CN110903413B - 一种改善功能性消化不良的菊芋粕菊粉及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种改善功能性消化不良的菊芋粕菊粉及其制备方法和应用，属于天然产物深加工技术领域。菊芋粕菊粉的制备方法，包括以下步骤：将菊芋粕粉末和含有糖苷酶的缓冲液混合，酶解提取；将提取液经超滤去除蛋白质和果胶大分子杂质；将得到的菊芋粕菊粉粗提液进行脱盐纯化处理；将脱盐菊芋粕菊粉提取液进行二次超滤除去单糖和寡糖小分子杂质，干燥得到菊芋粕菊粉。与传统热水浸提法相比，菊芋粕菊粉得率提高。菊芋粕菊粉在制备治疗功能性消化不良的药物中应用。同时菊芋粕菊粉还可以在改善胃内容物残留率和胃肠激素水平、肠道菌群紊乱和/或氧化应激水平的保健品中应用。

Description

一种改善功能性消化不良的菊芋粕菊粉及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于天然产物深加工技术领域，具体涉及一种改善功能性消化不良的菊芋粕菊粉及其制备方法和应用。
背景技术
菊粉因其具有抗氧化活性，并能改善肠道菌群多样性，促进肠道蠕动，改善胃肠动力障碍而广泛受到人们关注。10年来，中国菊粉市场需求量以平均每年15％左右的增速发展，至2018年中国菊粉市场需求量大约为8000吨，实现了约10倍的增长。从全球范围来看，2015年的数据显示：菊粉全球市场需求约为20万吨，全球膳食纤维新产品中，含菊粉的新产品约为24％，位居第一。
菊粉的生产原料在我国和欧美国家有着极大差别，欧洲菊粉工业化生产以菊苣(Helianthus tuberosus L.)为原料，而我国菊粉工业化生产以菊芋(Helianthustuberosus(L.1753)L.)为原料(魏凌云等2008)。相比欧洲国家，我国菊芋菊粉研究起步较晚，且目前采用热水浸提法获得菊芋菊粉，1吨鲜菊芋经热水浸提后能够得到约650kg菊芋渣，菊芋渣经干燥后获得菊芋粕，菊芋粕中含有果胶、菊粉、纤维素/半纤维素等大量糖类化合物。因此，菊芋粕中糖类化合物的深层提取利用，有望在不改变原有菊粉生产工艺的条件下，增加国内企业菊芋利用率，促进产业产值。目前，研究人员已经开始关注菊芋粕的高效利用，已有关于菊芋粕中果胶和单糖的二次利用研究的报道，但是还没有关于菊芋粕中菊粉深层利用的报道。
功能性消化不良(Functional dyspepsia，FD)是常见的功能性胃肠疾病之一，由于该病反复发作，且目前临床使用的西药大多伴随严重的消化道和神经系统方面的副作用，从天然产物中探索新的治疗药物已成为当前该疾病治疗药物的研究热点。菊粉是一种天然的水溶性膳食纤维，几乎不能被胃酸水解和消化，只有在结肠被有益微生物利用，从而改善肠道环境。杜昭平(2014)以含有菊粉的MRS液体培养液研究菊粉对干乳酪杆菌和植物乳杆菌体外增殖的影响，结果显示，菊粉能显著促进二者体外增殖。除调节肠道菌群外，菊粉还有促进肠胃蠕动，增强胃肠动力的功效，从而起到预防与改善便秘、腹泻、结肠癌等作用，李素彦等(2015)通过实验探讨菊粉联合益生菌对成人急性腹泻治疗的临床效果。结果显示，菊粉联合益生菌有助于改善急性腹泻患者肠道黏膜功能，促进肠道菌群平衡的恢复，两者协同治疗成人急性腹泻疗效显著，安全可靠。但是，到目前为止，还没有菊芋菊粉治疗功能性消化不良的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种改善功能性消化不良的菊芋粕菊粉及其制备方法和应用。
本发明提供了一种改善功能性消化不良的菊芋粕菊粉的制备方法，包括以下步骤：
1)将菊芋粕粉末和含有糖苷酶的缓冲液混合，酶解提取，得到提取液；
2)将所述提取液经超滤去除蛋白质和果胶大分子杂质，得到菊芋粕菊粉粗提液；
3)将所述菊芋粕菊粉粗提液进行脱盐纯化处理，得到脱盐菊芋粕菊粉提取液；
4)将所述脱盐菊芋粕菊粉提取液进行二次超滤除去单糖和寡糖小分子杂质，干燥，得到菊芋粕菊粉。
优选的，步骤1)中所述含有糖苷酶的缓冲液是以0.01～0.5mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液为溶剂，包含以下糖苷酶：果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和木聚糖酶；
所述菊芋粕粉末的质量和果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和木聚糖酶的活力比依次为1g：3～20U：5～15U：10～30U：5～20U。
优选的，步骤1)中所述菊芋粕粉末的质量和含有糖苷酶的缓冲液的体积比为1g：10～30mL；
所述酶解提取的温度为45～55℃，所述酶解提取的时间为1～3h。
优选的，步骤2)中所述超滤用超滤膜的截留分子量为20000Da，膜面积0.2m2；超滤操作时压差为1.0Mpa，循环流量2L/min。
优选的，步骤3)中所述脱盐纯化处理为采用阴阳离子交换树脂进行；
