CN114990180B - 一种具有辅助降血糖作用的小麦肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有辅助降血糖作用的小麦肽及其制备方法和应用，涉及生物活性炭技术领域。本发明以谷朊粉为原料进行连续三次酶解，而后再连续两次膜过滤，干燥即得所述小麦肽。在本发明实施例中，得到的小麦肽蛋白质含量达93.9％(m/m)，肽含量83.5％(m/m)，同时对小麦肽进行消化前以及消化后对α‑葡萄糖苷酶的抑制率变化，发现经消化后抑制率提高。本发明还从所述小麦肽中提取分离得到了一个特异性小麦寡肽W1，其具有显著的降血糖作用。

Description

一种具有辅助降血糖作用的小麦肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物活性肽技术领域，具体涉及一种具有辅助降血糖作用的小麦肽及其制备方法和应用。
背景技术
高血糖是糖尿病的主要特征，长期的高血糖症状会引发眼病、心血管病、脑血管病等各种慢性并发症，严重者危及生命。目前包括阿卡波糖、二甲双胍在内的治疗T2DM的6类长效或短效药物几乎都有一定的副作用，会对患者的身体造成不同程度的损害，且合成药物成本高、价格昂贵。因此，具有良好降低血糖功效的天然产物受到了广泛关注。
口服降血糖药按其化学结构可分为磺酰脲类、双胍类和α-葡萄糖苷酶抑制剂。临床的磺酰脲类降血糖药具有显著的降糖效果，但副作用仍多，特别是对肝脏的毒性较大；双胍类药物不良反应是消化道的不良反应，主要表现为胃肠道的不适，患者可以表现为腹泻、恶心、呕吐、腹痛、食欲的减退；α-葡萄糖苷酶抑制剂主要的不良反应是腹胀、排气增加、腹痛、腹泻。生物活性肽是一类对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，其中具有降血糖功能的肽类多用于开发预防和治疗糖尿病或肥胖症的药物。降糖肽一般是由2-15个氨基酸残基组成的短肽，其降血糖能力也与降糖肽的含量及氨基酸组成有关。降血糖原理主要分为两种，一是驱动胰岛β细胞分泌胰岛素，增强胰岛素敏感性，二是竞争性抑制α-葡萄糖苷酶活性，阻断α-1，4糖苷键水解，延缓淀粉在小肠分解为葡萄糖，抑制餐后血糖快速上升。相较于化学合成药物其具有效果明显且毒副作用少的优点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有辅助降血糖作用的小麦肽及其制备方法和应用，制备方法简单，且小麦肽得率高，降血糖作用好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种具有辅助降血糖作用的小麦肽的制备方法，包括以下步骤：对谷朊粉依次利用碱性蛋白酶、复合酶和风味蛋白酶进行酶解，灭酶后脱色脱味，对酶解液依次进行0.25μm膜过滤和10nm膜过滤，膜下液中包含所述小麦肽；
所述复合酶包括中性蛋白酶和菠萝蛋白酶。
优选的，所述谷朊粉与碱性蛋白酶、复合酶和风味蛋白酶的质量比为(450～550)：(2.25～2.75)：(1.35～1.65)：(0.45～0.55)。
优选的，在利用碱性蛋白酶酶解前，还包括将所述碱性蛋白酶利用碱性无离子水溶解，升温至55～58℃后，再进行所述碱性蛋白酶的酶解；酶解至pH值降至7.0～7.5时，利用复合酶进行酶解。
优选的，所述复合酶的酶解时间为5.5～6h，酶解温度为55～58℃。
优选的，所述风味蛋白酶的酶解时间为1.5～2h，酶解温度为55～58℃。
优选的，包括利用活性炭进行所述脱色脱味。
优选的，所述0.25μm膜过滤包括利用0.25μm孔径的陶瓷膜过滤处理，处理压力为1.2MPa，流速为2000L/h；
所述10nm膜过滤包括利用10nm孔径的有机过滤膜处理，处理压力为2.3MPa，流速为2800L/h。
本发明还提供了利用上述制备方法得到的小麦肽。
本发明还提供了从上述小麦肽中分离纯化得到的小麦寡肽W1，所述小麦寡肽W1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述小麦肽和/或上述小麦寡肽W1在制备降血糖试剂中的应用。
有益效果：本发明提供了一种具有辅助降血糖作用的小麦肽的制备方法，以谷朊粉为原料进行连续三次酶解，而后再连续两次膜过滤，得所述小麦肽。在本发明实施例中，得到的小麦肽蛋白质含量达93.9％(m/m)，肽含量83.5％(m/m)，同时对小麦肽进行消化前以及消化后对α-葡萄糖苷酶的抑制率变化，发现经消化后抑制率提高。本发明还从所述小麦肽中提取分离得到了一个特异性小麦寡肽W1，其具有显著的降血糖作用。
