CN109619089A - 一种胰岛细胞低温保存液及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胰岛细胞低温保存液及其使用方法。该低温保存液是在基本培养基中添加：间充质干细胞条件培养基10‑40％、人血白蛋白10‑50％、β‑氨基乙磺酸1‑10mM、二甲基亚砜0.1‑10％、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸1‑20mM、SD‑2821nM‑50uM、6‑羟基‑2,5,7,8‑四甲基色烷‑2‑羧酸1‑20mM、4‑(2‑氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐0.1‑1.0mM。该低温保存液能够达到在不影响胰岛细胞各项功能指标的前提下延长低温保存时间，以满足胰岛细胞短期长距离运输的目的。
Description
技术领域
本发明属于动物胰岛细胞低温保存技术领域，具体涉及一种可用于胰岛细胞低温运输保存液及其使用方法。
背景技术
2017年国际糖尿病联盟(IDF)发布了第八版全球糖尿病地图。新版地图显示，目前全球有4.25亿糖尿病患者，预计到2045年，将会有近7亿糖尿病患者。虽然采用强化血糖控制方案能控制糖尿病高血糖的发生，但不能防止低血糖的发生，也不能阻止糖尿病并发症的发生，终末期糖尿病患者由于存在着多器官损伤的并发症发生，需要耗费巨额医疗费用进行治疗，使大量家庭由此陷入严重的贫困状况，20％糖尿病并发症患者不能承受巨额医疗费用，因放弃治疗而导致死亡。因此，异种移植胰岛细胞治疗糖尿病研究蓬勃发展，日前取得了可喜的疗效。临床级猪胰岛细胞制品如何在全球范围内安全运输，也成了胰岛细胞产业化需要解决的关键问题。
体外培养(37℃)是目前公认的短期保存胰岛的最佳方法，原因在于通过体外培养可以提高胰岛细胞团的整体质量，如降低其免疫原性(Markmannet al.,1990；Jahret al.,2002)；纯化胰岛细胞团(Weberet al.,1977)等。但据报道称，这种方式的最长保存时间仅为48h(Heringet al.,2004)，且经过一段时间的体外培养，胰岛的数量会损失近总数的一半(Kin et al.,2008；Noguchiet al.,2010)，更为关键的是，通过这种方式保存的细胞在长途运输过程中也存在很大的问题，如胰岛细胞团的再次损失；培养环境要求过高、单位体积内保存的细胞密度小而导致的高运输成本等。
为了解决这些问题，考虑以超低温保存(cryopreservation)或低温保存(hypothermic preservation)等方式储存及运输胰岛细胞团。在超低温条件(-196℃)下，细胞将长期处于一个生命结构完整但新陈代谢缓慢甚至停滞的状态，可以进行长时间的储存，且在这种条件下细胞保存的密度相对与体外培养将大幅度提高。但通过超低温保存的胰岛细胞团，在降温和复温的过程中极易受胞内外冰晶的产生(McGann et al.,1988)、渗透压的急剧变化(osmotic rupture)(Toneret al.,1993)等因素的影响而损伤，尤其是在0～-60℃这段温度范围内。而且高浓度的冻存保护剂(cryoprotective agents,CPAs)，对细胞的活率及功能也存在一定的毒害作用(Best,2015)。
而在低温条件(0～4℃)下，细胞的代谢、能量储存及耗氧量均会降低，使其有短期储存的可能性，且低温保存不需要特殊的、价格高昂的超低温设备，因此，低温保存是最有可能实现胰岛细胞产业化运输的方式。但在这种温度条件下会引发如细胞膜及骨架受损(Stefanovich et al.,1995)、胞内离子失衡(Boutilier,2001)、氧化还原失衡(Vairettiet al.,2005)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)缺失(Brinkkoetteret al.,2008)等一系列的细胞损伤，且随着低温保存时间和复苏时间的延长这些损伤会逐渐加剧，最终导致细胞大量死亡。
因此，提高细胞活性、减轻细胞损伤，成了胰岛低温保存前进道路上必须解决的核心问题。除调节细胞密度(Paherniket al.,1996)和培养基内氧含量及增加培养基循环(Hart et al.,2005)外，最为有效的抑制细胞损伤的方法就是筛选合适的低温保存液和保护剂(Umeshitaet al.,1988；Todoet al.,1989；Shaninaet al.2000；Fenget al.,2006)。
