CN104306963B

CN104306963B - 一种猪丹毒活疫苗的生产方法

Info

Publication number: CN104306963B
Application number: CN201410602361.3A
Authority: CN
Inventors: 朱良全; 李聪研; 丁家波; 孙晔; 沈青春
Original assignee: Beijing Zhonghai Biotech Co Ltd
Current assignee: Beijing Zhonghai Biotech Co Ltd
Priority date: 2014-10-31
Filing date: 2014-10-31
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2034-10-31
Also published as: CN104306963A

Abstract

本发明涉及合成培养基及冻干保护剂在猪丹毒活疫苗生产中的应用。本发明所提供的合成培养基根据猪丹毒杆菌的生长特点和生长需求设计而成，配方原材料来源可控，不受牛肉、牛肝和猪胃等材料的影响，批次稳定、制作简单、使用方便，适合进行细菌高细胞密度培养，培养菌数高；冻干过程采用针对猪丹毒杆菌特性研制的冻干保护剂及配套冻干曲线，在冻干过程中有效保护细菌的活性，提高冻干菌存率，实现疫苗2～8℃长期保存，保存期可达24个月。

Description

一种猪丹毒活疫苗的生产方法

技术领域本发明涉及一种猪丹毒活疫苗的生产方法，属于生物学领域，特别是兽用生物制品领域。

背景技术

猪丹毒是猪的三大传染病之一，呈世界性分布，也是一种人畜共患病，其病原是猪丹毒杆菌。目前我国现有的猪丹毒活疫苗，有单苗、二联苗和三联苗，他们对预防猪丹毒病起到了重要的作用。但目前在菌液培养及冻干工艺上存在以下突出问题，与发达国家差距大。(1)培养稳定性差。60～70年代，生产疫苗采用含2％～4％裂解全血的肉肝胃(膜)消化汤作为培养基，至80年代后至今，国内兽用生物制品企业开始采用吐温-80替代裂解血球全血生产猪丹毒活疫苗，使培养活菌数平均提高40％，虽然在培养工艺上摆脱了对动物血的依赖。但肉肝胃(膜)消化汤主要成分肉、肝、胃浸液的质量受动物的种类、年龄、新鲜及消化程度影响大，培养菌数低，批次间不稳定。(2)疫苗冻干一直采用1.5％明胶5％蔗糖为保护剂，该保护剂为细菌类活疫苗通用保护剂，组方简单，冻干存活率低，保护功能较差(尤其在较高温度下)。一般需要-15℃以下保存，低温保存给边远地区储运和使用带来困难。

合成培养基按照细菌营养代谢特点设计，添加促进菌体增殖、提高保护性抗原表达的生长因子，具有培养菌数高、批次间质量稳定、操作简便等优点；耐热保护剂根据细菌细胞膜与保护剂相容性特点设计，具有冻干存活率高，耐老化性能好特点，使疫苗在2～8℃长期保存，更易于长途运输。有鉴于此，本发明目的在于研制一种适合猪丹毒杆菌生长、成分相对确定、易于在线检测、监控和及时调整的合成培养基和一套适合猪丹毒杆菌冻干的保护剂及其配套冻干工艺制备猪丹毒活疫苗。

发明内容

合成培养基按照细菌营养代谢特点设计，添加促进菌体增殖、提高保护性抗原表达的生长因子，具有培养菌数高、批次间质量稳定、操作简便等优点；耐热保护剂根据细菌细胞膜与保护剂相容性特点设计，具有冻干存活率高，耐老化性能好特点，使疫苗在2～8℃长期保存，更易于长途运输。，本发明目的在于研制一种适合猪丹毒杆菌生长、成分相对确定、易于在线检测、监控和及时调整的合成培养基和一套适合猪丹毒杆菌冻干的耐热保护剂及其配套冻干工艺制备猪丹毒耐热保护剂活疫苗。

实现本发明的技术方案为：

1.一种猪丹毒活疫苗的生产方法，其特征是：

(1)生产菌种为猪丹毒杆菌CVCC1318株；

(2)所使用合成培养基的配方(W/V)是：大豆胨10g、蛋白胨20g、酵母粉20g、磷酸氢二钾0.675g、磷酸二氢钾0.1632g、硫酸镁0.2g、葡萄糖5g、L-Arg-HCl5g、色氨酸1g、吐温-800.5ml、注射用水加至1000ml；

(3)所使用耐热保护剂的最佳配方(W/V)是：右旋糖苷10g，BSA1g，甘露醇50g，海藻糖50g，水解乳蛋白5g，L-谷氨酸钠5g，磷酸氢二钾1.25g，磷酸二氢钾0.52g，注射用水加至1000ml；

