CN107858389A - 红藻蛋白多肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了红藻蛋白多肽的制备方法，包括：超声破碎、等电点沉淀、酶解，将干净红藻粉经双频率超声波破碎后加入冰醋酸进行等电点沉淀提取红藻蛋白，将红藻蛋白溶解后先以胃蛋白酶、木瓜蛋白酶与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶酶解，酶解全程以双频率复合超声与微波辐射交错间隔辅助酶解，酶解液离心后取上清即为红藻蛋白多肽。有益效果为：（S）‑1‑氨基‑2‑羟甲基二氢吲哚在较强酸性环境下的聚合产物可以与酶蛋白产生亲电作用，防止胃蛋白酶与木瓜蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低；双频率超声与微波不仅可以为酶解体系提供能量，而且还可以大大提高酶解效率，降低酶解时间，同时保证了酶解的彻底性与准确性。

Description

红藻蛋白多肽的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽的提取领域，尤其是涉及红藻蛋白多肽的制备方法。
技术背景
红藻，绝大多数为多细胞体，极少数为单细胞体。藻体紫红、玫瑰红、暗红等色。红藻绝大部分生长于海洋中，分布广，种类多，据统计约有558属、3740余种，又分为两个亚纲：紫菜亚纲和真红藻亚纲。其中不少红藻有重要经济价值。除食用外，还是医学、纺织、食品等工业的原料。
红藻绝大部分海生，见于热带和亚热带海岸附近，常附著于其他植物。叶状体有丝状、分枝状、羽状或片状。细胞间连以纤细的原生质丝。除叶绿素外，尚含藻红素和藻蓝素，故常呈红色或蓝色。红藻的生殖细胞不能运动。雌性器官称果孢，由单核区和受精丝构成，不动精子在精子囊中单生。重要的食用红藻(如紫菜、掌状红皮藻)煮熟后仍保持其色泽及胶体性质。工业上，角叉菜属红藻作为明胶的代用品用于布丁、牙膏、冰淇淋及保藏食品中。珊瑚藻属(Corallina)的某些种在形成珊瑚礁与珊瑚岛的过程中起重要作用。主要由江蓠属和石花菜属红藻制备的琼脂是细菌和真菌培养基的重要成分。
关于红藻蛋白多肽的制备技术有很多方法，现有技术如授权公众号为
CN 103549032 B的中国发明专利，公开了一种新型美味红藻多肽内酯豆腐的制作方法，该发明方法将干燥并粉碎的红藻粉经冻融与超声破碎，加入蛋白酶酶解制备红藻多肽，具有工艺简单、豆腐成品味道鲜美的优点，但该发明方法中以蒸馏水作为冻融介质，可能会破坏红藻蛋白质的结构，影响其进一步的酶解操作，另外，该发明方法中的酶解步骤用时过长，酶解效率不高。
发明内容
本发明的目的在于提供红藻蛋白多肽的制备方法，本方法制备红藻蛋白多肽效率较高，用时较短，适合规模化生产。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：红藻蛋白多肽的制备方法，包括：超声破碎、等电点沉淀、酶解，具体包括以下步骤：
超声破碎：按照料液比1:18-20将干净红藻粉与缓冲液混合，以双频率超声波破碎，超声频率为40-50kHz、70-80kHz，超声密度为0.40-0.45W/cm2、0.55-0.60W/cm2，破碎25-45分钟后以4000-6000r/min离心20-45分钟，取上清待用；双频率超声波的两个空化效应会相互叠加，其协同后的空化效应远远大于两个空化效应的加和，因此其造成的空化崩溃次数也较多，能够快速、彻底的将红藻破壁；
等电点沉淀：将0.1-0.3mol/L冰醋酸加入上清液中，边滴加边搅拌混匀，调节pH至3.8-4.0，静置4-6小时，在0-4℃以5000-6000r/min离心25-30分钟，收集蛋白沉淀，冷冻干燥得粗蛋白粉末；以等电点沉淀的方式提取红藻粗蛋白粉末，可以以较快的速度、较低的成本提高进一步酶解的效率与精确度；
酶解：将粗蛋白粉末按料液比1:15-20溶解于蒸馏水中，加入粗蛋白粉末0.5-1.0%的胃蛋白酶与木瓜蛋白酶的混合酶，在35-37℃、pH1.5-3.0的条件下水解20-30分钟，在酶解过程的中间阶段加入混合酶重量10-35‰的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚；调整pH为7.0-7.5，加入粗蛋白粉末2.0-2.3%的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶混合酶，在35-37℃温度下酶解15-20分钟；酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解；酶解完成后高温灭酶，经3000-3500 r/min、0-4℃离心20-30分钟，取上清液低温干燥得红藻蛋白多肽；微波辐射时长过长会影响枯酶蛋白质的空间结构，进而降低酶的活性，随着反应的进行与微波辐射时长的增加，在酶解反应的中程添加（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚在较强酸性环境下可以发生二聚合、三聚合反应，聚合产物可以与酶蛋白产生亲电作用，防止胃蛋白酶与木瓜蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低；
