CN114732835B - 一种多效性红藻全质提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多效性红藻全质提取物，有效解决现有技术存在的藻体利用率低、核心成分转化率低等问题，并提供适于工业生产的制备方法。本发明综合利用物理溶胀、特异性酶多点切割技术，实现快速破壁，减少胞壁和胞质的传质阻力，促进红藻胞内成分释放，提高藻体成分提取率和转化率，实现红藻全质提取与转化；过程易控，成本低，利于工业化生产。本发明所述红藻全质提取物具有抗氧化、免疫增强、促进益生菌生长、调节肠道菌群等多重功效，综合改善亚健康状态；可单独或作为组件，广泛应用于药物、特殊医学用途配方食品、特殊营养配方食品、保健食品、食品或食品添加剂，拓展红藻在保健食品和医药产业的应用范围，提高红藻产品附加值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种多效性红藻全质提取物及其制备方法和应用。
背景技术
红藻是我国主要经济藻类之一，多产于我国江苏、福建、辽宁沿海，其中养殖品种主要是紫菜属(Porphyra)和江篱属(Gracilaria)的坛紫菜（Porphyra haitanensis）、条斑紫菜（Porphyra yezoensis）和龙须菜（Gracilariopsis lemaneiformis）等。我国紫菜产量同日本、韩国并列为世界三大紫菜养殖国。目前我国紫菜产品长期以来停留在干紫菜制品和烤紫菜制品的阶段，如紫菜饼（坛紫菜）和海苔（条斑紫菜）占市场份额的90%以上；再加工产品如紫菜酥、紫菜酱、紫菜汤包和夹心海苔等，加工水平相对初级，附加值低，环境成本较高。而龙须菜多用于化工产业的琼胶提取和饲料领域。与日韩两国相比，缺乏精深加工和高值化产品，加工水平相对滞后，亟缺深加工技术。在原料利用方面，四水紫菜、碎紫菜、龙须菜、养殖加工次级菜等等紫菜因其口感差、品相低等因素而得不到利用，白白浪费。
红藻所具有的营养成分和保健价值，使其在食品工业上有着极大的应用潜力。传统产品难以体现红藻的营养价值和保健价值，故将红藻提取物作为主要对象开发新产品，如调味品、饮品、调理食品、保健品、药品和化妆品等，大大扩大了红藻的应用范围，拓展了产业结构。红藻提取物制备方式主要有三种：一是常规浸渍提取，当前主要提取方式，仅针对紫菜中的氨基酸、维生素、矿质素及部分可溶性糖成分，提取效率不高，对原料的利用率有限。发酵法，日本和韩国等地区对紫菜提取主要技术手段，利用滋生菌群或添加乳酸菌、米曲霉等菌种进行发酵制备紫菜酵素等产品。酶解法是当前研究青睐的方法，本研究院团队于2011 -2018年陆续报道了基于琼胶酶的紫菜降解工艺（CN104413479A；食品科技, 36(12), 103-107；食品科学,2015(21):145-149；生物加工过程2018,16(04),103-108；食品工业科技,2018(19):142-146）；谢智芬等（2016）报道了利用果胶酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶降解条斑紫菜的工艺，获得条斑紫菜酶解液中游离氨基酸含量为0.541g/100mL。CN106072089A公布了一种紫菜提取物营养强化剂的制备方法,利用果胶酶、蛋白酶和纤维素酶酶解紫菜，得紫菜提取物，并与蛋白质粉、麦芽糊精和抗坏血酸组合制备成营养强化剂。CN108925897A公布了一种易溶解紫菜粉的制备方法及制备的产品，利用超声辅助复合酶（中性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶）酶解紫菜，得到酶解物，与黄原胶混合后喷雾干燥,得到易溶解紫菜粉。
上述方法为红藻的精深加工技术做了良好的探索。但上述方法在对红藻酶解提取过程中仅针对一到两种成分进行降解，且未考虑降解效果和产物活性；经计算上述方法对红藻的降解率均不足55%；对特定成分如多糖和蛋白成分的转化率更是不足40%。故上述技术仍是在紫菜可溶成分提取及对部分成分的生物转化，相对浸渍提取有一定的进步，但对不溶性成分和大分子成分利用有限，仍未解决原料利用率和红藻成分全质利用难题，有效成分难以充分释放吸收利用。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明从我国红藻资源精深加工中所出现的问题入手，提供一种多效性红藻全质提取物及其制备方法和应用。本发明根据红藻胞壁组成与结构特点，综合利用物理溶胀、特异性酶多点切割技术，实现红藻快速破壁，减少胞壁和胞质的传质阻力，促进红藻胞内天然活性成分的释放，提高藻体成分提取率和转化率，实现红藻营养与活性成分的全质提取与转化；以拓展红藻在饮品、调理食品、营养食品、和保健食品的应用，提高红藻产品附加值；有效解决现有技术存在的藻体利用率低、核心成分转化率低等问题；提供适于工业生产的制备方法。