附图说明
图1为小麦肽分离纯化色谱图；
图2为小麦肽组分6纯化后色谱图；
图3为小麦肽W1的氨基酸结构图。
具体实施方式
本发明提供了一种具有辅助降血糖作用的小麦肽的制备方法，包括以下步骤：对谷朊粉依次利用碱性蛋白酶、复合酶和风味蛋白酶进行酶解，灭酶后脱色脱味，对酶解液依次进行0.25μm膜过滤和10nm膜过滤，膜下液中包含所述小麦肽；
所述复合酶包括中性蛋白酶和菠萝蛋白酶。
本发明以谷朊粉为原料，对所述原料进行连续酶解。本发明所述酶解优选在酶解罐中进行，在进行所述酶解前，优选还包括向所述酶解罐中注入无离子水，并调节pH值至8.0～8.5。本发明对所述pH值的调节方法并没有特殊限定，优选包括利用30％(m/m)浓度的NaOH调节至目标pH即可。
本发明首先利用碱性蛋白酶进行第一酶解，且所述碱性蛋白酶的质量与所述谷朊粉的质量比优选为(450～550)：(2.25～2.75)，更优选为500:2.5。本发明在利用碱性蛋白酶酶解前，优选还包括将所述碱性蛋白酶利用碱性无离子水溶解，升温至55～58℃后，再进行所述碱性蛋白酶的酶解；酶解至pH值降至7.0～7.5时，利用复合酶进行酶解。本发明所述溶解，优选包括首先将所述碱性蛋白酶用10倍体积的无离子水充分溶解后加入至已调节pH值的酶解罐中，缓慢升温至55℃～58℃，先加入蛋白酶并升温至合适的温度有助于谷朊粉的充分溶解以提高酶解效率及生产效率。
本发明优选待第一酶解至酶解液的pH值达到7.2左右时，更换复合酶进行第二酶解，且所述复合酶的质量与所述谷朊粉的质量比优选为(1.35～1.65)：(450～550)：，更优选为1.5:500。本发明所述复合酶为中性蛋白酶和菠萝蛋白酶的复合酶，且所述中性蛋白酶和菠萝蛋白酶的质量比优选为2:1。本发明所述复合酶的酶解温度优选为55～58℃，所述酶解的时间优选5.5～6h。
本发明在所述第二酶解结束后，更换风味蛋白酶进行第三酶解，且所述风味蛋白酶的质量与所述谷朊粉的质量比优选为(0.45～0.55)：(450～550)，更优选为0.5:500。本发明所述风味蛋白酶的酶解温度优选为55～58℃，所述酶解的时间优选为1.5～2h。
本发明对上述酶解所用的酶的来源并没有特殊限定，优选利用本领域的常规市售商品酶即可。在本发明中，第一酶解以实现提高谷朊粉溶解性和初步酶解的效果；第二酶解是进一步酶解谷朊粉快速降低小麦肽的分子量，提高小麦肽的肽含量；第三酶解是改善小麦肽的口感以及风味。
本发明在上述酶解结束后进行灭酶，所述灭酶优选包括采用板式换热器进行灭酶处理，温度优选为115～120℃，灭酶时间优选为5s～7s。
本发明在所述灭酶后进行脱色脱味处理，优选包括利用活性炭进行所述脱色脱味。本发明在利用活性炭脱色脱味前，优选还包括调节灭酶后的酶解液pH值至5.0，并待酶解液降温至50℃，将活性炭缓慢加入至上述酶解液中，保温2h，进行脱色脱味处理。本发明对所述活性炭的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售活性炭即可。
本发明对脱色脱味处理后的酶解液进行两级膜过滤，即0.25μm膜过滤和10nm膜过滤，所述0.25μm膜过滤优选包括利用0.25μm孔径的陶瓷膜过滤处理，处理压力为1.2MPa，流速为2000L/h；陶瓷膜可以将活性炭、脂肪大分子蛋白以及其他杂质充分过滤掉，极大提升产品的品质。
本发明将经陶瓷膜过滤后的酶解液优选用10nm孔径的有机过滤膜处理，处理压力为2.3MPa，流速稳定在2800L/h，用有机膜浓缩小麦肽酶解液至32％～36％，膜下液中包含所述小麦肽。
本发明优选对得到的膜下液进行干燥，所述干燥优选包括喷雾干燥，并设置进风温度为165℃，出风温度为82℃，最终得到颜色为淡黄色，口感微微苦的小麦肽。
本发明还提供了利用上述制备方法得到的小麦肽。
在本发明实施例中，得到的小麦肽中蛋白质含量为93.9％，水分3.5％，灰分2.6％，肽含量83.5％。本发明所述小麦肽可被胃液和肠液消化，并且经消化后，可提高小麦肽对α-葡萄糖苷酶抑制率，证实所述小麦肽(也称小麦低聚肽粉)具有降血糖作用，且消化后降血糖作用得到提高。
