CN110272933A - 一种用于缓解痛经及女性经期不适的蛋白肽及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于防治痛经及缓解女性经期不适的球状念珠藻蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：取球状念珠藻粉或念珠藻胶质置于酶解罐中；当物料的温度达到40‑65℃，加入蛋白酶酶解，蛋白酶的用量为干燥球状念珠藻粉质量的0.1%‑5%，搅拌酶解时间为2‑9小时，酶解后升温灭酶，灭酶温度为85‑100℃，灭酶时间10‑30分钟；灭酶后酶解液冷却至室温后，取酶解液经过滤、浓缩、干燥即得。本发明还提供了上述制备方法所得球状念珠藻蛋白肽在制备缓解女性经期不适的食品、保健食品、药品中的应用。

Description

一种用于缓解痛经及女性经期不适的蛋白肽及制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于防治痛经及缓解女性经期不适的球状念珠藻蛋白肽的制备方法，及其在制备防治痛经及缓解女性经期不适的食品、保健食品、药品中的应用。

背景技术

有些女性每月月经来时，可出现口角发炎，甚至溃烂，且有头痛及失眠等现象，其症状多在10天内自然停止。一般常见的月经周期不适症有:偏头痛、乳房疼痛、周期间疼痛、痛经等。而痛经是指女性正值经期或行经前后，周期性出现小腹疼痛或痛引腰骶，严重者可伴有恶心呕吐、冷汗淋漓、手足厥冷，甚至剧痛至昏厥者，亦称经行腹痛。痛经好发于15-25岁及初潮后的6个月至两年内，是青春期常见症之一。痛经主要分为原发性痛经和继发性痛经，临床以前者为多发。原发性痛经是指在没有盆腔疾病的月经期痛，又称功能性痛经，集中出现在下腹的痉挛，是女性中的一种常见疾病，其病因多，病机复杂，周期性强、痛苦大，严重影响广大妇女的生活质量。球状念珠藻，俗称葛仙米，其中含18种氨基酸，其中含人体必需的八种氨基酸，干物质总蛋白高达56%左右，粗脂肪8.11%，碳水化合物12.69%，灰分10.88%，叶绿素30.98 mg/g，抗坏血酸5.50 mg/g，维生素℃含量接近鲜枣，比山楂高5倍多，比柑桔高5倍;维生素B1、B2高于一般菌藻类:含矿物质15种，最丰富的有磷、硫、钙、钾、铁等，较少的有铅、硅、镁、钡、锗等，微量元素有锌、铜、锰，还有淀粉和糖类，其含钙量高于一般蔬菜，是一种极好的天然富钙营养食品。通过对野生葛仙米的营养成分分析，得出野生葛仙米蛋白质含量达48.61%，含17种氨基酸，其中含人体7种必需氨基酸为44.619%;尤其在野生葛仙米中赖氨酸、苏氨酸的含量较高，利用现代生物酶解技术将其蛋白降解为小分子多肽，不仅降低了由于大蛋白引起免疫反应的可能，而且获得的蛋清肽具有多种生物学功能，更易于人体吸收。目前，尚未发现球状念珠藻蛋白肽用于防治痛经及缓解女性经期不适的报道，现有的公开文献技术也未涉及采用膜分离技术专门制备小分子球状念珠藻蛋白肽的方法。发明人经研宄发现，通过改善制备工艺及不同的酶解参数所得球状念珠藻蛋白肽可应用 于制备防治痛经及缓解女性经期不适的食品、保健食品、药品中。

综上所述，研宄和开发出一种生产流程简单，产物活性高、适合工业化生产的可用于防治痛经及缓解女性经期不适的念珠藻蛋白肽的制备方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于防治痛经及缓解女性经期不适的球状念珠藻蛋白肽的制备方法，该制备方法生产流程简单，产物活性高，制备的干燥球状念珠藻粉肽分子量小于10000Da、 易于被人体吸收，且具有防治痛经及缓解女性经期不适的功能。