为解决上述技术问题，达成发明目的，本发明采用如下技术方案，具体步骤：
（1）预处理：将干燥后的红藻用粉碎机粉碎，过10～80目筛，与水按重量体积比1:5～50比例充分混匀，复水一定时间；新鲜红藻与水按重量体积比1:1～30比例混合；用胶体磨匀浆，得红藻浆液；
（2）藻粉溶胀：将红藻浆液泵入反应罐中，升温至100～115℃下溶胀20～60min，期间不断搅拌，得红藻溶胀液；
（3）空化破壁：将溶胀后的红藻料液进行空化破壁，空化器的转速为800～1200rad/min，入口压力为0.1～0.5MPa，处理10-30min，得空化破壁液；
（4）酶解破壁：将步骤（3）所得到的空化破壁液泵入酶解罐，调节pH至4.5～6.0，在40～55℃下，加入果胶酶、纤维素酶和淀粉酶，酶解2～5h，得酶解破壁液；
（5）酶转化：将步骤（4）所得到的酶解破壁液调节pH至6.5～7.5，温度降低至25～35℃，加入琼胶酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶，酶解2～5h，得红藻转化液；
（6）灭酶：将酶解罐温度升至80～90℃维持20min，灭酶；
（7）离心：将步骤（6）灭酶后的红藻转化液，在转速6000～18000rpm下进行离心除去不溶物，上清液即为红藻全质提取液；
（8）干燥：将红藻全质提取液进行喷雾干燥,得到红藻全质提取粉。
进一步的，所述步骤（4）中酶解破壁过程中，果胶酶用量为红藻干重的100～200万U/Kg，纤维素酶用量为红藻干重的150～300万U/Kg，淀粉酶用量为红藻干重的200～600万U/Kg。
进一步的，步骤（4）中果胶酶、纤维素酶和淀粉酶的比例1.2～2.0:2.6～3.0:4～5；优选比:1.6:2.8:5，可以兼顾成本和提取效率。
进一步的，所述步骤（5）中酶转化过程中，琼胶酶用量为红藻干重的1～3万U/Kg，中性蛋白酶用量为红藻干重的50～150万U/Kg，风味蛋白酶用量为红藻干重的60～100万U/Kg。
优选地，步骤（8）中所述喷雾干燥进风温度为160～175℃，出风口温度为85～95℃，可有效防止红藻全质提取粉在塔内粘壁和板结。
上述方案所述的红藻为紫菜、江蓠和龙须菜中的至少一种。
进一步的，所述红藻全质提取物具有抗氧化、免疫增强、促进益生菌生长、调节肠道菌群等多重功效。
本发明的另一目的在于，提供上述红藻全质提取物单独或作为组件在制备抗氧化、免疫增强、调节肠道菌群的药物、特殊医学用途配方食品、特殊营养配方食品、保健食品、食品或食品添加剂中的应用。
通过上述技术方案，本发明提供的一种多效性红藻全质提取物及其制备方法和应用具有如下有益效果：
1、本发明提供的多效性红藻全质提取物制备方法，充分利用了红藻胞壁主要结构成分红藻多糖的性质；通过物理溶胀和空化破壁，暴露胞壁成分结合位点；在通过复合酶的多点切割作用，实现红藻胞壁大分子的快速断裂，实现红藻的高效破壁，减少胞壁和胞质的传质阻力，促进红藻胞内天然活性成分的释放，提高藻体成分提取率，藻体液化率达到87%以上，相对现有技术提高1.6倍。
2、本发明提供的多效性红藻全质提取物制备方法，在果胶酶、纤维素酶和淀粉酶组成复合酶的多点切割破壁的基础上，进一步利用琼胶酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶等特异性酶对红藻胞壁解离成分进一步转化形成活性因子，赋予其多重功效；提高红藻成分转化率，使红藻多糖和蛋白两类核心成分转化率达到90%以上，相对现有技术提高2.3倍。
4、本发明提供的红藻全质提取物的制备方法，过程简单，成本低，利于工业化生产。
5、本发明制备的红藻全质提取物，具有抗氧化、免疫增强、促进益生菌生长、调节肠道菌群等多重功效。
6、本发明制备的红藻全质提取物，具有抗氧化、免疫增强、调节肠道菌群的作用，预防亚健康状态的出现。
7、本发明制备的红藻全质提取物，具有良好的风味和色泽，可单独或作为组件，广泛应用于药物、特殊医学用途配方食品、特殊营养配方食品、保健食品、食品或食品添加剂。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
本实施例提供一种多效性红藻全质提取物，制备方法如下：
（1）预处理：取干紫菜5 kg用粉碎机粉碎，过20目筛，加入100kg水，充分混匀，搅拌室温下复水5 h，得紫菜浆液。
（2）藻粉溶胀：将紫菜浆液泵入反应罐中，升温至108℃下，维持30min，期间不断搅拌，得紫菜溶胀液；
（3）空化破壁：将溶胀后的紫菜料液进行空化破壁，空化器的转速为1000rad/min，入口压力为0.5MPa，处理10min，得空化破壁液；
（4）酶解破壁：将步骤（3）所得到的空化破壁液泵入酶解罐，调节pH至5.0，维持温度在50℃；分别取10万U/g的果胶酶90g、20万U/g的淀粉酶125g、20万U/g的纤维素酶70g，用水溶解后加入酶解罐，充分混匀，转速50rpm搅拌，酶解3h，得酶解破壁液；