目前国际上报道的胰岛低温保存运输最长时间只有72小时，远不能满足全球范围内的胰岛运输(≥4天)，且研究对象仅为小鼠胰岛(Yasuko et al.,2013)。世界卫生组(WHO)明确指出猪是异种器官移植的主要供体，所以针对猪胰岛这一关键的移植替代品的低温运输研究继续开展，这对于推动胰岛细胞产业化，全球范围内治疗糖尿病具有深远意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种能为临床异种移植提供高活性、高回收率、适合胰岛细胞团远距离、长时间运输的低温保存液及其使用方法，尤其是针对猪胰岛细胞的低温保存和运输。
本发明的低温保存液，是在基本培养基中添加间充质干细胞条件培养基10-40％；人血白蛋白10-50％；β-氨基乙磺酸1-10mM；二甲基亚砜0.1-10％；4-羟乙基哌嗪乙磺酸1-20mM；SD-282 1nM-50uM；6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸1-20mM；4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐0.1-1.0mM。
优选：是在基本培养基中添加间充质干细胞条件培养基15-30％；人血白蛋白20-40％；β-氨基乙磺酸2-5mM；二甲基亚砜1-5％；4-羟乙基哌嗪乙磺酸5-10mM；SD-282100nM-10uM；6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸5-10mM；4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐0.5-1mM。
进一步优选：是在基本培养基中添加间充质干细胞条件培养基30％；人血白蛋白20％；β-氨基乙磺酸3mM；二甲基亚砜1％；4-羟乙基哌嗪乙磺酸5mM；SD-282 1uM；6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸5mM；4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐0.5mM。
所述的基本培养基包括：F10，EGM-2，或RPMI1640培养基。
进一步优选基本培养基中添加有：10-30％猪血清、1-20mM谷氨酰胺、1-15mM尼克酰胺、10-50mM甘露醇、0.5-5mM半胱氨酸、10-500μM维生素C。
所述的胰岛细胞低温保存液，间充质干细胞条件培养基的制备过程如下：间充质干细胞条件培养基的制备过程如下：取P3-5代间充质干细胞置于37℃、体积分数为5％CO2培养箱中培养，加入含体积分数为10％猪血清的RPMI1640培养基，每3天换一次液；待细胞贴壁面积超过90％时，弃培养基，PBS洗涤2次后加入不含血清的RPMI1640培养基继续培养48h；用移液器将培养皿内培养基转移至50ml离心管内，300×g离心10min去除悬浮细胞；用移液器将上清转移至新的离心管内2000×g离心10min，去除死亡细胞、细胞碎片、凋亡小体等，上清过0.22um滤器获得间充质干细胞条件培养基；-80℃冷冻保存备用；使用前选用不同批次冻存条件培养基混合使用，以剔除个体差异。
所述的胰岛细胞低温保存液的使用方法，保存温度为0-4℃，浓度为猪胰岛细胞5000-10000IEQ/1-5mL保存液。
所述的胰岛细胞低温保存液的使用方法，保存时间为5天。所述的低温保存液针对猪胰岛细胞。
本发明的有益效果：(以下数据来源于大量试验结果，并具有统计学意义)：
在同等低温条件(4℃)下保存，本发明低温保存液的活性胰岛细胞可以保存5天，高于一般低温保存液只能保存3天的结果，满足了胰岛细胞的全球化运输的时间条件。
本发明的优化保存液减少了复苏后胰岛细胞团破碎现象，在保障胰岛细胞团正常体外功能的前提下，延长了细胞在低温条件下的保存时间，建立了稳定的猪胰岛低温保存体系。
本发明优势总结如下：
1、胰岛细胞团破碎减少，细胞团包膜完整，更适于后续实验；
2、细胞活率、回收率增加，凋亡率减少；
3、低温保存时间增加，满足短期长距离运输要求；
4、长时间保存复苏后细胞葡萄糖刺激应答正常。
附图说明
图1为：本发明低温保存液与普通的低温保存液保存猪胰岛细胞不同时间的形态比较；
图2为：本发明低温保存液与普通的低温保存液保存猪胰岛细胞不同时间的形态比较(放大40倍)；
图3为：本发明低温保存液与普通的低温保存液保存猪胰岛细胞不同时间活率比较；
图4为：本发明低温保存液与普通的低温保存液保存猪胰岛细胞不同时间回收率比较；
图5为：本发明低温保存液与普通的低温保存液保存猪胰岛细胞不同时间β细胞含量比较；
图6为：本发明低温保存液与普通的低温保存液保存猪胰岛细胞不同时间SI比较；
图7为：本发明添加与未添加1％DMSO低温保存猪胰岛细胞的回收率；
图8为：本发明添加与未添加1％DMSO低温保存猪胰岛细胞的活率；
图9为：本发明添加与未添加1％DMSO低温保存猪胰岛细胞的SI；