强酸性阳离子交换树脂：强碱性阴离子交换树脂的体积比为1：1～2；
离子树脂的总体积和菊芋粕菊粉粗提液的体积比为1：1～1.5；
所述脱盐纯化处理的时间为60～90min。
优选的，步骤3)中所述二次超滤用超滤膜截留分子量为1000Da，膜面积0.2m2，操作压差为1.0Mpa，循环流量2L/min；
所述干燥包括喷雾干燥；所述喷雾干燥的进口温度185～195℃，出口温度85～95℃，进料速度800～1000m L/h。
本发明提供了所述制备方法制备的改善功能性消化不良的菊芋粕菊粉，所述菊芋粕菊粉的纯度≥91％；
总糖含量≥93％，其中蔗果五糖及以上聚合度的果聚糖含量≥75％；
糖醛酸含量＜0.34％；及
蛋白质含量＜0.61％。
优选的，所述菊芋粕菊粉的总抗氧化能力以TEAC表示；所述TEAC为每克菊芋粕菊粉样品相当于x毫克水溶性维生素E；
菊芋粕菊粉的总抗氧化能力为3.56～4.25mgTE/g。
本发明提供了所述菊芋粕菊粉在制备治疗功能性消化不良的药物中应用。
本发明提供了所述菊芋粕菊粉在改善胃内容物残留率和胃肠激素水平、肠道菌群紊乱和/或氧化应激水平的保健品中应用。
本本发明提供的菊芋粕菊粉的制备方法，是将菊芋粕粉末和含有糖苷酶的缓冲液混合，酶解提取，将提取液经超滤去除蛋白质和果胶大分子杂质，将菊芋粕菊粉粗提液进行脱盐纯化处理后进行二次超滤除去单糖和寡糖小分子杂质，干燥，得到的菊芋粕菊粉。与传统热水浸提制备菊芋粕菊粉的工艺相比，采用本发明提供的制备方法具有提取效率高的特点，菊芋粕菊粉得率提高24.58～39.74％，增加菊芋原料的利用率，促进产业产值。
进一步的，本发明提供的制备方法进一步限定了酶解提取时所用温度为45～55℃，与传统热水浸提法提取温度80℃以上相比，降低了提取温度，有利于减少提取过程中能量消耗。
本发明提供了所述制备方法制备的改善功能性消化不良的菊芋粕菊粉，所述菊芋粕菊粉的纯度≥91％；总糖含量≥93％，其中蔗果五糖及以上聚合度的果聚糖含量≥75％；糖醛酸含量＜0.34％；及蛋白质含量＜0.61％。与传统热水浸提法相比，所述菊芋粕菊粉的纯度提高了2.4％～5.2％，总糖含量提高了3.9％～7.7％，菊粉中蔗果五糖及以上聚合度的果聚糖含量提高了3.7％～6.9％。
进一步的，通过检测菊芋粕菊粉的总抗氧化能力，用TEAC表示，本发明提供的菊芋粕菊粉的总抗氧化能力为3.56～4.25mgTE/g，与市售菊芋菊粉相比，总抗氧化能力(TEAC值)提高45.85～55.73％。
本发明提供了所述菊芋粕菊粉在制备治疗功能性消化不良的药物中应用。实验证明：菊粉改善FD大鼠胃内容物残留率和胃肠激素水平的效果更显著：与市售菊芋菊粉相比，本发明制备的菊粉实验组的胃排空速度增加9.47～18.39％，MTL含量增加14.60～25.70％，Gerlin含量降低1.22～2.43％，Gas含量降低4.21～7.62％，5-HT含量降低3.84～5.46％；同时菊粉改善FD大鼠肠道菌群紊乱的效果更显著。
具体实施方式
本发明提供了本发明提供了一种改善功能性消化不良的菊芋粕菊粉的制备方法，包括以下步骤：
1)将菊芋粕粉末和含有糖苷酶的缓冲液混合，酶解提取，得到提取液；
2)将所述提取液经超滤去除蛋白质和果胶大分子杂质，得到菊芋粕菊粉粗提液；
3)将所述菊芋粕菊粉粗提液进行脱盐纯化处理，得到脱盐菊芋粕菊粉提取液；
4)将所述脱盐菊芋粕菊粉提取液进行二次超滤除去单糖和寡糖小分子杂质，干燥，得到菊芋粕菊粉。
本发明将菊芋粕粉末和含有糖苷酶的缓冲液混合，酶解提取，得到提取液。
在本发明中，所述菊芋粕粉末优选将工业化生产过程中产生的菊芋粕，经食品破碎机破碎得到。所述菊芋粕粉末的粒径优选为50～300目，更优选为150目。本发明对所述粉碎用食品破碎机的型号没有特殊限制，采用本领域所熟知的食品破碎机即可。在本发明实施例中，所述食品破碎机购自成洵实业有限公司，型号为CXP-DJ-S-5T。
在本发明中，所述菊芋粕粉末的质量和含有糖苷酶的缓冲液的体积比优选为1g：10～30mL，更优选为1g：20mL。所述含有糖苷酶的缓冲液优选是以pH 4.0-5.5、0.01～0.5mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液为溶剂，包含以下糖苷酶：果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和木聚糖酶；所述菊芋粕粉末的质量和果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和木聚糖酶的活力比依次优选为1g：3～20U：5～15U：10～30U：5～20U，更优选为1g：5～15U：8～12U：15～25U：8～15U，最优选为1g：10U：10U：20U：12U。所述酶解提取的温度优选为45～55℃，更优选为50℃。所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度优选为0.1～0.4mol/L，更优选为0.25mol/L。所述酶解提取的时间优选为1～3h，更优选为2h。所述酶解提取过程有利于在多种生物酶的作用下，将菊芋粕中蛋白质、多糖从细胞中分离出来。
