CN108524850A - 一种用于增强免疫、防治心脑血管疾病的酒制剂 - Google Patents

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Abstract

一种用于增强免疫、防治心脑血管疾病的酒制剂，其采用人参40～80份、雪莲培养物30～80份、蛹虫草30～80份、山药10～50份、白芷10～50份、木瓜10～50份、肉桂10～50份、桑椹10～50份、玉竹10～50份、枸杞子10～50份、菊花10～50份、茯苓10～50份、牡蛎10～50份、昆布10～50份、陈皮10～50份、黄精10～50份、益智仁10～50份、甘草10～50份、60°基酒2000～5000份、水3000～5000份经粉碎、酶解、浸渍提取、过滤、勾兑、冷冻澄清处理、过滤、灌装制成酒制剂，其有益效果是：本发明采用传统的中草药与现代新资源食品相结合，通过独特的生产工艺，最大程度的提取了有效成分，具有提高人体免疫力、改善血液循环、防治心脑血管疾病、抗氧化、抗衰老的作用。

Description

一种用于增强免疫、防治心脑血管疾病的酒制剂
技术领域
本发明涉及一种中药组方制成的酒制剂，用于增强免疫、防治心脑血管疾病。
背景技术
免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质（如病菌等），或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。人体免疫力低下容易导致病毒的入侵，继而产生各种疾病。现代人因为各种原因对自身健康缺少关注而致使免疫力不断下降。心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病。心脑血管疾病是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年人健康的常见病，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点，即使应用目前最先进、完善的治疗手段，仍可有50%以上的脑血管意外幸存者生活不能完全自理。因此，研发一种既能增强人体免疫，又能防治心脑血管疾病的制剂十分必要。
发明内容
本发明克服现有技术上的不足，提供一种用于增强免疫、防治心脑血管疾病的酒制剂，不但治疗效果好，而且价格低廉，服用方便。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于增强免疫、防治心脑血管疾病的酒制剂，其采用人参、雪莲培养物、蛹虫草、山药、白芷、木瓜、肉桂、桑椹、玉竹、枸杞子、菊花、茯苓、牡蛎、昆布、陈皮、黄精、益智仁、甘草、65°基酒、水为原料，是由下述质量配比：人参40～80份、雪莲培养物30～80份、蛹虫草30～80份、山药10～50份、白芷10～50份、木瓜10～50份、肉桂10～50份、桑椹10～50份、玉竹10～50份、枸杞子10～50份、菊花10～50份、茯苓10～50份、牡蛎10～50份、昆布10～50份、陈皮10～50份、黄精10～50份、益智仁10～50份、甘草10～50份、60°基酒2000～5000份、水3000～5000份经粉碎、酶解、浸渍提取、过滤、勾兑、冷冻澄清处理、过滤、灌装制成酒制剂。其具体制备工艺为：将人参、山药、白芷、木瓜、肉桂、桑椹、玉竹、枸杞子、菊花、茯苓、牡蛎、昆布、橘皮、黄精、益智仁、甘草粉碎成粗粉，放入提取罐中，加入60°基酒密封浸渍30天，每日搅拌一次，一周后，每周搅拌一次，过滤；将雪莲培养物、蛹虫草粉碎过80目筛，置酶解罐中，加入5～20倍的水，加热至50℃，加入0.3%～2%酶活性单位为2万U/g～20万U/g的纤维素酶，在40℃～60℃，PH4.5～6.0的条件下酶解3～8h，然后将温度升至80℃～90℃灭酶15～30分钟，过滤，得酶解液备用；将酶解液倒入浸泡液中，勾兑成20°～35°，将调配好的半成品酒倒入冷冻罐，-5℃～-10℃冷冻24h，冷冻完成后使用硅藻土过滤机进行过滤处理，然后使用板框过滤器0.2～0.4μm进行过滤，灌装即得。
本发明所述的份为质量份，为本领域常用的微克、毫克、克、千克等质量单位。
本发明制剂所述的酶解条件PH值是通过使用食用级的盐酸或氢氧化钠进行调节的。
本发明制剂建议日服有效量为50ml，分两次，饭后服用。
本发明的有益效果是：本发明采用传统的中草药与现代新资源食品相结合，通过独特的生产工艺，最大程度的提取了有效成分，具有以下作用。
1、 提高人体免疫力
本发明中所含有的皂苷类、多糖类、虫草素、氨基酸等均能够改善机体功能，调节免疫细胞，达到提高人体免疫力的功能。
2、改善血液循环、防治心脑血管疾病
制剂中的人参、雪莲培养物、蛹虫草、白芷等多种成分具有清除自由基、扩张血管、调整血压、防止血栓形成、降血糖的作用，尤其是虫草酸即D-甘露醇是治疗心脑血管疾病的基本药物，可有效防治心脑血管疾病。
3、抗氧化、抗衰老
制剂中的雪莲培养物、蛹虫草是很好的抗氧化、抗衰老物质，其次桑椹、玉竹、枸杞子中也含抗氧化抗衰老的成分，诸成分相结合使本发明制剂抗氧化、抗衰老效果更佳。
综上，本发明制剂适用于因免疫低下所引起的体质虚弱、精神萎靡、疲乏无力、食欲降低、睡眠障碍等症状，同时也适用于心脑血管疾病引起的高血压、高血糖、动脉粥样硬化等症。