（5）酶转化：待酶解破壁反应结束后，调节pH至7.0，温度降低至35℃；分别取1万U/g的琼胶酶2.8g、20万U/g的中性蛋白酶45g、5万U/g的风味蛋白酶18g，用水溶解后加入酶解罐，转速50rpm搅拌，酶解转化3h；转化结束后温度升至90℃维持20min，灭酶；
（6）离心：采用管式离心机将灭酶后的紫菜转化液，在转速18000rpm下进行离心，收集上清液，即为紫菜全质提取液；
（7）干燥：将紫菜全质提取液进行喷雾干燥,进风口温度165℃，出风口温度85～90℃之间，收集紫菜全质提取粉，于2～8℃下保存备用。
实施例2
本实施例提供一种多效性红藻全质提取物，制备方法如下：
（1）预处理：取鲜龙须菜100 kg，切碎；与100kg水混合，用胶体磨匀浆，得龙须菜浆液。
（2）藻体溶胀：将龙须菜浆液泵入反应罐中，升温至105℃下，维持30min，期间不断搅拌，得红藻溶胀液；
（3）空化破壁：将溶胀后的龙须菜料液进行空化破壁，空化器的转速为1000rad/min，入口压力为0.5MPa，处理10min，得空化破壁液；
（4）酶解破壁：将步骤（3）所得到的空化破壁液泵入酶解罐，调节pH至5.0，维持温度在50℃；分别取10万U/g的果胶酶225g、30万U/g的淀粉酶200g、50万U/g的纤维素酶70g，用水溶解后加入酶解罐，充分混匀，转速50rpm搅拌，酶解3h，得酶解破壁液；
（5）酶转化：待酶解破壁反应结束后，调节pH至7.0，温度降低至35℃；分别取1万U/g的琼胶酶7g、20万U/g的中性蛋白酶100g、5万U/g的风味蛋白酶45g，用水溶解后加入酶解罐，转速50rpm搅拌，酶解转化3h；转化结束后温度升至90℃维持20min，灭酶；
（6）离心：采用管式离心机将灭酶后的龙须菜转化液，在转速18000rpm下进行离心，收集上清液，即为龙须菜全质提取液；
（7）干燥：将龙须菜全质提取液进行喷雾干燥,进风口温度165℃，出风口温度85～90℃之间，收集龙须菜全质提取粉，于2～8℃下保存备用。
对比例1
本对比例提供一种红藻提取物，制备方法如下：
称取1 kg的干紫菜粉（过20目筛），加15 kg水搅拌过夜，用盐酸调pH值至6.5，加热至45 ℃，恒温；加入10万U/g的果胶酶30g 、20万U/g的纤维素酶10g和60万U/g的木瓜蛋白酶30g，充分搅拌，酶解3h后，温度升至90℃维持20min，灭酶；冷却至室温，在转速18000rpm下进行离心，收集上清液；进风口温度165℃，出风口温度85～90℃之间进行喷雾干燥，得紫菜提取粉，于2～8℃下保存备用。
对比例2
本对比例提供一种红藻提取物，制备方法如下：
称取1 kg干紫菜粉（过20目筛），加20kg水，混合均匀得到浆体；在超声波功率为200W/L,超声波频率25KHZ为的条件下对浆体进行超声波处理20min；将20万U/g的中性蛋白酶20g、10万U/g的果胶酶200g和 20万U/g纤维素酶400g混合均匀后,取100Kg作为复合酶,然后将复合酶与超声处理后的浆体混合混匀后在40℃的条件下，酶解2.0 h；温度升至90℃维持20min，灭酶；冷却至室温，在转速18000rpm下进行离心，收集上清液；进风口温度165℃，出风口温度85～90℃之间进行喷雾干燥，得紫菜提取粉，于2～8℃下保存备用。
对比例3
本对比例提供一种红藻提取物，制备方法如下：
称取鲜龙须菜10 kg，切碎；与10kg水混合，用胶体磨匀浆，得龙须菜浆液；泵入反应罐中，升温至105℃下，维持30min，期间不断搅拌；冷却至35℃，恒温，调节pH至7.0；加入1万U/g的琼胶酶2g，充分搅拌，酶解6h后，温度升至90℃维持20min，灭酶；冷却至室温，在转速18000rpm下进行离心，收集上清液；进风口温度165℃，出风口温度85～90℃之间进行喷雾干燥，得紫菜提取粉，于2～8℃下保存备用。
实验资料：
1.红藻液化率和核心成分转化率评估
1.1红藻液化率
收集离心回收的不溶物，于105℃下烘干至恒重，按照公式（1）计算红藻液化率：
公式（1）：红藻液化率=（W0-W）/W0×100%（其中W是指离心回收不溶物干重，W0是指实验所用红藻干重）。
1.2 红藻多糖转化率
总糖：采用苯酚-硫酸法测定红藻全质提取物中总糖含量，以半乳糖计；
还原糖：采用DNS比色法测定红藻全质提取物中还原糖含量，以半乳糖计；
按照公式（2）计算红藻多糖转化率：
公式（2）：红藻多糖转化率= (R- R0)/（C-C0）×100%（其中R是指红藻提取物中还原糖含量；C是指红藻提取物中总糖含量；R0是指所加入酶中还原糖含量；C0是指所加入酶中总糖含量）。
1.3 红藻蛋白转化率
总蛋白：采用GB 5009.5第一法测定红藻全质提取物中总蛋白含量；