得到提取液后，本发明将所述提取液经超滤去除蛋白质和果胶大分子杂质，得到菊芋粕菊粉粗提液。
在本发明中，所述超滤用超滤膜的截留分子量优选为20000Da，膜面积优选为0.2m2。本发明对膜分离用设备以及超滤膜的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的膜分离用设备以及超滤膜的来源即可。在本发明实施例汇中，膜分离用设备优选为RNF-0460型。所述超滤膜优选购自厦门福美科技有限公司。超滤操作时压差优选为1.0Mpa，循环流量优选为2L/min。所述超滤方法能有效去除蛋白质和果胶大分子等杂质。
得到菊芋粕菊粉粗提液后，本发明将所述菊芋粕菊粉粗提液进行脱盐纯化处理，得到脱盐菊芋粕菊粉提取液。
在本发明中，所述脱盐纯化处理优选为采用阴阳离子交换树脂进行；
强酸性阳离子交换树脂：强碱性阴离子交换树脂的体积比为1：1～2，更优选为1:1.5。离子树脂的总体积和菊芋粕菊粉粗提液的体积比为1：1～1.5，更优选为1:1.2。所述脱盐纯化处理的时间优选为60～90min，70～80min。本发明对阴阳离子交换树脂脱盐的操作没有特殊限制，采用本领域所熟知的阴阳离子交换树脂脱盐的技术方案即可。
得到脱盐菊芋粕菊粉提取液后，本发明将所述脱盐菊芋粕菊粉提取液进行二次超滤除去单糖和寡糖小分子杂质，干燥，得到菊芋粕菊粉。
在本发明中，所述二次超滤用超滤膜截留分子量优选为1000Da，膜面积优选0.2m2。本发明对膜分离用设备以及超滤膜的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的膜分离用设备以及超滤膜的来源即可。在本发明实施例汇中，膜分离用设备优选为RNF-0460型。所述超滤膜优选购自厦门福美科技有限公司。操作压差优选为1.0Mpa，循环流量优选2L/min。所述二次超滤方法有利于提高单糖和寡糖等小分子杂质的去除率。
本发明对所述干燥的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的菊粉的干燥方法均可。所述干燥优选为喷雾干燥；所述喷雾干燥的进口温度185～195℃，更优选为190℃；出口温度优选为85～95℃，更优选为90℃。进料速度优选为800～1000mL/h，更优选为900mL/h。所述喷雾干燥有利于减少菊粉质量的破坏。
本发明提供了所述制备方法制备的改善功能性消化不良的菊芋粕菊粉，所述菊芋粕菊粉的纯度≥91％；测定方法参见文献1(肖仔君,等.菊芋中菊粉提取工艺的研究[J].现代食品科技,2013,29(2),315-318.)。
所述菊芋粕菊粉的总糖含量≥93％，所述总糖含量的测定是以果糖为标准单糖，测定方法参见文献2(Dubois M,Gilles KA,Hamilton JK,et al.Colorimetric methodfor determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry，1956，28：350-356)。
所述总糖中，蔗果五糖及以上聚合度的果聚糖含量≥75％；果聚糖中果糖残基的构型和糖苷键主要为→1)-β-D-Fruf-(2→和β-D-Fruf-(2→。测定方法参见文献3(Fu Q,Liang T,Zhang X,et al.Carbohydrate separation by hydrophilic interactionliquid chromatography on a'click'maltose column[J].Carbohydrate Research,2010,345:2690-2697)。
所述菊芋粕菊粉的糖醛酸含量＜0.34％；测定方法参见文献4(Blumenkrantz N,Asboe-Hansen G.New method for quantitative determination ofuronic acids.[J].Analytical Biochemistry,1973,54:484-489.)。
所述菊芋粕菊粉的蛋白质含量＜0.61％。测定方法参见文献5(Sedmark JJ，Grossberg SE.A rapid，sensitive，and versatile assay for protein usingCoomassie brilliantblue G250[J].Analytical Biochemistry，1979，79：544-552)。
在本发明中，所述菊芋粕菊粉的总抗氧化能力优选以TEAC表示；所述TEAC为每克菊芋粕菊粉样品相当于x毫克水溶性维生素E；菊芋粕菊粉的总抗氧化能力优选为3.56～4.25mgTE/g。与市售菊粉(
Figure BDA0002312620210000071
HIS Inulin powder，batch number:RHWCJ8ACJ8)相比，总抗氧化能力(TEAC值)提高45.85～55.73％。
