CN105901698A - 一种木耳多糖功能性食品 - Google Patents

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Abstract

本发明属于保健食品领域，具体涉及一种木耳多糖功能性食品。该功能性食品由以下重量份数的原料组成：黑木耳多糖20‑50份，银耳多糖20‑50份，灵芝多糖10‑20份，牛磺酸1‑10份，L‑精氨酸3‑5份，低聚果糖2‑10份，茶多酚0.01‑0.02份，麦精10‑80份，植物乳杆菌粉剂10‑20份。本发明所提供的多糖提取方法使得多糖提取率得到提高，使产品具有较好的提高免疫力的效果，并且获得的产品具有较好的降解胆固醇的功效。

Description

一种木耳多糖功能性食品
技术领域：
本发明属于营养保健食品领域，具体涉及一种木耳多糖功能性食品。
背景技术：
木耳多糖是从木耳中提取的多糖成分，具有降血脂降低胆固醇的功效。有一定的调节机体免疫功能的作用，其作用是多途径、多环节、多靶点的，如促进免疫细胞增殖与分化，分泌各种淋巴因子，调节神经-内分泌-免疫调节网络(NIM)的平衡等。
研究表明，黑木耳多糖具有多种生物活性，而且不同化学结构和不同构象的黑木耳多糖组分表现不同的生理活性。经研究发现，黑木耳多糖对细胞免疫和体液免疫功能具有良好的促进作用，具有抗白细胞降低、抗肿瘤、抗辐射、抗突变、抗炎症等细胞保护作用；具有降低血脂、胆固醇、血液粘度，抗血栓形成作用；具有降低血糖、抗糖尿病以及降低脂褐质含量，增强SOD活力，减少有害物质自由基产生的功能；同时还能促进核酸、蛋白质的生物合成和防治多种老年性疾病。
银耳(Tremella fuciformisBerk)，俗称白木耳，子实体中得到银耳多糖(Tremellam)是一种酸性杂多糖，具有改善机体免疫功能及提升白细胞的作用。可显著提高实验动物网状内皮细胞的吞噬功能，有促进非特异性免疫作用，提高免疫球蛋白、血清总补体的水平。可预防和治疗由放射与抗肿瘤药物(如CTX)引起的骨髓抑制，也能促进肝脏内蛋白质的合成。
灵芝多糖是由三股单糖链构成的、具有螺旋状立体构形(三级结构)的葡聚糖，其立体构形与脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)相似，是一种大分子化合物，其分子量从数千到数十万，它是一种从灵芝孢子粉或灵芝中提取的物质。灵芝多糖是灵芝的最有效成分之一，因此，也特别受到药科技工作者的重视，对它的研究报道也最多。已分离到的灵芝多糖有200多种，其中有数十种的结构已被搞清，分子量已被测定。
灵芝多糖有多方面的药理活性:能提高机体免疫力，加速血液微循环，提高血液供氧能力，降低机体静止状态下的无效耗氧量，消除体内自由基，提高机体细胞膜的封闭度，抗放射，提高肝脏、骨髓、血液合成DNA,RNA，蛋白质的能力，延长寿命等。灵芝的多种药理活性大多和灵芝多糖有关。
现代科技表明，真菌多糖是食用菌中所含的最重要的药效成分。是一种β-型的多糖，具有广泛的药理活性。灵芝、冬虫夏草、木耳、银耳、香菇、猴头菇、白灵菇、竹黄、云芝、鸡腿蘑、松茸、桑黄等食用菌，都含有真菌多糖。
中国发明专利201110407414.2公布了一种具有保健作用的真菌营养液，该营养液以香菇、灰树花、猴头菇、云芝等真菌为主要原料，辅以低聚木糖、异麦芽酮糖醇、牛磺酸、赖氨酸、维生素E、黄原胶和水等营养素加工而成，原料配伍科学，协同作用，具有提高人体免疫力和促进机体胃粘膜损伤修复双功能保健作用。
益生菌，是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。其广泛应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。
调节肠胃功能紊乱是益生菌最广为人知的功能之一，除此之外，益生菌还具有产生营养物质、抵抗细菌病毒的感染以及预防治疗某些疾病的功能。本发明将提供一种添加有益生菌的复合木耳多糖组合物，兼具真菌及多糖提高免疫力的功能以及益生菌的保健功效，改善目前保健品效果单一、复合功能不理想的问题。
发明内容：
为了解决上述问题，本发明提供一种木耳多糖功能性食品，由以下重量份数的原料组成：
黑木耳多糖20-50份，银耳多糖20-50份，灵芝多糖10-20份，牛磺酸1-10份，L-精氨酸3-5份，低聚果糖2-10份，茶多酚0.01-0.02份，麦精10-80份，植物乳杆菌粉剂10-20份。
所述黑木耳多糖的制备方法如下：
(1)取黑木耳，装入有0.3-0.5％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、40KHz清洗5-10min，然后于-21—-25℃冷冻10-30min，立即进行粉碎；
(2)粉碎后的黑木耳与水以1：3-5(m:v)的比例混合，调整温度为40-60℃，pH为5.0-7.0，加入黑木耳子实体质量0.1-0.3％的纤维素酶酶解1-2.5小时后调整温度到80-95℃保持2-5分钟，调整温度到50℃、随后添加黑木耳子实体质量0.1-0.3％风味蛋白酶进行酶解,酶解温度40-50℃、pH值6-7，酶解时间1-2小时，离心分离获得上清液；