寡肽和游离氨基酸：采用DB35/T 1089法测定红藻全质提取物中寡肽和游离氨基酸总量；
按照公式（2）计算红藻蛋白转化率：
公式（2）：红藻蛋白转化率= （T-T0）/( D0-D-T0)×100%（其中T是指红藻提取物中寡肽和游离氨基酸总量；T0是指酶解前红藻提取物中寡肽和游离氨基酸总量；D0是指红藻提取物中总蛋白含量；D是指所加入酶中蛋白含量）。
表1 实施例和对比例的红藻液化率和核心成分转化率
| 液化率（%） | 多糖转化率（%） | 蛋白转化率（%） | |
| 实施例1 | 95.89% | 93.38% | 94.74% |
| 实施例2 | 88.65% | 96.34% | 93.12% |
| 对比例1 | 43.83% | 27.34% | 28.16% |
| 对比例2 | 47.87% | 32.03 | 38.54% |
| 对比例3 | 54.79% | 39.64% | 2.34% |
由表1可知，对比例1、2和3方案对红藻的液化率均不足55%，红藻主要成分多糖和蛋白成分的转化率更是不足40%。其中对比例3的红藻液化率和多糖转化率相对较高，分别达到54.79%和39.64%；但因未添加蛋白酶，对蛋白成分基本不能转化。对比例2对蛋白成分转化率相对较高，也仅为38.54%。实施例1和2方案对红藻的液化率达到88%以上，对多糖和蛋白成分的转化率达到90%以上。相对于对比例，红藻液化率提高1.62～2.19倍，多糖转化率提高2.35～3.52倍，蛋白转化率提高2.42～3.36倍。故本发明方案相对现有方案，在藻体液化率、核心成分转化率方面具有显著优势和进步。
2.红藻提取物抗氧化作用评估
2.1 ABTS自由基清除率：将2,2-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS）用蒸馏水配制成7mmol/L溶液，另外配制2.45mmol/L K2S2O8水溶液，将ABTS溶液与K2S2O8溶液等体积避光放置12~16h，得到ABTS储存溶液。将储存溶液用蒸馏水稀释成在730nm下吸光度为0.70±0.002，成为ABTS工作液。反应如下：
2.4mLABTS工作液与0.6mL样品溶液混合均匀，常温下静置6min，在730nm下测定吸光值Ai；空白对照为2.4mLABTS工作液与0.6mL蒸馏水反应，吸光值记为A0，样品本底用蒸馏水替代ABTS工作液来扣除样品本身颜色的影响，吸光值记为Aio。
ABTS自由基清除率（%）=[A0-(Ai-Ai0)]/A0*100，其中A0为蒸馏水代替提取物溶液测得的空白对照，Ai为样品吸收值，Ai0为提取物本底吸收值。
2.2超氧自由基（O2-·）清除率：在4.5 mL Tris-HCl（50 mmol/L，PH 8.2）中进行。将其在25 ℃预热25 min后，加入不同浓度的样品液1 mL、0.3 mL邻苯三酚（3 mmol/L，以10mmol/L HCl 溶液配制），25 ℃反应5 min后取出并迅速加入1 mL 8 mol/L的盐酸终止反应，于299 nm测其吸光值Ai。考虑到多糖本身的吸光值，以HCl代替邻苯三酚的体系测定多糖本底吸收值Ai0。以Vc做阳性对照，按下述公式计算羟自由基清除率。
超氧自由基清除率=[A0-(Ai-Ai0)]/A0*100%，其中A0为蒸馏水代替提取物溶液测得的空白对照，Ai为样品吸收值，Ai0为提取物本底吸收值。
表2 红藻提取物对ABTS自由基和超氧自由基清除作用
| 红藻提取物（浓度0.5mg/mL） | ABTS自由基清除率（%） | 超氧自由基清除率（%） |
| 实施例1 | 97.54% | 89.24% |
| 实施例2 | 96.08% | 84.58% |
| 对比例1 | 50.32% | 36.01% |
| 对比例2 | 56.86% | 47.11% |
| 对比例3 | 74.34% | 61.51% |
如表2所示，在相同作用浓度下，实施例1和2红藻全质提取物对ABTS自由基清除率分别达到97.54%和96.08%，对超氧自由基清除率也达到89.24%和84.58%，远高于对比例。相对对比例1和2，实施例1和2的ABTS自由基清除率提高了69%～94%，超氧自由基清除率更是提高了80%～148%。对比例3对两种自由基的清除能力相对对比例1和2有所提高，表明特异性酶的使用可以提升提取物的活性，但提升有限，相对实施例1和2低29%～31%和37%～45%。由上可知，本发明技术所制备的红藻全质提取物具有良好的清除ABTS自由基和超氧自由基的能力，其效果远优于对比例所制备的红藻提取物。
3.红藻全质提取物免疫增强作用评估