本发明提供了所述菊芋粕菊粉在制备治疗功能性消化不良的药物中应用。
本发明提供了所述菊芋粕菊粉在改善胃内容物残留率和胃肠激素水平、肠道菌群紊乱和/或氧化应激水平的保健品中应用。
下面结合实施例对本发明提供的一种改善功能性消化不良的菊芋粕菊粉及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)菊芋菊粉工业化生产过程中产生的菊芋粕，经食品破碎机(生产厂家：成洵实业有限公司，型号：CXP-DJ-S-5T)破碎；
(2)按照料液比1:10(g/mL)，加入含有糖苷酶(酶底比分别为果胶酶3U/g、纤维素酶5U/g、半纤维素酶10U/g、木聚糖酶的比例为5U/g)的缓冲盐溶液(柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，0.01mol/L，pH 4.0)，在45℃提取3h；
(3)提取液经超滤除去蛋白质、果胶等大分子杂质(膜分离设备：RNF-0460型，超滤膜截留分子量20000Da，膜面积0.2m2，厦门福美科技有限公司；操作压差1.0Mpa，循环流量2L/min)，得到菊芋粕菊粉粗提液；
(4)菊芋粕菊粉粗提液，采用阴阳离子交换树脂进行脱盐纯化处理(强酸性阳离子交换树脂：强碱性阴离子交换树脂的体积比为1:1，离子树脂与菊芋粕菊粉粗提液的体积比为1:1，树脂处理时间为60min，获得脱盐菊芋粕菊粉提取液；
(5)脱盐菊芋粕菊粉提取液，采用超滤除去单糖、寡糖等小分子杂质(膜分离设备：RNF-0460型，超滤膜截留分子量1000Da，膜面积0.2m2，厦门福美科技有限公司；操作压差1.0Mpa，循环流量2L/min)，得到菊芋粕菊粉提取液；
(6)将经过纯化后的菊糖溶液经喷雾干燥(进口温度185℃，出口温度85℃，进料速度800L/h)处理后，得到菊芋粕菊粉产品。
实施例2
(1)菊芋菊粉工业化生产过程中产生的菊芋粕，经食品破碎机(生产厂家：成洵实业有限公司，型号：CXP-DJ-S-5T)破碎；
(2)按照料液比1:30(g/mL)，加入含有糖苷酶(酶底比分别为果胶酶20U/g、纤维素酶5U/g、半纤维素酶30U/g、木聚糖酶的比例为20U/g)的缓冲盐溶液(柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，0.5mol/L，pH 5.5)，在55℃提取1h；
(3)提取液经超滤除去蛋白质、果胶等大分子杂质(膜分离设备：RNF-0460型，超滤膜截留分子量20000Da，膜面积0.2m2，厦门福美科技有限公司；操作压差1.0Mpa，循环流量2L/min)，得到菊芋粕菊粉粗提液；
(4)菊芋粕菊粉粗提液，采用阴阳离子交换树脂进行脱盐纯化处理(强酸性阳离子交换树脂：强碱性阴离子交换树脂的体积比为1:2，离子树脂与菊芋粕菊粉粗提液的体积比为1:1.5，树脂处理时间为90min，获得脱盐菊芋粕菊粉提取液；
(5)脱盐菊芋粕菊粉提取液，采用超滤除去单糖、寡糖等小分子杂质(膜分离设备：RNF-0460型，超滤膜截留分子量1000Da，膜面积0.2m2，厦门福美科技有限公司；操作压差1.0Mpa，循环流量2L/min)，得到菊芋粕菊粉提取液；
(6)将经过纯化后的菊糖溶液经喷雾干燥(进口温度195℃，出口温度95℃，进料速度1000m L/h)处理后，得到菊芋粕菊粉产品。
实施例3
(1)菊芋菊粉工业化生产过程中产生的菊芋粕，经食品破碎机(生产厂家：成洵实业有限公司，型号：CXP-DJ-S-5T)破碎；
(2)按照料液比1:20(g/mL)，加入含有糖苷酶(酶底比分别为果胶酶15U/g、纤维素酶10U/g、半纤维素酶20U/g、木聚糖酶的比例为15U/g)的缓冲盐溶液(柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，0.1mol/L，pH 5)，在50℃提取2h；
(3)提取液经超滤除去蛋白质、果胶等大分子杂质(膜分离设备：RNF-0460型，超滤膜截留分子量20000Da，膜面积0.2m2，厦门福美科技有限公司；操作压差1.0Mpa，循环流量2L/min)，得到菊芋粕菊粉粗提液；
(4)菊芋粕菊粉粗提液，采用阴阳离子交换树脂进行脱盐纯化处理(强酸性阳离子交换树脂：强碱性阴离子交换树脂的体积比为1:1.5，离子树脂与菊芋粕菊粉粗提液的体积比为1:1.2，树脂处理时间为75min，获得脱盐菊芋粕菊粉提取液；
(5)脱盐菊芋粕菊粉提取液，采用超滤除去单糖、寡糖等小分子杂质(膜分离设备：RNF-0460型，超滤膜截留分子量1000Da，膜面积0.2m2，厦门福美科技有限公司；操作压差1.0Mpa，循环流量2L/min)，得到菊芋粕菊粉提取液；
(6)将经过纯化后的菊糖溶液经喷雾干燥(进口温度190℃，出口温度90℃，进料速度900m L/h)处理后，得到菊芋粕菊粉产品。。
实施例4
(1)菊芋菊粉工业化生产过程中产生的菊芋粕，经食品破碎机(生产厂家：成洵实业有限公司，型号：CXP-DJ-S-5T)破碎；