本发明的另一目的还在于提供上述制备方法所得的球状念珠藻蛋白肽在制备缓解女性经期不适的食品、保健食品、药品中的应用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于防治痛经及缓解女性经期不适的球状念珠藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:取球状念珠藻粉或念珠藻胶质置于酶解罐中；当物料的温度达到40-65°℃，加入蛋白酶酶解，蛋白酶的用量为干燥球状念珠藻粉质量的0.1%-5%，搅拌酶解时间为2-9小时，酶解后升温灭酶，灭酶温度为85-100℃，灭酶时间10-30分钟；灭酶后酶解液冷却至室温后，取酶解液经过滤、浓缩、干燥即得。

所述酶解所用蛋白酶选自木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶中的任意一种单酶或两到三种复配而成的复合酶，复合酶中的各单酶质量占总酶量的百分比范围为0%〜90%，且复合酶中的各酶质量占总酶量的百分比之和为100%。

所述酶解在酶解过程中每隔1小时将物料细化均质一次。

所述过滤为初滤，或初滤后超滤，超滤所用的有机复合膜材质为芳香聚酰胺、聚哌嗪酰胺类或聚醚砜类，截留分子量范围为小于10000Da。

所述干燥的方法为真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥;在喷雾干燥时，设备进口热风温度为85℃—130℃。

所制得的球状念珠藻蛋白肽相对分子质量＜ 10000,肽占总蛋白含量比≥70%。

所制得的球状念珠藻蛋白肽可作为防治痛经及缓解女性经期不适的保健食品、食品、药品中的有效成分,用于防治痛经及缓解女性经期不适的球状念珠藻蛋白肽在制备防治痛经及缓解女性经期不适的保健食品、食品、药品中的应用。本发明有益效果：

1、本发明提供的一种用于防治痛经及缓解女性经期不适的球状念珠藻蛋白肽的制备方法，其原料稀释倍数小、用酶比较广泛，产物活性高，节省能源，操作简便易行，适合于工业化生产。

2、本发明提供的一种用于防治痛经及缓解女性经期不适的球状念珠藻蛋白肽的制备方法，其所得念珠藻蛋白肽具有防治痛经及缓解女性经期不适的功能，且效果显著。

3、本发明提供的一种用于防治痛经及缓解女性经期不适的干燥球状念珠藻粉肽的制备方法所制得蛋白肽分子量小于10000Da、易于被人体吸收。

4、本发明提供的一种用于防治痛经及缓解女性经期不适的球状念珠藻蛋白肽的制备方法所制得蛋白肽可应用于防治痛经及缓解女性经期不适的食品、保健食品、药品中。

具体实施方式

下面通过具体实施例及药效学研宄结果对本发明作进一步说明。

实施例1

取干燥球状念珠藻粉2kg，加入1倍体积的水搅匀，置于酶解罐中；当物料温度达到45℃，加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶（木瓜蛋白酶占酶总质量的85%，胰蛋白酶占酶总质量的15%），总用酶量为球状念珠藻质量的0.4%，混匀，酶解温度45 ± 1℃，酶解过程中每隔1小时将物料经过胶体磨细化均质一次，总共搅拌酶解8小时90± 1℃灭酶20分钟。离心和板框压滤机初滤，滤材为纯绵帆布，然后真空浓缩、真空得球状念珠藻蛋白肽。

实施例2

取干燥球状念珠藻粉2kg，搅匀，置于酶解罐中；当物料温度达到45°℃，加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶（木瓜蛋白酶占酶总质量的85%，胰蛋白酶占酶总质量的15%），总用酶量为球状念珠藻质量的0.6%，混匀，酶解温度45 ± 1℃，酶解过程中每隔1小时将物料经过胶体磨细化均质一次，总共搅拌酶解6小时90± 1℃灭酶30分钟。板框过滤得澄清滤液，滤液经超滤法截 留收集分子量小于10000道尔顿的肽液，滤过压0.3Mpa，然后真空浓缩、冷冻干燥得球状念珠藻蛋白肽。

