DE102010053461A1

DE102010053461A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Kryokonservieren von biologischem Material

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Publication number: DE102010053461A1
Application number: DE201010053461
Authority: DE
Inventors: Anmelder Gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-12-03
Filing date: 2010-12-03
Publication date: 2012-06-06

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Kryokonservieren von biologischem Material und eine Vorrichtung zum Durchführen des Verfahrens. Es ist die Aufgabe gestellt, eine Zellsuspension unter Erhalt der Lebensfähigkeit der Zellen ohne Kryoprotektiva einzufrieren. Die Aufgabe wird gelöst durch die Methode des Elektrospraying bei gleichzeitigen Minimieren der Folgen des Leidenfrostschen Phänomens.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Kryokonservieren von Zellen, Zellsuspensionen und feingeweblichen Strukturen
Die Kryokonservierung von Zellen, Zellsuspensionen und Geweben ist nicht durch einfaches Abkühlen zu erreichen, weil dabei der Gefrierpunkt des Wassers unterschritten wird und sich zwei wesentliche Schädigungsmechanismen für die Zellen entwickeln.

1. Es bilden sich innerhalb und außerhalb der Zelle Eiskristalle, die durch ihr Wachstum die äußere Zellmembran oder innere Strukturen der Zelle mechanisch zerstören.
2. Mit fallender Temperatur geht das intrazelluläre Wasser in die Festphase – Eis – über, während zunächst in kleine Zellkompartimenten die verbleibenden Proteine, Lipide, Kohlenhydrate sowie Elektrolyte in sehr hoher Konzentration in Lösung und in der flüssigen Phase verbleiben. Erst wenn auch der Gefrierpunkt für diese konzentrierten gelösten Kompartimente überschritten ist, ist die Probe vollständig durchgefroren. Im Prozess der Kompartimentierung und Konzentrierung in diesen Kompartimenten werden jedoch Erhaltungsbedingungen für Proteine, Zellorganellen oder DNA, um nur einige zu nennen, soweit überschritten, dass Schädigungen an diesen Zellbestandteilen bzw. Biomolekülen irreversibel auftreten.

Nach Auftauen der Zelle würden beide Schädigungsmechanismen nicht dazu geeignet sein, die weitere Funktion eines hohen Anteils von Zellen in der ursprünglichen Zellsuspension bzw. dem ursprünglichen Gefriergut zu gewährleisten. Zur Vermeidung beider Effekte werden darum dem biologischen Material Kryoprotektiva zugemischt. Übliche Kryoprotektiva sind z. B. DMSO (Dimethylsulfoxid), Hydroxyethylstärke (HES) oder Glyzerol. Solche Kryoprotektiva sind, wie z. B. DMSO selbst toxisch oder gänzlich unphysiologisch, z. B. Glyzerol, so dass sie in weiterer Verwendung der Zellsuspensionen nach Wiederauftauen ausgewaschen werden müssen oder aber der schädigende Mechanismus in Kauf genommen werden muss.
Mit den üblichen Verfahren sind für verschiedene Zellarten verschiedene Abkühlgeschwindigkeiten als optimal für die Zellrecovery identifiziert worden. Zum Beispiel werden weiße Blutzellen sowie darin enthaltene Stammzellkompartimente optimal mit Einfriergeschwindigkeiten von 1 Kelvin pro Minute eingefroren, während z. B. Erythrozyten Einfriergeschwindigkeiten von größer 1000 Kelvin pro Minute benötigen.
Mit Elektrospraying als Methode der Vereinzelung von Zellen in Suspensionen befasst sich WO 2007/017653 . Es werden Tröpfchen mit einem Durchmesser von weniger als 50 μm erzeugt.
EP 1 528 856 beschreibt einen Tropfengenerator, der als Düse ausgebildet ist und erzeugte Tropfen auf einer vorbestimmten Bahn in ein Kühlmittel wie flüssigen Stickstoff transportiert.
Über die Leitfähigkeit von flüssigem Stickstoff berichtet D. C. Hamilton in einer Dissertation der University of California 1986.
EP 1 470 407 verbessert einen Trägerkörper für die biologische Probe.