本发明还提供了从上述小麦肽中分离纯化得到的小麦寡肽W1，所述小麦寡肽W1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明优选将经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后的小麦肽利用高效液相色谱进行分离纯化，并将经分离纯化后的多肽组分，进行α-葡萄糖苷酶抑制率的测定，并最终进行氨基酸序列结构的鉴定，筛选得到SEQ ID NO.1所示(AGGGAGDVPLL)的小麦寡肽W1。本发明优选采用制备型高效液相色谱仪对经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后的小麦肽进行分离纯化：流动相A：0.1％三氟乙酸+99.9％超纯水；流动相B：0.1％三氟乙酸+99.9％乙腈；检测波长：214nm；检测时间36min；柱温：21℃～25℃。
本发明还提供了上述小麦肽和/或上述小麦寡肽W1在制备降血糖试剂中的应用。
本发明实施例中以斑马鱼为模型动物，证实了本发明制备得到的小麦低聚肽粉和小麦寡肽W1都具有降血糖功效，可用于对应降血糖试剂的制备。
下面结合实施例对本发明提供的一种具有辅助降血糖作用的小麦肽及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
小麦肽制备工艺
(1)首先，往酶解罐中加入5000L无离子水，用30％浓度NaOH调节pH至8.0左右；称取2.5kg碱性蛋白酶(上海团昇科技有限公司)用10倍体积的无离子水充分溶解后加入至酶解罐中，缓慢升温至55℃～58℃；
(2)称取500kg谷朊粉，缓慢加入至酶解罐中，期间不断搅拌，酶解期间监测pH，待酶解液pH降至7.2左右时，称取1kg中性蛋白酶和0.5kg菠萝蛋白酶继续酶解5.5h～6h，称取0.5kg风味蛋白酶，继续酶解1.5h～2h；
(3)采用板式换热器进行灭酶处理，温度115～120℃，灭酶时间5s～7s；
(4)称取10.0kg活性炭(四川德墨活性炭有限公司)，调节酶解液pH至5.0，待酶解液降温至50℃，将活性炭缓慢加入至灭酶后的酶解液中，保温2h，进行脱色脱味处理；
(5)将经活性炭脱色后的酶解液用孔径为0.25μm孔径的陶瓷膜过滤处理，处理压力为1.2MPa，流速稳定至2000L/h；
(6)将经陶瓷膜过滤后的酶解液用孔径为10nm孔径的有机过滤膜处理，处理压力为2.3MPa，流速稳定在2800L/h，用有机膜浓缩小麦肽酶解液至32％～36％，后进行喷雾干燥处理，进风温度为165℃，出风温度为82℃，最终得到颜色为淡黄色，口感微微苦的小麦肽；
(7)按照相关国家标准进行检测(GB/T 22492)，对各种基本理化指标检测(小麦肽蛋白质、肽含量、水分、灰分、分子量分布、氨基酸分布等指标)。
表1理化指标检结果
蛋白质含量 水分 灰分 肽含量
93.9％ 3.5％ 2.6％ 83.5％
实施例2
1、体外消化试验
制备人工胃液：取240mL HCl溶液(pH＝2)，胃蛋白酶(3000-3500U/g)1.8g，摇匀后，加水稀释至300mL，置于4℃冰箱备用。
制备人工小肠液：取磷酸二氢钾2g，加水150mL使其溶解，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH值至6.8，取胰酶3g，加水适量使溶解，将以上配制的溶液混合后，加水稀释至300mL，置于4℃冰箱备用。
以人工胃液和肠液为溶剂，添加样品浓度控制为4mg/mL。取1mg样品，加入20mL人工胃液，温度37℃，100r/min震荡2h后，pH调至6.8，移入20mL人工小肠液摇匀，温度37℃，100r/min震荡3h，最后85℃灭酶10min，降至室温后进行超滤离心处理，保留滤出液。
2、消化前后降糖肽α-葡萄糖苷酶抑制率测定
将样品用0.1mol/L(pH＝6.8)磷酸钾缓冲液(PBS)配置成4mg/mL的溶液，在96孔酶标板中加入样品液40μL，1U/mLα-葡萄糖苷酶20μL，37℃保温10min，再加入1×10-3mol/L对硝基苯-α-D-葡萄糖苷(PNPG)40μL，37℃保温10min，最后加入1mol/LNa2CO3100μL终止反应，于405nm波长下测定样品组吸光值(A样品)，用PBS代替PNPG作为样品背景组(A样品背景)，用PBS代替样品作为空白组(A空白)，用PBS代替样品和PNPG作为空白背景组(A空白背景)α-葡萄糖苷酶抑制率计算见下公式：
经测定，小麦肽消化前后对α-葡萄糖苷酶的抑制率如表2所示，抑制率得到提高。
表2小麦肽消化前后对α-葡萄糖苷酶的抑制率
样品浓度 10mg/mL 20mg/mL 30mg/mL 40mg/mL 50mg/mL
消化前抑制率(％) 10.9 25.6 33.2 39.9 42.3