(3)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95％乙醇，4℃下醇析24h，弃去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，喷雾干燥，即得黑木耳多糖；
所述黑木耳子实体粉碎至粒径在0.5mm以下；
所述银耳多糖提取方法同黑木耳多糖；
所述灵芝多糖提取方法如下：
(1)取市售的灵芝子实体烘干粉碎后过80目筛；
(2)超声热水浸提：按过筛后的灵芝与水质量体积比1-3：20的比例加入纯净水，在pH7条件下，400W超声波，105℃水浴浸提0.5h；
(3)热蒸汽浸提：将上述提取体系置于灭菌锅，121℃，5min；
(4)循环重复步骤(2)、(3)4次；
(5)离心分离获得上清液；
(6)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95％乙醇，4℃下醇析24h，弃去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，喷雾干燥，即得灵芝多糖。
所述植物乳杆菌粉剂由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)tlj-2015制备，该菌已于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.11763，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101；
所述植物乳杆菌粉剂中活菌含量为：7×1012-9×1012cfu/g；
所述植物乳杆菌粉剂的制备方法如下：
(1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC NO.11763一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12-16h，使菌体处于对数生长中期；
(2)将对数期的菌种接入发酵培养基中，接种量为10-15％，35-38℃下100-200rpm培养8-12小时，溶氧控制10％(通气0.5L/min)，之后再厌氧培养60-70小时；发酵完毕发酵液静置沉淀、离心得到沉淀物，然后添加沉淀物质量1倍的载体，混合均匀，50℃流化床干燥即得植物乳杆菌粉剂，载体重量份数组成为：酸奶粉25份，糊精12份。
所述发酵培养基组成如下：蛋白胨10-12g，牛肉膏10-12g，酵母膏5-8g，柠檬酸氢二铵2-4g，葡萄糖20-25g，吐温80 1-2mL，乙酸钠5-7g，磷酸氢二钾2-3g，硫酸镁0.58-0.6g，硫酸锰0.25-0.3g，胆固醇100-120mg，中草药粉剂5-8g，蒸馏水1 000mL，pH 6.2～6.6；
所述胆固醇的添加方法为：先用无水乙醇溶解胆固醇，配制浓度为10-12mg/mL的胆固醇溶液,然后按一定比例添加到培养基中，使胆固醇最终浓度为100-120μg/mL；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取五味子10-20份；党参10-15份；山楂10-20份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度45-60℃保持2～4h，加入混合酶制剂进行酶解，调节pH值为6-7，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，110W功率下超声萃取0.5～1.5h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
所述混合酶添加量为混合物料总重量的5-10％；
所述混合酶的重量份数组成为：木聚糖酶15-20份，β-淀粉酶10-15份，果胶酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，酸性磷酸酶5-10份；
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1-2。
所述木耳多糖功能性食品的制备方法为：按本领域常规方法加工为片剂、粉剂、颗粒剂、软胶囊、硬胶囊等，直接服用，也可以作为食品原料使用。
有益效果：
1、本发明所提供的木耳多糖功能性食品中除含有黑木耳多糖、银耳多糖、灵芝多糖外还含有植物乳杆菌CGMCC NO.11763，该菌株①降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到10.9mg/h/kg，可有效的分解人们由于饮食不当而摄入的亚硝酸盐；②该菌对胆固醇降解率高，可达到64.76％，尤其适用于肥胖人群及三高患者；③该菌黏附能力高，测定的自凝集率为95.71％，可有效地定植于胃肠道系统中，充分发挥其生理活性作用。
