CN117700484A - 一种高f值玉米肽、玉米低聚肽组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高F值玉米肽、玉米低聚肽组合物及其制备方法与应用，属于玉米肽制备技术领域。本发明先采用酸性蛋白酶进行预处理，再利用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后收集上清液，进一步利用碱性蛋白酶和中性蛋白酶进行内切处理，然后采用胰蛋白酶和风味蛋白酶对芳香族类氨基酸进行外切处理，最后采用树脂材料对玉米蛋白酶解物中的芳香族氨基酸进行吸附去杂。本发明通过定向酶解工艺以及树脂特异性吸附，制备了F值＞20的高F值玉米肽，同时分离纯化，筛选了一条具有改善肌少症的功能多肽TPPDEVVVPY，本发明提供的玉米肽在肌少症患者治疗期间，具有促进肌肉生长和提高运动表现的作用，对于肌少症的预防和治疗具有重要意义。

Description

一种高F值玉米肽、玉米低聚肽组合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于玉米肽制备技术领域，尤其涉及一种高F值玉米肽、玉米低聚肽组合物及其制备方法与应用。

背景技术

肌肉减少综合征(又称肌少症)，主要特征是增龄性骨骼肌质量减少同时伴有肌肉力量和身体功能减退的综合征，是严重影响老年人生活质量，提高老年人跌倒率和全因死亡率的慢性退行性疾病。目前，临床上对于肌少症的预防和治疗，主要从补充蛋白质和合理运动两个方面进行干预。而高F值玉米肽为高蛋白质且经过水解纯化后，其主要特征是分子量小且富含支链氨基酸。经过水解后的小分子多肽可以更好地被中老年人吸收消化，蛋白质吸收利用率更高；高F值玉米肽富含支链氨基酸尤其是亮氨酸含量最高，支链氨基酸是一种必需氨基酸，其中包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸，对人体具有重要的生理作用，如参与蛋白质合成、维持肌肉组织和免疫功能等。在肌少症的治疗过程中，摄入足够的支链氨基酸可以帮助增加蛋白质合成，促进肌肉生长。此外，富含支链氨基酸的高F值玉米肽还可以提高肌少症患者的运动耐力，减轻肌肉酸痛，有助于增加训练强度和持久性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有改善肌少症作用、具有促进肌肉生长和提高运动表现作用的高F值玉米肽或玉米低聚肽组合物。

本发明的另一目的是提供上述高F值玉米肽或上述高F值玉米低聚肽组合物的制备方法，本发明通过定向酶解工艺以及树脂特异性吸附，制备了F值＞20的高F值玉米肽和玉米低聚肽组合物。

本发明的另一目的是提供上述高F值玉米肽或上述高F值玉米低聚肽组合物或上述制备方法在制备防治肌少症产品或在制备激活胰岛素信号通路产品中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种高F值玉米肽，所述高F值玉米肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种高F值玉米低聚肽组合物，所述玉米低聚肽组合物包括上述的高F值玉米肽。

本发明还提供了上述高F值玉米低聚肽组合物的制备方法，包括如下步骤：采用酸性蛋白酶预处理玉米蛋白粉，得酶解液1；将酶解液1、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶混合酶解，得酶解液2；将酶解液2与碱性蛋白酶混合酶解，待pH下降至7.0-7.3时添加中性蛋白酶，继续酶解，得酶解液3；将酶解液3、胰蛋白酶和风味蛋白酶混合酶解，得酶解液4；将酶解液4灭酶处理后，过滤，将滤液采用AMK树脂进行脱芳处理，将透过液采用截流分子量为300Da的膜过滤，所得滤液为高F值玉米低聚肽组合物。

优选的，所述酸性蛋白酶的用量以玉米蛋白粉的重量计，为1kg玉米蛋白粉添加4.5g-5.5g酸性蛋白酶。

优选的，获得酶解液2时所添加的碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的用量以玉米蛋白粉的重量计，碱性蛋白酶为：18g-22g/kg玉米蛋白粉，木瓜蛋白酶为：4.5g-5.5g/kg玉米蛋白粉。