配方依据。
人参，微苦，性平。归脾、肺、心经。具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津，安神的功效。用于体虚欲脱，肢冷脉微，脾虚食少，肺虚喘咳，津伤口渴，内热消渴，久病虚羸，惊悸失眠，阳痿宫冷；心力衰竭，心原性休克等症。主要化学成分有人参皂苷,还有少量的挥发油，此外还有葡萄糖、果糖等单糖。现代研究表明人参对心脑血管疾病、胃病、糖尿病、免疫力低下、心肌无力等症状都有一定的作用。人参对于高血压病、心肌营养不良、冠状动脉硬化、心绞痛等，都有一定时治疗作用，可以减轻各种症状。人参对不正常的血压具有调整作用，或认为不同的剂量可以出现不同的作用：小剂量能提高血压，大剂量能降低血压。人参对因肾上腺素引起的高血糖动物有降低血糖的作用；对糖尿病患者除能自觉改善症状外，还有轻微的降血糖作用，并与胰岛素有协同作用。人参皂苷成分，特别是人参皂苷Rb2，可以明显地改善高血脂及促进肝的蛋白质代谢、并且抑制实验糖尿动物的高血糖。可用于糖尿病者调理及辅助之用。人参皂苷和人参多糖是人参调节免疫功能的活性成分，不但对正常人，而且对免疫功能低下的人均有提高免疫功能作用，经过动物实验和人体临床实验观察，证实能显著增强人体免疫力，对恶性肿瘤有一定的疗效，可延长病人生存时间，提高机体细胞免疫功能，且减轻放疗的毒副作用，加快损伤组织的修复。
雪莲培养物，是在无菌条件下，将雪莲离体的植物器官、组织、细胞、胚胎或原生质体培养在人工配制的培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其组织或细胞增值进而按照需要进行培养的技术；或使其脱分化产生愈伤组织，并再逐步分化出器官并长成完整的植株而生产的培养物。雪莲培养物不仅含有与天然雪莲相近的活性成分,且亦具有与之相当的多方面的药理活性。其主要药理作用有镇痛、抗炎、抗风湿，抑制血小板聚集、降血脂、改善血液循环，对免疫系统具有调节作用，同时还有抗氧化、抗辐射、和抗疲劳等多方面的药效学作用。
蛹虫草，又叫北冬虫夏草，北虫草，简称蛹草。蛹虫草中含有大量的虫草素和虫草多糖，具有扶正固本作用，对老年性慢性支气管炎、肺原性心脏病有显著疗效，能提高肝脏解毒能力，起护肝作用，还可提高身体抗病毒和抗辐射能力。虫草酸即D-甘露醇是治疗心脑血管疾病的基本药物，具有清除自由基、扩张血管、降低血压的作用。核苷酸具有抑制血小板聚集、防止心脑血栓形成，消除黄褐斑、老年斑、青春痘，抗衰防皱，养颜美容等作用。
山药，味甘、平、无毒，归脾、肺、肾经。山药含皂苷类、黏液质、胆碱、淀粉、糖蛋白和17种以上的氨基酸，此外还含有尿囊素、多巴胺等，另含多糖等。具有健脾和胃，益肺补肾之功效。《本草正》：“山药，能健脾补虚，滋清固肾，治诸虚百损，疗五劳七伤”。现代药理研究结果表明：山药对小鼠细胞免疫功能和体液免疫有较强的促进作用；抗氧化；给小鼠腹腔注射山药水剂能显著延长小鼠存活时间，具有极显著的常压耐缺氧作用。
白芷，味辛，温。归肺、脾、胃经。含异欧前胡素、欧前胡素、佛手柑内酯、珊瑚菜素、氧化前胡素等。具有祛风，燥湿，消肿，止痛之功效。其所含的异欧前胡素和印度榅桲素具有降血压的作用，临床观察白芷有消肿止痛，化瘀生新之功，用白芷治疗消化性溃疡，除能理气止痛还能生肌长肉，化瘀效果良好。有学者认为白芷具有消肿与止痛，生肌与敛疡的双重调节治疗作用；有消除肿胀，修复愈合溃疡，软化斑痕，调节神经腺体之功能。
肉桂，味辛、甘，性热；归肾、心、脾、肝经。具有补火助阳，引火归源，散寒止痛，活血通经之功效，可用于阳痿、宫冷、心腹冷痛、虚寒吐泻、经闭、痛经、温经通脉等症。肉桂中所含的桂皮醛对中枢神经系统有一定的作用，有研究表明，桂皮醛以250－500 mg/kg灌胃，能减少小鼠自发活动，对抗苯丙胺产生的过度活动；桂皮醛还可对抗阿朴吗啡及去氧麻黄碱的运动兴奋，使体温下降，但对抗利血平引起的体温下降；用小鼠压尾法或腹腔注射醋酸扭体法表明桂皮醛有镇痛作用。肉桂水提物及挥发油对大鼠在冰水应激状态下内源性儿茶酚胺分泌增加所致的血小板聚集及心肌损伤有一定对抗及保护作用；肉桂煎剂可使麻醉犬冠脉、脑血流量增加，血管阻力下降；肉桂煎剂、桂皮醛及香豆素对ADP诱导大鼠血小板聚集有抑制作用。
桑椹，味甘、酸，性微寒。归心、肝、肾经。有补血滋阴，生津止渴，润肠燥之功效。桑椹中含糖、鞣酸、苹果酸及维生素 B1、B2、C和胡萝卜素等，具有改善皮肤（包括头皮）血液供应，营养肌肤、使皮肤白嫩及乌发等作用，并能延缓衰老。中医认为，桑椹性味甘寒，具有补肝益肾、生津润肠、乌发明日等功效，是中老年人健体美颜、抗衰老的佳果与良药。
玉竹，味甘，平。归肺、胃经。主要化学成分为玉竹粘多糖及4种玉竹果聚糖，吖丁啶-2-羧酸等。具有养阴，润燥，除烦，止渴的功能。用于热病阴伤，咳嗽烦渴，虚劳发热，消谷易饥，小便频数等症。本品具有促进实验动物抗体生成，提高巨噬细胞的吞噬百分数和吞噬指数，促进干扰素合成，抑制结核杆菌生长，降血糖，降血脂，缓解动脉粥样斑块形成，使外周血管和冠脉扩张，延长耐缺氧时间，强心，抗氧化，抗衰老等作用。