Kryoprotektionsmittel, bevorzugt für rote Blutkörperchen in Verbindung mit Wirkstoffen werden in DE 699 29 691 vorgeschlagen. Ohne Kryoprotektiva kommen auch Zeh, N. et al. www.kup.at/fertilität nicht aus.
Ohne Kryoprotektoren kommt DE 10 2008 019 842 aufgrund hoher Abkühlungsraten unter Einsatz von Stickstoffmatsch aus. Hohe Abkühlungsraten werden auch von Li-Min Wang et al., Arizona State University bevorzugt.
Das Leidenfrost-Phänomen erörtern Song, Y. S. et al. der Havard Mecical School.
Ein aseptisches Vitrifikationsverfahren entwickelt Schmölzer, E.-M. in der Dissertation der Universität Leipzig 2007.
Der Nachteil aller derzeit üblichen Verfahren ist die Verwendung von Kryoprotektiva sowie die intrazelluläre Eiskristallbildung und die Kompartimentierung intrazellulärer Flüssigkeit mit erheblichen Konzentrationsveränderungen in den Flüssigphasen-Kompartimenten.
Das Leidenfrostsche Phänomen und die Tatsache, dass es bisher nicht gelungen ist, dessen Wirkung zu eliminieren erlaubt bisher nicht Zellsuspensionen mit den nötigen sehr hohen Abkühlungsraten ohne Kroyprotektiva einzufrieren. Die Erfindung hat das Ziel, den Einsatz von Kryoprotektiva beim Tiefkühlen von biologischem Material einzuschränken oder ganz zu vermeiden und dabei die Lebensfähigkeit des biologischen Materials zu erhalten.
Die Aufgabe der Erfindung wird darin gesehen, die intrazellulären Bestandteile der Zellen zu vitrifizieren, das heißt, einen direkten Übergang von der Flüssigphase in die Glasphase intra- und extrazellulär zu erreichen, ohne das es zur Kristallbildung bzw. nur zur Bildung von sehr kleinen Kristallen kommt. Dies könnte mit sehr hohen Abkühlgeschwindigkeiten von > 1000 Kelvin pro Sekunde erreicht werden.¹²
Die Abkühlgeschwindigkeit in dem Gefriergut hängt davon ab, wie schnell es gelingt, die darin enthaltene Wärmemenge über die Oberfläche an die Umgebung abzuführen. Es wurde erkannt, dass die Parameter Temperatur, Wärmekapazität und Wärmeleitfähigkeit der Umgebung sowie die Relation Oberfläche zu Volumen bzw. Wärmeenergiegehalt der Probe bzw. Teilproben relevant sind. Außerdem spielt die Wärmeleitfähigkeit sowie die Wärmekapazität innerhalb der Probe bzw. Teilproben eine Rolle. Das Verfahren ist geeignet für biologische Proben, die als Suspensionen von protein- und elektrolythaltigen Lösungen vorliegen, (z. B. Blut, Zellkultursuspensionen, Körperflüssigkeiten etc.)
Ein übliches und preiswert vorhandenes Kühlmedium ist flüssiger Stickstoff, mit einer Siedetemperatur von ca. minus 196°C oder Trockeneis mit einer Sublimationstemperatur von minus 78,5°C
Wird Gefriergut in Behältnissen, wie z. B. Straws, Tubes oder Kryobeuteln in flüssigen Stickstoff getaucht, wird die rasche Abkühlung durch das sogenannte Leidenfrost'sche Phänomen behindert. Dabei bildet sich an der Oberfläche des Containers eine Schicht gasförmigen Stickstoffs aus, der selbst eine geringe Wärmeleitfähigkeit im Vergleich zu flüssigem Stickstoff hat. Es kommt also zur Ausbildung eines thermischen Isolators in der Grenzschicht. Mit diesem Verfahren sind also die für die Vitrifikation erforderlichen Abkühlungsraten nicht zu erreichen. Das Leidenfrost'sche Phänomen tritt nicht auf, wenn das Gefriergut auf kalte feste Oberflächen aufgebracht wird.³ Hier ist allerdings nur bis zu einer Schichttiefe von 10 bis 20 Mikrometern (μm) eine sehr rasche Abkühlung, Vitrifikation gewährleistet, da die innere Wärmeleitfähigkeit der biologischen Proben nicht höher als die von Wasser ist. Außerhalb dieser Randzone werden die Abkühlgeschwindigkeiten weit oberhalb der für Vitrifikation notwendigen bleiben.