(2)按照料液比1:15(g/mL)，加入含有糖苷酶(酶底比分别为果胶酶12U/g、纤维素酶12U/g、半纤维素酶15U/g、木聚糖酶的比例为10U/g)的缓冲盐溶液(柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，0.25mol/L，pH 4.0-5.5)，在48℃提取1.5h；
(3)提取液经超滤除去蛋白质、果胶等大分子杂质(膜分离设备：RNF-0460型，超滤膜截留分子量20000Da，膜面积0.2m2，购自厦门福美科技有限公司；操作压差1.0Mpa，循环流量2L/min)，得到菊芋粕菊粉粗提液；
(4)菊芋粕菊粉粗提液，采用阴阳离子交换树脂进行脱盐纯化处理(强酸性阳离子交换树脂：强碱性阴离子交换树脂的体积比为1:1.2，离子树脂与菊芋粕菊粉粗提液的体积比为1:1.4，树脂处理时间为88min，获得脱盐菊芋粕菊粉提取液；
(5)脱盐菊芋粕菊粉提取液，采用超滤除去单糖、寡糖等小分子杂质(膜分离设备：RNF-0460型，超滤膜截留分子量1000Da，膜面积0.2m2，购自厦门福美科技有限公司；操作压差1.0Mpa，循环流量2L/min)，得到菊芋粕菊粉提取液；
(6)将经过纯化后的菊糖溶液经喷雾干燥(进口温度188℃，出口温度92℃，进料速度920m L/h)处理后，得到菊芋粕菊粉产品。
实施例5
(1)菊芋菊粉工业化生产过程中产生的菊芋粕，经食品破碎机(生产厂家：成洵实业有限公司，型号：CXP-DJ-S-5T)破碎；
(2)按照料液比1:25(g/mL)，加入含有糖苷酶(酶底比分别为果胶酶18U/g、纤维素酶8U/g、半纤维素酶26U/g、木聚糖酶的比例为16U/g)的缓冲盐溶液(柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，0.02mol/L，pH 4.0～5.5)，在52℃提取2.5h；
(3)提取液经超滤除去蛋白质、果胶等大分子杂质(膜分离设备：RNF-0460型，超滤膜截留分子量20000Da，膜面积0.2m2，厦门福美科技有限公司；操作压差1.0Mpa，循环流量2L/min)，得到菊芋粕菊粉粗提液；
(4)菊芋粕菊粉粗提液，采用阴阳离子交换树脂进行脱盐纯化处理(强酸性阳离子交换树脂：强碱性阴离子交换树脂的体积比为1:1.8，离子树脂与菊芋粕菊粉粗提液的体积比为1:1.4，树脂处理时间为73min，获得脱盐菊芋粕菊粉提取液；
(5)脱盐菊芋粕菊粉提取液，采用超滤除去单糖、寡糖等小分子杂质(膜分离设备：RNF-0460型，超滤膜截留分子量1000Da，膜面积0.2m2，厦门福美科技有限公司；操作压差1.0Mpa，循环流量2L/min)，得到菊芋粕菊粉提取液；
(6)将经过纯化后的菊糖溶液经喷雾干燥(进口温度192℃，出口温度91℃，进料速度890m L/h)处理后，得到菊芋粕菊粉产品。
比较例1
传统热水浸提法的提取条件：提取液为水，料液比1:20(g/mL)，提取时间2h，提取温度80℃。其提取液的纯化和干燥过程与本专利所述方法相同。
实施例6
将实施例1～5制备的菊芋粕菊粉和对比例1制备的菊芋粕菊粉为对象，测定菊粉得率、总糖含量、蔗果五糖及以上聚合度的果聚糖含量、蛋白质含量、糖醛酸含量和果聚糖中果糖残基的构型和糖苷键类型。
菊粉得率按照式(1)计算：
菊粉得率(％)＝(总糖含量-还原糖含量)/菊芋粕质量×100％式(1)
其中，总糖含量以果糖为标准品采用苯酚-硫酸法测定，还原糖含量以葡萄糖为标准品采用二硝基水杨酸(DNS)法测定。
总糖含量测定：果糖为标准单糖，测定方法：Dubois M,Gilles KA,Hamilton JK,et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry，1956，28：350-356。
蔗果五糖及以上聚合度的果聚糖含量测定方法：Fu Q,Liang T,Zhang X,etal.Carbohydrate separation by hydrophilic interaction liquid chromatographyon a'click'maltose column[J].Carbohydrate Research,2010,345:2690-2697。
蛋白质含量测定方法：Sedmark JJ，Grossberg SE.Arapid，sensitive，andversatile assay forprotein using Coomassie brilliant blue G250[J].Analytical Biochemistry，1979，79：544-552)
糖醛酸含量测定方法：BlumenkrantzN,Asboe-Hansen G.New method forquantitative determination ofuronic acids.[J].Analytical Biochemistry,1973,54:484-489。