(4)该方法所生产的猪丹毒活疫苗的保藏条件为2～8℃，有效期达24个月。

2.本发明所述一种猪丹毒活疫苗的生产方法，其中猪丹毒活疫苗生产菌种也可以为猪丹毒杆菌CVCC1319株。

本发明的详细描述

一、疫苗生产用菌种

1.猪丹毒杆菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)CVCC1318株菌种即GC42株，由哈尔滨兽医研究所鉴定、保管和供应。弱毒株，由强毒G370株致弱而成，该菌种皮下注射500×10⁸CFU活菌不致死猪，1×10⁷CFU活菌免疫小鼠可产生80％保护。血清型为1a型。

2.猪丹毒杆菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)CVCC1319株菌种即G4T10株，江苏农科院分离，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。弱毒株，皮下注射50×10⁸～500×10⁸CFU活菌猪100％健活，1×10⁷CFU活菌免疫小鼠可产生81.8％保护。血清型为1a型。

二、合成培养基的制备

1.本发明设计的合成培养基配方(W/V)如下：

大豆胨10g、蛋白胨20g、酵母粉20g、磷酸氢二钾0.675g、磷酸二氢钾0.1632g、硫酸镁0.2g、葡萄糖5g、L-Arg-HCl5g、色氨酸1g、吐温-800.5ml、注射用水加至1000ml。

2.合成培养基配制方法

按上述配方依次称取培养基成分加入到注射用水中，充分溶解后用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为7.8～8.2，116℃灭菌30分钟。临用时，无菌操作加入终浓度0.5％的50％葡萄糖溶液，混匀。

50％葡萄糖溶液(W/V)称取50g葡萄糖，加注射用水溶解，定容至100ml，116℃灭菌30分钟，2～8℃保存。

2mol/L的氢氧化钠溶液称取8g氢氧化钠，加注射用水溶解，定容至100ml，116℃灭菌30分钟，2～8℃保存。

3.合成培养基检验

(1)性状溶液澄清透明、呈棕色。

(2)无菌检验按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇〇五版三部.中国农业出版社，2006,以下称《中国兽药典》)规定的方法进行，应无菌生长。

(3)pH值应为8.0±0.2。

(4)生长试验

1)生长试验中使用：猪丹毒杆菌CVCC1318株菌种即GC42株，由哈尔滨兽医研究所鉴定、保管和供应。弱毒株，由强毒G370株致弱而成，该菌种皮下注射500×10⁸CFU活菌不致死猪，1x10⁷CFU活菌免疫小鼠可产生80％保护。血清型为1a型；猪丹毒杆菌CVCC1319株菌种即G4T10株，江苏农科院分离，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。弱毒株，皮下注射50×10⁸～500×10⁸CFU活菌猪100％健活，1×10⁷CFU活菌免疫小鼠可产生81.8％保护。血清型为1a型。

2)种子液制备

开启冻干的猪丹毒杆菌CVCC1318株和CVCC1319株各1支，分别用1.0ml的马丁肉汤稀释，接种明胶平板，置15～18℃培养3～5日，各选取合格的菌落5～10个，混合于少量肉肝胃膜消化汤中，再划线接种于马丁琼脂平板上，置36～37℃培养24～36小时，分别选取中等大小光滑型菌落5～10个，混合于少量肉肝胃膜消化汤中，再接种含5％绵羊脱纤血的马丁琼脂斜面5～10支，置36～37℃培养24小时，纯粹检验合格后作为一级种子，在2～8℃保存，应不超过1个月。取一级种子接种肉肝胃膜消化汤，36～37℃培养20～22h，纯粹检查合格后，作为种子液(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二〇〇〇年版.化学工业出版社，2001，以下称《规程》)。

3)菌液培养及判定下列方法任选其一种：

①将种子液按2％接种装有10ml液体培养基1管，37℃、150r/min振荡培养13～15小时，同时各设1管不接种阴性对照。分别取样按现行《中国兽药典》规定的方法进行活菌计数。菌数应不低于100×10⁸CFU/ml，且阴性对照应无菌生长。

②将种子液按2％接种装有200ml液体培养基的500ml三角瓶1个，37℃、150r/min振荡培养13～15小时，同时设1个不接种阴性对照。分别取样按现行《中国兽药典》附录进行活菌计数。菌数应不低于140×10⁸CFU/ml，且阴性对照应无菌生长。