在适应性喂养7天后，将BALB/c小鼠随机分成6组：空白对照组（BC）、模型对照组（MC）、实施例1组、实施例2组、对比例1组、对比例2组、对比例3组。在第1～28天，给予实施例1组、实施例2组、对比例1组、对比例2组、对比例3组小鼠分别按照90 mg/kg·d剂量灌胃，空白对照组和模型对照组分别灌胃等体积的生理盐水（0.9%，w/w），每天一次。在第23～28天，除空白对照组外，其他组小鼠每天腹腔注射氢化可的松（HC，15 mg/kg），而空白对照组小鼠则注射生理盐水。每组共有30只小鼠，其中10只在末次给药24 h后，摘眼球收集血液（外周血和血清）、取肝脏备用，无菌取脾脏和腹腔巨噬细胞；其中10只用于迟发型变态反应、抗体生成细胞检测和血清溶血素试验操作；其中10只用于碳廓清指数测定。
3.1 白细胞总量测定
末次给药后，禁食不禁水8 h，将小鼠经麻醉后摘眼球采集全血，将血液收集到含抗凝剂乙二胺四乙酸（EDTA）的干净的EP管中，立即混匀避免血液凝固。使用全自动血细胞分析仪对采集的外周血进行分析，以检测各组小鼠血液中白细胞（WBC）的含量。
3.2脾T淋巴细胞增殖测定
采用MTT法对脾T淋巴细胞增殖反应测定。将无菌环境下取出的脾脏，在无菌生理盐水中研磨成脾单细胞悬液，用200目筛过滤，收集细胞悬液。用无菌三蒸水处理5秒钟后，将细胞悬液于1000 rpm离心5 min以除去红细胞，并用无菌生理盐水洗涤3次。然后将脾细胞重悬于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中，并调整细胞浓度为5×106细胞/mL。将脾细胞悬液（100 μL/孔）接种至96孔板中，然后加入100 μL含ConA（终浓度为5 μg/mL）和10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，并将不添加ConA的作为无刺激的空白对照孔。将培养板置于37℃，5% CO2的培养箱中孵育72 h后，向每孔中添加20 μL MTT（5 mg/mL），继续培养4 h后，小心地吸取100 μL 上清液，然后向每孔中加入150 μL 酸性异丙醇溶解紫色结晶，待紫色晶体溶解完全，于570 nm处测量吸光度。脾T淋巴细胞增殖能力表示为实验孔与无刺激的空白对照孔之间的吸光度差值（∆A570）。
3.3迟发型变态反应测定
在第24天，通过给每只小鼠腹腔注射0.2 mL SRBC（2%，v/v）进行系统致敏，致敏5天之后，使用游标卡尺测量小鼠右后足跖的厚度，然后在测量部位皮下注射20 μL 20%（v/v）SRBC进行局部激发。注射后24 h后，由同一个人再次测量小鼠右后足跖的厚度，相同部位测量3次。DTH的程度由激发前后的足跖厚度变化差值来表示。
3.4抗体生成细胞检测
基于溶血空斑试验的基础上建立了B细胞介导的红细胞定量溶血分光光度法,来反映机体的体液免疫功能。在第24天，通过给每只小鼠腹腔注射0.2 mL SRBC（2%，v/v）进行系统致敏，致敏5天后处死小鼠，同3.3.6方法制备脾细胞悬液，并用生理盐水调整细胞浓度为2×107细胞/mL。于冰浴中，依此向试管中加入脾细胞悬液、0.4%（v/v）SRBC、补体各0.5mL，对照管以0.5 mL生理盐水代替脾细胞悬液，37℃水浴60 min后，立即冰浴终止反应，3000 rpm离心5 min，取上清于413 nm处测吸光度。
3.5血清免疫球蛋白含量测定
将采集的血液，在室温下凝结30 min，然后在4℃下4000 rpm离心20 min收集血清。按照IgA、IgG和IgM ELISA试剂盒说明书检测血清中免疫球蛋白水平。
3.6血清溶血素的测定
在第24天，通过给每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（v/v）SRBC进行系统致敏，5天后摘眼球采集小鼠血液收集到干净的EP管中，于室温下凝结30 min，然后在4000 rpm，4℃下离心20 min收集上层血清。血清样品用SA缓冲液稀释250倍，取100 μL稀释后血清、50 μLSRBC（10%，v/v）和100 μL补体（用SA缓冲液以1 : 8稀释）混合。将混合物在37℃水浴30min,后，立即冰浴终止反应，1500 rpm离心10 min分离得上清液，同时以SA缓冲液代替血清样品作为空白对照。然后样品和空白对照各移取50 μL于96孔板中，加入150 μL都氏试剂。与此同时，设置半数溶血孔，将12.5 μL SRBC（10%，v/v）和187.5 μL都氏试剂混合均匀。静置10 min后，于540 nm处测量吸光度。血清溶血素水平以半数溶血值（HC50）表示，根据下列公式计算：
样品HC_50=(样品光密度值-空白光密度值)/(SRBC半数溶血光密度值-空白光密度值)×稀释倍数
3.7碳廓清试验