果聚糖中果糖残基的构型和糖苷键类型的测定方法：Bi H,Gao T,Liu D,etal.Structures of(1→6)-β-D-glucans from Bulgaria inquinans(Fries)and theirimmunological activities[J].Carbohydrate Polymers.2013,93:547-552。
菊芋粕菊粉的得率结果见表1。由表1可知，与传统热水浸提法相比，本专利所述菊芋粕菊粉提取方法的菊粉得率提高24.58～39.74％。
表1传统热水浸提与本专利制备方法的菊芋粕菊粉的得率比较
Figure BDA0002312620210000111
Figure BDA0002312620210000121
菊芋粕菊粉的组成结果见表2。由表2可知，与传统热水浸提法相比，所述菊芋粕菊粉的纯度提高了2.4％～5.2％，总糖含量提高了3.9％～7.7％，菊粉中蔗果五糖及以上聚合度的果聚糖含量提高了3.7％～6.9％。
表2传统热水浸提与本发明制备方法的菊芋粕菊粉的组成比较
Figure BDA0002312620210000122
实施例7
以实施例1～5制备的菊芋粕菊粉产品与市售菊粉(
Figure BDA0002312620210000123
HIS Inulin powder，batchnumber:RHWCJ8ACJ8)为对象，测定总抗氧化能力。总抗氧化能力测定方法：分别于1.5mL EP管中加入400μL 5mM/LABTS溶液、250μL1.0 uM/L HRP溶液、10μL6.0 mM H2O2溶液，340μL 50mM/LpH7.5磷酸缓冲液，混合溶液总体积1mL，其中包括2mMABTS，15μM H2O2，0.25μMHRP；再加入10μL待测样品溶液，测试温度为25℃；涡旋10s，将反应液转移至比色皿中，黑暗条件静置10min，读取730nm光吸收数值。样品总抗氧化能力以Trolox当量(每克样品相当于x毫克水溶性维生素E，TEAC(mgTE/g)表示结果。
表3市售菊粉与本发明制备方法的菊芋粕菊粉的总抗氧化能力比较
市售菊粉 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
TEAC(mgTE/g) 2.53±0.24 3.82±0.29 3.69±0.16 3.94±0.31 3.72±0.23 3.85±0.33
结果见表3。由表3可知，与市售菊粉相比，总抗氧化能力(TEAC值)提高45.85～55.73％。
实施例8
实施例1～5制备的菊芋粕菊粉改善FD大鼠胃内容物残留率和胃肠激素水平方面的影响
功能性消化不良(FD)大鼠模型的建立：SD雄性大鼠54只，称重后随机分为9组：空白对照组(C)、模型组(M)、多潘立酮组(D)、多潘立酮+市售菊粉(D+市售菊粉)、多潘立酮+实施例1所得菊粉(D+实施例1)、多潘立酮+实施例2所得菊粉(D+实施例2)、多潘立酮+实施例3所得菊粉(D+实施例3)、多潘立酮+实施例4所得菊粉(D+实施例4)、多潘立酮+实施例5所得菊粉(D+实施例5)，除空白组外其余各组按文献所述稍加改良后造模(郭海军等，2000)，在给予夹尾刺激同时单日正常饮食双日禁食，各药物采用蒸馏水溶解，给药体积为10mL/kg，每日一次，给药时间为15天，具体处理如下表4。
表4实验分组
Figure BDA0002312620210000131
Figure BDA0002312620210000141
胃排空速度测定：各组大鼠于实验结束后禁食不禁水12h，并给每只大鼠灌胃3mL0.1％甲基橙溶液，10min后5％水合氯醛麻醉大鼠，心脏采血；并迅速打开腹腔取下整胃，沿胃大弯剪开，5mL生理盐水充分冲洗胃内容物于试管中，用5％碳酸氢钠溶液调pH值至6～6.5后定容至10mL，3000r/min离心10min取上清液；另以3mL 0.1％甲基橙溶液加7mL生理盐水混匀，离心取上清液作为标准液；420nm处测定吸光度，并按照下列公式计算出各组大鼠胃中甲基橙残留率：胃中甲基橙含有率(％)＝胃中甲基橙吸光度/标准液甲基橙吸光度×100％。(参见曹峰等，2009；QIU X J等，2011)
MTL、Gas、Gherlin、5-HT含量测定：血浆样本处理：选择乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)作为抗凝剂，将血液置于含有抗凝剂的采血管中混匀，并在4℃下，以3000r/min离心20min，收集上清即为待测血浆。血清样本处理：采血得到血液后静置使其自然凝固，在4℃下，以3000r/min离心20min，收集上清即为待测血清。MTL、Gas、Gherlin、5-HT含量测定采用酶联免疫双抗体夹心法，具体操作步骤按试剂盒说明进行。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，汇出标准曲线的直线回归方程，根据样品的OD值计算出相应的样品浓度，再乘以稀释倍数，计算含量。