2、本发明所提供的植物乳杆菌培养方法中，发酵培养基中添加有中药成分五味子、党参和山楂，这三种重要成分的添加可有效提高植物乳杆菌的耐酸耐胆盐能力，从而提高其在人体肠道中发挥的作用。
3、本发明所提供的植物乳杆菌培养方法中，发酵培养基中以可溶性形式添加有胆固醇，发酵完成后可有效提高菌株降解胆固醇的能力。由于本发明提供的产品中添加有所述植物乳杆菌，使得本发明除了具有提高人体免疫力能力外，还具有较好的降解胆固醇的能力。
具体实施方式：
实施例1：一种木耳多糖功能性食品
一种木耳多糖功能性食品，由以下重量份数的原料组成：
黑木耳多糖20份，银耳多糖20份，灵芝多糖20份，牛磺酸1份，L-精氨酸3份，低聚果糖2份，茶多酚0.01份，麦精10份，植物乳杆菌粉剂10份；
按照上述配方比例称取各组分，粉碎，过80目筛，然后混合10min，得粉剂。
所述黑木耳多糖的制备方法如下：
(1)取黑木耳子实体，装入有0.3％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、40KHz清洗5min，然后于-21℃冷冻10min，立即进行粉碎；
(2)粉碎后的黑木耳与水以1：3(m:v)的比例混合，调整温度为40℃，pH为5.0，加入黑木耳子实体质量0.1％的纤维素酶酶解1小时后调整温度到80℃保持2分钟，调整温度到50℃、随后添加黑木耳子实体质量0.1％风味蛋白酶进行酶解,酶解温度40℃、pH值6，酶解时间1小时，离心分离获得上清液；
(3)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95％乙醇，4℃下醇析24h，弃去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，喷雾干燥，即得黑木耳多糖；
所述黑木耳子实体粉碎至粒径在0.5mm以下；
所述银耳多糖提取方法同黑木耳多糖；
所述灵芝多糖提取方法如下：
(1)取市售的灵芝子实体烘干粉碎后过80目筛；
(2)超声热水浸提：按过筛后的灵芝与水质量体积比1：20的比例加入纯净水，在pH7条件下，400W超声波，105℃水浴浸提0.5h；
(3)热蒸汽浸提：将上述提取体系置于灭菌锅，121℃，5min；
(4)循环重复步骤(2)、(3)4次；
(5)离心分离获得上清液；
(6)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95％乙醇，4℃下醇析24h，弃去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，喷雾干燥，即得灵芝多糖。
所述植物乳杆菌粉剂的制备方法如下：
(1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC NO.11763一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h，使菌体处于对数生长中期；
(2)将对数期的菌种接入发酵培养基中，接种量为10％，35℃下100rpm培养8小时，溶氧控制10％(通气0.5L/min)，之后再厌氧培养60小时；发酵完毕发酵液静置沉淀、离心得到沉淀物，然后添加沉淀物质量1倍的载体，混合均匀，50℃流化床干燥即得植物乳杆菌粉剂，载体重量份数组成为：酸奶粉25份，糊精12份。
所述发酵培养基组成如下：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，胆固醇100mg，中草药粉剂5g，蒸馏水1 000mL，pH6.2；
所述胆固醇的添加方法为：先用无水乙醇溶解胆固醇，配制浓度为10mg/mL的胆固醇溶液,然后按一定比例添加到培养基中，使胆固醇最终浓度为100μg/mL；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取五味子10份；党参10份；山楂10份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3倍重量的水，控制温度45℃保持2h，加入混合酶制剂进行酶解，调节pH值为6，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，110W功率下超声萃取0.5h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
所述混合酶添加量为混合物料总重量的5％；
所述混合酶的重量份数组成为：木聚糖酶15份，β-淀粉酶10份，果胶酶10份，酸性蛋白酶10份，酸性磷酸酶5份；
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1。
实施例2一种木耳多糖功能性食品
一种木耳多糖功能性食品，由以下重量份数的原料组成：
黑木耳多糖50份，银耳多糖50份，灵芝多糖20份，牛磺酸10份，L-精氨酸5份，低聚果糖10份，茶多酚0.02份，麦精80份，植物乳杆菌粉剂20份；
按照上述配方比例称取各组分，粉碎，过80目筛，然后混合10min，得粉剂。
所述黑木耳多糖的制备方法如下：