优选的，获得酶解液3时所添加的碱性蛋白酶的用量以玉米蛋白粉的重量计，为9g-11g/kg玉米蛋白粉；所述中性蛋白酶的用量以玉米蛋白粉的重量计，为4.5g-5.5g/kg玉米蛋白粉。

优选的，所述胰蛋白酶的用量以玉米蛋白粉的重量计，为1.9-2.1g/kg玉米蛋白粉，所述风味蛋白酶的用量以玉米蛋白粉的重量计，为9g-11g/kg玉米蛋白粉。

本发明还提供了上述高F值玉米肽的制备方法，在上述制备方法的基础上，还包括高效液相色谱分离纯化以及对不同时间收集的液相色谱峰组分进行成肌细胞增殖效果活性检测的步骤。

本发明还提供了上述玉米肽、上述玉米低聚肽组合物或上述制备方法在制备防治肌少症产品或制备激活胰岛素信号通路产品中的应用。

本发明的有益效果：

本发明首先采用酸性蛋白酶进行预处理，其次利用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后收集上清液，进一步利用碱性蛋白酶和中性蛋白酶进行内切处理，然后采用胰蛋白酶和风味蛋白酶对芳香族类氨基酸进行外切处理，最后采用特异性的树脂材料(AMK)对玉米蛋白酶解物中的芳香族氨基酸进行吸附去杂。本发明通过定向酶解工艺以及树脂特异性吸附，制备了F值＞20的高F值玉米肽，并将其转化为工业化产品，同时也不断分离纯化，筛选了一条具有改善肌少症的功能多肽，其应用范围也将逐渐扩展到保健、食品、医药等各个行业，不难预期高F值玉米肽的商业化必将带来极大的社会与经济效益。

另外，本发明提供的高F值玉米低聚肽组合物或氨基酸序列为TPPDEVVVPY的玉米肽在肌少症患者治疗期间，具有促进肌肉生长和提高运动表现的作用，对于肌少症的预防和治疗具有重要的意义。

附图说明

图1为实施例1的氨基酸分析仪输出的检测结果；

图2为对比例1的氨基酸分析仪输出的检测结果；

图3为对比例2的氨基酸分析仪输出的检测结果；

图4为对比例3的氨基酸分析仪输出的检测结果；

图5为对比例4的氨基酸分析仪输出的检测结果；

图6为实施例1制备所得高F值玉米低聚肽组合物高效液相色谱图；

图7为分离纯化后高F值玉米肽组分2高效液相色谱图；

图8为高F值玉米肽C1的二级质谱图；

图9为不同组别样品对地塞米松诱导的外周神经损伤的保护作用荧光图；

图10为动物试验方案；

图11为样品对小鼠前肢抓力的影响；

图12为样品对小鼠睾酮水平的影响；

图13为样品对小鼠血清中IGF-1含量；

图14为样品对小鼠血清中IGFBP-3含量的影响；

图15为样品对骨骼肌线粒体中ATP合成酶活性的影响；

图16为样品对胰岛素信号通路的影响。

具体实施方式

本发明提供了一种高F值玉米肽，所述高F值玉米肽的氨基酸序列为TPPDEVVVPY(Thr-Pro-Pro-Asp-Glu-Val-Val-Val-Pro-Tyr)，如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的高F值玉米肽分子量为1115.2Da。

本发明还提供了一种高F值玉米低聚肽组合物，所述玉米低聚肽组合物包括上述的高F值玉米肽。在本发明所述高F值玉米低聚肽组合物中，上述高F值玉米肽在玉米低聚肽组合物中的质量百分含量优选为0.86％。