作为优选，缓冲液为0.025 mol/L的Na2HPO4和KH2PO4溶液按照1.56-1.65:1的比例混合；缓冲液能够较好地的保护红藻蛋白的完整性，为进一步的等电点提纯做准备。
作为优选，胃蛋白酶与木瓜蛋白酶的重量比为3-5:1，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的重量比为2-4:1；合适配比的酶能够较大程度的发挥复合酶的酶解效率。
作为优选，双频率复合超声与微波辐射交错间隔辅助酶解的步骤为：开启双频率超声波50-55秒，关闭超声波，开启微波辐射5-10秒，关闭微波辐射；开启双频率超声波50-55秒，关闭超声波，开启微波辐射5-10秒，关闭微波辐射；在酶解过程中持续地以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解；以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解，不仅可以为酶解体系提供能量，维持酶解所需温度，而且双频率超声与微波辐射的交替间隔辅助还可以大大提高酶解效率，降低酶解时间，同时保证了酶解的彻底性与准确性，节约了成本；
作为优选，双频率超声波的超声频率与超声密度分别为23-25kHz、0.33-0.35W/cm2与65-70kHz、0.53-0.55W/cm2，微波辐射的功率为150-160W；双频率复合超声波的双空化效应可以产生叠加作用与协同作用，所产生的空化效应较之单频甚至双频交替要强的多，其所产生的空化崩溃次数也较多，更加高效的打散团聚的蛋白质分子与酶分子，使酶与底物的接触几率与接触面积大大增大，从而提高酶解效率；微波频率的共振使蛋白质大分子能象偶极子分子一样在微波的作用下产生振荡，这种振荡使蛋白质分子在微波触发下产生相干、有序的振动，从而加快蛋白的酶解。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）在冻融过长中，以Na2HPO4和KH2PO4缓冲溶液作为冻融介质，能够较好的保护红藻蛋白的完整性，提高进一步等电点提纯的效率；2）以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解，不仅可以为酶解体系提供能量，维持酶解所需温度，而且双频率超声与微波辐射的交替间隔辅助还可以大大提高酶解效率，降低酶解时间，同时保证了酶解的彻底性与准确性，节约了成本；3）在酶解过程中，（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚在较强酸性环境下可以发生二聚合、三聚合反应，聚合产物可以与酶蛋白产生亲电作用，防止胃蛋白酶与木瓜蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
红藻蛋白多肽的制备方法，包括以下步骤：
1）按照料液比1:18将干净红藻粉与缓冲液混合，以双频率超声波破碎，破碎25分钟后以4000r/min离心20分钟，取上清待用；2）将0.1mol/L冰醋酸加入上清液中，边滴加边搅拌混匀，调节pH至3.8，静置4小时，在0℃以5000r/min离心25分钟，收集蛋白沉淀，冷冻干燥得粗蛋白粉末；3）将粗蛋白粉末按料液比1:15溶解于蒸馏水中，加入粗蛋白粉末0.5%的胃蛋白酶与木瓜蛋白酶的混合酶，在35℃、pH1.5的条件下水解20分钟，在酶解过程的中间阶段加入混合酶重量10‰的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚；4）调整pH为7.0，加入粗蛋白粉末2.0%的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶混合酶，在35℃温度下酶解15分钟；酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解；酶解完成后高温灭酶，经3000r/min、0℃离心20分钟，取上清液低温干燥得红藻蛋白多肽。
实施2：
红藻蛋白多肽的制备方法，包括以下步骤：
1）超声破碎：按照料液比1:20将干净红藻粉与缓冲液混合，以双频率超声波破碎，超声频率为50kHz、80kHz，超声密度为0.45W/cm2、0.60W/cm2，破碎45分钟后以6000r/min离心45分钟，取上清待用；双频率超声波的两个空化效应会相互叠加，其协同后的空化效应远远大于两个空化效应的加和，因此其造成的空化崩溃次数也较多，能够快速、彻底的将红藻破壁；
