CN112048534B - 一种具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物及其制备方法 - Google Patents

一种具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物及其制备方法。该制备方法包括将马鲛鱼肉打浆、蛋白酶酶解、低温高速离心、离子交换色谱纯化、尺寸排阻色谱纯化及冷冻干燥等工艺，得到一种具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物。该水解物多肽含量＞70％(质量百分比)，对白藜芦醇的活性提高程度＞20％。本发明提供的制备工艺简单，整个工艺流程均可达食品级要求，可应用于药品、保健品和食品等领域当中。

Description

一种具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物及其制 备方法
技术领域
本发明属于马鲛鱼深加工、高值化领域，具体涉及一种具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物及其制备方法。
背景技术
马鲛鱼(Scomberomorus niphonius)，隶属于鲈形目(Perciformes)，鲭科(Scombridae)，马鲛属(Scomberomorus)，亦称蓝点马鲛鱼、鲅鱼、竹鲛等,是一种温性中上层鱼类，其广泛分布于太平洋西北部，在我国渤海、东海以及日本诸岛等海域是重要的捕捞经济鱼类。马鲛鱼胆固醇含量低，含有丰富的蛋白质及不饱和脂肪酸，并含有多种维生素，可用于加工鱼油，对治疗贫血、早衰、营养不良、产后虚弱和神经衰弱等症有一定辅助疗效。马鲛鱼肉鱼腥味较大，肉质偏酸且口感粗糙，不适合加工，国内对其利用大部分停留在冻品、鲜销或者加工成饲料，其蛋白质资源未得到充分利用，属高产低值化海洋鱼类。
多酚在膳食中广泛存在，并且呈现出多种生理活性，例如抗癌、抗菌、抗氧化、降血压、降血糖等，但多酚所发挥的的生物活性与其生物利用度息息相关。由于多酚溶解性较差，以及胃肠道消化酶和外排转运蛋白的存在，所以多酚生物利用度较差。目前，提高多酚生物利用度的方法主要通过以下三种方式。其一，改变剂型，利用新型的运载系统(微乳、纳米颗粒、脂质体等)提高多酚的水溶性或消化稳定性，从而提高多酚在小肠的吸收率。其二，采用乙酰化、糖基化等方式对多酚的化学结构进行修饰，提高多酚的水溶性以及与转运蛋白相结合的能力。其三，将多酚类物质与其他食物成分进行复配。但很少有通过交互作用提高多酚生物利用率的研究。
Zhao等利用5种酶分别水解马鲛鱼肉并在体外模拟胃肠道消化，然后使用超滤和多种色谱法从蛋白质水解物中分离并鉴定出4条抗氧化肽：Pro-Glu-Leu-Asp-Trp(PELDW)，Trp-Pro-Asp-His-Trp(WPDHW)和Phe-Gly-Tyr-Asp-Trp-Trp(FGYDWW)，和Tyr-Leu-His-Phe-Trp(YLHFW)。Xiong等人利用碱性蛋白酶处理马鲛鱼肉得到了具有抗氧化功能的蛋白水解物，蛋白质水解物对羟基和超氧化物自由基清除性能分别为53.11％和23.1％，并且它们的还原能力随着水解产物中肽含量的增加而增加。Zhang等人从马鲛鱼皮中分离得到了胶原蛋白，并制备了平均分子量为5.04-47.82kDa的七个胶原蛋白水解产物组分，结果发现分子量最小的组分(5.04kDa)具有最高的自由基清除活性。刘哲以血管紧张素转化酶(ACE)抑制率为指标，筛选出了从马鲛鱼鱼肉中酶法制备ACE抑制肽的最佳工艺，经超滤及RP-HPLC纯化后，鉴定出一条IC50值为0.0038mg/mL的三肽：Ile-Tyr-Pro。此外，张宝林以ACE抑制率为指标，采用单因素实验，筛选出了从马鲛鱼鱼骨中酶法制备ACE抑制肽的最佳工艺。
然而，对于马鲛鱼蛋白水解物提高白藜芦醇功效的活性尚未有相关的报道。
与大多数多酚相同，白藜芦醇生物利用度不高，当前通常采用改变剂型的方式提高白藜芦醇生物利用度，LóPEZ-NICOLáS等通过环糊精包埋，提高了白藜芦醇水溶性及稳定性从而提高其生物利用度，但是环糊精可能会使白藜芦醇的生物活性降低。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物及其制备方法。