4)贮藏与有效期配制后的液体合成培养基置于室温避光保存，有效期为21日。

三、、冻干保护剂

1.保护剂的配方

右旋糖苷10g，BSA1g，山梨醇50g，蔗糖50g，水解乳蛋白5g，L-谷氨酸钠5g，磷酸氢二钾1.25g，磷酸二氢钾0.52g，注射用水1000ml。

2.配制方法

溶液1:在洁净烧杯中，加入注射用水(100℃)适量，按配方依次称取右旋糖苷、BSA、山梨醇，加入烧杯中，边加入边用玻璃棒搅拌，使其完全溶解，再用注射用水定容至500ml，经116℃灭菌30分钟。

溶液2：按配方依次称取蔗糖、水解乳蛋白、L-谷氨酸钠、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾于烧杯中，加入注射用水使其充分溶解后，定容至500ml，0.22μm滤膜的除菌滤器过滤除菌。

配苗前，在无菌条件下，将溶液1和溶液2等体积混匀，即成。

四、疫苗制备

将猪丹毒杆菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)CVCC1318株(或CVCC1319株)菌种种子液按培养基总量的1％～2％接种于以胰酪蛋白胨、大豆胨和酵母浸出粉为主要原材料的液体合成培养基中，37℃发酵或通气培养8～10小时，培养过程中根据需要加入适量消泡剂，并根据pH下降情况加入适量2mol/L氢氧化钠溶液以控制pH值在7.0以上。培养结束后菌液经3500r/min离心20min，沉淀加入经过灭菌处理并预热至37℃的冻干保护剂，充分混匀分装后，真空冷冻干燥而成。CVCC1318株活疫苗每头份活菌数不少于7×10⁸CFU，CVCC1319株活疫苗每头份活菌数不少于5×10⁸CFU。

半成品检验

纯粹检验取菌液用马丁琼脂平板，按《中国兽药典》(中国兽药典委员会)规定的方法进行，应纯粹。

活菌计数取样用含10％牛血清的马丁琼脂平板培养计活菌数，按《中国兽药典》规定的方法进行，作为计算冻干活菌率的基数及配苗时参考。

配苗、分装、冻干将悬浮菌液充分混匀后，按规定头份定量分装，CVCC1318株活疫苗每头份活菌数不少于10×10⁸CFU，CVCC1319株活疫苗每头份活菌数不少于7×10⁸CFU(按冻干菌存率不低于70％计算)。

五、成品检验

性状灰白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

纯粹检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验，应纯粹。

活菌计数按瓶签注明头份，用含10％牛血清的马丁琼脂平板做活菌计数(按《中国兽药典》规定的方法进行)。CVCC1318株活疫苗每头份活菌数不少于7×10⁸CFU，CVCC1319株活疫苗每头份活菌数不少于5×10⁸CFU。

耐老化检验取疫苗5瓶，置37℃保存7日，任选3瓶分别进行活菌计数，放置后核定的每头份活菌数与“活菌计数”项测定的结果相比，其活菌存活率应不低于70％。

安全检验按瓶签注明头份，将疫苗用20％氢氧化铝胶生理盐水稀释，皮下注射体重20～22g小白鼠10只，每只2头份，观察14日，注射CVCC1318株活疫苗应全部健活，注射CVCC1319株活疫苗应至少8只健活。

效力检验按瓶签注明头份用20％氢氧化铝胶生理盐水稀释成1ml含1/10使用剂量，皮下注射体重16～18g小白鼠10只，每只0.2ml(含1/50使用剂量)。14日后连同条件相同的对照小白鼠6只，其中3只对照小白鼠和免疫小白鼠各皮下注射1000MLD的猪丹毒杆菌1型和2型(各1株)强毒菌的混合菌液，另3只对照小白鼠各皮下注射1MLD的猪丹毒杆菌强毒的混合菌液。观察10日，注射1000MLD的对照小白鼠全部死亡，注射1MLD的对照小鼠至少死亡2只，免疫小白鼠至少保护8只。

剩余水分测定按《中国兽药典》规定的方法进行测定，应不超过4.0％。

真空度测定按《中国兽药典》规定的方法进行测定。

本发明涉及的微生物资源信息

猪丹毒丝菌或称猪丹毒丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)，通称猪丹毒杆菌，CVCC1318株即GC42株，由哈尔滨兽医研究所鉴定、保管和供应。弱毒株，由强毒G370株致弱而成，血清型为1a型(中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录(第2版)中国农业科学技术出版社，2002，p64)；猪丹毒杆菌CVCC1319株菌种即G4T10株，江苏农科院分离，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应，弱毒株，血清型为1a型(中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录(第2版)中国农业科学技术出版社，2002，p65)。以上两株菌均为我国猪丹毒活疫苗商品疫苗生产菌株。