图10为：本发明添加不同浓度SD282低温保存猪胰岛细胞的活率；
图11为：本发明添加不同浓度SD282低温保存猪胰岛细胞的SI；
图12为：本发明添加不同浓度间充质干细胞条件培养基低温保存猪胰岛细胞的活率；
图13为：本发明添加不同浓度间充质干细胞条件培养基低温保存猪胰岛细胞的SI。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
材料与试剂：间充质干细胞条件培养基、人血白蛋白、β-氨基乙磺酸、二甲基亚砜、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、SD-282、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、猪血清(life公司)、DTZ、AnnexinV/PI试剂盒、NEWPORT GREEN、2.5mM低糖培养液、25mM高糖培养液、5mL冻存管(corning公司)、0.22μm滤器(Merck millipore)、10mL注射器(江苏正康医疗器械公司)、6孔培养皿(捷特公司)、流式管等。
上述试剂耗材无特殊说明，均购自sigma公司。
间充质干细胞条件培养基制备：
取P3-5代间充质干细胞置于37℃、体积分数为5％CO2培养箱中培养，加入含体积分数为10％猪血清的RPMI1640培养基，每3天换一次液；待细胞贴壁面积超过90％时，弃培基，PBS洗涤2次后加入不含血清的RPMI1640培养基继续培养48h；用移液器将培养皿内培基转移至50ml离心管内，300×g离心10min去除悬浮细胞；用移液器将上清转移至新的离心管内，2000×g离心10min去除死亡细胞、细胞碎片、凋亡小体等，上清过0.22um滤器获得间充质干细胞源条件培基；-80℃冷冻保存备用。使用前尽量选用不同批次冻存条件培基混合使用，以剔除个体差异。
基本培养基是在F10培养基中添加10％猪血清、5mM谷氨酰胺、5mM尼克酰胺、30mM甘露醇、1mM半胱氨酸、0.1mM维生素C。
实施例1、本发明低温保存液及保存方法试验
本发明针对已分离纯化的新生猪、青年猪胰岛细胞，低温保存液为在基本培养基中添加间充质干细胞条件培养基30％、人血白蛋白20％、β-氨基乙磺酸3mM、二甲基亚砜1％、4-羟乙基哌嗪乙磺酸5mM、SD-282 1uM、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)5mM、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐(Pefabloc)0.5mM，-20℃预冷冻存管后，以猪胰岛细胞5000-10000IEQ/1-5mL的保存浓度加入冻存管，置于4℃保存，于1天、3天、5天时复苏细胞计数并做相关检测。
实施例2
本发明针对已分离纯化的新生猪、青年猪胰岛细胞，低温保存液为在基本培养基中添加间充质干细胞条件培养基10％、人血白蛋白20％、β-氨基乙磺酸3mM、二甲基亚砜1％、4-羟乙基哌嗪乙磺酸5mM、SD-282 1uM、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)5mM、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐(Pefabloc)0.5mM，-20℃预冷冻存管后，以猪胰岛细胞5000-10000IEQ/1-5mL的保存浓度加入冻存管，置于4℃保存，于1天、3天、5天时复苏细胞计数并做相关检测。
实施例3
本发明针对已分离纯化的新生猪、青年猪胰岛细胞，低温保存液为在基本培养基中添加间充质干细胞条件培养基30％、人血白蛋白20％、β-氨基乙磺酸3mM、二甲基亚砜10％、4-羟乙基哌嗪乙磺酸5mM、SD-282 1uM、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)5mM、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐(Pefabloc)0.5mM，-20℃预冷冻存管后，以猪胰岛细胞5000-10000IEQ/1-5mL的保存浓度加入冻存管，置于4℃保存，于1天、3天、5天时复苏细胞计数并做相关检测。
实施例4
本发明针对已分离纯化的新生猪、青年猪胰岛细胞，低温保存液为在基本培养基中添加间充质干细胞条件培养基30％、人血白蛋白20％、β-氨基乙磺酸3mM、二甲基亚砜1％、4-羟乙基哌嗪乙磺酸5mM、SD-282 3uM、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)5mM、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐(Pefabloc)0.5mM，-20℃预冷冻存管后，以猪胰岛细胞5000-10000IEQ/1-5mL的保存浓度加入冻存管，置于4℃保存，于1天、3天、5天时复苏细胞计数并做相关检测。