(1)取黑木耳子实体，装入有0.5％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、40KHz清洗5-10min，然后于-25℃冷冻30min，立即进行粉碎；
(2)粉碎后的黑木耳与水以1：5(m:v)的比例混合，调整温度为60℃，pH为7.0，加入黑木耳子实体质量0.3％的纤维素酶酶解2.5小时后调整温度到95℃保持5分钟，调整温度到50℃、随后添加黑木耳子实体质量0.3％风味蛋白酶进行酶解,酶解温度50℃、pH值7，酶解时间2小时，离心分离获得上清液；
(3)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95％乙醇，4℃下醇析24h，弃去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，喷雾干燥，即得黑木耳多糖；
所述黑木耳子实体粉碎至粒径在0.5mm以下；
所述银耳多糖提取方法同黑木耳多糖；
所述灵芝多糖提取方法如下：
(1)取市售的灵芝子实体烘干粉碎后过80目筛；
(2)超声热水浸提：按过筛后的灵芝与水质量体积比3：20的比例加入纯净水，在pH7条件下，400W超声波，105℃水浴浸提0.5h；
(3)热蒸汽浸提：将上述提取体系置于灭菌锅，121℃，5min；
(4)循环重复步骤(2)、(3)4次；
(5)离心分离获得上清液；
(6)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95％乙醇，4℃下醇析24h，弃去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，喷雾干燥，即得灵芝多糖。
所述植物乳杆菌粉剂的制备方法如下：
(1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC NO.11763一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养16h，使菌体处于对数生长中期；
(2)将对数期的菌种接入发酵培养基中，接种量为15％，38℃下200rpm培养12小时，溶氧控制10％(通气0.5L/min)，之后再厌氧培养70小时；发酵完毕发酵液静置沉淀、离心得到沉淀物，然后添加沉淀物质量1倍的载体，混合均匀，50℃流化床干燥即得植物乳杆菌粉剂，载体重量份数组成为：酸奶粉25份，糊精12份。
所述发酵培养基组成如下：蛋白胨12g，牛肉膏12g，酵母膏8g，柠檬酸氢二铵4g，葡萄糖25g，吐温80 2mL，乙酸钠7g，磷酸氢二钾3g，硫酸镁0.6g，硫酸锰0.3g，胆固醇120mg，中草药粉剂8g，蒸馏水1000mL，pH 6.6；
所述胆固醇的添加方法为：先用无水乙醇溶解胆固醇，配制浓度为12mg/mL的胆固醇溶液,然后按一定比例添加到培养基中，使胆固醇最终浓度为120μg/mL；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取五味子20份；党参15份；山楂20份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加6倍重量的水，控制温度60℃保持4h，加入混合酶制剂进行酶解，调节pH值为7，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，110W功率下超声萃取1.5h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
所述混合酶添加量为混合物料总重量的10％；
所述混合酶的重量份数组成为：木聚糖酶20份，β-淀粉酶15份，果胶酶15份，酸性蛋白酶15份，酸性磷酸酶10份；
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：2。
实施例3：一种木耳多糖功能性食品
一种木耳多糖功能性食品，由以下重量份数的原料组成：
黑木耳多糖35份，银耳多糖35份，灵芝多糖15份，牛磺酸5份，L-精氨酸4份，低聚果糖5份，茶多酚0.015份，麦精40份，植物乳杆菌粉剂15份；
按照上述配方比例称取各组分，粉碎，过80目筛，然后混合10min，得粉剂。
所述黑木耳多糖的制备方法如下：
(1)取黑木耳子实体，装入有0.4％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、40KHz清洗5-10min，然后于-23℃冷冻20min，立即进行粉碎；
(2)粉碎后的黑木耳与水以1：4(m:v)的比例混合，调整温度为50℃，pH为6.0，加入黑木耳子实体质量0.2％的纤维素酶酶解1.5小时后调整温度到85℃保持3分钟，调整温度到50℃、随后添加黑木耳子实体质量0.2％风味蛋白酶进行酶解,酶解温度45℃、pH值6.5，酶解时间1.5小时，离心分离获得上清液；