本发明提供了一种具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物的制备方法，能够得到一种具有潜在提高多酚生物利用度活性的马鲛鱼蛋白水解物。该水解物多肽含量＞70％(质量百分比)，通过体外验证具有良好的提高白藜芦醇功效的活性。本发明提供的制备方法，工艺简单，整个工艺流程均可达食品级要求，可应用于药品、保健品和食品等领域当中。
本发明提供了一种马鲛鱼蛋白水解物的制备方法，体外验证该水解物具有提高白藜芦醇功效的活性。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的一种具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物的制备方法，包括：以马鲛鱼肉为原料，采用打浆、蛋白酶酶解、低温高速离心、离子交换色谱纯化、尺寸排阻色谱纯化及冷冻干燥等工艺，得到一种具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物。该水解物多肽含量＞70％(质量百分比)，对白藜芦醇的活性提高程度＞20％。
本发明提供的一种具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：
(1)打浆：将鲜活马鲛鱼去头去尾去骨去内脏后，与适量碎冰混合，在绞肉机中打浆，得到马鲛鱼肉糜；
(2)蛋白酶酶解：将马鲛鱼肉糜与水混合均匀，形成混悬液1，在混悬液1中加入蛋白酶进行恒温酶解反应，得到混悬液2；
(3)低温离心处理：加热混悬液2，冷却至室温后，低温离心处理，取上清液，得到提取液1；
(4)离子交换色谱纯化：利用离子交换树脂填料过滤分离提取液1，取滤液，得到提取液2；
(5)尺寸排阻色谱纯化：使用葡聚糖凝胶填料过滤分离步骤(4)所述提取液2，得到提取液3；
(6)冷冻干燥：对提取液3进行冷冻干燥，得到所述具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物。
进一步地，步骤(1)所述碎冰的质量为马鲛鱼肉质量的5-10％。
进一步地，步骤(2)所述马鲛鱼肉糜与水的料液比为1:5-1:20(g/mL)；所述水的pH值为7.0-10.0。
进一步地，步骤(2)所述蛋白酶为碱性蛋白酶；所述蛋白酶的加入量为2000-5000U/g。
进一步地，步骤(2)所述恒温酶解反应的温度为45-55摄氏度，恒温酶解反应的时间为3-6h。
进一步地，步骤(3)所述加热的温度为90-100摄氏度，加热的时间为10-15min。
进一步地，步骤(3)所述低温离心处理的温度为4-10摄氏度，所述低温离心处理的转速为8000-10000rpm，所述低温离心处理的时间为10-15min。
进一步地，步骤(4)所述离子交换树脂填料为DEAE-纤维素(52)。
进一步地，步骤(4)所述葡聚糖凝胶填料为Sephadex G-15。
进一步地，步骤(6)得到的马鲛鱼蛋白水解物多肽含量＞70％(质量百分比)，对白藜芦醇的活性提高程度＞20％。
本发明提供一种由上述的制备方法制得的具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物是一种含马鲛鱼小分子活性物质的马鲛鱼蛋白水解物，其具有良好提高白藜芦醇功效的活性，该提取物多肽含量＞70％(质量百分比)，对白藜芦醇的活性提高程度＞20％。
(2)本发明提供的制备工艺流程均可达食品级要求。
(3)本发明提供的具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物，经过体外验证具有良好的提高白藜芦醇功效活性，可用于制备提高多酚生物利用度的保健品或辅助性治疗药物。
附图说明
图1为实施例1-4所得具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物(经离子交换树脂填料分离)的洗脱曲线。
图2为实施例1-4所得具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物(经离子交换树脂填料分离)对白藜芦醇功效的提升活性柱状图。
图3为实施例1-4所得具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物二次洗脱(先经离子交换树脂填料分离后经葡聚糖凝胶填料分离)的曲线。
图4为实施例1-4所得具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物经一次洗脱和二次洗脱后的产物对白藜芦醇功效的提升活性柱状图。