通过碳廓清试验检测巨噬细胞的吞噬活性。第29天时，根据小鼠的体重，通过尾静脉以0.1 mL/10 g bw注射印度墨汁（用生理盐水稀释4倍），待印度墨汁注入后立即计时。在注入墨汁2 min（t1）和10 min（t2）时，预先用EDTA处理的毛细血管分别从小鼠眼眶内眦静脉丛取血20 μL，并将其立即与2 mL 0.1% Na2CO3溶液混合均匀避免凝血。将混合液于酶标仪上检测600 nm处的吸光度，以0.1% Na2CO3溶液为空白对照。再将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸洗净脏器表面血污并称重。碳廓清能力以吞噬指数表示，根据下列公式计算：
K=(lgOD_1-lgOD_2)/(t_2-t_1 )
吞噬指数=体重/(肝重+脾重)×∛K
其中OD1和OD2分别表示2 min和10 min时取的血液样品吸光值
3.8腹腔巨噬细胞吞噬活性测定
采用流式细胞仪检测吞噬荧光微球的的巨噬细胞来评估腹腔巨噬细胞的吞噬活性[154]。在实验的前4天给每只小鼠（每组3只）腹腔注射0.2 mL 2%（v/v）SRBC来激活小鼠巨噬细胞。实验当天处死小鼠后，每只小鼠腹腔注射3 mL含5%小牛血清的Hank’s液，轻轻按揉小鼠腹部以充分将腹腔巨噬细胞洗出，使用灭菌的剪刀将小鼠腹腔剪开一个小口，将腹腔洗液吸取至干净的EP管中。取100 μL荧光微球与10 mL 1% BSA混合均匀于37℃避光孵育30 min进行预处理，调整腹腔巨噬细胞浓度为4～6×107细胞/mL并记录。将1 mL腹腔巨噬细胞洗液与预处理的荧光微球（1×107微球/孔）加入至6孔板中，于37℃，5% CO2的培养箱中孵育2 h后，弃去上清，使用PBS轻轻洗涤培养板两次并用细胞刮刮取贴壁细胞并收集于测定管中，然后借助流式细胞仪上进行检测。腹腔巨噬细胞的吞噬能力以吞噬百分率（%）表示，计算公式如下：
吞噬百分率（%）=吞噬荧光微球的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100
表3 红藻提取物的增强免疫力作用效果
| BC组 | MC组 | 实施例1 | 实施例2 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | |
| WBC (109/L) | 154.6±5.3 | 126.0±4.9# | 154.7±3.2* | 153.0±6.34* | 128.7±4.3 | 130.2±5.6 | 132.2±4.1 |
| T淋巴细胞增殖∆A570 | 0.59±0.06 | 0.39±0.07# | 0.64±0.09* | 0.68±0.08* | 0.41±0.09 | 0.40±0.06 | 0.48±0.08 |
| 抗体生成细胞A413 | 0.33±0.05 | 0.23±0.04# | 0.34±0.02* | 0.32±0.03* | 0.25±0.04 | 0.26±0.06 | 0.29±0.05 |
| IgA（μg/mL） | 304.1±9.8 | 232.2±16.3# | 314.7±10.2** | 310.3±9.5** | 252.6.7±11.2 | 262.8±4.4* | 273.2±16.4* |
| IgG （mg/mL） | 16.4±0.8 | 14.3±0.5# | 16.3±0.9* | 17.3±1.2* | 15.6±0.9 | 14.8±0.3 | 15.2±0.8 |
| IgM（mg/mL） | 2.59±0.16 | 1.96±0.29# | 2.70±0.13* | 2.67±0.25* | 2.16±0.34 | 2.37±0.27 | 2.39±18 |
| 血清溶血素HC50 | 222.9±13.6 | 140.4±9.4# | 185.9±11.9** | 191.1±18.0** | 151.3±14.5 | 148.1±9.4 | 154.3±10.9 |
| 迟发型变态反应（mm） | 0.64±0.05 | 0.43±0.05# | 0.68±0.04** | 0.71±0.06** | 0.51±0.06 | 0.54±0.07, | 0.50±0.07 |
| 碳廓清吞噬指数 | 6.25±0.29 | 5.01±0.28# | 6.09±0.15** | 6.50±0.36** | 5.39±0.64 | 5.78±0.55 | 5.94±0.25* |
| 腹腔巨噬细胞吞噬百分率（%） | 3.25±0.17 | 1.98±0.19# | 3.42±0.18** | 3.11±0.38** | 2.08±0.21 | 2.17±0.35 | 2.54±0.32* |
注：# P＜0.05，## P＜0.01与BC组比较；* P＜0.05，** P＜0.01与MC组比较
