌを座標の
Ｘ軸に、また混釈培養法により得られた炊飯米１ｇ当り
の雑細菌数の対数ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇの値をＹ軸にし
て、その相関を調べた。得られた結果を図２０に示し
た。 （１）なお上記混釈培養法による雑菌数の測定は以下の
ようにして求めたものである。 （混釈培養法による被検微生物懸濁液のｍｌ当たりのＣ
ＦＵの算出）被検微生物懸濁液を滅菌処理した「標準液
体培地」で適宜濃度となるように希釈し、滅菌処理し
た、寒天２％を含有する「標準寒天培地」に混釈培養法
によりプレ−ティングして、３５℃で２日培養し、出現
したコロニ−数を計測し、希釈率から被検微生物懸濁液
のｍｌ当たりのＣＦＵを算出した。そしてこの値を２倍
することにより炊飯米１ｇ当りの雑菌数ＣＦＵ／ｇを得
た。
【０１５０】図２０の結果から、雑菌数がｇ当り１００
ＣＦＵ以上（即ちＹ軸における目盛り２以上）におい
て、雑菌由来のＡＴＰ量の対数ｌｏｇ ｍｏｌ／ｍｌ
と、混釈培養法により求めた雑菌数の対数ｌｏｇ ＣＦ
Ｕ／ｇは、正の相関（相関係数０．９７６）関係を示
し、この結果から、本発明方法により炊飯米の雑菌を正
確に、しかも簡便、迅速に感度良く定量することができ
ることが判る。
【図面の簡単な説明】
【図１】ベルト−ルド社製ルミノメ−タ−「ルマット
ＬＢ９５０１」によるＡＴＰ検量線を示す。
【図２】酵素によるＡＴＰ消去法において、酵素反応の
時間と反応後に残存するＡＴＰ濃度の関係を示す。
【図３】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを
併用添加するＡＴＰ消去法において、該アデノシンリン
酸デアミナ−ゼの活性と反応後に残存するＡＴＰ濃度の
関係を示す。
【図４】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを
併用添加するＡＴＰ消去法において該アデノシンリン酸
デアミナ−ゼの活性とＡＴＰ残存率の関係を示す。
【図５】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを
併用添加するＡＴＰ消去法において、該アピラ−ゼの活
性と反応後に残存するＡＴＰ濃度の関係を示す。
【図６】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを
併用添加するＡＴＰ消去法において該アピラ−ゼの活性
とＡＴＰ残存率の関係を示す。
【図７】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼの
存在下、各濃度のＡＴＰ標準液を加えて反応させた場合
の経時的なＡＴＰ残存率を示す。
【図８】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを
併用添加するＡＴＰ消去法において、酵素反応における
ｐＨと反応後に残存するＡＴＰ濃度の関係を示す。
【図９】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを
併用添加するＡＴＰ消去法において、酵素反応における
温度と反応後に残存するＡＴＰ濃度の関係を示す。
【図１０】キッコ−マン社製ルミノメ−タ−「ルミテス
タ−Ｋ−１００」によるＡＴＰ検量線を示す。
【図１１】本発明により求められた各微生物菌体由来の
ＡＴＰ濃度と混釈培養法により得られた菌数との関係を
示す。
【図１２】バチルス・ズブチリスに汚染された醤油麹の
該バチルス・ズブチリスの定量結果を示す。
【図１３】乳酸菌に汚染された醤油麹の該乳酸菌の定量
結果を示す。
【図１４】雑細菌に汚染された醤油麹盛込み原料の該雑
細菌の定量結果を示す。
【図１５】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼ
を併用添加して、酵母に汚染されたトマトケチャップ希
釈懸濁液の遊離ＡＴＰを消去する場合の反応時間とＡＴ
Ｐ濃度の関係を示す
【図１６】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼ
を併用添加して、酵母に汚染されたリンゴジュ−ス希釈
懸濁液の遊離ＡＴＰを消去する場合の反応時間とＡＴＰ
濃度の関係を示す
【図１７】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼ
を併用添加して、雑菌に汚染された豆腐希釈懸濁液の遊
離ＡＴＰを消去する場合の反応時間とＡＴＰ濃度の関係
を示す
【図１８】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼ
を併用添加して、雑菌に汚染された、かにかまぼこ希釈
懸濁液の遊離ＡＴＰを消去する場合の反応時間とＡＴＰ
濃度の関係を示す
【図１９】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼ
を併用添加して、雑菌に汚染された米飯希釈懸濁液の遊
離ＡＴＰを消去する場合の反応時間とＡＴＰ濃度の関係
を示す。
【図２０】米飯の希釈懸濁液１ｍｌ当りの雑細菌のＡＴ
Ｐ量の対数ｌｏｇ ｍｏｌ／ｍｌと混釈培養法により得
られた炊飯米１ｇ当りの雑細菌数の対数ｌｏｇＣＦＵ／
ｇとの相関を示す。
フロントページの続き (72)発明者 谷地舘 恵子 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内 (72)発明者 渡会 輝夫 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内 (72)発明者 中島 基雄 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内 (72)発明者 今井 一洋 東京都世田谷区代田６−15−18

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アデノシンリン酸デアミナ−ゼを有効成分
    として含有することを特徴とするＡＴＰ消去剤。
  2. 【請求項２】アピラ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、酸
    性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ及びアデノシントリ
    ホスファタ−ゼからなる群より選ばれる少なくとも一種
    とアデノシンリン酸デアミナ−ゼとを有効成分として含
    有することを特徴とするＡＴＰ消去剤。
  3. 【請求項３】ＡＴＰ含有試料にアデノシンリン酸デアミ
    ナ−ゼを添加することを特徴とするＡＴＰ消去法。
  4. 【請求項４】ＡＴＰ含有試料にアピラ−ゼ、アルカリホ
    スファタ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ及
    びアデノシントリホスファタ−ゼからなる群より選ばれ
    る少なくとも一種とアデノシンリン酸デアミナ−ゼとを
    併用添加することを特徴とするＡＴＰ消去法。
  5. 【請求項５】アデノシンリン酸デアミナ−ゼを有効成分
    として含有することを特徴とする生物細胞測定試薬。
  6. 【請求項６】アピラ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、酸
    性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ、アデノシントリホ
    スファタ−ゼからなる群より選ばれた少なくとも一種と
    アデノシンリン酸デアミナ−ゼとを有効成分として含有
    することを特徴とする生物細胞測定試薬。
  7. 【請求項７】生物細胞を含有する試料にアデノシンリン
    酸デアミナ−ゼを作用させ該試料中の遊離ＡＴＰを消去
    し、次いで該生物細胞内のＡＴＰを生物発光法を用いて
    測定することを特徴とする生物細胞測定法。
  8. 【請求項８】生物細胞を含有する試料にアピラ−ゼ、ア
    ルカリホスファタ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘキソキ
    ナ−ゼ、アデノシントリホスファタ−ゼからなる群より
    選ばれる少なくとも一種とアデノシンリン酸デアミナ−
    ゼとを作用させ該試料中の遊離ＡＴＰを消去し、次いで
    該生物細胞内のＡＴＰを生物発光法を用いて測定するこ
    とを特徴とする生物細胞測定法。
  9. 【請求項９】生物細胞を含有する試料が飲食品、その半
    製品、またはその素材である請求項７または８に記載の
    生物細胞測定法。
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