实施例3

取干燥球状念珠藻粉2kg，搅匀，置于酶解罐中；当物料温度达到58℃，加入木瓜蛋白酶，用酶量为干燥球状念珠藻粉质量的0.6%，混匀，酶解温度58 ± 1℃酶解，酶解过程中每隔1小时将物料经过胶体磨细化均质一次，总共搅拌酶解6小时。95 ± 1 ℃灭酶20分钟。板框过滤得澄清滤 液，滤液经超滤法截留收集分子量小于10000道尔顿的肽液，滤过压0.3Mpa，然后真空浓缩、 喷雾干燥得干燥球状念珠藻粉肽，喷雾干燥时，设备进口热风温度为120℃。

实施例4

取干燥球状念珠藻粉2kg，搅匀，置于酶解罐中；当物料温度达到55℃，加入木瓜蛋白酶和风味蛋白酶（木瓜蛋白酶占总酶量90%，风味蛋白酶占总酶量10%），总用酶量为球状念珠藻质量的0.4%，混匀，酶解温度55± 1℃，酶解过程中每隔1小时将物料经过胶体磨细化均质一次，总共搅拌酶解8小时。95± 1℃灭酶30分钟。板框过滤得澄清滤液，滤液经超滤法截留收集分子量小于10000道尔顿的肽液，滤过压0.3Mpa，然后真空浓缩、喷雾干燥得念珠藻蛋白肽，喷雾干燥时，设备进口热风温度为110℃。

实施例5

取干燥球状念珠藻粉2kg，搅匀，置于酶解罐中；当物料温度达到52℃，加入风味蛋白酶和中性蛋白酶（风味蛋白酶占总酶量10%，复合蛋白酶占总酶量90%），总用酶量为球状念珠藻质量的0.6%，混匀，酶解温度52 ± 1℃，酶解过程中每隔1小时将物料经过胶体磨细化均质一次，总共搅拌酶解6小时87± 1℃灭酶30分钟。板框过滤得澄清滤液，滤液经超滤法截留收集分子量小于10000道尔顿的肽液，滤过压0.3Mpa，然后蒸发浓缩得球状念珠藻粉肽浓缩液。

实验例

1.球状念珠藻蛋白肽对缩宫素诱发小鼠子宫收缩的抑制作用

取体重20-25g昆明种雌性未孕小鼠适应环境饲养7天后，于实验前3天连续注射苯甲酸雌二醇1mg/kg，以同步化子宫并提高子宫的敏感性。于第4天随机分成5组，分别为空白对照组、硝苯地平对照组、球状念珠藻蛋白肽组、普通蛋清肽组、球状念珠藻粉组;分别颈椎脱白处死小鼠，在下腹部作切口，打开腹腔，迅速从子宫颈部和一侧子宫角剪取子宫，轻轻剥离周围的脂肪组织和结缔组织，置于预冷4C的De-Jalon’ s营养液中清洗，取单侧子宫，用手术线分别扎住子宫颈端和卵巢端。将绑好的单侧子宫置于盛有40mLDe-Jalon’ s营养液的麦氏浴槽中，将子宫颈端固定于底部，卵巢端连接在张力换能器上。麦氏浴槽内温度为（37±0.1） C，通入空气，每秒1、2个小气泡。平衡45min，待子宫收缩稳定，自发节律恢复后，开始进行试验。采用生物信息处理系统预先记录5-10min正常收缩曲线，随后加入缩宫素注射液20μL，使其终浓度为5U/L。终浓度指的是药品溶于浴槽中溶液后的药品浓度。作用10min后再加入不同待测样品，阳性药物硝苯地平的加入剂量为0.0125mg/L，球状念珠藻蛋白肽组加入剂量为 200mg/L （球状念珠藻蛋白肽为实施例3中所述制备方法制得），普通蛋清肽组加入剂量为200mg/L （普通蛋清肽为实施例3中所述相同制备方法制得，仅是将念珠藻蛋白肽替换为等量的市售普通鸡蛋清），球状念珠藻粉组加入剂量为600mg/L （球状念珠藻粉为实施例3中所述制备方法制得， 仅是未加任何酶、未进行过滤后直接真空浓缩、喷雾干燥后制得）。观察记录10min内样品对缩宫素诱发小鼠子宫收缩的作用。试验结束后保存记录文件，用软件提供的区间测量方法测量平均张力、幅度等指标。按下式计算平均张力抑制率、幅度抑制率。平均张力抑制率=给药前平均张力—给药后平均张力/给药前平均张力×100%幅度抑制率=给药前幅度—给药后幅度/给药前幅度×100%