枸杞子，味甘，平。归肝、肾经。具有滋补肝肾，益精明目之功效。含有甜菜碱、多糖、粗脂肪、粗蛋白、胡萝卜素、多种维生素及钙、磷、铁、锌、锰、亚油酸等营养成分。枸杞子具有升高外周白细胞、增强网状内皮系统吞噬能力，又增强细胞与体液免疫的作用；对造血功能有促进的作用；还能抗衰老、抗突变、抗肿瘤、保肝及降血糖等。用于虚劳精亏，腰膝酸痛，眩晕耳鸣，内热消渴，血虚萎黄，目昏不明。
菊花，味辛，甘，苦；性微寒。归肺、肝经。有散风清热，平肝明目之功。主要化学成分香叶木素。可用于风热感冒，头痛眩晕，目赤肿痛，眼目昏花。菊花在体外对革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌及β-溶血性链球菌)、人型结核杆菌有某些抑制作用；还可增强毛细血管抵抗力。
茯苓，味甘、淡，平。归肝、胃经。具有渗湿利水，益脾和胃，宁心安神的功效。菌核含β-茯苓聚糖约占干重93%和三萜类化合物乙酰茯苓 酸、茯苓酸、3β-羟基羊毛甾三烯酸。此外，尚含树胶、甲壳质、蛋白质、脂肪、甾醇、卵磷脂、葡萄糖、腺嘌呤、组氨酸、胆碱、β-茯苓聚糖分解酶、脂肪酶、蛋白酶等。用于小便不利，水肿胀满，痰饮咳逆，呕哕，泄泻，遗精，淋浊，惊悸，健忘等症。
陈皮，味苦、辛，性温。归肺、脾经。理气健脾，燥湿化痰。含挥发油、橙皮甙、维生素B、C等成分。用于胸脘胀满，食少吐泻，咳嗽痰多。
牡蛎，味咸、涩，性寒。归肝、肾经。具有平肝潜阳，重镇安神，软坚散结，收敛固涩之功效。含糖元，牛磺酸，10种必需氨酸，无机盐，碘，脂类等。用于眩晕耳鸣，惊悸失眠，瘰疬瘿瘤，症瘕痞块，自汗盗汗，遗精，崩漏，带下等症。
昆布，味咸，性寒；入肝、胃、肾经。消痰软坚，利水消肿。含藻胶素、甘露醇、半乳聚糖、海带氨酸、海带聚糖、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、维生素B1、C、P和磺、钾等。用于瘿瘤瘰疬，水肿等症。
黄精，味甘、性平，归脾、肺、肾经。具有补气养阴，健脾，润肺，益肾之功效，可用于脾胃虚弱，体倦乏力，口干食少，肺虚燥咳，精血不足，内热消渴等症。现代药理研究表明黄精能提高机体免疫功能、降血脂、抗动脉粥样硬化、降血压、扩张冠脉及抗心肌缺血、改善微循环、抗衰老、降血糖等作用。
益智仁，味辛，性温。归脾、肾经。具有温脾止泻摄涎，暖肾缩尿固精之功效。可用于脾胃虚寒，呕吐，泄泻，腹中冷痛，口多唾涎，肾虚遗尿，尿频，遗精，白浊等症。益智仁的甲醇提取物有增强豚鼠左心房收缩力的活性，其最低有效剂量为10-6g/ml，报告者认为， 益智酮甲的强心作用，部分是因为它对心肌内钠钾泵的抑制所致，因此我们是可以通过益智仁来保护心脏健康的。
甘草，味甘，性平。归脾、胃、肺经。具有补脾益气、清热解毒、润肺止咳、调和诸药之功效，主治咽喉肿痛，咳嗽，脾胃虚弱，胃、十二指肠溃疡，肝炎，癔病，痈疖肿毒，药物及食物中毒等。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1：一种用于增强免疫、防治心脑血管疾病的酒制剂，其采用人参60g、雪莲培养物50g、蛹虫草50g、山药30g、白芷30g、木瓜30g、肉桂30g、桑椹30g、玉竹30g、枸杞子30g、菊花30g、茯苓30g、牡蛎30g、昆布30g、陈皮30g、黄精30g、益智仁30g、甘草30g、60°基酒2000ml、水适量，经粉碎、酶解、浸渍提取、过滤、勾兑、冷冻澄清处理、过滤、灌装制成酒制剂。其具体制备工艺为：将人参、山药、白芷、木瓜、肉桂、桑椹、玉竹、枸杞子、菊花、茯苓、牡蛎、昆布、橘皮、黄精、益智仁、甘草粉碎成粗粉，放入提取罐中，加入60°基酒密封浸渍30天，每日搅拌一次，一周后，每周搅拌一次，过滤；将雪莲培养物、蛹虫草粉碎过80目筛，置酶解罐中，加入10倍的水，加热至50℃，加入1%酶活性单位20万U/g的纤维素酶，在50℃，PH5.0的条件下酶解5h，然后将温度升至90℃灭酶15分钟，过滤，得酶解液备用；将酶解液倒入浸泡液中，勾兑成20°，将调配好的半成品酒倒入冷冻罐，-5℃～-10℃冷冻24h，冷冻完成后使用硅藻土过滤机进行过滤处理，然后使用板框过滤器0.22μm进行过滤，灌装即得。每日服用50ml，分2次服用。
实施例2：一种用于增强免疫、防治心脑血管疾病的酒制剂，其采用人参40g、雪莲培养物80g、蛹虫草30g、山药50g、白芷50g、木瓜50g、肉桂20g、桑椹20g、玉竹20g、枸杞子50g、菊花50g、茯苓20g、牡蛎30g、昆布20g、陈皮30g、黄精30g、益智仁20g、甘草20g、65°基酒3000ml、水适量，经粉碎、酶解、浸渍提取、过滤、勾兑、冷冻澄清处理、过滤、灌装制成酒制剂。其具体制备工艺为：将人参、山药、白芷、木瓜、肉桂、桑椹、玉竹、枸杞子、菊花、茯苓、牡蛎、昆布、橘皮、黄精、益智仁、甘草粉碎成粗粉，放入提取罐中，加入65°基酒密封浸渍30天，每日搅拌一次，一周后，每周搅拌一次，过滤；将雪莲培养物、蛹虫草粉碎过80目筛，置酶解罐中，加入15倍的水，加热至50℃，加入0.5%酶活性单位10万U/g的纤维素酶，在60℃，PH5.5的条件下酶解6h，然后将温度升至80℃灭酶20分钟，过滤，得酶解液备用；将酶解液倒入浸泡液中，勾兑成25°，将调配好的半成品酒倒入冷冻罐，-5℃～-10℃冷冻24h，冷冻完成后使用硅藻土过滤机进行过滤处理，然后使用板框过滤器0.22μm进行过滤，灌装即得。每日服用50ml，分2次服用。
