CN105535981A - 一种耐热保护剂、禽用耐热保护剂活疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种耐热保护剂、禽用耐热保护剂活疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。本发明的一种耐热保护剂，组分包括蔗糖10～15%、聚乙烯吡咯烷酮2～4%、芦布若尔1～5%、PEG8000？0.1～2%、聚赖氨酸1～4%、L-半胱氨酸1～4%、L-组氨酸1～2%、甘氨酸1～2%，余量为水；将半成品病毒液与耐热保护剂混合，冷冻干燥，制成禽用耐热保护剂活疫苗。本发明通过添加耐热保护剂，降低了病毒在冷冻和真空干燥过程中损伤，提高了产品在保存和使用中的稳定性；本发明方法制备的禽用耐热保护剂活疫苗，实现了储运过程中冷藏保存，保存期延长到2～8℃保存36个月。

Description

一种耐热保护剂、禽用耐热保护剂活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种耐热保护剂、禽用耐热保护剂活疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
冷冻干燥技术是生物学领域的一个重要储藏技术，广泛地应用于动物用生物制品的研发和生产中，以保持细菌、病毒和抗体等的生物活性，延长产品的有效期。冻干保护技术是动物用活疫苗生产中的关键技术，对于疫苗的保存、运输和使用具有很大的影响。
影响冻干保护剂保护性能的因素主要来自两方面：一是微生物因素，微生物的种类差异（如是否为有囊膜病毒）、培养方式以及疫苗的种类等；二是保护剂的配方，选用保护剂的原料性质、配比和疫苗冻干曲线等。病毒对热、酸敏感，在存放和运输过程中容易受到环境中温度和酸碱度的影响较大，因此需要选择一种合适的冻干保护剂，能够在不同保存条件下有效的避免病毒遭受破坏，保持病毒活性，以延长病毒的存放时间。
但是目前国内禽用活疫苗产品仍然以常规疫苗（冷冻保存）为主，禽用耐热保护剂活疫苗（冷藏保存）市场占有率远低于10%，而且现有耐热保护剂活疫苗还存在生产成本较高、保护性能不尽理想等问题。因此，研发一种适于大规模生产、保护功能强的禽用活疫苗耐热冻干保护技术显得尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服已有技术之缺陷，提供一种耐热保护剂、禽用耐热保护剂活疫苗及其制备方法，应用耐热保护剂的活疫苗具有耐热性能好、保护功能强的特点。
本发明所述技术问题是以下述技术方案实现的：
一种耐热保护剂，是由以质量体积百分含量计的下列组分制成：
蔗糖10～15%，聚乙烯吡咯烷酮2～4%，芦布若尔1～5%，PEG80000.1～2%，聚赖氨酸1～4%，L-半胱氨酸1～4%，L-组氨酸1～2%，甘氨酸1～2%，余量为水。
上述耐热保护剂，所述耐热保护剂包括保护剂A和保护剂B，所述保护剂A是将蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和芦布若尔溶解于水中，除菌后备用；所述保护剂B是将PEG8000、聚赖氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸和甘氨酸溶解于水中，除菌后备用。
一种禽用耐热保护剂活疫苗的制备方法，使用如上述耐热保护剂，并按以下步骤制备：
a.病毒储存液制备：将禽用活疫苗半成品病毒液与部分保护剂B按照体积比10：2～10：5充分混匀，制成病毒储存液，置-15℃以下保存；
b.疫苗制备：将病毒储存液室温放置，至完全融化，然后按半成品病毒液与耐热保护剂体积比1：1加入保护剂A和剩余的保护剂B，充分混匀后，定量分装，冷冻干燥，制成禽用耐热保护剂活疫苗。
一种禽用耐热保护剂活疫苗，它按照上述方法生产的禽用耐热保护剂活疫苗。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明在半成品病毒液储存时加入保护剂，有效延长半成品的保存期，保证半成品病毒在常温状态下生物活性的维持，实现了常温直接融化疫苗半成品，生产工序更简化，且降低了能耗。
在耐热保护剂中添加表面活性剂芦布若尔、氨基酸聚合物聚赖氨酸，并与PEG8000、聚乙烯吡咯烷酮等最适配比，降低了病毒在冷冻和真空干燥过程中的损伤，且提高了产品在保存和使用中的稳定性。
本发明方法制备的禽用耐热保护剂活疫苗可实现疫苗储运过程中的冷藏保存，延长了保存期，由原来-15℃以下保存24个月提高到2～8℃保存36个月，37℃保存期15天，在降低产品储运要求和成本的同时提高产品质量及应用的便捷性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式做进一步的说明。
实施例1耐热保护剂的制备
蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮（K30）和PEG8000等耐热保护剂组方原料均为常规试剂，市场上有售。
（1）配制耐热保护剂1
配制1000ml耐热保护剂：称取蔗糖100g、聚乙烯吡咯烷酮（K30）40g、芦布若尔10g、PEG800020g、聚赖氨酸40g、L-半胱氨酸10g、L-组氨酸20g和甘氨酸10g。配制时将蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮（K30）、芦布若尔加入去离子水中并定容到500ml，充分溶解，配成保护剂A，除菌后备用；将PEG8000、聚赖氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸、甘氨酸加入去离子水中并定容到500ml，充分溶解，配成保护剂B，除菌后备用。
（2）配制耐热保护剂2
配制1000ml耐热保护剂：称取蔗糖150g、聚乙烯吡咯烷酮（K30）20g、芦布若尔50g、PEG80001g、聚赖氨酸10g、L-半胱氨酸40g、L-组氨酸20g和甘氨酸20g。配制时将蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮（K30）、芦布若尔加入去离子水中并定容到500ml，充分溶解，配成保护剂A，除菌后备用；将PEG8000、聚赖氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸、甘氨酸加入去离子水中并定容到500ml，充分溶解，配成保护剂B，除菌后备用。
实施例2鸡传染性支气管炎耐热保护剂活疫苗的制备
由瑞普（保定）生物药业有限公司提供鸡传染性支气管炎（H120株）半成品病毒液（按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》（2000版）（以下简称“规程”）制备而成，毒种购自中国兽医药品监察所）。
（1）鸡传染性支气管炎病毒储存液的制备
将两份相同的鸡传染性支气管炎半成品病毒液(每份1000ml）分别与耐热保护剂1中的保护剂B和耐热保护剂2中的保护剂B按照体积比10：4（V：V）充分混匀（分别加入保护剂B400ml），制成病毒储存液1和病毒储存液2，置于-15℃保存，设立不添加保护剂的半成品病毒液作为空白对照，并于保存0、2、4和12个月时分别测定病毒含量。测定结果如表1所示
表1不同保存期病毒储存液病毒含量检测结果
单位：lg(EID50/0.1ml)
添加耐热保护剂1和耐热保护剂2的两组鸡传染性支气管炎病毒储存液在-15℃的条件下保存12个月时病毒含量只下降了0.4lg(EID50/0.1ml)；而对照组病毒含量下降迅速，其在保存4个月时病毒含量已低于“规程”要求（制苗用的半成品病毒液病毒含量应≥6.1lg(EID50/0.1ml)），为不合格产品。因此，添加保护剂B能够有效延长半成品病毒液的保存期（至12个月），为生产高效价的鸡传染性支气管炎活疫苗提供保障。
（2）疫苗制备
将两种病毒储存液室温放置，至完全融化，然后按半成品病毒液与耐热保护剂1：1的体积比（V：V），在病毒储存液1中加入耐热保护剂1的保护剂A（500ml）和保护剂B（100ml），在病毒储存液2中加入耐热保护剂2的保护剂A（500ml）和B（100ml），充分混匀后，进行定量分装，冷冻干燥，制成耐热保护剂疫苗1和耐热保护剂疫苗2。按照农业部1049号公告（鸡传染性支气管炎耐热保护剂活疫苗制造及检验试行规程、同类耐热苗行业标准）方法制备同类耐热苗作为对照1；按“规程”方法制备的常规苗作为对照2。
（3）疫苗稳定性测定
检测冷藏保存的稳定性：于冻干前、冻干后2～8℃放置0、6、12、24和36个月时随机取样测定病毒含量，3瓶/次。测定结果见表2
检测37℃保存的稳定性：每批取20瓶，于37℃放置0、5、10和15天时随机取样测定病毒含量，3瓶/次。测定结果见表3
表2不同保存期鸡传染性支气管炎活疫苗病毒含量检测结果（2～8℃）
单位：lg(EID50/羽)
表3不同保存期鸡传染性支气管炎活疫苗病毒含量检测结果（37℃）
单位：lg(EID50/羽)
由以上结果可以看出：采用本发明方法制备的两组鸡传染性支气管炎活疫苗，2～8℃条件下保存36个月其病毒含量只下降0.6lg(EID50/羽)，病毒含量远高于“规程”要求（鸡传染性支气管炎活疫苗病毒含量应≥3.5lg(EID50/羽)），因此在冷藏条件下保存期可长达36个月；对照1（同类耐热苗）、对照2（常规苗）在2～8℃条件下保存，病毒含量下降较快，对照1保存期为24个月、对照2保存期仅为6个月。本发明制备的疫苗在37℃条件下保存15天其病毒含量下降0.6lg(EID50/羽)，病毒含量远高于“规程”规定，保存期可达15天；对照1（同类耐热苗）、对照2（常规苗）37℃条件下保存，病毒含量迅速下降，对照1保存期为10天、对照2保存期不足5天。
实施例3按照实施例2方法制备鸡新城疫耐热保护剂活疫苗（LaSota株）。
实施例4按照实施例2方法制备鸡传染性喉气管炎耐热保护剂活疫苗。
实施例5按照实施例2方法制备鸡传染性法氏囊病耐热保护剂活疫苗（B87株）。
实施例6按照实施例2方法制备鸡痘耐热保护剂活疫苗。