(3)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95％乙醇，4℃下醇析24h，弃去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，喷雾干燥，即得黑木耳多糖；
所述黑木耳子实体粉碎至粒径在0.5mm以下；
所述银耳多糖提取方法同黑木耳多糖；
所述灵芝多糖提取方法如下：
(1)取市售的灵芝子实体烘干粉碎后过80目筛；
(2)超声热水浸提：按过筛后的灵芝子实体与水质量体积比1：10的比例加入纯净水，在pH7条件下，400W超声波，105℃水浴浸提0.5h；
(3)热蒸汽浸提：将上述提取体系置于灭菌锅，121℃，5min；
(4)循环重复步骤(2)、(3)4次；
(5)离心分离获得上清液；
(6)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95％乙醇，4℃下醇析24h，弃去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，喷雾干燥，即得灵芝多糖。
所述植物乳杆菌粉剂的制备方法如下：
(1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC NO.11763一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12-16h，使菌体处于对数生长中期；
(2)将对数期的菌种接入发酵培养基中，接种量为12％，37℃下150rpm培养10小时，溶氧控制10％(通气0.5L/min)，之后再厌氧培养65小时；发酵完毕发酵液静置沉淀、离心得到沉淀物，然后添加沉淀物质量1倍的载体，混合均匀，50℃流化床干燥即得植物乳杆菌粉剂，载体重量份数组成为：酸奶粉25份，糊精12份。
所述发酵培养基组成如下：蛋白胨11g，牛肉膏11g，酵母膏6g，柠檬酸氢二铵3g，葡萄糖22g，吐温80 1.5mL，乙酸钠6g，磷酸氢二钾2.5g，硫酸镁0.6g，硫酸锰0.25g，胆固醇110mg，中草药粉剂6g，蒸馏水1 000mL，pH 6.5；
所述胆固醇的添加方法为：先用无水乙醇溶解胆固醇，配制浓度为11mg/mL的胆固醇溶液,然后按一定比例添加到培养基中，使胆固醇最终浓度为110μg/mL；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取五味子15份；党参12份；山楂15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度50℃保持3h，加入混合酶制剂进行酶解，调节pH值为6.5，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，110W功率下超声萃取1h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
所述混合酶添加量为混合物料总重量的8％；
所述混合酶的重量份数组成为：木聚糖酶18份，β-淀粉酶12份，果胶酶12份，酸性蛋白酶12份，酸性磷酸酶8份；
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1.5。
实施例4效果实验
1、植物乳杆菌CGMCC NO.11763的培养
(1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC NO.11763一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长中期。
(2)将对数期的菌种接入装有发酵培养基的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧培养63小时。
发酵培养基：
①：蛋白胨11g，牛肉膏11g，酵母膏6g，柠檬酸氢二铵3g，葡萄糖22g，吐温80 1.5mL，乙酸钠6g，磷酸氢二钾2.5g，硫酸镁0.6g，硫酸锰0.25g，胆固醇110mg，中草药粉剂6g，蒸馏水1 000mL，pH 6.5；
②：删去①中的胆固醇；
③：删去①中的中草药粉剂；
2、降解胆固醇能力测定
步骤1中分别以发酵培养基①和②为发酵培养基完成发酵后，分别取1ml发酵液离心并用无菌水洗涤2遍后重悬于1ml无菌水中，分别接种于10mL的MRS胆固醇液体培养基(胆固醇含量0.1mg/ml,pH 6.2)中，37℃的恒温静置分别培养20h、40h、60h备用，取以上培养不同时间的菌液样品各1ml,9000r/min，4℃下离心10min，得到发酵上清液，邻苯二甲醛法测定上清液中胆固醇含量(具体为：取各上清液0.1ml于相应的试管中,加冰醋酸0.3ml,1mg/ml的邻苯二甲醛0.15ml，缓缓加入浓硫酸1.0ml，混合均匀。室温静置10min，于550nm下测吸光值)。每一处理3个重复，以同样方法制作胆固醇标准曲线，计算上清液中胆固醇含量及降解率,结果见表1。可知，CGMCC NO.11763对胆固醇有很好的降解作用，60h小时后，降解率可达到64.76％。并且，添加有胆固醇的培养基所培养出的CGMCC NO.11763降解胆固醇的能力显著提高。
