CN103599531A - 一种鸡传染性支气管炎活疫苗、耐热保护剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡传染性支气管炎活疫苗、耐热保护剂及其制备方法，该活疫苗由抗原和耐热保护剂组成，其中抗原是保藏编号为：CCTCC-V201320的鸡肾型传染性支气管炎病毒K136株。其具体的制备方法是，首先用鸡胚对传染性支气管炎病毒K136株进行扩大培养并配置耐热保护剂，然后将K136株扩大培液与耐热保护剂混合，将得到的混合液冻干制成疫苗。本发明中制备的活疫苗，能够缓解我国目前对流行的鸡肾型传染性支气管炎的疫苗防治工作几乎面临无药可用的窘境，同时填补我国制备鸡肾型传染性支气管炎耐热型活疫苗的空白。与现有活疫苗相比本发明中的疫苗在有效期内保存在2-8℃条件下，便于储存、运输和使用。

Description

一种鸡传染性支气管炎活疫苗、耐热保护剂及其制备方法

技术领域

本发明属于畜禽用生物新医药技术领域，尤其是涉及一种鸡传染性支气管炎活疫苗、耐热保护剂及其制备方法 

背景技术

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是鸡的一种急性、高度接触性传染病，它主要侵害呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统。本病最早由美国Schalk和Hawn报道，临床以患鸡咳嗽、喷嚏和气管啰音的呼吸道症状为主，之后陆续在世界各国发生，1936年Beach和Schalm确定病原为病毒(呼吸型IBV)，后命名为鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)，归入冠状病毒科，是冠状病毒的代表株。 

肾型传染性支气管炎是鸡传染性支气管炎的一种病理表现形式。我国于1972年由邝荣禄首次报道在广东省有传染性支气管炎存在，随后绝大多数省份都有该病发生的报道，在此期间发生的传染性支气管炎也主要为呼吸型。1962年,Winterfied等在美国发现了致肾病变型传染性支气管炎病毒,并将其命名为Holte株,该型的代表毒株有Holte株、Gray株、CV56b株、Wolgemuth株等,其中Gray株是缓和型毒株。同年,Cumming在澳大利亚分离出N1/62(T株),该病毒被认为是嗜肾型传染性支气管炎病毒的代表株。20世纪90年代以来，肾型传染性支气管炎在国内也相继爆发，流行十分广泛。尤其是最近几年，肾型传染性支气管炎在我国肉鸡群中大面积流行，给养鸡生产带来了严重的损失。 

疫苗接种是防治IB的有效手段，但是由于IBV基因组核酸RNA复制的不连续机制及RNA聚合酶的不完全校对机制，使得病毒RNA在复制过程中易发生基因点突变、插入、缺失或重组，因此造成大量IBV变异株的出现。目前世界上已分离到的IB血清型已达30种之多，不同血清型毒株疫苗之间仅有部分或无交叉保护作用，IB的多血清型性为其免疫预防增加了难度。随着IBV基因变异的加速，我国目前对流行的鸡肾型传染性支气管炎的疫苗防治工作，几乎面临无药可用的窘境。因此筛选获得新的保护力好的肾型IB毒株并用于制备针对目前中国流行 的肾型传染性支气管炎病毒活疫苗就显得尤为重要。 

弱毒活疫苗是预防畜禽传染病的主要疫苗之一，在我国动物用疫苗中，活疫苗占相当大的比例。国内疫苗企业常用的保护剂主要是蔗糖、牛奶、明胶等，组方简单，保护性能差。如果在2℃～8℃条件下，保存期只有3～6个月，多需要在-15℃以下保存。而国内传统的动物用疫苗保护剂的研制相对滞后，使疫苗的长期保存和长途运输受到很大限制，加上基层防疫部门缺乏必要的冷冻和冷藏设施，容易因免疫失败而造成疫病流行。国际上发达国家的耐热保护技术已经得到广泛应用，冻干疫苗大多数都实现了2-8℃保存，大大降低了疫苗的保存条件，提高了疫苗的稳定性和使用效果，但未见其配方的详细报道。加之耐热保护剂的效用与微生物的种类和其本身的结构差异密切相关，决定了不同种类疫苗的保护剂的配方也应不同。因此通过对疫苗耐热技术的研究，开发出适合我国疫情特性的耐热型活疫苗便成为当务之急。 