Es ist deshalb erforderlich, die Schichtdicke des Gefriergutes bis in den Bereich von 10 bis 20 μm bei einseitiger Kältebeaufschlagung bzw. 20 bis 40 μm bei beidseitiger Kältebeaufschlagung abzusenken. Das Gefriergut muss also in kleine Einheiten (Tröpfchen) aufgeteilt werden, welches durch Vernebelung oder Versprühen von Zellsuspensionen möglich ist.⁴ ⁵ Die dabei zu erreichende Tröpfchengröße der Zellsuspension sollte im Bereich zwischen 15 bis 60 μm im Durchmesser liegen. In derartig kleinen Tröpfchen sind einzelne oder wenige Zellen von dem Suspensionsmedium, (z. B. Zellkulturmedium oder Blutplasma) umgeben. Die Oberfläche ist groß im Verhältnis zum Gesamtwärmeinhalt des Tröpfchens. Derart feine Tröpfchen lassen sich in der Regel nicht durch Gasdüsen erreichen, (z. B. Airbrush) wohl aber durch Druckversprühung, Ultraschallvernebelung oder Elektrospraying.⁶ Es ist durch verschiedene Methoden gezeigt worden, dass Zellsuspensionen unter Erhalt der Vitalität der enthaltenen Zellen mit den genannten Methoden versprüht werden können.^{7 8}
Es wurde erkannt, dass durch die Kombination zweier Methoden ein Fortschritt erzielt werden kann. Das Elektrospraying als Methode zum Erzeugen winziger Tröpfchen und deren Kryokonservierung durch Einbringen in flüssigen Stickstoff, bevorzugt durch Einsatz einer der beschriebenen Vorrichtungen, kann miteinander kombiniert werden.
Die gestellte Aufgabe wird erfindungsgemäß unter Einsatz des Verfahrens des Elektrospraying gelöst⁹. Beim Elektrospraying wird die Zellsuspension mit definierter Flußrate an eine Düse von ca. 0,5 mm (500 μm) Durchmesser gefördert und eine Hochspannung zwischen der elektrolythaltigen Zellsuspension und einer gegenüberliegenden Elektrode angelegt. Die erreichte Tröpfchengröße hängt von der angelegten Spannung der elektrischen Ladung und Leitfähigkeit der Zellsuspension sowie der Viskosität und der Oberflächenspannung¹⁰ der Zellsuspension und in geringerem Maße auch des Düsendurchmessers ab. Als vorteilhaft für Tröpfchendurchmessern um 50 μm aus Zellsuspension mit > 20% korpuskulären Bestandteilen sind Spannungen von 4 bis 50 KV und Elektrodenabstände von 7 bis 15 mm beschrieben.¹¹
In einer ersten Variante der vorliegenden Erfindung liegt eine Elektrode (2) innerhalb von flüssigem Stickstoff, so dass sich das elektrische Feld zunächst in der Gasphase von Stickstoff, dann innerhalb des flüssigen Stickstoffes (8) ausbreitet. Da sich die an der Düse (1) bildenden Tröpfchen durch das elektrische Feld fortlaufend in Richtung Anode (2) bewegen, werden die Tröpfchen nicht an der Oberfläche des flüssigen Stickstoffes reflektiert, sondern durch das elektrische Feld konstant weiter in Richtung zur Anode (2) transportiert. Das elektrische Feld wirkt sowohl in der Dampf- wie in der Flüssigphase von Stickstoff, da dieser von geringer Leitfähigkeit ist.¹² Dadurch wird der aufgrund der geringen Größe des Tröpfchens ohnehin sehr kleine Leidenfrost'sche Gasmantel um das Tröpfchen deformiert, das heißt, an der Unterseite, der Anode zugewandten Seite des Tröpfchens sehr dünn bis gar nicht vorhanden sein, wodurch sich eine gute Wärmekonvektion vom Tröpfcheninneren zum umgebenden Flüssigstickstoff erreichen lässt.