本发明还提供了上述高F值玉米低聚肽组合物的制备方法，包括如下步骤：采用酸性蛋白酶预处理玉米蛋白粉，得酶解液1；将酶解液1、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶混合酶解，得酶解液2；将酶解液2与碱性蛋白酶混合酶解，待pH下降至7.0-7.3时添加中性蛋白酶，继续酶解，得酶解液3；将酶解液3、胰蛋白酶和风味蛋白酶混合酶解，得酶解液4；将酶解液4灭酶处理后，过滤，将滤液采用AMK树脂进行脱芳处理，将透过液采用截流分子量为300Da的膜过滤，所得滤液为高F值玉米低聚肽组合物。

本发明对于玉米蛋白粉的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可，也可以从提取完玉米淀粉的加工副产物中提取获得，所述提取方法优选的为采用纤维素酶和淀粉酶进行。本发明对于上述制备方法中所用的所有酶的具体来源没有特殊限定。在本发明中，所述酸性蛋白酶的用量以玉米蛋白粉的重量计，优选为1kg玉米蛋白粉添加4.5g-5.5g酸性蛋白酶，更优选为1kg玉米蛋白粉添加5g酸性蛋白酶，所述酸性蛋白酶的酶活为每克≥6万U，所述预处理的时间优选为2h，所述预处理的温度优选为50～55℃。

在本发明中，获得酶解液1后，优选的先将酶解液1升温至75～80℃，调节pH至8.0～8.5，再加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，所添加的碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的用量以玉米蛋白粉的重量计，碱性蛋白酶的添加量优选为：18g-22g/kg玉米蛋白粉，更优选为20g/kg玉米蛋白粉，所述碱性蛋白酶的酶活为每克≥20万U，木瓜蛋白酶的添加量优选为：4.5g-5.5g/kg玉米蛋白粉，更优选为5g/kg玉米蛋白粉，所述木瓜蛋白酶的酶活为每克≥10万U。获得酶解液2的酶解时间优选为2h，获得酶解液2后，优选的收集上清酶解液继续进行酶解处理。

在本发明中，获得酶解液3时所添加的碱性蛋白酶的用量以玉米蛋白粉的重量计，优选为9g-11g/kg玉米蛋白粉，更优选为10g/kg玉米蛋白粉，所述碱性蛋白酶的酶活为每克≥20万U；所述中性蛋白酶的用量以玉米蛋白粉的重量计，优选为4.5g-5.5g/kg玉米蛋白粉，更优选为5g/kg玉米蛋白粉，所述中性蛋白酶的酶活为每克≥5万U，所述继续酶解的时间优选为2h。

在本发明中，所述胰蛋白酶的用量以玉米蛋白粉的重量计，优选为1.9-2.1g/kg玉米蛋白粉，更优选为2g/kg玉米蛋白粉，所述胰蛋白酶的酶活为每克≥20万U，所述风味蛋白酶的用量以玉米蛋白粉的重量计，优选为9g-11g/kg玉米蛋白粉，更优选为10g/kg玉米蛋白粉，所述风味蛋白酶的酶活为每克≥5万U，获得酶解液4的酶解时间优选为1h。所述灭酶处理的方法优选为升温至100℃进行灭酶处理。将酶解液4灭酶处理后，所述过滤优选的为将灭酶后酶解液体加入活性炭继续保温脱色及吸附一些游离氨基酸，继续处理1h后用离心机离心处理，转速优选为8500转/分钟，采用孔径为100目的滤布板框过滤料液至澄清。

在本发明中，将滤液采用AMK树脂进行脱芳处理时，所述AMK树脂优选为经预处理后的AMK树脂，具体预处理方法优选为：加入高于树脂层10-20cm的乙醇浸泡1-2h，放出浸液，用乙醇继续洗至滴出液在试管中加水稀释不浑浊，水洗至出口无醇味，乙醇和水的用量约在2-5倍树脂体积；加入3-5倍树脂量的1M氢氧化钠洗出树脂内残余溶剂和杂质离子，去离子水洗至滴出液pH＜9；加入3-5倍树脂量的1M盐酸洗出金属离子，去离子水洗至滴出液pH＞4，即完成彻底清洗的预处理。采用预处理后的AMK树脂进行脱芳处理时，将经过离心过滤后的酶解液缓慢加入到离子交换柱中，利用恒流泵控制流速在15ml/min，收集树脂吸附后的透过液。获得透过液后，优选的先采用孔径为0.12μm的陶瓷膜过滤料液截流没有彻底酶解的大分子玉米蛋白，然后再采用截流分子量为300Da的有机膜过滤料液，目的是去除游离氨基酸，收集滤液，优选的进行冷冻干燥，得高F值玉米低聚肽组合物。