发明内容

本发明的目的是在于提供一种耐热型鸡肾型传染性支气管炎活疫苗及其制备方法，以缓解我国目前对流行的鸡肾型传染性支气管炎的疫苗防治工作几乎面临无药可用的窘境，同时填补我国制备鸡肾型传染性支气管炎耐热型活疫苗的空白。 

本发明的目的还在于提供上述耐热型鸡肾型传染性支气管炎活疫苗的耐热保护剂及其制备方法，该耐热保护剂可使本发明中的疫苗在有效期内保存在2-8℃条件下，便于储存、运输和使用，同时该耐热保护剂具有制备简单、经济，适合于大规模生产的特点。 

为实现本发明的上述目的，所采用的技术方案如下： 

一种耐热型鸡肾型传染性支气管炎活疫苗，该活疫苗由抗原和耐热保护剂组成，所述抗原是指鸡肾型传染性支气管炎病毒K136株，保藏编号为CCTCC-V201320。 

K136株病毒是由发明人针对我国目前流行的鸡肾型传染性支气管炎病毒连续鸡胚传代136代致弱获得的，其有效的克服了经典肾型毒株W93株在疫苗制备过程中副反应大、不适合我国流行株防治的缺点，本发明中用K136株做抗原 制备耐热型活疫苗尚属首次。所述耐热保护剂包括海藻糖，聚乙烯吡咯烷酮（PVP），丙氨酸，组氨酸，谷氨酸钠。 

一种上述耐热型鸡肾型传染性支气管炎活疫苗的制备方法，其中包括以下步骤： 

1）经鸡胚尿囊腔接种鸡传染性支气管炎弱毒K136株进行扩大培养； 

2）收获扩大培养病毒液，经效价测定、无菌处理制备成疫苗抗原； 

3）将疫苗抗原与耐热保护剂按比例混合均匀后冷冻干燥制备成疫苗。 

上述制备方法具体包括以下步骤： 

1、将K136毒株的基础种毒利用无菌生理盐水稀释100倍，在无菌条件下接种10日龄SPF鸡胚，每个鸡胚接种0.1mL于尿囊腔中，石蜡封口后置37℃孵化箱内进行孵化，弃去24小时内死亡的鸡胚，以后每隔4-8小时照蛋一次，死亡的鸡胚挑出置于4℃，36小时将剩余鸡胚置于4℃冰箱内8-12小时，然后在无菌条件下收获鸡胚尿囊液； 

2、收获的鸡胚尿囊液经无菌检验合格后利用10日龄SPF鸡胚测定病毒效价，将病毒效价高于10^6.5EID₅₀/0.1mL的尿囊液备用，即为疫苗抗原； 

3、将疫苗抗原与冻干保护剂按照体积比1:1进行配比，经冷冻干燥后36-48h后即得疫苗，即为成品。 

本发明还提供了一种耐热型鸡肾型传染性支气管炎活疫苗的耐热保护剂，所述耐热保护剂包括：海藻糖10-12%，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）1-2%，丙氨酸0.1%-0.5%，组氨酸0.2-0.5%，谷氨酸钠1-2%。 

一种上述耐热保护剂的制备方法，其中包括以下步骤： 

1）将海藻糖，丙氨酸，组氨酸，谷氨酸钠，溶解于1/2总量的去离子水中，充分溶解后用0.22μm的滤膜进行过滤除菌； 

2）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）充分溶解于1/2总量的去离子水中，116℃高压30min除菌， 

3）两者充分混匀后即得耐热保护剂。 

本发明制备的活疫苗能有效防治我国当前流行的鸡肾型传染性支气管炎，降低因肾型传染性支气管炎在我国养殖鸡群中大面积流行带给鸡养殖业的极大损失。而且，因为耐热保护剂的添加和使用，可使本发明中的疫苗在有效期内保存 在2-8℃条件下，便于储存、运输和使用。 

具体实施方式

为能进一步说明本发明的内容、特点及功效，兹例举以下实施例进一步描述本发明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。 

实施例1：鸡传染性支气管炎肾型株K136株的筛选 

本公司从2003年-2005年分别在我国不同鸡场采集疑似鸡传染性支气管炎病毒分离毒株。病鸡主要表现为精神不振、咳嗽，常听到呼噜声，病理剖检发现除气管环有小出血点外肾脏还有明显病变，经过初步鉴定获得4株肾型传染性支气管炎病毒毒株，分别命名为CK/IBV/QD03株、CK/IBV/ZC03株、CK/IBV/YT04株和CK/IBV/SD05株。使用10日龄SPF鸡胚对四株毒株进行连续传代致弱，每代通过尿囊腔接种4枚鸡胚，37℃孵育，接种后36h冻死鸡胚，收获尿囊液用于下一代接种，连传至136代。期间进行致弱评价，其评价方法是取第2、20、40、50、60、70、80、90、100、110、120、124、128、132、134、136、140代的毒株感染1日龄雏鸡，观察雏鸡发病情况。 