消化后抑制率(％) 13.5 34.1 39.7 44.2 45.3
实施例3
小麦肽分离纯化
将经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后的小麦肽利用高效液相色谱进行分离纯化，并将经分离纯化后的多肽组分参考实施例2方法，进行α-葡萄糖苷酶抑制率的测定，并最终进行氨基酸序列结构的鉴定。
采用制备型高效液相色谱仪对经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后的小麦肽进行分离纯化：
流动相A：0.1％三氟乙酸+99.9％超纯水；流动相B：0.1％三氟乙酸+99.9％乙腈；
检测波长：214nm；检测时间36min；柱温：21℃～25℃。
(3)采用流动相A以5mL/min的速度平衡6个柱体积，直到基线稳定为止。
(4)将得到的小麦肽混合物用流动相A溶解，配制样品的浓度为10mg/mL，10000r/min离心5min，上清液采用0.22μm的滤膜过滤处理，上样量为15mL。
(5)采用流动相A和流动相B的混合液进行梯度洗脱，洗脱梯度如下：
0至5min流动相B浓度由0％梯度上升到5％；5至30min，流动相B浓度由5％梯度上升到80％；30至40min始终保持用浓度为80％的流动相B洗脱；40至45min流动相B浓度由80％梯度下降到5％；
(6)按照表3进行接样，冷冻干燥后进行α-葡萄糖苷酶的抑制活性检测。
表3不同组分的α-葡萄糖苷酶的抑制活性
出峰时间 样品名称 抑制率(％) 出峰时间 样品名称 抑制率(％)
5min～7min 组分1 15.6％ 15min～17min 组分6 72.6％
7min～9min 组分2 29.3％ 17min～19min 组分7 31.3％
9min～11min 组分3 21.5％ 19min～21min 组分8 37.6％
11min～13min 组分4 35.6％ 21min～23min 组分9 22.4％
13min～15min 组分5 53.2％ 23min～25min 组分10 17.6％
对经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后的小麦肽的10个组分进行α-葡萄糖苷酶抑制率进行测定，并针对激活率较高的组分进一步分离纯化，并利用液质联用系统对组分6进行氨基酸序列结构鉴定(图1)。采用纳升级液相色谱-Q EXACTIVE质谱联用系统，对实施例3得到的组分6进行纯度和结构鉴定，其氨基酸结构为AGGGAGDVPLL将其命名为W1(图2和图3)，通过液质联用技术测定W1在小麦肽(经体内消化后)质量百分含量为0.61％。委托武汉星皓生物技术有限公司对核桃肽进行合成，进行后续实验，记为小麦肽W1。
实施例4
样品降血糖功效评价
1.检测材料
1.1.样品配制信息
实施例1制备得到的小麦低聚肽粉(混合物)和实施例3制备得到的小麦肽W1(纯肽，纯度99.5％)均用标准稀释水配制成2.00mg/mL母液，现配现用。
阳性对照：盐酸吡格列酮，白色片剂，批号2108102104，江苏德源药业股份有限公司，用DMSO配制成10.0mg/mL母液，研磨机研磨，离心取上清，4℃储存。
1.2.实验动物
斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100mg/L CaCO3)，由本公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171，饲养管理符合国际AAALAC认证(认证编号：001458)的要求。
野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为5dpf的斑马鱼用于样品降血糖功效评价。
1.3.仪器、耗材与试剂
解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)；CCD相机(VertA1，上海土森视觉科技有限公司，China)；精密电子天平(CP214，OHAUS，USA)；6孔板(NestBiotech，China)；血糖仪(卓越精采型，罗氏诊断有限公司，Germany)；血糖试纸(批号479142，罗氏诊断产品(上海)有限公司，USA)；高速冷冻离心机(Heraeus Fresco17，ThermoFisher，Germany)；高速组织研磨器(OSE-Y30，天根生化科技(北京)有限公司，China)。