Die Ausführung dieser Variante 1 der Erfindung ist anhand der näher erläutert.
Alternativ (Variante 2) wird das Elektrospray durch eine trockene, nicht tiefkalte und nicht leitende Gasatmosphäre (VN₂) direkt auf eine kalte Oberfläche aufgetragen, das heißt, in diesem Falle wäre die Anode eine hochglatte, mit flüssigem Stickstoff auf minus 196°C gekühlte feste Oberfläche (10), auf die die Tröpfchen des Gefriergutes auftreffen. Auch in diesem Falle bildet sich keine Leidenfrost'sche Isolationshülle, die die Wärmeabfuhr reduziert; sondern die Temperaturreduzierung innerhalb des Tropfens geschieht ebenfalls mit sehr hoher Abkühlungsrate. Die gefrorenen Tröpfchen fallen anschließend in das mit LN₂ gefüllte Kryogefäß (z. B. Kryotube oder Kryobeutel o. ä.) (16). Die Temperatur des trockenen gasförmigen Stickstoffs liegt dabei zwischen minus 120 und minus 190°C.
Diese Variante 2 der Erfindung ist durch näher erläutert.
Es ist besonders darauf hinzuweisen, dass die angelegte Spannung den Transport der Tröpfchen in Richtung Kühlmittel wesentlich beschleunigt. Nicht nur die Gravitation, sondern zusätzlich das elektrische Feld bewirken ein schnelles und andauerndes Eintauchen des biologischen Materials in Tröpfchenform in das Kühlmittel, wodurch das Ziel der Erfindung erreicht werden kann.
In einer Variante 3 wird auf die feste Elektrodenoberfläche (10) in Trockeneis als festes Kühlmedium aufgebracht. Die Tröpfchen des Elektrosprays treffen also zunächst auf Trockeneis und werden an dieser Oberfläche durch das elektrische Feld gehalten. Trockeneis hat eine Sublimationswärme von 573 kJ/kg und liegt damit wesentlich über der spezifischen Übergangswärme von LN₂ (199 kJ/kg) oder Stickstoffschlamm SN₂ (26 kJ/kg). Um die im Tröpfchen enthaltene Wärmemenge abzuführen muss also deutlich weniger Kühlmedium den Phasenwechsel durchlaufen. Dabei ist nicht von wesentlicher Bedeutung, dass Trockeneis mit –80°C wärmer ist als LN₂ –196°C oder SN₂ –210°C, denn alle Temperaturen sind für die Vitrifikation völlig ausreichend. Der Leidenfrostsche Gasmantel wird für die Tröpfchen deutlich kleiner sein als mit LN₂, da nur etwa ein Viertel soviel Gas entsteht. Auch bei dieser Variante wird die Leidenfrost'sche Gashülle deformiert, da das Gefrierguttröpfchen weiter in Richtung Anode, also direkt auf die Festphase des Trockeneis, gezogen wird.
Anschließend werden die nun bereits vitrifizierten Tröpfchen durch eine geeignete Methode vom Trockeneis abgelöst und in LN₂ bzw. mit LN₂ gekühlte Behältnisse verbracht. Dies kann z. B. durch erneutes Elektrospraying zwischen der nunmehr als Elektrode geschalteten Platte (10) und einer weiteren Elektrode (19) direkt im LN₂ oder um das Gefäß erfolgen. Dabei muss die Hochspannung alternierend angelegt werden, wie in den und gezeigt ist. Das Ablösen kann aber auch durch mechanische oder Gravitationskräfte erfolgen.
Mit den Varianten der Erfindung lassen sich also intrazelluläre Vitrifikationen erreichen und damit ohne Kryokonservierungsmittel bzw. mit erheblich reduzierten Konzentrationen von Kryokonservierungsmitteln ausreichende Vitalitäten nach Wiederauftauen der kryokonservierten biologischen Proben.