实施例3：一种用于增强免疫、防治心脑血管疾病的酒制剂，其采用人参80g、雪莲培养物30g、蛹虫草80g、山药20g、白芷20g、木瓜40g、肉桂40g、桑椹40g、玉竹10g、枸杞子20g、菊花20g、茯苓50g、牡蛎20g、昆布20g、陈皮50g、黄精20g、益智仁20g、甘草40g、63°基酒5000ml、水适量，经粉碎、酶解、浸渍提取、过滤、勾兑、冷冻澄清处理、过滤、灌装制成酒制剂。其具体制备工艺为：将人参、山药、白芷、木瓜、肉桂、桑椹、玉竹、枸杞子、菊花、茯苓、牡蛎、昆布、橘皮、黄精、益智仁、甘草粉碎成粗粉，放入提取罐中，加入63°基酒密封浸渍30天，每日搅拌一次，一周后，每周搅拌一次，过滤；将雪莲培养物、蛹虫草粉碎过80目筛，置酶解罐中，加入20倍的水，加热至50℃，加入2%酶活性单位20万U/g的纤维素酶，在40℃，PH5.0的条件下酶解4h，然后将温度升至90℃灭酶15分钟，过滤，得酶解液备用；将酶解液倒入浸泡液中，勾兑成35°，将调配好的半成品酒倒入冷冻罐，-5℃～-10℃冷冻24h，冷冻完成后使用硅藻土过滤机进行过滤处理，然后使用板框过滤器0.4μm进行过滤，灌装即得。每日服用50ml，分2次服用。
实施例4：使用实施例1中制成的本发明制剂，对本发明增强免疫的功能进行验证。
1.材料。
1.1样品：
棕红色澄清透明酒制剂，人体推荐量50ml/60kg BW，每日50ml，室温保存，供试验用。
1.2实验动物：
选用17.0～20.0g健康二级雌性ICR小鼠60只，分为4组，每组15只，作为免疫Ⅰ组，进行脏器体重比值测定、迟发型变态反应实验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、半数溶血值（HC50）的测定和抗体生成细胞数的测定；16.0～17.9g健康二级雌性ICR小鼠60只，分为4组，每组15只，作为免疫Ⅱ组，进行碳廓清实验；16.0～16.7g健康二级雌性ICR小鼠60只，分为4组，每组15只，作为免疫Ⅲ组，进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和NK细胞活性测定。
1.3剂量组选择与受试物给予方式：
推荐剂量每人（按60kg体重计）每日50ml本发明制剂，相当于0.83ml/kg BW。实验设人体推荐量的10倍即每日8.33ml/kg BW，上、下各设一个剂量组：15.00 ml/kg BW和0.83 ml/kg BW。0.00 ml/kg BW剂量组以水代替受试物。实验小鼠以远交系小鼠专用料喂饲，经口每日一次灌胃给予小鼠受试物，连续给予30d后测各项指标。
1.4主要仪器与试剂：
动物天平、分析天平、洁净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、分光光度计、恒温水浴、酶标仪、显微镜等。无菌手术器械、游标卡尺（精密度0.01mm）、微量注射器（25μL）、细胞计数器、24孔和96孔平地细胞培养板、96孔U型细胞培养板、玻璃平皿、纱布、试管、玻片架、200目网筛、计时器、血色素吸管、载玻片等。绵阳红细胞（SRBC）、生理盐水、Hank’液（PH7.2～7.4）、RPMI1640培养液、小牛血清、青链霉素、刀豆蛋白A（ConA）、1%冰醋酸、1moL/L的HCl溶液、酸性异丙醇（96mL异丙醇加1moL/L的HCl溶液4mL）、MTT、PBS缓冲液（PH7.2～7.4）、补体（豚鼠血清）、SA缓冲液、琼脂糖、都氏试剂（碳酸氢钠1.0g，高铁氰化钾0.2g，氰化钾0.05g，加蒸馏水至1000mL）、YAC-1细胞、乳酸钠、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶Ⅰ、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液（PH8.2）、2.5%Triton、印度墨汁、0.1%NaCO3、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液等。
1.5实验方法。
1.5.1脏器体重比值的测定。
小鼠称重后脱臼处死，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算脾脏体重比值和胸腺体重比值。
1.5.2迟发型变态反应（足跖增厚法）实验（DTH）。
取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2%（v/v,用生理盐水配制）压积SRBC（2000rpm，10min）0.2mL，至敏后4d，测量左后足跖部厚度，同一部位测量3次，取平均值。然后在测量部位皮下注射20%（v/v,用生理盐水配制）压积SRBC 20μL，于注射后24h测量左后足跖部厚度，以攻击前后足跖厚度的差值（足跖肿胀度）来表示DTH的程度。
所得数据为计量资料，若受试物组攻击前后足跖厚度的差值明显高于0.000g/kgBW组，且差异有显著性（P＜0.05）,可判定该受试物有提高小鼠的迟发型变态反应能力的作用。
1.5.3 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验（MTT法）。