附图说明

图1：冻干曲线1示意图图中显示：-35℃进箱；-40℃维持约4小时；产品由-40℃升至-10℃，维持10小时；板层温度提高到28℃，维持8小时。全程约28小时。

图2：冻干曲线2示意图图中显示：0～5℃进箱；以每分钟1℃降至-40℃或以下，维持约4小时；板层控制-10℃，维持14～16小时；每间隔2小时升温10℃，在28℃维持6小时出箱。全程约28小时。

本发明的积极效果

本发明所提供的合成培养基根据猪丹毒杆菌的生长特点和生长需求设计而成，配方原材料来源可控，不受牛肉、牛肝和猪胃等材料的影响，批次稳定、制作简单、使用方便，适合进行细菌高细胞密度培养，培养菌数高；冻干过程采用针对猪丹毒杆菌特性研制的耐热冻干保护剂及配套冻干曲线，在冻干过程中有效保护细菌的活性，提高冻干菌存率，实现疫苗2～8℃长期保存，保存期可达24个月。

实施例

本实施例是对本发明的进一步的说明，不构成对本发明的限制。

实施例1

——合成培养基的制备

1.合成培养基的制备

合成培养基配方(W/V)如下：

大豆胨10g、蛋白胨20g、酵母粉20g、磷酸氢二钾0.675g、磷酸二氢钾0.1632g、硫酸镁0.2g、葡萄糖5g、L-Arg-HCl5g、色氨酸1g、吐温-800.5ml、注射用水加至1000ml；

2.合成培养基配制方法

按上述配方依次称取培养基成分(除葡萄糖外)加入到注射用水中，充分溶解后用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为7.8～8.2，116℃灭菌30分钟。临用时，无菌操作加入终浓度0.5％的50％葡萄糖溶液，混匀。

实施例2

——冻干保护剂的制备

保护剂的配方

2.配制方法

实施例3

——猪丹毒活疫苗(CVCC1318)

1制苗用菌液制备

将猪丹毒杆菌CVCC1318株种子液按培养基总量的1％～2％接种于液体培养基中，37℃发酵或通气培养8～10小时，培养过程中根据需要加入适量消泡剂，并根据pH升高情况加入适量灭菌2mol/L的氢氧化钠溶液以控制pH值。培养结束后菌液用3500r/min离心20min，收获菌体沉淀，沉淀加入适量经过灭菌处理并预热至37℃的耐热冻干保护剂悬浮，充分混匀后按规定头份分装。分装过程中应注意保温振摇均匀，分装后迅速进行冷冻真空干燥，按《中国兽药典》规定的方法进行。CVCC1318株活疫苗每头份活菌数不少于7×10⁸CFU。

2半成品检验

纯粹检验取菌液用马丁琼脂平板，按《中国兽药典》规定的方法进行，结果纯粹。

配苗、分装、冻干将悬浮菌液充分混匀后，按规定头份定量分装，CVCC1318株活疫苗每头份活菌数不少于10×10⁸CFU(按冻干菌存率不低于70％计算)。

3.成品检验

(1)性状3批疫苗制品均为灰白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

(2)纯粹检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验，3批疫苗制品均为纯粹。

(3)活菌计数按瓶签注明头份，用含10％牛血清的马丁琼脂平板做活菌计数(按《中国兽药典》规定的方法进行)。结果为01批为13×10⁸CFU/头份。

(4)安全检验按瓶签注明头份，将疫苗用20％铝胶生理盐水稀释，皮下注射体重20～22g小白鼠10只，每只2头份，观察14天,3批疫苗检验结果小鼠10/10健活。

(5)效力检验按瓶签注明头份用20％铝胶生理盐水稀释成1ml含1/10使用剂量，皮下注射体重16～18g小白鼠10只，每只0.2ml(含1/50使用剂量)。14日后连同条件相同的对照小白鼠6只，其中3只对照小白鼠和免疫小白鼠各皮下注射1000MLD的猪丹毒杆菌1型和2型(各1株)强毒菌的混合菌液，另3只对照小白鼠各皮下注射1MLD的猪丹毒杆菌强毒的混合菌液。观察10日，注射1000MLD的对照小白鼠全部死亡，注射1MLD的对照小鼠至少死亡2只，免疫小白鼠至少保护8只结果见表1。

(6)剩余水分测定按《中国兽药典》规定的方法进行测定，为1.25％、2.26％、2.35％、1.47％。

(7)真空度测定按《中国兽药典》规定的方法进行测定结果均为白色或紫色辉光。

(8)耐老化检验取猪丹毒活疫苗(GC42株)5瓶，置37℃保存7日，任选3瓶分别进行活菌计数，放置后核定的每头份活菌数与“活菌计数”项测定的结果相比，结果为86.7％，国内同类制品(GC42株)37℃保存7日，活菌存活率仅达55％。

实施例4

——猪丹毒活疫苗(CVCC1319株)