具体实施方式
以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
用绞肉机将添加10％碎冰的马鲛鱼肉打成肉糜，得到马鲛鱼肉糜，按照1:5(g/mL)的料液比加入去离子水，其中马鲛鱼肉糜的质量为10g，去离子水的体积为50mL，pH值为7，形成混悬液1。在混悬液1中加入2000U/g的碱性蛋白酶，在45℃恒温条件下进行酶解反应，酶解时间为6h，得到混悬液2。然后加热混悬液2，加热的温度为90℃，加热的时间为15min，冷却至室温后，在4℃低温条件下进行离心处理，离心处理的转速为8000rpm，离心处理的时间为15min，取上清液，得到提取液1。采用DEAE-纤维素(52)分离提取液1，得到提取液2。使用Sephadex G-15分离所述提取液2，得到提取液3。对提取液3进行冷冻干燥，得到所述具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物(多肽含量为71.88％)。MTT法测定，马鲛鱼水解物对白藜芦醇的活性提高程度为21.7％。
实施例2
用绞肉机将添加8％碎冰的马鲛鱼肉打成肉糜，得到马鲛鱼肉糜，按照1:10(g/mL)的料液比加入去离子水，其中马鲛鱼肉糜的质量为10g，去离子水的体积为100mL，pH值为8，形成混悬液1。在混悬液1中加入3000U/g的碱性蛋白酶，在50℃恒温条件下进行酶解反应，酶解时间为4h，得到混悬液2。然后加热混悬液2，加热的温度为95℃，加热的时间为10min，冷却至室温后，在7℃低温条件下进行离心处理，离心处理的转速为8000rpm，离心处理的时间为15min，取上清液，得到提取液1。采用DEAE-纤维素(52)分离提取液1，得到提取液2。使用Sephadex G-15分离所述提取液2，得到提取液3。对提取液3进行冷冻干燥，得到所述具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物(多肽含量为73.86％)。MTT法测定，马鲛鱼水解物对白藜芦醇的活性提高程度为23.1％。
实施例3
用绞肉机将添加8％碎冰的马鲛鱼肉打成肉糜，得到马鲛鱼肉糜，按照1:15(g/mL)的料液比加入去离子水，其中马鲛鱼肉糜的质量为10g，去离子水的体积为150mL，pH值为9，形成混悬液1。在混悬液1中加入4000U/g的碱性蛋白酶，在55℃恒温条件下进行酶解反应，酶解时间为5h，得到混悬液2。然后加热混悬液2，加热的温度为100℃，加热的时间为10min，冷却至室温后，在10℃低温条件下进行离心处理，离心处理的转速为10000rpm，离心时间为10min，取上清液，得到提取液1。采用DEAE-纤维素(52)分离提取液1，得到提取液2。使用Sephadex G-15分离所述提取液2，得到提取液3。对提取液3进行冷冻干燥，得到所述具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物(多肽含量为71.25％)。MTT法测定，马鲛鱼水解物对白藜芦醇的活性提高程度为19.8％。
实施例4
用绞肉机将添加5％碎冰的马鲛鱼肉打成肉糜，得到马鲛鱼肉糜，按照1:20(g/mL)的料液比加入去离子水，其中马鲛鱼肉糜的质量为10g，去离子水的体积为200mL，pH值为10，形成混悬液1。在混悬液1中加入5000U/g的碱性蛋白酶，在50℃恒温条件下进行酶解反应，酶解时间为6h，得到混悬液2。然后加热混悬液2，加热的温度为100℃，加热的时间为10min，冷却至室温后，在10℃低温条件下进行离心处理，离心处理的转速为10000rpm，离心时间为10min，取上清液，得到提取液1。采用DEAE-纤维素(52)分离提取液1，得到提取液2。使用Sephadex G-15分离所述提取液2，得到提取液3。对提取液3进行冷冻干燥，得到所述具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物(多肽含量为72.21％)。MTT法测定，马鲛鱼水解物对白藜芦醇的活性提高程度为20.3％。
实施效果测试：
检测实施例1-4制得的马鲛鱼蛋白水解物进行体外白藜芦醇的提高活性。
(1)检测原理
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。
(2)检测步骤