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，制成细胞悬液。用Hank’s液洗3次，每次离心10min(1000rpm)。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，计数活细胞数，调整细胞浓度2×106个/mL。再将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，在其中一孔加50μL ConA液（相当于5μg/mL）,另一孔作为对照，置5%CO2，37℃培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后将此液体移入96孔培养板上，每孔作3个平行孔，用酶标仪测定，波长570nm。淋巴细胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表示。
所得数据为计量资料，若受试物组淋巴细胞的增殖能力明显高于0.000g/kg BW组，且差异有显著性（P<0.05）,可判定该受试物有提高ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力的作用。
1.5.4 抗体生成细胞数的测定（Jerne改良玻片法）。
取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2%（v/v,用生理盐水配制）压积SRBC0.2mL。将SRBC免疫5d后的小鼠处死，取脾，制成细胞悬液。将琼脂糖加热溶解后，与等量双倍Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加10%（v/v，用SA液配制）压积SRBC50μL、脾细胞悬液20μL，迅速混匀后，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1.5h,然后用SA缓冲液稀释的补体（1：10）加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。
所得数据为计量资料，若受试物组的溶血空斑数明显高于0.000g/kg BW组，且差异有显著性（P＜0.05）,可判定该受试物有增加小鼠的抗体生成细胞数的作用。
1.5.5 半数溶血值（HC50）的测定。
取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2%（v/v,用生理盐水配制）压积SRBC0.2mL进行免疫。5d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h,将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000rpm离心10min，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释为400倍，取1mL置试管内，依次加入10%（v/v，用SA缓冲液配制）压积SRBC 0.5mL，补体1mL（用SA缓冲液按1:10稀释）。另设不加血清的对照管（以SA缓冲液代替）。置37℃恒温水域中保温30min后，冰浴终止反应。2000rpm离心10min，取上清1mL，加都氏试剂3mL。同时取10%（v/v，用SA缓冲液配制）压积SRBC 0.25mL，加都氏试剂至4mL于另一试管中，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值（HC50）表示，按下式计算
样品半数溶血值=样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数。
所得数据为计量资料，若受试物组的半数溶血值明显高于0.000g/kg BW组，且差异有显著性（P＜0.05）,可判定该受试物有提高小鼠的半数溶血值的作用。
1.5.6 小鼠碳廓清实验。
小鼠尾静脉注射1:3.5稀释的印度墨汁，待墨汁注入，立即计时。注入墨汁后2、10min,分别从内眦静脉丛取血20μL，并将其加到2mLNa2CO3溶液中。用分光光度计在600nm波长处测光密度值（OD），以Na2CO3溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏称重。按下式计算a:
K=(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1) a=体重÷（肝重+脾重）×k1/3
所得数据为计量资料，若受试物组的吞噬指数明显高于0.000g/kg BW组，且差异有显著性（P＜0.05）,可判定该受试物有提高小鼠单核-巨噬细胞的碳廓清能力的作用。
1.5.7 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（滴片法）。