实施例5、以实施例1制备的低温保存液进行如下实验检测和结果：
1、DTZ染色观察猪胰岛细胞的形态、数目及纯度
将10mg DTZ溶于10ml的二甲基亚砜(DMSO)中，用0.22μm的孔径滤膜过滤除菌后分装储存于-20℃冰箱内。常规染色时，每1mL胰岛细胞悬液与10μL的DTZ储存液混合，于37℃孵育10分钟后镜检，胰岛细胞被染成猩红色后观察细胞的形态。
胰岛纯度＝DTZ染色阳性的胰岛细胞团数/细胞团总数×100％
2、活率检测：取1500-2000IEQ胰岛细胞团胰酶消化为单个细胞，AnnexinV/PI试剂盒染色，染色后通过流式细胞仪对活细胞和死细胞计数。
3、β细胞活力检测：取1500-2000IEQ胰岛细胞胰酶消化为单个细胞，NEWPORTGREEN特异染β细胞，过流式细胞仪检测β细胞含量。
4、胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能
猪胰岛细胞分别培养至第6天及第10天时，分别提取6000IEQ的细胞悬液自然沉淀6分钟后吸出细胞，用含2.5mM低糖培养液洗涤两次并孵化细胞于37℃、5％CO2培养箱1小时，取出细胞悬液让其自然沉淀6分钟，每组胰岛细胞平均分成2份，每份再分成3个平行孔，分别加入2mL含2.5mM低糖培养液(Hyclone培养基)及2mL含25mM高糖培养液(Hyclone培养基)于6孔培养皿内，放入37℃、5％CO2培养箱内再培养2小时后，离心取上清液，通过化学发光法来检测胰岛素含量。计算葡萄糖刺激指数(SI)。SI>1.8代表胰岛细胞的功能良好。
葡萄糖刺激指数(Stimulation index，SI)＝25mM葡萄糖培养时的胰岛素释放量/2.5mM葡萄糖培养时的胰岛素释放量
结果：
本发明保存1天复苏后的活性胰岛细胞(实验组)存活率达到94.5±4.56％，比不加添加剂的低温保存液(即F10培养基中添加10％猪血清、5mM谷氨酰胺、5mM尼克酰胺、30mM甘露醇、1mM半胱氨酸、0.1mM维生素C,下同。)保存的胰岛细胞(对照组)(<2.9％)高；本发明保存3天复苏后的活性胰岛细胞存活率达到87.6±3.37％，比不加添加剂的低温保存液保存的胰岛细胞(<3％)高；本发明保存5天复苏后的活性胰岛细胞存活率达到88.9±5.14％，比不加添加剂的低温保存液保存的胰岛细胞(<6.8％)高(图3)；本发明保存1天复苏后胰岛细胞团中β细胞所占百分比61.3±6.3％，比不加添加剂的低温保存液(<5.1％)高；本发明保存3天复苏后胰岛细胞团中(实验组)β细胞所占百分比达到72.2±3.8％，与不加添加剂的低温保存液胰岛细胞(对照组)无显著性差异；本发明保存5天复苏后胰岛细胞团中β细胞所占百分比达到75.3±7.2％(图5)，与不加添加剂的低温保存液胰岛细胞无显著性差异；此外，低温保存5天后，使用本发明低温保存运输液的胰岛细胞葡萄糖刺激指数(实验组)(SI)为2.6(2.6±0.32)也远高于不加添加剂的低温保存液1.8(1.8±0.65)(对照组)(图6)。
且本发明保存1/3/5天复苏后的胰岛细胞团(试验组)颗粒直径大多大于100μm，细胞团包膜完整，破碎胰岛细胞团(直径<50μm)低于不加添加剂的低温保存液保存的胰岛细胞(对照组)。如图1，将细胞同时用吖啶橙(AO)和溴化乙锭(EB)染色，活细胞在荧光显微镜488nm激发光下呈绿色荧光，死细胞在546nm激发光下呈红色荧光，图片为胰岛细胞分别在本发明低温保存液和不加添加剂的低温保存液中保存1/3/5天，放大40×的图片，由图2中可以看出，本发明低温保存液细胞团(试验组)周边包膜完整，细胞团大小均匀，大部分直径在100-200nm，死细胞极少，叠加图片几乎看不到死细胞；不加添加剂的低温保存液(对照组)虽然活细胞团多，但细胞团大小分布不均，包膜不完整，细胞团边缘不平滑，易破碎成为单个细胞而死亡。
实施例6：申请人发现：添加1％的DMSO有利于提高胰岛细胞活率、回收率及功能。
以本发明实施例1为准，其他组分相同的情况下，进行是否添加1％DMSO的对比，低温保存5d后添加有DMSO的保存液在回收率(78.3％)、活率(88.9％)及体外功能(SI＝2.6)上均高于未添加组的52.5％、64.4％、SI＝1.83，结果见图7，图8，图9。
实施例7：SD282添加浓度筛选：
以本发明实施例1为准，其他组分相同的情况下，进行添加不同浓度SD282的对比试验，对比添加不同浓度SD282低温保存5天，结果显示添加浓度为1uM时，胰岛细胞活率较高(88.9％)，体外功能最好(SI＝2.93)，结果见图10，图11。