本发明第一步先采用酸性蛋白酶预处理，芳香族氨基酸在酸性条件下溶解性较差；第二步高温处理并进一步采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行处理，并收集上清液，可以将玉米蛋白分子量进一步减小，方便后面的内切处理；内切处理：将玉米蛋白进一步酶解为小分子多肽，并将大部分的芳香族氨基酸暴露在C末端和N末端，为后面的外切处理做准备；外切处理：采用胰蛋白酶和风味蛋白酶外切处理，将暴露的芳香族氨基酸酶切下来；然后采用特异性的吸附材料AMK树脂，对芳香族氨基酸进行吸附处理，进而提高其F值。本领域目前大多采用活性炭对玉米蛋白酶解物中的芳香族氨基酸进行吸附去杂，并进一步采用紫外分光光度计检测不同吸光度条件下的比值，相对来说比较粗糙，结果不准确。

本发明还提供了上述高F值玉米肽的制备方法，在上述制备方法的基础上，还包括高效液相色谱分离纯化以及对不同时间收集的液相色谱峰组分进行成肌细胞增殖效果活性检测的步骤。

在本发明中，采用高效液相色谱对上述制备获得的高F值玉米低聚肽组合物进行分离纯化时，所述分析条件优选为：流动相A：0.1％三氟乙酸+99.9％超纯水；流动相B：0.1％三氟乙酸+99.9％乙腈；检测波长：214nm；检测时间50min；柱温：21℃～25℃。优选的每间隔5min收集不同液相色谱峰组分，然后采用C2C12骨骼肌细胞模型对不同组分进行成肌细胞增殖效果活性检测，选择能够显著促进C2C12细胞增殖的组分，采用纳升级液相色谱-Q EXACTIVE质谱联用系统，对所述组分进行纯度和结构鉴定，鉴定得到一条多肽，其氨基酸组成为TPPDEVVVPY(Thr-Pro-Pro-Asp-Glu-Val-Val-Val-Pro-Tyr)。

本发明还提供了上述玉米肽、上述玉米低聚肽组合物或上述制备方法在制备防治肌少症产品或制备激活胰岛素信号通路产品中的应用。

在本发明中，所述产品优选的包括药物。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1)玉米蛋白制备：从提取完玉米淀粉的加工副产物(江苏采薇生物科技有限公司)中提取玉米蛋白，具体处理工艺如下：称取加工副产物500kg，加入6000L无离子水充分搅拌，用1M NaOH调节其pH至4.5，同时升温至50℃，先加入1kg淀粉酶(夏盛)和1kg纤维素酶(夏盛)充分搅拌提取2h后，静止30min，采用离心机将酶解液离心处理，收集沉淀即为目标物，玉米蛋白(135kg)。经检测玉米蛋白粉的蛋白含量为86.5％，水分3.1％，灰分5.6％，脂肪2.1％，碳水化合物11.4％。

2)酸性蛋白酶预处理：量取10L无离子水升温至55℃，调节pH至4.5，加入5g酸性蛋白酶(SDG-2422，夏盛)充分搅拌溶解均匀后加入1kg玉米蛋白，65转/分钟充分搅拌酶解2h后再作进一步处理；

3)高温处理：将步骤2)中的酶解液升温至80℃，调节pH至8.0，加入20g碱性蛋白酶(FDG-2202，夏盛)和5g木瓜蛋白酶(FDG-2203，夏盛)，65转/分钟充分搅拌酶解2h后离心处理，转速为6000转/分钟，收集上清酶解液；