1制苗用菌液制备

将猪丹毒杆菌CVCC1319株种子液按培养基总量的1％～2％接种于液体培养基中，37℃发酵或通气培养8～10小时，培养过程中根据需要加入适量消泡剂，并根据pH升高情况加入适量灭菌2mol/L的氢氧化钠溶液以控制pH值。培养结束后菌液用3500r/min离心20min，收获菌体沉淀，沉淀加入适量经过灭菌处理并预热至37℃的耐热冻干保护剂悬浮，充分混匀后按规定头份分装。分装过程中应注意保温振摇均匀，分装后迅速进行冷冻真空干燥，按《中国兽药典》规定的方法进行。CVCC1319株活疫苗每头份活菌数不少于5×10⁸CFU。

2半成品检验

配苗、分装、冻干将悬浮菌液充分混匀后，按规定头份定量分装，CVCC1319株活疫苗每头份活菌数不少于7×10⁸CFU(按冻干菌存率不低于70％计算)。

3成品检验

性状3批疫苗制品均为灰白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

纯粹检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验，3批疫苗制品均纯粹。

活菌计数按瓶签注明头份，用含10％牛血清的马丁琼脂平板做活菌计数(按《中国兽药典》规定的方法进行)，结果为03批为9.1×10⁸CFU/头份。

安全检验按瓶签注明头份，将疫苗用20％铝胶生理盐水稀释，皮下注射体重20～22g小白鼠10只，每只2头份，观察14日，检验小鼠均全部健活。

效力检验按瓶签注明头份用20％铝胶生理盐水稀释成1ml含1/10使用剂量，皮下注射体重16～18g小白鼠10只，每只0.2ml(含1/50使用剂量)。14日后连同条件相同的对照小白鼠6只，其中3只对照小白鼠和免疫小白鼠各皮下注射1000MLD的猪丹毒杆菌1型和2型(各1株)强毒菌的混合菌液，另3只对照小白鼠各皮下注射1MLD的猪丹毒杆菌强毒的混合菌液。观察10日，注射1000MLD的对照小白鼠全部死亡，注射1MLD的对照小鼠至少死亡2只，免疫小白鼠至少保护8只(结果见表1)。

表1猪丹毒活疫苗免疫小鼠的免疫原性检验结果

剩余水分测定按《中国兽药典》规定的方法进行测定，结果为为1.25、2.26、1.55、1.47。

真空度测定按《中国兽药典》规定的方法进行测定结果3批制品均为白色或紫色辉光。

耐老化检验取猪丹毒活疫苗(G4T10株)5瓶，置37℃保存7日，任选3瓶分别进行活菌计数，放置后核定的每头份活菌数与“活菌计数”项测定的结果相比，结果为89.9％。

实施例5

——猪丹毒耐活疫苗的保存期试验

将试验室试制的3批猪丹毒耐热保护剂活疫苗(CVCC1318株)(批号为01、02和03批)和3批猪丹毒耐热保护剂活疫苗(CVCC1319株)(批号为01、02和03批)分别置2～8℃保存3、6、12、18、24个月，分别取样进行性状、纯粹检验、活菌计数、安全检验、剩余水分、真空度测定，结果6批制品在2～8℃保存24个月，性状仍为白色疏松团块，加入稀释液后迅速溶解，均纯粹；CVCC1318株活菌计数11.9×10⁸CFU/头份、12.5×10⁸CFU/头份和12.8×10⁸CFU/头份，菌存率分别为91.5％、92.6％和92.8％；CVCC1319株活菌数分别为7.9×10⁸CFU/头份、7.2×10⁸CFU/头份和8.8×10⁸CFU/头份，菌存率分别为92.9％、80.9％和96.7％，均达到《规程》中CVCC1318株活疫苗每头份活菌数不少于7×10⁸CFU，CVCC1319株活疫苗每头份活菌数不少于5×10⁸CFU。2头份皮下接种小鼠均安全；1/10使用剂量皮下注射小鼠保护力达到规程标准；剩余水分不超过4.0％；真空度检测均为白色或紫色辉光；37℃保存7日耐老化后活菌存活率均大于70％。确定该疫苗在2～8℃条件下其保存期为24个月。

1材料

1.1疫苗

猪丹毒耐热保护剂活疫苗(CVCC1318株)，批号分别为201001、201002和201003，规格30头份/瓶；猪丹毒耐热保护剂活疫苗(CVCC1319株)，批号分别为201101、201102和201103，均为40头份/瓶，由北京中海生物科技公司实验室制备。

1.2检验用丹毒杆菌(CVCC43006株)和猪丹毒杆菌(CVCC43008株)，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和提供。