实施例8：间充质干细胞条件培基添加比例筛选：
以本发明实施例1为准，其他组分相同的情况下，进行添加不同比例间充质干细胞条件培养基的对比试验，对比添加比例间充质干细胞条件培养基的低温保存5天，结果显示添加浓度为30％时，胰岛细胞活率较高(88.9％)，体外功能最好(SI＝2.93)，结果见图12，图13。
Claims (10)
1.一种胰岛细胞低温保存液，其特征在于，是在基本培养基中添加：
间充质干细胞条件培养基10-40％；
人血白蛋白10-50％；
β-氨基乙磺酸1-10mM；
二甲基亚砜0.1-10％；
4-羟乙基哌嗪乙磺酸1-20mM；
SD-282 1nM-50uM；
6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸1-20mM；
4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐0.1-1.0mM。
2.根据权利要求1所述的胰岛细胞低温保存液，其特征在于，是在基本培养基中添加：
间充质干细胞条件培养基15-30％；
人血白蛋白20-40％；
β-氨基乙磺酸2-5mM；
二甲基亚砜1-5％；
4-羟乙基哌嗪乙磺酸5-10mM；
SD-282 100nM-10uM；
6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸5-10mM；
4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐0.5-1mM。
3.根据权利要求2所述的胰岛细胞低温保存液，其特征在于，是在基本培养基中添加：
间充质干细胞条件培养基30％；
人血白蛋白20％；
β-氨基乙磺酸3mM；
二甲基亚砜1％；
4-羟乙基哌嗪乙磺酸5mM；
SD-282 1uM；
6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸5mM；
4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐0.5mM。
4.根据权利要求1所述的胰岛细胞低温保存液，其特征在于，基本培养基包括：F10，EGM-2，或RPMI1640培养基。
5.根据权利要求4所述的胰岛细胞低温保存液，其特征在于，基本培养基中添加有：10-30％猪血清、1-20mM谷氨酰胺、1-15mM尼克酰胺、10-50mM甘露醇、0.5-5mM半胱氨酸、10-500μM维生素C。
6.根据权利要求1所述的胰岛细胞低温保存液，其特征在于，间充质干细胞正常培养至细胞融合90％时，通过饥饿或者缺氧处理48-72h后，收集细胞上清液，过滤去除死亡细胞、细胞碎片和凋亡小体，获得含有外泌体的间充质干细胞条件培养基。
7.根据权利要求6所述的胰岛细胞低温保存液，其特征在于，间充质干细胞条件培养基的制备过程如下：取P3-5代间充质干细胞置于37℃、体积分数为5％CO2培养箱中培养，加入含体积分数为10％猪血清的RPMI1640培养基，每3天换一次液；待细胞贴壁面积超过90％时，弃培养基，PBS洗涤2次后加入不含血清的RPMI1640培养基继续培养48h；用移液器将培养皿内培养基转移至50ml离心管内，300×g离心10min去除悬浮细胞；用移液器将上清转移至新的离心管内2000×g离心10min，去除死亡细胞、细胞碎片、凋亡小体等，上清过0.22um滤器获得间充质干细胞条件培养基；-80℃冷冻保存备用；使用前选用不同批次冻存条件培养基混合使用，以剔除个体差异。
8.权利要求1-7任一项所述的胰岛细胞低温保存液的使用方法，其特征在于，保存温度为0-4℃，胰岛细胞浓度为5000-10000IEQ/1-5mL保存液。
9.根据权利要求8所述的胰岛细胞低温保存液的使用方法，其特征在于，保存时间为5天。
10.根据权利要求8所述的胰岛细胞低温保存液的使用方法，其特征在于，所述的低温保存液针对猪胰岛细胞。
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|---|---|
| CN (1) | CN109619089B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110367242A (zh) * | 2019-08-02 | 2019-10-25 | 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 | 凋亡小体保存液及凋亡小体的保存方法 |
| CN112251397A (zh) * | 2020-10-30 | 2021-01-22 | 湖南赛诺生物科技股份有限公司 | 一种新生猪胰岛细胞培养方法 |