2）等电点沉淀：将0.3mol/L冰醋酸加入上清液中，边滴加边搅拌混匀，调节pH至4.0，静置6小时，在4℃以6000r/min离心30分钟，收集蛋白沉淀，冷冻干燥得粗蛋白粉末；以等电点沉淀的方式提取红藻粗蛋白粉末，可以以较快的速度、较低的成本提高进一步酶解的效率与精确度；
3）酶解：将粗蛋白粉末按料液比1:20溶解于蒸馏水中，加入粗蛋白粉末0.5-1.0%的胃蛋白酶与木瓜蛋白酶的混合酶，胃蛋白酶与木瓜蛋白酶的重量比为5:1，在37℃、pH3.0的条件下水解20-30分钟，在酶解过程的中间阶段加入混合酶重量35‰的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚；调整pH为7.5，加入粗蛋白粉末2.3%的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶混合酶，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的重量比为4:1，在37℃温度下酶解20分钟；酶解过程中以双频率复合超声（55秒）与微波辐（5秒）射交替间隔辅助酶解，双频率超声波的超声频率与超声密度分别为25kHz、0.35W/cm2与70kHz、0.55W/cm2，微波辐射的功率为160W；；酶解完成后高温灭酶，经3500 r/min、4℃离心30分钟，取上清液低温干燥得红藻蛋白多肽；微波辐射时长过长会影响枯酶蛋白质的空间结构，进而降低酶的活性，随着反应的进行与微波辐射时长的增加，在酶解反应的中程添加（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚在较强酸性环境下可以发生二聚合、三聚合反应，聚合产物可以与酶蛋白产生亲电作用，防止胃蛋白酶与木瓜蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低。
实施3：
红藻蛋白多肽的制备方法，包括：超声破碎、等电点沉淀、酶解，具体包括以下步骤：
超声破碎：按照料液比1:18将干净红藻粉与缓冲液混合，以双频率超声波破碎，超声频率为45kHz、75kHz，超声密度为0.40W/cm2、0.55W/cm2，破碎30分钟后以4500r/min离心30分钟，取上清待用；双频率超声波的两个空化效应会相互叠加，其协同后的空化效应远远大于两个空化效应的加和，因此其造成的空化崩溃次数也较多，能够快速、彻底的将红藻破壁；
等电点沉淀：将0.25mol/L冰醋酸加入上清液中，边滴加边搅拌混匀，调节pH至3.8，静置5小时，在2℃以5500r/min离心25分钟，收集蛋白沉淀，冷冻干燥得粗蛋白粉末；以等电点沉淀的方式提取红藻粗蛋白粉末，可以以较快的速度、较低的成本提高进一步酶解的效率与精确度；
酶解：将粗蛋白粉末按料液比1:18溶解于蒸馏水中，加入粗蛋白粉末0.8%的胃蛋白酶与木瓜蛋白酶的混合酶，胃蛋白酶与木瓜蛋白酶的重量比为4:1，在36℃、pH1.8的条件下水解25分钟，在酶解过程的中间阶段加入混合酶重量18‰的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚；调整pH为7.2，加入粗蛋白粉末2.0%的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶混合酶，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的重量比为3:1，在36℃温度下酶解18分钟；酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解；酶解完成后高温灭酶，经3400 r/min、2℃离心25分钟，取上清液低温干燥得红藻蛋白多肽；微波辐射时长过长会影响枯酶蛋白质的空间结构，进而降低酶的活性，随着反应的进行与微波辐射时长的增加，在酶解反应的中程添加（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚在较强酸性环境下可以发生二聚合、三聚合反应，聚合产物可以与酶蛋白产生亲电作用，防止胃蛋白酶与木瓜蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低；
双频率复合超声与微波辐射交错间隔辅助酶解的步骤为：开启双频率超声波53秒，关闭超声波，开启微波辐射7秒，关闭微波辐射；开启双频率超声波53秒，关闭超声波，开启微波辐射7秒，关闭微波辐射；在酶解过程中持续地以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解；以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解，不仅可以为酶解体系提供能量，维持酶解所需温度，而且双频率超声与微波辐射的交替间隔辅助还可以大大提高酶解效率，降低酶解时间，同时保证了酶解的彻底性与准确性，节约了成本；