表5市售菊粉与本专利制备方法的菊芋粕菊粉与多潘立酮联合给药的对FD大鼠的胃排空率、MTL、Gherlin、Gas、5-HT含量的影响比较
Figure BDA0002312620210000142
Figure BDA0002312620210000151
实施例1～5制备的菊芋粕菊粉改善FD大鼠胃内容物残留率和胃肠激素水平方面的效果更显著：与市售菊芋菊粉相比，本发明制备的菊粉实验组的胃排空速度增加9.47～18.39％，MTL含量增加14.60～25.70％，Gerlin含量降低1.22～2.43％，Gas含量降低4.21～7.62％，5-HT含量降低3.84～5.46％。
实施例9
肠道菌群多样性实验方法
1.样本收集
1)准备材料棉花、酒精、镊子、无菌冻存管、记号笔、一次性PE及橡胶手套、大小不同的自封袋、液氮少许。
2)①在解剖室找到尽量洁净的工作台面并用酒精擦拭，尽量避免外源细菌污染；②标记冻存管及自封袋编号；③腹部按摩(或倒悬)大鼠，使其在工作台面排便并装进无菌冻存管，迅速放入液氮中，样品采集2h内保存到-80℃冰箱备用；④酒精擦拭工作台面，继续取样；
2.DNA抽提和PCR扩增
根据
Figure BDA0002312620210000152
soil试剂盒(OmegaBio-tek,Norcross,GA,U.S.)说明书进行总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；用338F-5’-actcctacgggaggcagcag-3’(SEQ ID No.1)，806R 5’-ggactachvgggtwtctaat-3’(SEQ ID No.2)引物对V3-V4可变区进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性3min，27个循环(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s)，最后72℃延伸10min(PCR仪：ABI
Figure BDA0002312620210000161
9700型)。扩增体系为20μl，4μl 5*FastPfu缓冲液，2μl2.5mM dNTPs，0.8μl引物(5μM)，0.4μlFastPfu聚合酶；10ng DNA模板。
3.IlluminaMiseq测序
使用2％琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNAGel Extraction Kit(AxygenBiosciences,Union City,CA,USA)进行纯化，Tris-HCl洗脱，2％琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST(Promega,USA)进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台(Illumina,SanDiego,USA)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2*300的文库。
构建文库步骤:(1)连接“Y”字形接头；(2)使用磁珠筛选去除接头自连片段；(3)利用PCR扩增进行文库模板的富集；(4)氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。利用Illumina公司的MiseqPE300平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。
4.数据处理
原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，使用FLASH软件进行拼接：
(1)设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，去除质控后长度低于50bp的序列；
(2)barcode需精确匹配，引物允许2个碱基的错配，去除模糊碱基；
(3)根据重叠碱基overlap将两端序列进行拼接，overlap需大于10bp，去除无法拼接的序列；使用的UPARSE软件(version 7.1http://drive5.com/uparse/)，根据97％的相似度对序列进行OTU聚类；使用UCHIME软件剔除嵌合体。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库(SSU123)，设置比对阈值为70％。
表6市售菊粉与实施例1～5制备的菊芋粕菊粉与多潘立酮联合给药的对FD大鼠的肠道菌群多样性Chao、ACE、Shannon和Simpson指数的影响比较
Chao指数 ACE指数 Shannon指数 Simpson指数
空白组 622±32 674±53 0.035±0.006 4.1±0.1
模型组 831±54 769±41 0.072±0.003 2.5±0.9