用颈椎脱臼法处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank’s液4mL/只，轻轻按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬细胞，然后将腹壁剪开一个小口，用胶头吸管吸取腹腔洗液2mL于试管内（或用注射器）。用1mL加样器吸取腹腔洗液0.5mL加入盛有0.5mL1%鸡血红细胞悬液的试管内，混匀。用注射器（装大针头）吸取0.5mL混合液，加入玻片的琼脂圈内。放置孵箱内37℃孵育15分钟。孵育结束后迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醇液中固定1分钟，Giemsa液染色15分钟。用蒸馏水冲洗干净，晾干，用40×显微镜计数吞噬率和吞噬指数。
吞噬率%=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100。
吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数。
所得数据为计量资料，若受试物组的吞噬率或吞噬指数明显高于0.000g/kg BW组，且差异有显著性（P＜0.05）,可判定该受试物有提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的作用。
1.5.8 NK细胞活性的测定（乳酸脱氢酶LDH测定法）。
实验前24h将靶细胞YAC-1进行传代培养，应用前以Hank’s液洗3次，用含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。受试小鼠拉颈处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hank’s液洗3次，1500rpm离心10min，再用2mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用台酚兰染色计数（活细胞数应在95%以上），调整细胞浓度为2×107个/mL，使效靶比为50:1。取靶细胞和效应细胞各100μL，加入U形96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各100μL；上述各项均设三个平行孔，37℃，5%CO2培养箱中培养4h，将96孔板以1500rpm离心5min，每孔吸取上清100μL置酶标板中，加入LDH基质液100μL，反应10min，然后每孔加入1mol的HC1溶液30μL终止反应，在酶标仪490nm处测OD值，NK细胞活性按下式计算：
NK%=（反应孔OD-自然释放孔OD）/（最大释放孔OD-自然释放孔OD）×100
LDH基质液的配制：乳酸钠5×10-2mol/L
硝基氯化四氮唑6.6×10-4mol/mL
吩嗪二甲酯硫酸盐2.8×10-4mol/mL
氧化型辅酶I 1.3×10-3mol/mL
将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris-HC1缓冲液中（pH8.2）。
所得数据为计量资料，若受试物组的NK细胞活性明显高于0.000g/kg BW组，且差异有显著性（P＜0.05）,可判定该受试物有提高小鼠NK细胞活性的能力。
1.6 实验数据统计。
实验数据用Stata软件对各实验原始数据进行方差齐性检验，满足“方差齐”要求的数据资料用单因素方差分析方法和多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理；对非正态分布或方差不齐的数据资料进行适当的变量转换，待满足“正态方差齐”要求后，用转换所得的数据进行计处理。
1.7结果判定。
增强免疫力功能判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。
其中细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一实验的一个以上剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。体液免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一实验的一个以上的剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性。单核-巨噬细胞功能测定实验一个以上剂量组结果阳性，可判定单核-巨噬细胞功能测定结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量组结果阳性，可判定NK细胞活性结果阳性。
2结果。
2.1本发明制剂对小鼠体重的影响。
表1 本发明制剂对小鼠体重的影响（±SD）
原始数据进行方差齐性检验后，符合方差齐的要求，用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表1可见，初始体重在各剂量组与0.00ml/kg BW组间比较，差异均无显著性（P＞0.05），即小鼠的初始体重在各组间较为均衡。经口给予小鼠不同剂量的本发明制剂30d，终体重在各剂量组与其相应的0.00ml/kg BW组间比较，差异均无显著性（P＞0.05），即本发明制剂对小鼠体重增长无影响。
2.2本发明制剂对小鼠脏器体重比值的影响。
表2 本发明制剂对小鼠脾脏体重比值的影响（±SD）