| CN112715533A (zh) * | 2021-02-26 | 2021-04-30 | 康妍葆(北京)干细胞科技有限公司 | 一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法 |
| CN114831107A (zh) * | 2022-04-11 | 2022-08-02 | 依科赛生物科技（太仓）有限公司 | 一种细胞和组织低温保存液及其配制方法、应用 |
| CN114868736A (zh) * | 2022-03-08 | 2022-08-09 | 四川中科奥格生物科技有限公司 | 一种胰岛细胞稳定液及其制备方法和用途 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102197802A (zh) * | 2011-03-25 | 2011-09-28 | 中国人民解放军南京军区福州总医院 | 一种胰岛冻存保护剂及其使用方法 |
| CN105850979A (zh) * | 2016-03-14 | 2016-08-17 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种骨髓间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法 |
| CN106982822A (zh) * | 2017-05-24 | 2017-07-28 | 湖南赛诺生物科技股份有限公司 | 一种猪胰岛细胞冻存液及冻存方法 |
-
2018
- 2018-12-27 CN CN201811610661.0A patent/CN109619089B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102197802A (zh) * | 2011-03-25 | 2011-09-28 | 中国人民解放军南京军区福州总医院 | 一种胰岛冻存保护剂及其使用方法 |
| CN105850979A (zh) * | 2016-03-14 | 2016-08-17 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种骨髓间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法 |
| CN106982822A (zh) * | 2017-05-24 | 2017-07-28 | 湖南赛诺生物科技股份有限公司 | 一种猪胰岛细胞冻存液及冻存方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HARDIKAR, AA等: ""Islet cryopreservation: Improved recovery following taurine pretreatment"", 《CELL TRANSPLANTATION》 * |
| K. OMORI等: ""Improvement of Human Islet Cryopreservation by a p38 MAPK Inhibito"", 《AMERICAN JOURNAL OF TRANSPLANTATION》 * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110367242A (zh) * | 2019-08-02 | 2019-10-25 | 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 | 凋亡小体保存液及凋亡小体的保存方法 |
| CN112251397A (zh) * | 2020-10-30 | 2021-01-22 | 湖南赛诺生物科技股份有限公司 | 一种新生猪胰岛细胞培养方法 |
| CN112251397B (zh) * | 2020-10-30 | 2022-02-15 | 湖南赛诺生物科技股份有限公司 | 一种新生猪胰岛细胞培养方法 |
| CN112715533A (zh) * | 2021-02-26 | 2021-04-30 | 康妍葆(北京)干细胞科技有限公司 | 一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法 |
| CN112715533B (zh) * | 2021-02-26 | 2022-04-29 | 康妍葆(北京)干细胞科技有限公司 | 一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法 |