表1对胆固醇的降解情况。
3、耐胆盐实验
步骤1中分别以发酵培养基①和③为发酵培养基完成发酵后，分别取1ml发酵液离心并用无菌水洗涤2遍后重悬于1ml无菌水中，分别接种于含有不同胆盐(含量梯度为0.0％、0.4％、0.6％、1％)的10mL MRS液体培养基(pH＝6.4)，置于37℃下分别培养0、2、4h，每个处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释度溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布，于37℃生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平板上的菌数个数。结果见表2。可知该菌在胆盐浓度为1％处理4h后菌的生长量依然达到0.51±0.92×107(cfu/ml)，有很好的耐胆盐能力，而采用添加有中草药成分的培养基，其耐胆盐能力有效提高。
表2耐胆盐能力检测(×107cfu/ml)
4、耐酸实验
步骤1中分别以发酵培养基①和③为发酵培养基完成发酵后，分别取1ml发酵液离心并用无菌水洗涤2遍后重悬于1ml无菌水中，分别接种于不同pH值(pH梯度为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)的10mL MRS液体培养基，置于37℃下分别培养0、2、4h，每一处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布，于37℃生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录平板上的菌落个数。结果见表3。说明该菌具有很强的耐酸能力，且添加有中草药成份的培养基能有效提高该菌的耐酸性。
表3耐酸能力检测(×107cfu/ml)
5、亚硝酸盐分解实验
步骤1中以①培养基，发酵过程中根据亚硝酸盐的消耗速率流加20g/L的亚硝酸钠溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌CGMCCNO.11763对亚硝酸钠的降解速率。结果发现：在该条件下，CGMCC NO.11763对亚硝酸钠的降解速率可以达到653mg/h/L。
6、黏附能力测定
培养CGMCC NO.11763(MRS液体培养基)、大肠杆菌DH5α(LB液体培养基)24h得发酵液，分别置于3000r/min、4℃下离心10min，收集菌泥，分别用pH＝7.0的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤菌泥2次(即在菌落中加入PBS，震荡混合均匀后，置于3000r/min、4℃下离心10min，收集菌体)。自凝集率(％)：用无菌的PBS将菌泥CGMCC NO.11763制成在波长600nm处的吸光值为0.4±0.1(A0)的悬浮菌液及菌悬液,静置24h后测定吸光值A24，自凝集率(％)公式为(A0—A24)/A0。测定结果见表5，可知CGMCCNO.11763的自凝集率为95.71％，有很强的黏附能力。
表5黏附能力表
类别 A0平均值±s A24平均值±s 凝集率％
11763磷酸盐混合液 0.5131±0.0045 0.0220±0.0369 95.71
实施例5本发明益生性试验
将本发明实施例3制备的产品，用无菌水制备成活菌数为2×1010CFU/mL的益生菌溶液，于4℃保存备用；
1、模拟胃液及肠液的耐受试验：
取100g/L的盐酸16.4mL加蒸馏水稀释，使pH值分别为1.5、2.5和3.5，取100mL稀盐酸溶液，分别加入1g胃蛋白酶，使其充分溶解，得模拟胃液，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。
取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1moL/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰蛋白酶10g，加水100mL使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml，得模拟肠液，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。
取1mL保存好的益生菌溶液加入到9mL的模拟胃液中(即十倍逐级稀释)，并迅速在振荡器上充分混匀，然后置于30-45℃静置培养2-4h。分别在1h、2h、3h、4h的时候取出培养液并立即计数残存活菌数，与原活菌数进行比较，结果表明，活菌存活率为97％。然后取在人工胃液中消化不同时间的培养液各1mL，分别接种于9mLpH值为6.8的人工肠液中，置于30-45℃静置培养2-4h，并分别在0、3、6、24h取样，测定其活菌数，与原活菌数进行比较，结果表明活菌存活率为99％。