结果见表1： 

表14种分离株不同代次对SPF鸡的致病结果 

表1续 

结果表明只有CK/IBV/SD05毒株从传至第80代病毒株受试鸡开始无死亡，第100代病毒株受试鸡开始无眼观病变，第120代病毒株开始受试鸡开始无组织学病变。其他3株在传代过程中其病毒毒价一直不高这表明病毒不能在鸡胚上很好的适应、致弱；发病率和死亡率均不为0，证明这三种毒株在鸡胚上传代后并没有致弱，甚至有些毒株在致弱的情况下又出现了返强，这些都说明CK/IBV/QD03株、CK/IBV/ZC03株和CK/IBV/YT04株的致弱毒株均不适合作为活疫苗的疫苗毒株使用。 

而CK/IBV/SD05株于第120代已完全致弱，对受试鸡具有良好的安全性。同时用第124、128、132、134、136代毒分别免疫3日龄SPF鸡，进行免疫保护评价,免疫后14天用同源强毒攻击，免疫组分毒率为0/10，对照组分毒率为10/10，说明本发明毒株具有良好的免疫保护性，为便于同以前毒株区分，将传代至136 代弱化的CK/IBV/SD05毒株定为原始种毒E1代，命名为冠状病毒属鸡传染性支气管炎病毒科鸡传染性支气管炎病毒K136株，作为本发明中疫苗制备的候选毒株。本发明的鸡传染性支气管炎病毒K136株于2013年6月28日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC-V201320 

实施例2：K136株安全性检测 

1、不同代次K136株在鸡胚上的毒价测定 

取K136株的E2、E4、E7、E10、E15代毒种，作适当倍数稀释，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，同时设置空白对照组，每胚经尿囊腔接种生理盐水0.1mL，37℃孵育培养。弃去24h内死亡鸡胚，孵育144h后，取出观察鸡胚发育情况。按照Reed-Muench方法计算EID₅₀，E2、E4、E7、E10、E15代毒种的毒价分别为：10^6.7、10^6.8、10^6.5、10^6.6、10^6.8EID₅₀/0.1mL。试验结果说明K136株在鸡胚上增殖稳定，无毒力返强现象。 

2、不同代次K136株在雏鸡上的致病性试验 

选取10日龄SPF雏鸡，随机分为6组，每组10只鸡，分别以10^5。0EID₅₀滴鼻接种取K136株的E2、E4、E7、E10、E15代毒种0.1mL，最后一组以生理盐水滴鼻0.1mL作为空白对照组，各组受试鸡均分开隔离饲养，连续观察20日后，扑杀、剖检各组受试鸡是否出现气管出血、分泌物增多、肾肿大、尿酸盐沉积等病变特征，结果见表2。 

表2不同代次K136株在雏鸡上的安全性检测结果 

上述试验结果表明，试验结束后各组受试鸡均健活，无任何异常反应，剖检 无组织学病变，这表明K136株在雏鸡上毒力稳定没有发生毒力返强。 

实施例3：不同代次K136株免疫效力评价 

用E2、E4、E7、E10、E15代次K136株毒种鸡胚尿囊液，以5×10^2.0EID₅₀剂量，对1日龄SPF鸡滴鼻，免疫后14日，连同对照鸡，每只鸡用10^3.68EID₅₀/0.1mL的分离株强毒CK/IBV/SD05株点眼、滴鼻各0.05mL，攻毒后第5日，采集每只鸡的气管拭子，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.1mL/胚，孵育观察至144小时。结果显示，免疫组分毒率在0/10-1/10之间，保护率在9/10-10/10之间；对照组分毒率为10/10。说明IBV-K136株毒种在15代以内其免疫原性基本一致，均具有良好免疫原性，说明IBV-K136株具有良好的免疫保护性。 