| CN114868736A (zh) * | 2022-03-08 | 2022-08-09 | 四川中科奥格生物科技有限公司 | 一种胰岛细胞稳定液及其制备方法和用途 |
| CN114868736B (zh) * | 2022-03-08 | 2022-12-09 | 四川中科奥格生物科技有限公司 | 一种胰岛细胞稳定液及其制备方法和用途 |
| CN114831107A (zh) * | 2022-04-11 | 2022-08-02 | 依科赛生物科技（太仓）有限公司 | 一种细胞和组织低温保存液及其配制方法、应用 |
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Legal Events
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Denomination of invention: A cryopreservation solution for islet cells and its application method Effective date of registration: 20201229 Granted publication date: 20200421 Pledgee: Jinzhou Branch of Hunan Ningxiang Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: HUNAN XENO LIFE SCIENCE Co.,Ltd. Registration number: Y2020980010070 |
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Date of cancellation: 20230105 Granted publication date: 20200421 Pledgee: Jinzhou Branch of Hunan Ningxiang Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: HUNAN XENO LIFE SCIENCE Co.,Ltd. Registration number: Y2020980010070 |
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Denomination of invention: A cryopreservation solution for islet cells and its use method Effective date of registration: 20230112 Granted publication date: 20200421 Pledgee: Jinzhou Branch of Hunan Ningxiang Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: HUNAN XENO LIFE SCIENCE Co.,Ltd. Registration number: Y2023980031055 |
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Date of cancellation: 20231124 Granted publication date: 20200421 Pledgee: Jinzhou Branch of Hunan Ningxiang Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: HUNAN XENO LIFE SCIENCE Co.,Ltd. Registration number: Y2023980031055 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A low-temperature preservation solution for pancreatic islet cells and its usage method Effective date of registration: 20231129 Granted publication date: 20200421 Pledgee: Jinzhou Branch of Hunan Ningxiang Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: HUNAN XENO LIFE SCIENCE Co.,Ltd. Registration number: Y2023980068297 |