2、模拟胆盐的耐受试验：用胰液素制成1g/L的溶液，并在溶液中加入0.8％的猪胆盐，用10％的NaOH调整pH为8.0，然后用0.45μm微滤膜过滤并除菌。将0.5mL保存好的益生菌溶液接种到4.5mL模拟胆盐中，培养24h后得到培养液，计数残存的活菌数。将培养液在灭菌生理盐水中十倍逐级稀释至10-8，并用MRS倾注，然后置于35℃静置培养24h。
结果表明活菌存活率为99％。
以上试验结果表明，本发明营养保健食品中的益生菌益生性(耐pH性、耐胆盐)较强，非常适合人体胃肠环境，在模拟胃肠环境中存活率大，可有效改善胃肠功能。
需要说明的是：本发明实施例1-3制备的营养保健食品同样具有上述实验效果，各实施例之间及与上述实验效果差异性不大。
实施例6本发明对降胆固醇效果实验
1.实验材料
1.1实验动物及饲料
昆明种小鼠，♂性，体重(20±2)g，由广州中医药大学实验动物中心提供；
普通饲料为市售小鼠饲料；高脂饲料由为60％普通饲料+10％猪油+10％奶粉+10％蛋黄粉+7％白糖+2％花生+0.5％盐+0.5％麻油；
1.2试剂
总胆固醇试剂盒(TCH，浙江东欧诊断产品有限公司)
饲喂试剂配置：
样品液①：2g实施例3产品加入50mL超纯水，振荡混匀，即得；
样品液②：实施例3产品制备过程中CGMCC NO.11763发酵培养基去除胆固醇，其他条件不变制备的产品2g加入50mL超纯水，振荡混匀，即得
对照液：纯水；
2.方法
2.1小鼠的分组与饲养
小鼠适应性喂养5天后，随机分为2组：空白组、实验组，每组20只；饲喂75天；
空白组：高脂饲料，给纯水，体积与样品液溶液体积相同；
实验组①：高脂饲料，给样品液①800mg/kg.d；
实验组②：高脂饲料，给样品液②800mg/kg.d；末次给药后，禁食不禁水12小时，眼眶取血制备血清，依试剂盒说明书方法测定总胆固醇(TC)；实验结果如下：
由实验结果可知，实验前后，实验组和对照组小鼠血清中胆固醇差异显著，本发明所述产品对降低血清中胆固醇含量具有明显的效果。
实施例7本发明产品提高免疫力的效果实验
本产品实施例3产品在冬季选择北京地区100位年龄在60-75岁体弱易感冒的老年人连续食用1月，每日食用5克，以食用前和食用后效果比较，结果见表1，结果表明本产品对提高老年人抵抗力、增强身体免疫力有明显效果，产品有良好的食用和营养滋补功效。同时能够显著提高睡眠质量，改善率达到70％(以有质量睡眠时间为评估依据)许多连续食用本产品老人反映久服效果更佳，全年不感冒，身体状况更好.
表6食用效果对照表
人数 食用前30天感冒次数(总计) 食用2月后30天内感冒次数(总计)
100 31 6
实施例8灵芝多糖提取效果对比试验
方法1：灵芝多糖提取方法如下：
(1)取市售的灵芝子实体烘干粉碎后过80目筛；
(2)超声热水浸提：按3：20的比例加入纯净水，在pH7条件下，400W超声波，105℃水浴浸提0.5h；
(3)热蒸汽浸提：将上述提取体系置于灭菌锅，121℃，5min；
(4)循环重复步骤(2)、(3)4次；
(5)离心分离获得上清液；
(6)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95％乙醇，4℃下醇析24h，弃去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，喷雾干燥称重，即得灵芝多糖。
方法2：灵芝多糖提取方法如下：
(1)取市售的灵芝子实体烘干粉碎后过80目筛；
(2)超声热水浸提：按3：20的比例加入纯净水，在pH7条件下，400W超声波，105℃水浴浸提140min；
(3)离心分离获得上清液；
(4)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95％乙醇，4℃下醇析24h，弃去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，喷雾干燥称重，即得灵芝多糖。
灵芝多糖粗提取率(％)＝(粗多糖干重/灵芝子实体烘干后干重)×100
根据上述公式计算上述两种提取方法对灵芝多糖粗提取率的影响，方法1灵芝多糖粗提取率为10.12％，方法1灵芝多糖粗提取率为8.25％，可见，间歇热蒸汽浸提能有效提高超声热水浸提对灵芝多糖的粗提取率。

Claims (10)

1.一种木耳多糖功能性食品，由以下重量份数的原料组成：黑木耳多糖20-50份，银耳多糖20-50份，灵芝多糖10-20份，牛磺酸1-10份，L-精氨酸3-5份，低聚果糖2-10份，茶多酚0.01-0.02份，麦精10-80份，植物乳杆菌粉剂10-20份；
所述植物乳杆菌粉剂由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)tlj-2015制备，保藏号为CGMCC NO.11763。
2.如权利要求1所述的一种木耳多糖功能性食品，其特征在于，所述黑木耳多糖的制备方法如下：
(1)取黑木耳，装入有0.3-0.5％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、40KHz清洗5-10min，然后于-21—-25℃冷冻10-30min，立即进行粉碎；