经口给予小鼠不同剂量的本发明制剂30d，原始数据进行方差齐性检验后，符合方差齐的要求，用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表2可见，在各剂量组与0.00ml/kg BW组间比较，差异均无显著性（P＞0.05），本发明制剂对小鼠脾脏体重比值无影响。
表3 本发明制剂对小鼠胸腺体重比值的影响（±SD）
经口给予小鼠不同剂量的本发明制剂30d，原始数据进行方差齐性检验后，符合方差齐的要求，用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表3可见，在各剂量组与0.00ml/kg BW组间比较，差异均无显著性（P＞0.05），本发明制剂对小鼠胸腺体重比值无影响。
表4 本发明制剂对小鼠迟发型变态反应的影响（±SD）
**P＜0.01
经口给予小鼠不同剂量的本发明制剂30d，原始数据进行方差齐性检验后，符合方差齐的要求，用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表4可见，在各剂量组与0.00ml/kg BW组间比较，差异均有极显著性（P＜0.01），即本发明制剂在0.83ml/kg BW组、8.33ml/kg BW组、15.00ml/kg BW组均能提高小鼠的迟发型变态反应能力。
表5 本发明制剂对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响（±SD）
经口给予小鼠不同剂量的本发明制剂30d，原始数据进行方差齐性检验后，符合方差齐的要求，用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表5可见，在各剂量组与0.00ml/kg BW组间比较，差异均无显著性（P＞0.05），即本发明制剂对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力无影响。
由表4、5可见，本发明制剂小鼠免疫功能测定结果阳性。
2.4本发明制剂对小鼠体液免疫的影响。
表6 本发明制剂对小鼠抗体生成细胞数的影响（±SD）
*P＜0.01
经口给予小鼠不同剂量的本发明制剂30d，原始数据进行方差齐性检验后，符合方差齐的要求，用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表6可见，在15.00ml/kg BW组与0.00ml/kg BW组间比较，差异均有显著性（P＜0.05），在其余各剂量组与0.00ml/kg BW组间比较，差异均无显著性（P＞0.05）。即本发明制剂在15.00ml/kg BW组能提高小鼠抗体生成细胞数。
表7 本发明制剂对小鼠半数溶血值的影响（±SD）
*P＜0.05
经口给予小鼠不同剂量的本发明制剂30d，原始数据进行方差齐性检验后，符合方差齐的要求，用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表7可见，在8.33ml/kg BW组与0.00ml/kg BW组间比较，差异有显著性（P＜0.05），在其余各剂量组与0.00ml/kg BW组间比较，差异均无显著性（P＞0.05）。即本发明制剂在8.33ml/kg BW组能增加小鼠的半数溶血值。
由表6、7可见，本发明制剂小鼠体液免疫功能测定结果阳性。
2.5本发明制剂对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响。
表8 本发明制剂对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清能力的影响（±SD）
经口给予小鼠不同剂量的本发明制剂30d，原始数据进行方差齐性检验后，符合方差齐的要求，用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表8可见，各剂量组与0.00ml/kg BW组间比较，差异均无显著性（P＞0.05）。即本发明制剂对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清能力无影响。
表9 本发明制剂对小鼠巨噬细胞鸡红细胞吞噬率的影响（±SD）
*P＜0.05 ** P＜0.01
经口给予小鼠不同剂量的本发明制剂30d，原始数据进行平方根反正弦转换后，经过方差齐性检验，符合方差齐的要求，用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表9可见，在8.33ml/kg BW组与0.00ml/kg BW组间比较，差异有显著性（P＜0.05），在15.00ml/kg BW组与0.00ml/kg BW组间比较，差异有极显著性（P＜0.01），在0.83ml/kg BW组与0.00ml/kg BW组间比较，差异无显著性（P＞0.05）。即本发明制剂在8.33ml/kg BW组、15.00ml/kg BW组能提高小鼠巨噬细胞鸡红细胞吞噬率。
表10 本发明制剂对小鼠巨噬细胞鸡红细胞吞噬指数的影响（±SD）
*P＜0.05 ** P＜0.01