实施例4：鸡传染性支气管炎活疫苗的制备及检测 

1.生产种毒的繁殖 

将K136毒株的基础种毒利用无菌生理盐水稀释100倍，在无菌条件下接种10日龄SPF鸡胚，每个鸡胚接种0.1mL于尿囊腔中，石蜡封口后置37℃孵化箱内进行孵化，弃去24小时内死亡的鸡胚，以后每隔4-8小时照蛋一次，死亡的鸡胚挑出置于4℃，36小时将剩余鸡胚置于4℃冰箱内8-12小时，然后在无菌条件下收获鸡胚尿囊液，置于-20℃备用。按此方法制备3批半成品，对每批收获的尿囊液进行取样，按现行《中国兽药典》附录方法进行无菌检验，并分别测定3批尿囊液病毒含量，实验结果见表3。 

表3：各批次毒种病毒含量和无菌检验结果 

2.配苗与冻干 

将检验合格后的半成品与耐热保护剂按1:1比例进行配苗，同时加入500单位/mL的氨苄青霉素及链霉素，定量分装后进行冷冻真空干燥过程，冻干全过程需要30-38h。冻干后的疫苗利用鸡胚测定每羽份病毒含量应≥10^3.7EID₅₀。 

3.耐老化实验 

将冻干合格的三批疫苗放置于37℃条件下进行保存，分别放置7、10、15天后测定疫苗效价。制备的三批传染性支气管炎耐热保护剂活疫苗作为实验组，对照组为常规蔗糖脱脂乳配制的普通冻干保护剂传染性支气管炎活疫苗，37℃条件下保存7、10、15天，分别测定每批苗每羽份病毒效价。 

效力检验：将在37℃条件下保存的疫苗于7d、10d、15d取出，用灭菌生理盐水稀释至1羽份/0.1mL，随后做10倍梯度稀释，取合适的稀释度，每个稀释度分别接种5枚10日龄SPF鸡胚，接种方式为尿囊腔接种，0.1mL/胚，石蜡封口后置于37℃孵育，同时设置5枚接种等量生理盐水对照组。观察144小时，记录接种24小时之后死亡的鸡胚或有特异性病痕的感染鸡胚，计算半数感染量。实验结果，见表4。 

表4疫苗在37℃条件下保存7、10、15天每羽份病毒效价测定结果 

实验结果表明，3组实验组在耐老化10天时病毒效价下降均不超过1个滴度，而对照组病毒效价下降明显，说明本实验耐热保护剂对该病毒的耐热保护效果很好。 

4.保存期实验 

制备的三批传染性支气管炎耐热保护剂活疫苗作为3组实验组，对照组为常规蔗糖脱脂乳配制的普通冻干保护剂传染性支气管炎活疫苗，将各组疫苗分别置于2-8℃条件下保存6、12、18、24个月，分别测定每批疫苗每羽份病毒效价。 

效力检验：将在2-8℃条件下保存的疫苗分别于第6、12、18、24个月取出，用灭菌生理盐水稀释至1羽份/0.1mL，随后做10倍梯度稀释，取合适的稀释度，每个稀释度分别接种5枚10日龄SPF鸡胚，接种方式为尿囊腔接种，0.1mL/胚，石蜡封口后置于37℃孵育，同时设置5枚接种等量生理盐水对照组。观察144小时，记录接种24小时之后死亡的鸡胚或有特异性病痕的感染鸡胚，计算半数感染量。 

实验结果见表5。 

表5疫苗在2-8℃条件下保存6、12、18、24个月每羽份病毒效价测定结果 

实验结果表明，3组实验组在2-8℃条件下保存24个月病毒效价下降均不超过1个滴度，而对照组病毒效价下降明显，表明本研究的耐热型鸡传染性支气管炎活疫苗可在2-8℃条件下保存24个月。 

5.攻毒保护试验 

各实验组各取3日龄SPF鸡10只，每只滴鼻1羽份的疫苗，同时设10只对照组。免疫后14日，每只鸡滴鼻攻击10^3.68EID₅₀的IBV-K2毒株，观察10日。记录发病情况，结果见表6。 

表6疫苗免疫后攻毒保护情况 

实验结果显示：本发明制备的耐热型鸡传染性支气管炎活疫苗免疫雏鸡后可以抵御肾型传染性支气管炎强毒株的攻击，对雏鸡的攻毒保护作用很好。 

以上实验结果显示，本发明的鸡传染性支气管炎耐热保护剂活疫苗在2-8℃条件保存24个月，病毒含量仍能达到《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》规定的各项指标，可见本发明耐热保护剂的保护效果明显优于传统的5％蔗糖10%脱脂牛奶保护剂的保护效果，且37℃保存10天，病毒含量下降不超过1个滴度，可见本发明的疫苗改进了常规疫苗需冷链支撑的缺点。。 