WBC是机体血液中的主要的具有防护作用的免疫细胞，可以吞噬细菌和防御疾病，是评估机体免疫状态的重要指标。由表3可知，与BC组相比，MC组的WBC的含量显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。相对MC组，实施例1和2红藻全质提取物对HC引起血液免疫细胞WBC的降低均有良好的抑制作用（P＜0.05），并达到BC小鼠的WBC含量水平。而对比例1、2和3无显著作用（P＞0.05）。
淋巴细胞是机体中至关重要的免疫细胞，在免疫监视和免疫防御扮演重要角色，淋巴细胞的增殖可以直接反映细胞的免疫功能。如表3所示，与BC组小鼠相比，HC对ConA诱导的小鼠脾脏T淋巴细胞增殖反应明显受到抑制，增殖率降低了33.9%（P＜0.05），而实施例1和2红藻全质提取物显著提高了T淋巴细胞的增殖水平（P＜0.05），恢复至正常水平，甚至略高于正常小鼠。而对比例1、2和3均无显著作用，不具有统计学意义。迟发型变态反应是细胞免疫的体内检测法。当系统致敏之后，SRCK可以刺激T细胞增殖成致敏淋巴细胞，当再次受到SRCK攻击时，会促使T细胞活化，释放炎症因子，造成攻击部位发生炎症反应，研究结果如表3所示。与脾T淋巴细胞增殖反应结果类似，与BC小鼠相比，MC组小鼠足跖厚度明显降低（P＜0.05），表明MC组小鼠迟发型变态能力减弱。与MC组相比，实施例1和2组小鼠足跖增厚反应效果显著（P＜0.01）；对比例1、2和3均无显著作用。上述结果表明实施例1和2红藻全质提取物对细胞免疫有免疫增强作用，可以抵抗HC对机体细胞免疫的损害，而对比例1、2和3红藻提取物没有此功效。
抗体生成细胞检测反映的是B淋巴细胞合成分泌的Ig型抗体所引起的红细胞裂解释放的血红蛋白水平。由表3可知，与BC组小鼠相比，MC组小鼠的抗体分泌水平显著降低（P＜0.05）。经过红藻全质提取物受试，与MC组小鼠相比，实施例1和2组小鼠抗体生成细胞分泌抗体水平显著提高47.8%（P＜0.05）和39.1%（P＜0.05），与BC组小鼠水平持平。与细胞免疫结果类似，对比例1、2和3组小鼠抗体生成细胞分泌抗体水平相对MC组未有显著变化。同时，实施例1和2组小鼠的血清免疫球蛋白IgA（P＜0.01）、IgG（P＜0.05）和IgM（P＜0.05）水平相对MC组显著提高，与BC组小鼠水平持平。对比例1、2和3组小鼠血清中IgG和IgM水平无显著变化，而对比例2和3组小鼠血清中IgA水平显著提高，表明对比例2和3红藻提取物对免疫球蛋白具有一定的作用。溶血素是B淋巴细胞接受各种抗原刺激后分泌的能使红细胞发生溶血反应的物质，根据释放出来的血红蛋白含量评估血清中溶血素含量，是反映机体体液免疫水平的一个可靠指标。与BC组相比，MC组小鼠血清溶血素水平显著下调37.0%（P＜0.03，表3）。相对MC组小鼠，实施例1和2红藻全质提取物显著增加了免疫抑制小鼠血清溶血素水平，提高32.04%（P＜0.01）和36.1%倍（P＜0.01）；对比例1、2和3均无显著作用，不具有统计学意义。综合上述数据可知，实施例1和2红藻全质提取物对体液免疫具有显著的免疫增强作用，可以改善免疫低下小鼠的体液免疫水平，而对比例1、2和3红藻提取物不能显著提升免疫低下小鼠的体液免疫能力。
巨噬细胞的吞噬能力是评估先天性免疫功能的重要指标，在非特异性免疫中起着重要作用。我们采用流式细胞术检测了受试小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，评测巨噬细胞在离体状态下的吞噬能力，结果如表3所示，与BC组相比，MC小鼠的巨噬细胞的吞噬功能显著被抑制作用（P＜0.01）；实施例1和2红藻全质提取物可显著显著改善这一现象，并能使其恢复到正常小鼠水平；对比例1和2红藻提取物均无显著效果。但是比例3红藻提取物显著提升了免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力（P＜0.05），但提升水平有限，低于实施例1和2组小鼠水平。在体内状态下的小鼠巨噬细胞的吞噬能力，采用碳廓清试验进行评测；测评结果与腹腔巨噬细胞的吞噬能力检测结果一致，实施例1和2、对比例3实验组小鼠碳廓清能力显著提升，但对比例3组廓清水平低于实施例1和2；对比例1和2没有显著效果。综合体内和体外检测结果可知，实施例1和2红藻全质提取物及对比例3提取物可以显著提升免疫低下小鼠的非特异性免疫水平，对比例1和2红藻提取物不能显著提升免疫低下小鼠的非特异性免疫能力。
综上可知，实施例1和2红藻全质提取物在血液白细胞总数、细胞免疫功能、体液免疫功能、巨噬细胞功能方面均表现出显著的免疫增强活性；根据国家保健品功能检验与评价标准，红藻全质提取物具有免疫增强功效。对比例3提取物仅在巨噬细胞功能具有显著效果，根据相关评价标准，对比例3提取物不具有免疫增强功效。另，对比例1和2红藻提取物在血液白细胞总数、细胞免疫功能、体液免疫功能、巨噬细胞功能方面均不具有出显著的免疫增强活性，故其不具有免疫增强功效。
4.红藻全质提取物调节肠道菌群作用评估