Die Erfindung lässt sich wie folgt zusammen fassen. Zunächst als Verfahren zum Kryokonservieren von biologischem Material, wobei eine Zellsuspension mit einer Fließrate von 10^–3 bis 10^–15 m³/s durch eine Pumpe (3) an eine oder mehrere Düsen (1) gefördert wird, denen gegenüber eine Elektrode (2) angeordnet ist, wobei zwischen Düsen (1) und Elektrode (2) eine Gleichspannung von 2 bis 50 KV angelegt ist, die ein Hochspannungsgenerator (4) erzeugt, gebildete Tröpfchen in ein Kryogefäß (7) gelangen, das sich im elektrischen Feld der genannten Elektroden befindet und mit flüssigem Stickstoff LN₂ gefüllt ist, so dass die Tröpfchen durch das elektrische Feld weiter zu einer Anode gezogen werden unter gleichzeitiger Deformation eines entstandenen Leidenfrostschen Gasmantels und somit sehr hohe Abkühlraten des gesamten Tröpfcheninhaltes, also des biologischen Materials, bewirkt oder austretende Tröpfchen auf eine schräggestellte tiefkalte Plattenelektrode (10) prallen, wodurch das Leidenfrostsche Phänomen ausgeschaltet wird, die Tröpfchen von der Plattenelektrode (10) in ein Kryogefäss (15) gelangen, das mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist, während eine Atmosphäre über der tiefkalten Platte (10) aus trockenem, gasförmigen, kalten Stickstoff gebildet wird und zwischen minus 120 und minus 190°C liegt. Die Plattenelektrode (10) kann mit einer Schicht von Trockeneis (CO₂) belegt sein, die vitrifizierten Tröpfchen können vom Trockeneis durch Anlegen eines elektrischen Feldes zwischen der Platte und dem Kryogefäss (15) abgelöst werden, wobei das Kryogefäss (15) selbst eine Elektrode darstellt oder von einer solchen umgeben ist oder eine solche beinhaltet und der flüssige Stickstoff nach Beendigung der Kryokonservierung aus dem Kryogefäss (15) verdampft wird, welches jedoch von außen mittels flüssigem Stickstoff weiterhin kontinuierlich gekühlt wird, das Kryogefäss mit den Tröpfchen anschließend verschlossen und weiter in Kryolagerbehältern gelagert wird.
Das Verfahren wird vorteilhaft mit einer Vorrichtung verwirklicht, bei der eine Düse (1) als Elektrode ausgestaltet ist, eine Pumpe (3) Zellsuspension durch die Düse (1) fördern kann, ein Hochspannungsgenerator (4) mit einer Düse oder mehreren Düsen als Kathode und einer Elektrode (2) als Anode verbunden ist, ein Kryogefäss (7) Flüssigstickstoff (8) enthält und sich sowohl das Kryogefäss (7) als die Elektrode (2) in einem Isolationsgefäss (5) befinden, das flüssigen Stickstoff (6) enthält oder ein Hochspannungsgenerator (12) mit einer Düse oder mehreren Düsen (9) als Kathode und einer tiefkalten Platte (10) als Anode verbunden ist, ein Kryogefäss (15) flüssigen Stickstoff (16) enthält und seinerseits in einer Wanne (14) mit flüssigem Stickstoff angeordnet ist, während die schräg angeordnete Platte (10) durch flüssigen Stickstoff (14) in einem Isolationsgefäss (13) tief gekühlt wird. Die Platte (10) kann alternierend als Anode oder Kathode geschaltet werden, so zum Kryokonservieren der Tröpfchen als Anode und zur Ablösung der vitrifizierten Tröpfchen als Kathode, wobei für den letztgenannten Fall eine Elektrode am oder im oder um das Kryogefäß (15) als Anode dient. Die Anode kann im Kryogefäss innen oder außen angebracht sein oder das Kryogefäß kann selbst die Elektrode darstellen, wobei es rechteckig, rund, oval, sphärisch oder anderweitig ausgeformt sein kann.