1.3小鼠：体重16～22g，SPF级，由中国兽医药品监察所实验动物组采购和提供。

2方法

各取3批实验室制品，每批40瓶置2～8℃保存，于冻干后第1日及保存后3、6、12、18和24个月，分别取样进行如下检测。

2.1性状按现行《中国兽药典》附录进行。

2.2纯粹检验按现行《中国兽药典》附录进行。

2.3活菌计数各取2～8℃保存3、6、12、18和24个月的3批样品，取样按现行《中国兽药典》附录进行。

2.4安全检验将3批疫苗各抽取3瓶，用20％铝胶生理盐水稀释，皮下注射体重20～22g小白鼠10只，每只2头份，观察14日。

2.5效力检验将3批疫苗各抽取3瓶，用20％铝胶生理盐水稀释成1ml含1/10使用剂量，皮下注射体重16～18g小白鼠10只，每只0.2ml(含1/50使用剂量)。14日后连同条件相同的对照小白鼠6只，其中3只对照小白鼠和免疫小白鼠各皮下注射1000MLD的猪丹毒杆菌1型和2型(各1株)强毒菌的混合菌液，另3只对照小白鼠各皮下注射1MLD的猪丹毒杆菌强毒的混合菌液。观察10日。

2.6剩余水分按现行《中国兽药典》附录进行。

2.7真空度测定按现行《中国兽药典》附录进行。

3结果

3.1性状两个菌株6批疫苗经3、6、12、18和24个月的保存后，其疫苗的性状检测结果均为白色疏松团块，经生理盐水复溶后，其溶解性、复水性良好。

3.2纯粹检验两个菌株6批疫苗经3、6、12、18和24个月的保存后，其疫苗的纯粹检验结果均为纯粹。

3.3活菌计数结果见表2和表3。

表2猪丹毒活疫苗不同保存时间的活菌计数结果(10⁸CFU/头份)

表3猪丹毒活疫苗不同保存时间的活菌存活率(％)

注：表2及表3中2～8℃保存不同时间活菌数高于冻干后制品或菌存率高于100％，主要是由于分装量、稀释液及计数人员操作误差引起。

从上表2和3可看出，6批疫苗2～8℃保存至24个月，猪丹毒杆菌耐热保护剂活疫苗(CVCC1318株)菌存率达91.5％～92.8％，猪丹毒杆菌耐热保护剂活疫苗(CVCC1319株)菌存率达80.9％～96.7％。国内同类制品仅能在2～8℃保存至12个月，保存12个月活菌存活率为80.5％，保存18个月活菌存活率下降至56％。

3.4安全检验CVCC1318株3批疫苗2～8℃保存3、6、12、18和24个月的小鼠安全检验结果小鼠全部健活。CVCC1319株3批疫苗2～8℃保存3、6、12、18和24个月的小鼠安全检验结果小鼠全部健活。由以上结果可见两个品种的6批疫苗2～8℃保存至24个月安全性良好。

3.5效力检验结果见表4。

表4猪丹毒活疫苗不同保存时间的效力检验结果

从表4看出，4批疫苗2～8℃保存至24个月效力检验均能达到《规程》标准。

3.6剩余水分见表5。

表5猪丹毒活疫苗不同保存时间的剩余水分结果(％)

从上表5看出，两个菌株的6批疫苗在2～8℃保存至24个月剩余水分合格，均未超过4.0％。

3.7真空度测定检验结果为经2～8℃保存3、6、12、18和24个月，两个菌株的6批疫苗的真空度没有改变，仍呈现白色或紫色辉光。

实施例6

——两种培养基培养菌体的安全及效力试验

将合成培养基与肉肝胃膜消化汤分别培养的各批次CVCC1318株和CVCC1319株菌液，经3500r/min离心20分钟，弃上清，菌体沉淀用适量20％铝胶生理盐水悬浮后，进行活菌计数。

1.安全试验分别皮下注射体重20～22g的小鼠10只，0.2ml/只(含10×10⁸CFU活菌)，观察14日，记录存活情况；结果见表6

2.效力试验皮下注射体重16～18g的小鼠10只，0.2ml/只(含1×10⁷CFU活菌)，14日后，连同条件相同的不免疫对照小鼠6只，其中3只对照小鼠和免疫组小鼠各皮下注射1000MLD的猪丹毒杆菌1型和2型(各1株)强毒菌的混合菌液，另3只对照小鼠注射1MLD的强毒混合菌液，观察14日，记录存活情况。结果见表6。

表6两种培养基培养菌体安全及免疫原性试验结果

从表6结果看出，合成培养基培养的菌体对小鼠安全，均10/10健活；免疫效果与肉肝胃膜消化汤结果基本一致，CVCC1318株和CVCC1319株免疫小鼠均可达8/10～10/10保护，1MLD组对照2/3死亡，1000MLD组对照3/3死亡。