二甲基亚砜(DMSO，批号20171016，国药集团化学试剂有限公司，China)；无水乙醇(批号20210529，国药集团化学试剂有限公司，China)；蛋黄粉(批号20200809，浙江艾格生物科技股份有限公司，China)；D-(+)-葡萄糖(批号20201105，国药集团化学试剂有限公司，China)。
2.检测方法
随机选取野生型AB品系斑马鱼于烧杯中，每杯(实验组)24尾。分别水溶给予样品(浓度见表4)，阳性对照盐酸吡格列酮10.0μg/mL，同时设置正常对照组和模型对照组，每杯容量为25mL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予高糖高脂饲料，建立斑马鱼高糖高脂模型。样品与高脂饲料共同处理15h(每天共同处理7.5h)，28℃处理48h，使用血糖仪采集数据，分析斑马鱼体内血糖值，以该指标的统计学分析结果评价样品降血糖功效。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。
表4样品降血糖功效评价实验结果(n＝8)
与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
3.检测结果
3.1.样品降血糖功效评价(5个样品)
在本实验条件下，模型对照组斑马鱼体内血糖值(4.49mmol/L)与正常对照组(0.950mmol/L)比较p<0.001，提示模型构建成功。阳性对照组盐酸吡格列酮10.0μg/mL浓度组斑马鱼体内血糖值为1.39mmol/L，与模型对照组比较p<0.001，提示盐酸吡格列酮具有明显的降血糖功效。
小麦低聚肽粉，500、1000和2000μg/mL浓度组斑马鱼体内血糖值分别为4.31、4.33和3.04mmol/L，与模型对照组比较分别p>0.05&p>0.05&p<0.01。提示在本实验条件下，小麦低聚肽粉具有降血糖功效。
小麦肽W1，50、100和200μg/mL浓度组斑马鱼体内血糖值分别为2.90、2.88和2.46mmol/L，与模型对照组比较均p<0.001。提示在本实验条件下，小麦肽W1具有降血糖功效。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东天久生物技术有限公司
中食都庆（山东）生物技术有限公司
<120> 一种具有辅助降血糖作用的小麦肽及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Gly Gly Gly Ala Gly Asp Val Pro Leu Leu
1 5 10

Claims (5)

1.一种具有辅助降血糖作用的小麦肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：对谷朊粉依次利用碱性蛋白酶、复合酶和风味蛋白酶进行酶解，灭酶后脱色脱味，对酶解液依次进行0.25μm膜过滤和10nm膜过滤，膜下液中包含所述小麦肽；
所述复合酶包括中性蛋白酶和菠萝蛋白酶；
所述谷朊粉与碱性蛋白酶、复合酶和风味蛋白酶的质量比为(450～550)：(2.25～2.75)：(1.35～1.65)：(0.45～0.55)；
在利用碱性蛋白酶酶解前，还包括将所述碱性蛋白酶利用碱性无离子水溶解，升温至55～58℃后，再进行所述碱性蛋白酶的酶解；酶解至pH值降至7.0～7.5时，利用复合酶进行酶解；所述复合酶的酶解时间为5.5～6h，酶解温度为55～58℃；
所述风味蛋白酶的酶解时间为1.5～2h，酶解温度为55～58℃；
所述0.25μm膜过滤包括利用0.25μm孔径的陶瓷膜过滤处理，处理压力为1.2MPa，流速为2000L/h；所述10nm膜过滤包括利用10nm孔径的有机过滤膜处理，处理压力为2.3MPa，流速为2800L/h。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，包括利用活性炭进行所述脱色脱味。
3.利用权利要求1或2所述制备方法得到的小麦肽。
4.从权利要求3所述小麦肽中分离纯化得到的小麦寡肽W1，其特征在于，所述小麦寡肽W1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.权利要求3所述小麦肽和/或权利要求4所述小麦寡肽W1在制备降血糖试剂中的应用。
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