本发明的鸡传染性支气管炎耐热保护剂活疫苗可以抵御我国流行的肾型传染性支气管炎病毒的攻击，保护率达到90%以上，可见本发明的疫苗可对我国肾型传染性支气管炎的防控起到重要作用。 

实施例5：耐热保护剂的制备 

1）用1/2总量的去离子水充分溶解以下组分，使其各组分浓度分别为海藻糖10%，丙氨酸0.1%，组氨酸0.2%，谷氨酸钠1%，充分溶解后用0.22μm的滤膜进行过滤除菌； 

2）用1/2总量的去离子水溶解浓度为1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），116℃高压30min除菌； 

3）两者充分混匀后即得耐热保护剂。 

实施例6：耐热保护剂的制备 

1）用1/2总量的去离子水充分溶解以下组分，使其各组分浓度分别为海藻糖11%，丙氨酸0.3%，组氨酸0.3%，谷氨酸钠1.5%，充分溶解后用0.22μm的滤膜进行过滤除菌； 

2）用1/2总量的去离子水溶解浓度为1.5%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），116℃高压30min除菌； 

3）两者充分混匀后即得耐热保护剂。 

实施例7：耐热保护剂的制备 

1）用1/2总量的去离子水充分溶解以下组分，使其各组分浓度分别为海藻糖12%，丙氨酸0.5%，组氨酸0.5%，谷氨酸钠2%，充分溶解后用0.22μm的滤膜进行过滤除菌； 

2）用1/2总量的去离子水溶解浓度为2%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），116℃高压30min除菌； 

3）两者充分混匀后即得耐热保护剂。 

实施例8：利用上述三种耐热保护剂分别与同一批K136病毒液制备疫苗，批号分别1301、1302、1303，将制备的疫苗分别置于37℃温箱内放置7、10、15天，测定相应时间段各批疫苗的病毒效价。实验结果见表7。 

表7三种保护剂制备的疫苗的耐老化实验结果 

实验结果显示：按3种配方制备的耐热保护剂制成的疫苗在37℃存放10天后病毒效价下降仍不超过一个滴度，表明3种配方均对K136毒株有较好的耐热保护作用。 

Claims (7)

1.一种耐热型鸡肾型传染性支气管炎活疫苗，该活疫苗由抗原和耐热保护剂组成，其特征在于所述抗原是指鸡肾型传染性支气管炎病毒K136株，保藏编号为CCTCC-V201320。

2.根据权利要求1所述的一种耐热型鸡肾型传染性支气管炎活疫苗，其特征在于所述抗原K136株病毒是由发明人针对我国目前流行的鸡肾型传染性支气管炎病毒连续鸡胚传代136代致弱获得的。

3.根据权利要求1或2所述的一种耐热型鸡肾型传染性支气管炎活疫苗，其特征在于所述抗原中包括的K136株病毒在传代致弱评价中，传至第80代病毒株受试鸡开始无死亡，第100代病毒株受试鸡开始无眼观病变，第120代病毒株开始受试鸡开始无组织学病变。

4.根据权利要求1或2或3所述的一种耐热型鸡肾型传染性支气管炎活疫苗，其特征在于所述抗原中包括的K136株病毒在免疫评价中，传至第136代病毒株免疫组分毒率为0/10，对照组分毒率为10/10。

5.根据权利要求1所述的一种耐热型鸡肾型传染性支气管炎活疫苗，其特征在于所述耐热保护剂包括：海藻糖10-12%，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）1-2%，丙氨酸0.1%-0.5%，组氨酸0.2-0.5%，谷氨酸钠1-2%。

6.根据权利要求1所述的一种耐热型鸡肾型传染性支气管炎活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）经鸡胚尿囊腔接种鸡传染性支气管炎弱毒K136株进行扩大培养；

2）收获扩大培养病毒液，经效价测定、无菌处理制备成疫苗抗原；

3）将疫苗抗原与耐热保护剂按比例混合均匀后冷冻干燥制备成疫苗。

7.根据权利要求1或5所述的一种耐热型鸡肾型传染性支气管炎活疫苗耐热保护剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将海藻糖，丙氨酸，组氨酸，谷氨酸钠，溶解于1/2总量的去离子水中，充分溶解后用0.22μm的滤膜进行过滤除菌；

2）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）充分溶解于1/2总量的去离子水中，116℃高压30min除菌，

3）两者充分混匀后即得耐热保护剂。