Zitierte Literatur

¹ Ghose, T: Flash-Freezing Technique May Boost Egg Suivival Rates, (Wired Science, News for your Neurons, Categories: Biotech, Medicine), February 26, 2010
² Isachenko V., Isachenko E., Katov I. I., Montag M., Dessole S., Nawroth F., van der Ven H.: Cryoprotectant-Free cryopreserfation of human spermatozoa by Vitrification and freezing in vapor: Effect on Motility, DNA Integrity and Fertilization ability, Biology of Reproduction 71, 1167–1173, 2004
³ Xing, W., Zhou, C., Bian, J., Montag M., Xu, Y. and Li T.: Solid-surface vitrification is an appropriate and convenient method for cryopreservation of isolated rat follicles, Xing et a. Reproductive Biology and Endocrinology 2010.
⁴ Brajdich, T., Hagman, M., Lind, B., Muir, G. and Orr A.: Atomization, Graco Concept and Theory Training 1995
⁵ Song, Y. S., Adler, D., Xu, F., Kayaalp, E., Nureddin, A., Anchan, R. M., Maas, R. L and Demirci, U.: Vitrifcation and levitation of a liquid droplet on liquid nitrogen, (www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0914059107), PNAS 2009
⁶ Joly, P., Chavda, N, Eddaoudi A. and Jayasinghe, S. N.: Bio-electrospraying and aerodynamically assisted bio-jetting whole human blood: Interrogating cell surface marker integrity, BIOMICROFLUIDICS 4, 011101 (2010)
⁷ Jayasinghe, S. N. and Townsend-Nicholson A.: Stable electric-filed driven cone-jetting of concentrated biosuspensions, Lab Chip, 2006, 6, 1086–1090
⁸ Jayasinghe, S. N.: Bio-electrosprays: The development of a promising tool for regenerative and therapeutic medicine, Biotechnology Journal. 2007, 2, 934–937
⁹ WO 2007/017653 A1
¹⁰ Hrncir, E. und Rosina, J.: Surface tension of blood, Physiol. Res. 46(4): 319–321, 1997
¹¹ Jayasinghe, S. N., Eagles P. A. M. and Qureshi A. N.: Electric field driven jetting: an emerging approach for processing living cells, Biotechnology Journal, 2006, 1, 86–94
¹² Hamilton, D. C.: Electrical Conductivity and Equation of State of Liquid Nitrogen, Oxygen, Benzene, and 1-Butene Shocked to 60 GPa, Lawrence Livermore National Laboratory, University of California, October 8, 1986 (National Technical Information Service, U. S. Department of Commerce Springfield, UCRL-53768, Distrib: Category UC-34)

Bezugszeichenliste

1: Düse und Elektrode
2: Ringelektrode Anode
3: Pumpe mit definierter Flussrate für die Zellsuspension (Gefriergut)
4: Hochspannungsgenerator
5: Isolationsgefäß für LN₂
6: LN₂
7: Kryogefäß für das Gefriergut
8: LN₂ im Kryogefäß
9: Düse und Elektrode
10: Tiefkalte Plattenelektrode (Anode)
11: Pumpe mit definierter Flussrate für die Zellsuspension (Gefriergut)
12: Hochspannungsgenerator
13: Isolationsgefäß für LN₂
14: LN₂
15: Kryogefäss für das Gefriergut (Zellsuspension)
16: LN₂ im Kryogefäss
17: Isolationsgefäß für LN₂
18: Trockene, kalte Atmosphäre
19: Elektrode

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2007/017653 [0005]
EP 1528856 [0006]
EP 1470407 [0008]
DE 69929691 [0009]
DE 102008019842 [0010]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Zeh, N. et al. www.kup.at/fertilität [0009]
Li-Min Wang et al., Arizona State University [0010]
Song, Y. S. et al. der Havard Mecical School [0011]

Claims

Verfahren zum Kryokonservieren von biologischem Material wobei eine Zellsuspension mit einer Fließrate von 10^–3 bis 10^–15 m³/s durch eine Pumpe (3) an eine oder mehrere Düsen (1) gefördert wird, denen gegenüber eine Elektrode (2) angeordnet ist, wobei zwischen Düsen (1) und Elektrode (2) eine Gleichspannung von 2 bis 50 KV angelegt ist, die ein Hochspannungsgenerator (4) erzeugt, gebildete Tröpfchen in ein Kryogefäß (7) gelangen, das sich im elektrischen Feld der genannten Elektroden befindet und mit flüssigem Stickstoff LN₂ gefüllt ist, so dass die Tröpfchen durch das elektrische Feld weiter zu einer Anode gezogen werden unter gleichzeitiger Deformation eines entstandenen Leidenfrostschen Gasmantels und somit sehr hohe Abkühlraten des gesamten Tröpfcheninhaltes, also des biologischen Materials, bewirkt.