表1 球状念珠藻蛋白肽对缩宫素诱发小鼠子宫收缩平均张力的抑制作用( n＝14)

组别	药物剂量/（mg/L）	平均张力抑制率/%
			空白对照	—	2.44±4.77
硝苯地平	0.0125	58.13±7.69**##
			球状念珠藻蛋白肽	200	41.12±9.21**
普通蛋清肽	200	1.77±4.50##
			球状念珠藻蛋白粉	600	3.42±3.11##

注：与空白对照比较：P<0.05，*P<0.01;

与球状念珠藻蛋白肽比较：P<0.05, ##P<0.01。

表2球状念珠藻蛋白肽对缩宫素诱发小鼠子宫收缩幅度的抑制作用（i±s，n =14）

组别	药物剂量/（mg/L）	平均张力抑制率/%
			空白对照	—	0.99±3.11
硝苯地平	0.0125	41.03±3.85**##
			球状念珠藻蛋白肽	200	30.49±4.29**
普通蛋清肽	200	3.22±3.00##
			球状念珠藻蛋白粉	600	2.29±2.60##

注：与空白对照比较：P<0.05，**P<0.01;

与球状念珠藻蛋白肽比较：P<0.05, ##P<0.01。

实验结果如表1,所示，在抑制缩宫素诱发小鼠子宫收缩平均张力方面，与空白对照比较，硝苯地平对照组、球状念珠藻蛋白肽组与空白对照组有极显著性差异(p<0.01)，普通蛋清肽组、球状念珠藻粉组与空白对照组统计学上差异不显著(p>0.05);与球状念珠藻蛋白肽比较， 硝苯地平对照组极显著的高于球状念珠藻蛋白肽组(p<0.01)，球状念珠藻蛋白肽组极显著的高于普通蛋清肽组、球状念珠藻粉组(p<0.01)。在抑制缩宫素诱发小鼠子宫收缩幅度方面，与空白对照比较，硝苯地平对照组、球状念珠藻蛋白肽组与空白对照组有极显著性差异(p<0.01)，普通蛋清肽组、球状念珠藻粉组与空白对照组统计学上差异不显著(p>0.05);与球状念珠藻蛋白肽比较， 硝苯地平对照组极显著的高于球状念珠藻蛋白肽组(p<0.01)，球状念珠藻蛋白肽组极显著的高于普通蛋清肽组、球状念珠藻粉组(p<0.01)。说明：球状念珠藻蛋白肽能够有效地、显著性地抑制缩宫素诱导的小鼠子宫收缩，作用弱于阳性药物硝苯地平;而普通蛋清肽或未经本发明酶解的乌鸡蛋清粉没有抑制缩宫素诱导的子宫收缩的作用，体现了本发明制备方法的优势。

2.念珠藻蛋白肽对热板法小鼠致痛模型的镇痛作用

取体重20〜25g昆明种雌性小鼠适应环境饲养7天后，分别放置于预热至55±0.5 ℃的恒温热板上，以小鼠自放在热板上至出现舔后足所需时间(秒)作为该鼠的痛阈值，选取痛阈值大于5s，小于30s的合格小鼠40只，随机分成4组，分别为生理盐水组、萘普生对照组、球状念珠藻蛋白肽组、普通蛋清肽组和球状念珠藻粉组，分别测定各组小鼠给药前痛阈值，以两 次测定的痛阈值平均数为最终痛阈值。各组连续灌胃给药5天，阳性药物萘普生的灌胃剂量 为0.15g/kg体重，球状念珠藻蛋白肽组灌胃剂量为2.00g/kg体重(所灌球状念珠藻蛋白肽为实施例2中制备方法制得)，普通蛋清肽组灌胃剂量为2.00g/kg体重(普通蛋清肽为实施例2中所述相同制备方法制得，仅是将乌鸡蛋清替换为等量的市售普通鸡蛋清)，球状念珠藻粉组灌胃剂量为 6.00g/kg体重(球状念珠藻粉为实施例2中所述制备方法相同，仅未加任何酶、未进行过滤后直接真空浓缩、喷雾干燥后制得)，生理盐水组灌胃同体积的生理盐水，各组灌胃体积均相同。每天灌胃前观察小鼠的状态，并记录小鼠体重，以校正每日灌胃给药量，各组给药期间 自由饮食。于小鼠末次灌胃给药2h后，测定药后痛阈值，以两次痛阈值的平均数为最终痛阈值。并计算痛阈提高百分率。