结果可见合成培养基，培养菌数均高于肉肝胃膜消化汤，其安全性及免疫原性良好。

实施例7

——冻干保护剂配方及冻干曲线的筛选

通过10种保护剂基质的“冻融”试验和“冻干”试验，初步明确了各种保护剂基质的适用浓度，谷氨酸钠(0.5％、2％)、蔗糖(5％、7.5％)冻融试验菌存率最高；1.5％右旋糖苷5％蔗糖保护剂中加入0.5％水解乳蛋白或0.5％谷氨酸钠可明显提高冻干菌存率(均达71％)；1.5％右旋糖苷+5％蔗糖+5％山梨醇可使冻干菌存率达75％。1.5％明胶、5％蔗糖中添加0.5％～2％谷氨酸钠均有明显提高菌体耐老化作用，使疫苗37℃保存7日的活菌减少率分别为46％、47％和43％、48％，而明胶蔗糖对照为65％。据此设计了4种冻干保护剂配方1、2、3和4，与猪丹毒杆菌菌液等量混合，分别用冻干曲线1、2进行冻干，结果表明冻干保护剂配方1及冻干曲线2冻干效果最好。

为了提高目前我国猪丹毒杆菌活疫苗的菌存率，并方便疫苗的保存及运输，我们进行了该疫苗冻干保护剂研究，现将结果报告如下。

1材料

1.1猪丹毒杆菌CVCC1318株(2006.8.29冻干，0.3ml/支)，由中国兽医药品监察所提供。

1.2猪丹毒合成培养基(批号0102)由本发明人提供及配制。

1.3冻干保护剂基质

右旋糖苷(货号:9004-54-0)购自Pharmacia公司；明胶(批号115K0144)购自Sigma公司；BSA购自Amresco公司；水解乳蛋白(批号282288)购自BD公司；甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、谷氨酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾均为分析纯,进口分装，购自北京拜尔迪生物公司。

1.4冻干机，Edwards公司，Lyoflex2.0。

2方法

2.1猪丹毒杆菌制苗用菌液制备

种子液按《规程》进行制备。将种子液按2％接种250ml合成培养基三角瓶6个，置37℃、180r/min振荡培养13小时，菌液经3500r/min离心20分钟，收集所有的沉淀菌体，用200ml灭菌pH7.2磷酸钾缓冲液(附录1)悬浮，充分混匀后，作为制苗用菌液。

2.2冻融试验

2.2.1保护剂配制

2.2.1.1大分子保护剂配制

称取右旋糖苷6g、明胶6g及BSA12g，分别用注射用水定容至100ml，配制成6％右旋糖苷、6％明胶及12％BSA贮液，2MNaOH调整pH值至7.2，116℃灭菌30分钟。然后各取5ml用等量灭菌pH7.2磷酸钾缓冲液稀释成3％右旋糖苷、3％明胶及6％BSA。

2.2.1.2小分子保护剂配制

称取甘露醇10g、山梨醇10g、蔗糖15g、海藻糖15g、谷氨酸钠15g和水解乳蛋白2g，分别用pH7.2磷酸钾缓冲液(磷酸氢二钾1.25g、磷酸二氢钾0.52g溶解于1000ml注射用水中，116℃灭菌30分钟，pH值为7.2)定容至100ml，0.22μm滤膜过滤除菌。然后按上法用灭菌pH7.2磷酸钾缓冲液稀释成使用浓度。

2.2.2冻融

分别取2.1项制备的菌液1ml与22种单基质保护剂等量混合后(保护剂终浓度如表1所示)，先置2～8℃20分钟，后置-40℃冷冻保存4小时。同时设不含保护剂基质的磷酸钾缓冲液作对照。将各冻存菌液融化后，连同冻融前及对照样品按《中国兽药典》进行活菌计数，并计算冻干菌存率。

2.3冻干试验

2.3.1保护剂配制按2.2.1项进行。

2.3.2冻干分别取2.1项制备的菌液10ml与14种保护剂等量混合后(保护剂终浓度如表2所示)，定量分装(2ml/瓶)，按《中国兽药典》附录进行冻干。同时设1.5％明胶5％蔗糖作对照。分别取冻干前、后以及冻干后置37℃保存7日样品进行活菌计数。

2.4耐热保护剂配方及冻干曲线优化

2.4.1保护剂配制依据冻融和冻干试验结果，将能够提高冻干菌存率及疫苗耐老化性能的保护剂基质，设计成4组耐热保护剂(分别标记为配方1、2、3和4)，其配方及配制方法见附录3。