Verfahren zum Kryokonservieren von biologischem Material, wobei eine Zellsuspension mit einer Fließrate von 10^–3 bis 10^–15 m³/s durch eine Pumpe (11) an eine oder mehrere Düsen (9) gefördert wird, denen gegenüber eine Elektrode (10) angeordnet ist, wobei zwischen Düsen und Elektrode eine Gleichspannung von 2 bis 50 KV angelegt ist, von einem Hochspannungsgenerator (12) erzeugt, austretende Tröpfchen auf eine schräg gestellte tiefkalte Plattenelektrode (10) prallen, wodurch das Leidenfrostsche Phänomen ausgeschaltet wird, die Tröpfchen von der Plattenelektrode (10) in ein Kryogefäss (15) gelangen, das mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist, während eine Atmosphäre über der tiefkalten Platte (10) aus trockenem, gasförmigen, kalten Stickstoff gebildet wird.
Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, wobei eine Düse (1) als Elektrode ausgestaltet ist, eine Pumpe (3) Zellsuspension durch die Düse (1) fördern kann, ein Hochspannungsgenerator (4) mit Düsen als Kathode und einer Elektrode (2) als Anode verbunden ist, ein Kryogefäss (7) Flüssigstickstoff (8) enthält und sich sowohl das Kryogefäss (7) als die Elektrode (2) in einem Isolationsgefäss (5) befinden, das flüssigen Stickstoff (6) enthält.
Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 2, wobei Düsen (9) als Elektrode ausgestaltet sind, eine Pumpe (11) Flüssigkeit durch die Düsen (9) fördern kann, ein Hochspannungsgenerator (12) mit Düsen (9) als Kathode und einer tiefkalten Platte (10) als Anode verbunden ist, ein Kryogefäss (15) flüssigen Stickstoff (16) enthält und seinerseits in einer Wanne (14) mit flüssigem Stickstoff angeordnet ist, während die schräg angeordnete Platte (10) durch flüssigen Stickstoff (14) in einem Isolationsgefäss (13) tief gekühlt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Plattenelektrode (10) mit einer Schicht von Trockeneis (CO₂) belegt ist und die vitrifizierten Tröpfchen vom Trockeneis durch Anlegen eines elektrischen Feldes zwischen der Platte und dem Kryogefäss (15) abgelöst werden, wobei das Kryogefäss (15) selbst eine Elektrode darstellt oder von einer solchen umgeben ist oder eine solche beinhaltet.
Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei die Platte (10) abwechselnd als Anode zur Kryokonservierung und als Kathode zur Ablösung der vitrifizierten Tröpfchen geschaltet wird, wobei eine Elektrode am oder im oder um das Kryogefäß (15) als Anode dient.
Verfahren nach den Ansprüchen 1–3 und 5, wobei der flüssige Stickstoff nach Beendigung der Kryokonservierung aus dem Kryogefäss (15) verdampft wird, welches jedoch von außen mittels flüssigem Stickstoff weiterhin kontinuierlich gekühlt wird, das Kryogefäss mit den Tröpfchen anschließend verschlossen und weiter in Kryolagerbehältern gelagert wird.
Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektroden im Kryogefäss innen oder außen angebracht sind oder dass das Kryogefäß selbst die Elektrode darstellt, wobei es rechteckig, rund, oval, sphärisch ausgeformt sein kann.
Verfahren nach Anspruch 1–3, 5 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass der trockene gasförmige Stickstoff eine Temperatur zwischen –120 und –180° C aufweist.