多潘立酮组 716±21 742±38 0.021±0.011 4.9±0.2
市售菊粉+多潘立酮 652±27 667±33 0.042±0.012 3.9±0.2
实施例1菊粉+多潘立酮 603±18 642±35 0.033±0.007 4.2±0.2
实施例2菊粉+多潘立酮 610±24 637±42 0.031±0.005 4.3±0.1
实施例3菊粉+多潘立酮 593±38 632±30 0.027±0.009 4.5±0.2
实施例4菊粉+多潘立酮 599±31 646±28 0.029±0.009 4.4±0.2
实施例5菊粉+多潘立酮 607±26 639±39 0.030±0.008 4.2±0.1
结果如表6所示，市售菊粉和实施例1～5获得的菊粉均能降低FD大鼠的肠道菌群丰富度Chao和ACE指数，降低菌群均匀度Shannon指数，升高菌群均匀度Simpson指数。与市售菊粉相比，实施例1～5制备的菊芋粕菊粉缓解FD大鼠肠道菌群紊乱的能力更强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院西北高原生物研究所
<120> 一种改善功能性消化不良的菊芋粕菊粉及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actcctacgg gaggcagcag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggactachvg ggtwtctaat 20

Claims (8)

1.一种菊芋粕菊粉在制备改善胃内容物残留率和胃肠激素水平的保健品中的应用，所述菊芋粕菊粉的制备方法包括以下步骤：
1)将菊芋粕粉末和含有糖苷酶的缓冲液混合，酶解提取，得到提取液；所述糖苷酶由果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和木聚糖酶组成；所述菊芋粕粉末的质量和果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和木聚糖酶的活力比依次为1g:3～20U:5～15U:10～30U:5～20U；
2)将所述提取液经超滤去除蛋白质和果胶大分子杂质，得到菊芋粕菊粉粗提液；
3)将所述菊芋粕菊粉粗提液进行脱盐纯化处理，得到脱盐菊芋粕菊粉提取液；
4)将所述脱盐菊芋粕菊粉提取液进行二次超滤除去单糖和寡糖小分子杂质，干燥，得到菊芋粕菊粉；
步骤2)中所述超滤用超滤膜的截留分子量为20000Da；
步骤3)中所述脱盐纯化处理为采用阴阳离子交换树脂进行，具体采用强酸性阳离子交换树脂和强碱性阴离子交换树脂，强酸性阳离子交换树脂：强碱性阴离子交换树脂的体积比为1:1～2；
步骤4)中所述二次超滤用超滤膜截留分子量为1000Da。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1)中所述含有糖苷酶的缓冲液以0.01～0.5mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液为溶剂。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，步骤1)中所述菊芋粕粉末的质量和含有糖苷酶的缓冲液的体积比为1g:10～30mL；
所述酶解提取的温度为45～55℃，所述酶解提取的时间为1～3h。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述超滤用超滤膜的膜面积0.2m2；超滤操作时压差为1.0Mpa，循环流量为2L/min。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤3)中离子树脂的总体积和菊芋粕菊粉粗提液的体积比为1:1～1.5；所述脱盐纯化处理的时间为60～90min。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤4)中所述二次超滤的超滤膜膜面积0.2m2，操作压差为1.0Mpa，循环流量为2L/min；
所述干燥为喷雾干燥；所述喷雾干燥的进口温度185～195℃，出口温度85～95℃，进料速度800～1000mL/h。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述菊芋粕菊粉的纯度≥91％；总糖含量≥93％，其中蔗果五糖及以上聚合度的果聚糖含量≥75.64％；
糖醛酸含量＜0.34％；及
蛋白质含量＜0.61％。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述菊芋粕菊粉的总抗氧化能力以TEAC表示；所述TEAC为每克菊芋粕菊粉样品相当于x毫克水溶性维生素E；菊芋粕菊粉的总抗氧化能力为3.56～4.25mgTE/g。
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