痛阈提高百分率=给药后痛阈值—给药前痛阈值/给药前痛阈值×100%

表3 球状念珠藻蛋白肽对热板法小鼠致痛的镇痛作用( n＝10)

组别	药物剂量/（mg/L）	平均张力抑制率/%
			生理盐水	—	1.22±6.17
萘普生	0.15	61.11.±16.71**##
			球状念珠藻蛋白肽	2.00	39.72±4.58**
普通蛋清肽	2.00	4.99±4.58##
			球状念珠藻蛋白粉	6.00	5.77±5.33##

注：与生理盐水比较：P<0.05，**P<0.01;

与球状念珠藻蛋白肽比较：P<0.05，##P<0.01。

实验结果表明，与生理盐水比较，萘普生对照组、球状念珠藻蛋白肽组痛阈提高百分率都有不同程度的延长。萘普生对照组、球状念珠藻蛋白肽组给药后痛阈提高百分率都极显著高于空白对照组(p<0.01)，普通蛋清肽组、球状念珠藻粉组与空白对照组统计学上差异不显著(p> 0.05)；与球状念珠藻蛋白肽比较，在延长痛阈值方面，球状念珠藻蛋白肽组与萘普生对照组有极显著性 差异(p<0.01);球状念珠藻蛋白肽组极显著高于普通蛋清肽组、球状念珠藻粉组(p<0.01)。说明： 本发明制备方法所得球状念珠藻蛋白肽对热板法致痛小鼠有较好的镇痛作用，且镇痛作用优于普通蛋清肽或未经本发明酶解的球状念珠藻粉，体现了本发明制备方法的优势。以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种用于防治痛经及缓解女性经期不适的球状念珠藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:取球状念珠藻粉或念珠藻胶质置于酶解罐中；当物料的温度达到40-65℃，加入蛋白酶酶解，蛋白酶的用量为干燥球状念珠藻粉质量的0.1%-5%，搅拌酶解时间为2-9小时，酶解后升温灭酶，灭酶温度为85-100℃，灭酶时间10-30分钟；灭酶后酶解液冷却至室温后，取酶解液经过滤、浓缩、干燥即得。

2.根据权利要求1所述的一种用于防治痛经及缓解女性经期不适的球状念珠藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述酶解所用蛋白酶选自木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶中的任意一种单酶或两到三种复配而成的复合酶，复合酶中的各单酶质量占总酶量的百分比范围为0%〜90%，且复合酶中的各酶质量占总酶量的百分比之和为100%。

3.根据权利要求1所述的一种用于防治痛经及缓解女性经期不适的球状念珠藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述酶解在酶解过程中每隔1小时将物料细化均质一次。

4.根据权利要求1所述的一种用于防治痛经及缓解女性经期不适的球状念珠藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述过滤为初滤，或初滤后超滤，超滤所用的有机复合膜材质为芳香聚酰胺、聚哌嗪酰胺类或聚醚砜类，截留分子量范围为小于10000Da。

5.根据权利要求1所述的一种用于防治痛经及缓解女性经期不适的球状念珠藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述干燥的方法为真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥;在喷雾干燥时，设备进口热风温度为85℃—130℃。

6. 根据权利要求1-5任意一种所述的一种用于防治痛经及缓解女性经期不适的球状念珠藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，所制得的球状念珠藻蛋白肽相对分子质量＜10000,肽占总蛋白含量比≥70%。

7.根据权利要求1-6任意一种所述的一种用于防治痛经及缓解女性经期不适的球状念珠藻蛋白肽在制备防治痛经及缓解女性经期不适的保健食品、食品、药品中的应用，其特征在于，所制得的球状念珠藻蛋白肽可作为防治痛经及缓解女性经期不适的保健食品、食品、药品中的有效成分。