Claims (4)

1.一种耐热保护剂，其特征在于，是由以质量体积百分含量计的下列组分制成：蔗糖10～15%，聚乙烯吡咯烷酮2～4%，芦布若尔1～5%，PEG80000.1～2%，聚赖氨酸1～4%，L-半胱氨酸1～4%，L-组氨酸1～2%，甘氨酸1～2%，余量为水。
2.根据权利要求1所述的耐热保护剂，其特征在于，所述耐热保护剂包括保护剂A和保护剂B，所述保护剂A是将蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和芦布若尔溶解于水中，除菌后备用；所述保护剂B是将PEG8000、聚赖氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸和甘氨酸溶解于水中，除菌后备用。
3.一种禽用耐热保护剂活疫苗的制备方法，其特征在于，使用如权利要求2所述的耐热保护剂，并按以下步骤制备：
a.病毒储存液制备：将禽用活疫苗半成品病毒液与部分保护剂B按照体积比10：2～10：5充分混匀，制成病毒储存液，置-15℃以下保存；
b.疫苗制备：将病毒储存液室温放置，至完全融化，然后按半成品病毒液与耐热保护剂体积比1：1加入保护剂A和剩余的保护剂B，充分混匀后，定量分装，冷冻干燥，制成禽用耐热保护剂活疫苗。
4.一种禽用耐热保护剂活疫苗，其特征在于，它按照权利要求3所述的方法生产的禽用耐热保护剂活疫苗。
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