双频率超声波的超声频率与超声密度分别为24kHz、0.34W/cm2与68kHz、0.54W/cm2，微波辐射的功率为150W；双频率复合超声波的双空化效应可以产生叠加作用与协同作用，所产生的空化效应较之单频甚至双频交替要强的多，其所产生的空化崩溃次数也较多，更加高效的打散团聚的蛋白质分子与酶分子，使酶与底物的接触几率与接触面积大大增大，从而提高酶解效率；微波频率的共振使蛋白质大分子能象偶极子分子一样在微波的作用下产生振荡，这种振荡使蛋白质分子在微波触发下产生相干、有序的振动，从而加快蛋白的酶解。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.红藻蛋白多肽的制备方法，包括：超声破碎、等电点沉淀、酶解，其特征在于：所述酶解步骤为：将粗蛋白粉末按料液比1:15-20溶解于蒸馏水中，加入粗蛋白粉末0.5-1.0%的胃蛋白酶与木瓜蛋白酶的混合酶酶解，在酶解过程的中间阶段加入混合酶重量10-35‰的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚；在酶解液中加入粗蛋白粉末2.0-2.3%的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶混合酶酶解；酶解全程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解；酶解完成后高温灭酶，经3000-3500 r/min、0-4℃离心20-30分钟，取上清液低温干燥得红藻蛋白多肽。
2.根据权利要求1所述的红藻蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述酶解步骤中胃蛋白酶与木瓜蛋白酶的酶解温度为35-37℃，pH为1.5-3.0，酶解时间为20-30分钟，胃蛋白酶与木瓜蛋白酶的重量比为3-5:1。
3.根据权利要求1所述的红藻蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述酶解步骤中胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的酶解温度为35-37℃，pH为7.0-7.5，酶解时间为15-20分钟，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的重量比为2-4:1。
4.根据权利要求1所述的红藻蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述酶解步骤中双频率复合超声与微波辐射交错间隔辅助酶解的操作为：开启双频率超声波50-55秒，关闭超声波，开启微波辐射5-10秒，关闭微波辐射，开启双频率超声波50-55秒，在酶解过程中持续地以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解。
5.根据权利要求1所述的红藻蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述酶解步骤中双频率超声波的超声频率与超声密度分别为23-25kHz、0.33-0.35W/cm2与65-70kHz、0.53-0.55W/cm2，微波辐射的功率为150-160W。
6.根据权利要求1所述的红藻蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述超声破碎步骤为：按照料液比1:18-20将干净红藻粉与缓冲液混合，以双频率超声波破碎，超声频率为40-50kHz、70-80kHz，超声密度为0.40-0.45W/cm2、0.55-0.60W/cm2，破碎25-45分钟后以4000-6000r/min离心20-45分钟，取上清待用。
7. 根据权利要求1所述的红藻蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述超声破碎步骤的缓冲液为0.025 mol/L的Na2HPO4和KH2PO4溶液按照1.56-1.65:1的比例混合。
8.根据权利要求1所述的红藻蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述等电点沉淀步骤为：将0.1-0.3mol/L冰醋酸加入上清液中，边滴加边搅拌混匀，调节pH至3.8-4.0，静置4-6小时，在0-4℃以5000-6000r/min离心25-30分钟，收集蛋白沉淀，冷冻干燥得粗蛋白粉末。
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