将生长状态良好的B16细胞进行消化、离心、重悬、计数和稀释后，以8-10×104个/mL的密度接种于96孔细胞板中央的60孔上，每孔100μL，边缘孔添加PBS缓冲液(0.01mol/L)以防污染。将96孔板置于恒温培养箱中培养24h，待细胞完全贴壁后，空白组加入100μL新鲜的完全培养基，样品组加入100μL稀释三倍后的马鲛鱼蛋水解物与白藜芦醇混合物的模拟胃肠消化上清液。将96孔板继续在恒温培养箱中培养24h后，每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h后，取出96孔板，吸去上清培养液，每孔重新加入150μL DMSO溶液以溶解甲瓒结晶，振板后采用全功能微孔板检测酶标仪于490nm处检测吸光度值。以稀释三倍后的模拟胃肠消化上清液作为空白对照，以消除消化液带来的影响，以单独的白藜芦醇的模拟胃肠消化上清液作为阳性对照。样品组吸光度值与空白对照组吸光度值的比值即为B16细胞存活率。
实验结果分析
1.离子交换色谱纯化实验结果分析：
以DEAE-纤维素(52)分别对实施例1-4得到的具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物进行初级纯化，称量马鲛鱼蛋白水解物，用蒸馏水完全溶解，加样。加样结束后以浓度为0、0.01、0.05、0.1mol/L的NaCl溶液为洗脱液，分步收集洗脱液，各管洗脱液经20倍稀释后于214nm下检测其吸光值，并绘制洗脱曲线，洗脱曲线如图1所示，最终得到3个实施例的洗脱组分。分别收集这5个洗脱峰组分，分别记为SHa、SHb、SHc、SHd、SHe，其中SHa含量最高。如图2所示为SHa对白藜芦醇活性提高程度。因此，选择SHa组分进行下一步Sephadex G-15凝胶纯化。
2.凝胶色谱纯化实验结果分析：
将SHa通过Sephadex G-15凝胶柱层析进行进一步的纯化，检测洗脱液在214nm波长下的吸光值(测定前将洗脱液稀释20倍)，收集洗脱组分，洗脱曲线如图3所示。如图4所示为SHa1、SHa2、SHa3、SHa4四种组分对白藜芦醇活性提高程度，结果显示SHa1活性最高。
本发明实施例可见，整个制备工艺流程简单、各环节均可达食品级要求，制备成本低。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种马鲛鱼蛋白水解物的制备方法在提高白藜芦醇功效活性的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）打浆：将马鲛鱼去头去尾去骨去内脏后，与碎冰混合，打浆，得到马鲛鱼肉糜；
（2）蛋白酶酶解：将马鲛鱼肉糜与水混合均匀，形成混悬液1，在混悬液1中加入碱性蛋白酶2000-5000 U/g进行恒温酶解反应，得到混悬液2；
（3）低温离心处理：加热混悬液2，冷却至室温后，低温离心处理，取上清液，得到提取液1；
（4）离子交换色谱纯化：利用离子交换树脂填料DEAE-纤维素过滤分离提取液1，取滤液，得到提取液2；
（5）尺寸排阻色谱纯化：使用葡聚糖凝胶填料Sephadex G-15过滤分离步骤（4）所述提取液2，得到提取液3；
（6）冷冻干燥：对提取液3进行冷冻干燥，得到具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物。
2.根据权利要求1所述的一种马鲛鱼蛋白水解物的制备方法在提高白藜芦醇功效活性的应用，其特征在于，步骤（1）所述碎冰的质量为马鲛鱼肉质量的5-10%。
3.根据权利要求1所述的一种马鲛鱼蛋白水解物的制备方法在提高白藜芦醇功效活性的应用，其特征在于，步骤（2）所述马鲛鱼肉糜与水的料液比为1:5-1:20g/mL；所述水的pH值为7.0-10.0。
4.根据权利要求1所述的一种马鲛鱼蛋白水解物的制备方法在提高白藜芦醇功效活性的应用，其特征在于，步骤（2）所述恒温酶解反应的温度为45-55摄氏度，恒温酶解反应的时间为3-6h。
5.根据权利要求1所述的一种马鲛鱼蛋白水解物的制备方法在提高白藜芦醇功效活性的应用，其特征在于，步骤（3）所述加热的温度为90-100摄氏度，加热的时间为10-15min。
6.根据权利要求1所述的一种马鲛鱼蛋白水解物的制备方法在提高白藜芦醇功效活性的应用，其特征在于，步骤（3）所述低温离心处理的温度为4-10摄氏度，所述低温离心处理的转速为8000-10000rpm，所述低温离心处理的时间为10-15min。
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