上述免疫增强实验小鼠取结肠内容物。采用实时荧光定量PCR法测定结肠内容物中双歧杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属和肠杆菌的含量，结果见表2。
表4 红藻提取物对肠道菌群的调节效果（log 拷贝数/g）
| 双歧杆菌 | 乳杆菌 | 肠球菌 | 肠杆菌 | |
| 实施例1 | 3.27±0.26 | 5.69±0.44** | 0.80±0.16** | 1.04±0.16** |
| 实施例2 | 3.19±0.21** | 5.43±0.47** | 0.71±0.16** | 1.14±0.16** |
| 对比例1 | 1.58±0.27 | 3.05±0.21 | 2.02±0.33 | 2.80±0.44 |
| 对比例2 | 1.69±0.23 | 3.06±0.31 | 2.11±0.15 | 2.93±0.16 |
| 对比例3 | 2.79±0.34* | 3.32±0.18* | 1.98±0.45 | 2.73±0.33 |
| MC组 | 1.48±0.22# | 2.82±0.16## | 2.34±0.32# | 3.03±0.16## |
| BC组 | 2.51±0.12 | 4.73±0.16 | 1.08±0.16 | 1.05±0.16 |
注：# P＜0.05，## P＜0.01与BC组比较；* P＜0.05，** P＜0.01与MC组比较
由表4可知，实施例1、2和对比例3制得的红藻提取物对小鼠肠道内双歧杆菌和乳杆菌具有更好的促生长作用，显著提高了其含量（P＜0.05）；实施例1和2红藻全质提取物并对肠球菌和肠杆菌产生了有效抑制作用（P＜0.01）；对比例3红藻提取物对小鼠肠道内肠球菌和肠杆菌抑制效果有限，不具有统计学意义。对比例1和2制得的红藻提取物对上述菌群均不具备显著调节作用。据国家保健品功能检验与评价标准，红藻全质提取物具有调节肠道菌群功效；对比例3红藻提取物对肠道益生菌具有显著调节作用，但对肠道内肠球菌和肠杆菌不具备抑制效果，故不具有调节肠道菌群功效；对比例1和2制得的红藻提取物均不具有调节肠道菌群功效。
综上所述，本发明红藻全质提取物具有良好的抗氧化、免疫增强和调节肠道菌群功效，具有多效性保健功效；优于现有技术制备的红藻提取物。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.一种多效性红藻全质提取物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）预处理：取干紫菜5 kg用粉碎机粉碎，过20目筛，加入100kg水，充分混匀，搅拌室温下复水5 h，得紫菜浆液；
（2）藻粉溶胀：将紫菜浆液泵入反应罐中，升温至108℃下，维持30min，期间不断搅拌，得紫菜溶胀液；
（3）空化破壁：将溶胀后的紫菜料液进行空化破壁，空化器的转速为1000 rad/min，入口压力为0.5MPa，处理10min，得空化破壁液；
（4）酶解破壁：将步骤（3）所得到的空化破壁液泵入酶解罐，调节pH至5.0，维持温度在50℃；分别取10万U/g的果胶酶90g、20万U/g的淀粉酶125g、20万U/g的纤维素酶70g，用水溶解后加入酶解罐，充分混匀，转速50rpm搅拌，酶解3h，得酶解破壁液；
（5）酶转化：待酶解破壁反应结束后，调节pH至7.0，温度降低至35℃；分别取1万U/g的琼胶酶2.8g、20万U/g的中性蛋白酶45g、5万U/g的风味蛋白酶18g，用水溶解后加入酶解罐，转速50rpm搅拌，酶解转化3h；转化结束后温度升至90℃维持20min，灭酶；
（6）离心：采用管式离心机将灭酶后的紫菜转化液，在转速18000rpm下进行离心，收集上清液，即为紫菜全质提取液；
（7）干燥：将紫菜全质提取液进行喷雾干燥,进风口温度165℃，出风口温度85～90℃之间，收集紫菜全质提取粉，于2～8℃下保存备用。
2.根据权利要求1所述的制备方法制备得到的多效性红藻全质提取物，其特征在于，所述红藻全质提取物具有抗氧化、免疫增强、调节肠道菌群的多重功效。
3.根据权利要求2所述的红藻全质提取物，其特征在于，所述红藻全质提取物在体内能够促进肠道中乳杆菌、双歧杆菌的增殖，抑制肠道中肠球菌和肠杆菌的生长，并调节机体免疫。
4.权利要求2所述的红藻全质提取物在制备抗氧化、免疫增强、调节肠道菌群的药物、食品或食品添加剂中的应用，其特征在于，所述食品为保健食品。
5.根据权利要求4所述的红藻全质提取物在制备抗氧化、免疫增强、调节肠道菌群的药物、食品或食品添加剂中的应用，其特征在于，所述红藻全质提取物在有效发挥抗氧化、免疫增强、调节肠道菌群功效的前提下，调节人体肠道菌群功能。
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