经口给予小鼠不同剂量的本发明制剂30d，原始数据进行方差齐性检验后，符合方差齐的要求，用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表10可见，在8.33ml/kg BW组与0.00ml/kg BW组间比较，差异有显著性（P＜0.05），在15.00ml/kg BW组与0.00ml/kg BW组间比较，差异有极显著性（P＜0.01），在0.83ml/kg BW组与0.00ml/kg BW组间比较，差异无显著性（P＞0.05）。即本发明制剂在8.33ml/kg BW组、15.00ml/kg BW组能提高小鼠巨噬细胞鸡红细胞的吞噬指数。
由表8、9、10可见，本发明制剂小鼠单核-巨噬细胞功能测定结果阳性。
2.6本发明制剂对小鼠NK细胞活性的影响。
表11 本发明制剂对小鼠NK细胞活性的影响（±SD）
经口给予小鼠不同剂量的本发明制剂30d，原始数据非正态分布，进行平方根反正弦转换后，符合正态方差齐的要求，用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表11可见，在各剂量组与0.00ml/kg BW组间比较，差异均无显著性（P＞0.05）。即本发明制剂对小鼠NK细胞活性无影响，即小鼠NK细胞活性测定结果阴性。
3 小结。
经口给予小鼠不同剂量的本发明制剂30d，对小鼠胸腺体重比值、脾脏体重比值无影响。对小鼠的体重无不良影响。小鼠的细胞免疫功能、体液免疫功能、小鼠的单核-巨噬细胞功能结果均为阳性，NK细胞活性测定结果为阴性。由此可见，本发明制剂具有增强免疫力的功能。
实施例5：使用实施例1中制备的本发明制剂，对本品的预防心血管疾病效果进行检验。
1 受试对象标准：
单纯的具有心脑血管疾病的患者，年龄在45～65岁之间。
2 实验设计与分组：
采用自身和组间两种对照设计。按上述标准选择200例受试者，根据随机双盲的要求进行分组，分为试食组和对照组，尽可能考虑影响结果的主要因素如年龄、性别、饮食等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每组受试者100例。试食组每人每天服用该发明2次，每次25mL，对照组服用安慰剂，连续服用60天。
分组情况见表12。试食前两组受试者年龄、性别、血液中血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）均无明显差异（P＞0.05），具有可比性。
表12 试食前一般资料比较
项目 对照组 试食组
例数 100 100
男/女 67/33 65/35
平均年龄 48.33±9.45 48.54±9.36
TC 6.48±0.64 6.34±0.56
TG 2.43±0.38 2.55±0.61
HDL-C 1.86±0.25 1.91±0.35
试食后情况见表13。
表13 试食后试食组和对照组的比较
项目 对照组 试食组
例数 100 100
男/女 67/33 65/35
平均年龄 46.33±9.55 46.54±9.35
TC 6.15±0.54 4.33±0.51
TG 2.41±0.32 1.22±0.53
HDL-C 1.77±0.24 1.13 ± 0.46
由表13可见，服食后60天，试食组试食前后血液中血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）均明显降低（P＜0.05），且明显好于对照组，两组间差异极为显著（P＜0.05）。
3 结果
试服本发明制剂60天后，试食组试食前后自身比较及试食后试食组与对照组组间比较，血液中血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）均明显降低（P＜0.05），所以该发明有调节血脂的作用，可以很好的防治心血管疾病。

Claims (2)

1.一种用于增强免疫、防治心脑血管疾病的酒制剂，其采用人参40～80份、雪莲培养物30～80份、蛹虫草30～80份、山药10～50份、白芷10～50份、木瓜10～50份、肉桂10～50份、桑椹10～50份、玉竹10～50份、枸杞子10～50份、菊花10～50份、茯苓10～50份、牡蛎10～50份、昆布10～50份、陈皮10～50份、黄精10～50份、益智仁10～50份、甘草10～50份、60°基酒2000～5000份、水3000～5000份经粉碎、酶解、浸渍提取、过滤、勾兑、冷冻澄清处理、过滤、灌装制成酒制剂。
2.根据权利要求1所述的一种用于增强免疫、防治心脑血管疾病的酒制剂，去特征在于具体制备工艺为：将人参、山药、白芷、木瓜、肉桂、桑椹、玉竹、枸杞子、菊花、茯苓、牡蛎、昆布、橘皮、黄精、益智仁、甘草粉碎成粗粉，放入提取罐中，加入60°基酒密封浸渍30天，每日搅拌一次，一周后，每周搅拌一次，过滤；将雪莲培养物、蛹虫草粉碎过80目筛，置酶解罐中，加入5～20倍的水，加热至50℃，加入0.3%～2%酶活性单位2万U/g～20万U/g的纤维素酶，在40℃～60℃，PH4.5～5.5的条件下酶解3～8h，然后将温度升至80℃～90℃灭酶15～30分钟，过滤，得酶解液备用；将酶解液倒入浸泡液中，勾兑成20°～35°，将调配好的半成品酒倒入冷冻罐，-5℃～-10℃冷冻24h，冷冻完成后使用硅藻土过滤机进行过滤处理，然后使用板框过滤器0.2～0.4μm进行过滤，灌装即得。
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