2.4.2冻干分别取2.1项制备的菌液50ml与4组保护剂等量混合后，定量分装(2ml/瓶)，按冻干曲线1及冻干曲线2进行冻干。分别取冻干前、后以及冻干后置37℃保存7日样品进行活菌计数。通过比较结果选择最佳耐热保护剂和冻干曲线。

2.结果

2.1冻融试验冻融试验结果见表7

表7冻融试验中活菌计数及菌存率结果

注：冻融菌存率计算方法按本发明提供的计算方法计算(下同)。

表7结果显示，在10种单基质中，谷氨酸钠(0.5％、2％)、蔗糖(5％、7.5％)菌存率最高，可达60％以上；海藻糖(5％)、甘露醇(5％)、右旋糖苷(1.5％、3％)、水解乳蛋白(0.5％)次之，菌存率达50％～60％。

2.2冻干试验样品冻干前后及耐老化试验检测结果见表8。

表8样品冻干前后及耐老化试验检测结果

注：冻干后样品及耐老化试验样品用生理盐水恢复至原量后进行检测，其冻干菌存率及活菌减少率按本发明提供的计算方法计算(下同)。

表8结果显示，1.5％右旋糖苷5％蔗糖保护剂中加入0.5％水解乳蛋白或0.5％谷氨酸钠可明显提高冻干菌存率(均达71％)；1.5％右旋糖苷+5％蔗糖+5％山梨醇可使冻干菌存率达75％。1.5％右旋糖苷、5％蔗糖中添加0.5％、2％谷氨酸钠均有明显提高菌体耐老化作用，使疫苗37℃保存7日的活菌减少率分别为33％、38％。另外BSA(0.1％)、水解乳蛋白(0.5％)也有一定提高菌存率及耐老化作用。

2.3冻干保护剂及冻干曲线优化根据表2结果，设计3组不同冻干保护剂配方，具体配方及配制方法见表9，不同保护剂配方及冻干曲线的冻干结果见表9。

表9冻干保护剂配方

注：1)保护剂1配制：在洁净的烧杯中，加入注射用水(100℃)适量，按配方依次称取右旋糖苷、BSA、山梨醇于烧杯中，边加入边用玻璃棒搅拌，使其完全溶解，再用注射用水定容至250ml，116℃灭菌30分钟。

2)保护剂2配制：按配方依次称取蔗糖、水解乳蛋白、L-谷氨酸钠、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾于烧杯中，加入注射用水充分溶解后，定容至250ml，0.22μm滤膜的除菌滤器过滤除菌。

3)临用时，在百级层流罩下，将250ml保护剂1加入250ml保护剂2中进行充分混合。再与抗原液1:1混合使用。

表10不同保护剂配方及冻干曲线的冻干结果(活菌数：10⁸CFU/ml)

表10结果显示，采用耐热保护剂配方1与冻干曲线2冻干猪丹毒杆菌(CVCC1318株)效果最好，冻干后不结晶，冻干菌存率达86.9％；37℃保存7日不萎缩，活菌减少率为15.0％。明显优于明胶蔗糖对照(其冻干菌存率为63.0％与55.1％；37℃保存7日后活菌减少率为50％与55％)。

3小结与讨论

3.1采用耐热保护剂配方1与冻干曲线2冻干猪丹毒杆菌(CVCC1318株)效果良好。

3.2某些单保护剂基质(如：0.5％和2％谷氨酸钠、5％和7.5％蔗糖、1.5％和3％右旋糖苷、0.5％水解乳蛋白)可以提高猪丹毒杆菌(CVCC1318株)在“冻结-解冻”的活性恢复率，可能是由于它们含有的糖醇羟基、或某些氨基酸成分和菌膜表面的氨基基团发生类似水合反应，形成范德华表面张力，减少了冰晶对菌体损伤。Scott(Scott，W.J.，InRecentResearinFreezingandDrying.1960，188～202.)、ChoandObayashi(Cho,CandObayashi,Y.,BulletionoftheWorldHealthOrgination.1956,14:657.)曾报导使用谷氨酸钠，在冷冻干燥过程中对病毒囊膜起到同样作用。

3.3在右旋糖苷大分子中添加少量BSA，可以更好的发挥保护剂与填充剂作用(华泽钊.冷冻干燥新技术.北京：科学出版社，2006.1.)。

3.4该耐热保护剂中大分子物质主要形成耐热框架，形成间接的隔热层；小分子物质主要与菌体形成悬液，起直接作用。

本发明试验中所使用的药品、试剂均购自国内试剂公司和医药商店。

Claims

1.一种猪丹毒活疫苗的生产方法，其特征是：

(1)生产菌种为猪丹毒杆菌CVCC1318株或CVCC1319株；