(2)粉碎后的黑木耳与水以1：3-5(m:v)的比例混合，调整温度为40-60℃，pH为5.0-7.0，加入黑木耳子实体质量0.1-0.3％的纤维素酶酶解1-2.5小时后调整温度到80-95℃保持2-5分钟，调整温度到50℃、随后添加黑木耳子实体质量0.1-0.3％风味蛋白酶进行酶解,酶解温度40-50℃、pH值6-7，酶解时间1-2小时，离心分离获得上清液；
(3)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95％乙醇，4℃下醇析24h，弃去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，喷雾干燥，即得黑木耳多糖；
所述黑木耳子实体粉碎至粒径在0.5mm以下；
所述银耳多糖提取方法同黑木耳多糖。
3.如权利要求1所述的一种木耳多糖功能性食品，其特征在于，所述灵芝多糖提取方法如下：
(1)取市售的灵芝子实体烘干粉碎后过80目筛；
(2)超声热水浸提：按过筛后的灵芝子实体与水质量体积比1-3：20的比例加入纯净水，在pH7条件下，400W超声波，105℃水浴浸提0.5h；
(3)热蒸汽浸提：将上述提取体系置于灭菌锅，121℃，5min；
(4)循环重复步骤(2)、(3)4次；
(5)离心分离获得上清液；
(6)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95％乙醇，4℃下醇析24h，弃去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，喷雾干燥，即得灵芝多糖。
4.如权利要求1所述的一种木耳多糖功能性食品，其特征在于，所述植物乳杆菌粉剂中活菌含量为：7x1012-9x1012cfu/g。
5.如权利要求1所述的一种木耳多糖功能性食品，其特征在于，所述植物乳杆菌粉剂的制备方法如下：
(1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC NO.11763一环，接入装有50mL培养基MRS培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12-16h，使菌体处于对数生长中期；
(2)将对数期的菌种接入发酵培养基中，接种量为10-15％，35-38℃下100-200rpm培养8-12小时，溶氧控制10％，之后再厌氧培养60-70小时；发酵完毕发酵液静置沉淀、离心得到沉淀物，然后添加沉淀物质量1倍的载体，混合均匀，50℃流化床干燥即得植物乳杆菌粉剂，载体重量份数组成为：酸奶粉25份，糊精12份。
6.如权利要求5所述的一种木耳多糖功能性食品，其特征在于，所述发酵培养基组成如下：蛋白胨10-12g，牛肉膏10-12g，酵母膏5-8g，柠檬酸氢二铵2-4g，葡萄糖20-25g，吐温80 1-2mL，乙酸钠5-7g，磷酸氢二钾2-3g，硫酸镁0.58-0.6g，硫酸锰0.25-0.3g，胆固醇100-120mg，中草药粉剂5-8g，蒸馏水1 000mL，pH 6.2～6.6。
7.如权利要求6所述的一种木耳多糖功能性食品，其特征在于，所述胆固醇的添加方法为：先用无水乙醇溶解胆固醇，配制浓度为10-12mg/mL的胆固醇溶液,然后按一定比例添加到培养基中，使胆固醇最终浓度为100-120μg/mL。
8.如权利要求6所述的一种木耳多糖功能性食品，其特征在于，所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取五味子10-20份；党参10-15份；山楂10-20份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度45-60℃保持2～4h，加入混合酶制剂进行酶解，调节pH值为6-7，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，110W功率下超声萃取0.5～1.5h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
所述混合酶添加量为混合物料总重量的5-10％；
所述混合酶的重量份数组成为：木聚糖酶15-20份，β-淀粉酶10-15份，果胶酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，酸性磷酸酶5-10份；
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1-2。
9.如权利要求1所述的一种木耳多糖功能性食品，其特征在于，由以下重量份数的原料组成：黑木耳多糖35份，银耳多糖35份，灵芝多糖15份，牛磺酸5份，L-精氨酸4份，低聚果糖5份，茶多酚0.015份，麦精40份，植物乳杆菌粉剂15份灵芝。
10.权利要求1所述一种木耳多糖功能性食品在保健领域的应用。
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