4)内切蛋白酶处理：将上一步经高温处理后的玉米蛋白酶解液调节pH至8.5，添加10g碱性蛋白酶(FDG-2202，夏盛)继续酶解，待pH下降至7.2时添加5g中性蛋白酶(FDG-2209，夏盛)，继续酶解2h；

5)外切蛋白酶处理：将上一步经内切处理后的酶解液，继续添加2g胰蛋白酶(GDG-2009，夏盛)和10g风味蛋白酶(FFG-3903，夏盛)酶解1h后升温至100℃进行灭酶处理；

6)离心过滤：将灭酶后酶解液体加入20g活性炭，继续处理1h后用离心机离心处理，转速为8500转/分钟，采用孔径为100目的滤布板框过滤料液至澄清；

7)AMK树脂脱芳处理

称取200gAMK树脂，树脂在首次使用前需彻底清洗，加入高于树脂层20cm的75％浓度乙醇浸泡1小时，放出浸液，用75％浓度乙醇继续洗至滴出液在试管中加水稀释不浑浊，水洗至出口无醇味，乙醇和水的用量为2倍树脂体积；加入3倍树脂量的1M氢氧化钠洗出树脂内残余溶剂和杂质离子，去离子水洗至滴出液pH＜9；加入3倍树脂量的1M盐酸洗出金属离子，去离子水洗至滴出液pH＞4，即完成预处理；

将经过步骤6)的酶解液缓慢加入到离子交换柱中，利用恒流泵控制流速在15ml/min，收集树脂吸附后的透过液；

8)采用孔径为0.12μm的陶瓷膜过滤透过液，截流没有彻底酶解的大分子玉米蛋白，最后采用截流分子量为300Da的有机膜过滤料液，目的是去除游离氨基酸，收集滤液；

9)冷冻干燥及物料性质检测：将膜过滤纯化后的酶解液(滤液)，喷雾干燥，干燥条件为：进风温度165℃，出风温度90℃，得高F值玉米低聚肽组合物。

参考相关国家标准对高F值玉米肽的理化性质进行检测，具体检测项目为：氨基酸分布检测(GB/T 22492-2008)、色氨酸含量检测(GB 5009.294-2023)。F值计算是通过支链氨基酸(BCAA:Val，Ile，Leu)与芳香族氨基酸(AAA:Trp，Tyr，Phe)含量的摩尔数比值所得。

检测结果如图1和表1所示：亮氨酸含量为2.71％，异亮氨酸含量为1.03％，缬氨酸含量为3.98％；苯丙氨酸含量为0.44％，酪氨酸含量为0，色氨酸含量为0，经计算制备的高F值玉米肽的F值为23.45。

表1为实施例1所得高F值玉米低聚肽组合物的水解氨基酸分布

实施例2

1)酸性蛋白酶预处理：量取10L无离子水升温至50℃，调节pH至4.5，加入5g酸性蛋白酶(SDG-2422，夏盛)充分搅拌溶解均匀后加入1kg玉米蛋白(购自于江苏采薇生物科技有限公司)，65转/分钟充分搅拌酶解2h后再作进一步处理；

2)高温处理：将步骤1)中的酶解液升温至75℃，调节pH至8.5，加入20g碱性蛋白酶(FDG-2202，夏盛)和5g木瓜蛋白酶(FDG-2203，夏盛)，65转/分钟充分搅拌酶解2h后离心处理，转速为6000转/分钟，收集上清酶解液；

3)内切蛋白酶处理：将上一步经高温处理后的玉米蛋白酶解液调节pH至9.0，添加10g碱性蛋白酶(FDG-2202，夏盛)继续酶解，待pH下降至7.2时添加5g中性蛋白酶(FDG-2209，夏盛)，继续酶解2h；

4)外切处理：将上一步经内切处理后的酶解液，继续添加2g胰蛋白酶(GDG-2009，夏盛)和10g风味蛋白酶(FFG-3903，夏盛)酶解1h后升温至100℃进行灭酶处理；

5)离心过滤：将灭酶后酶解液体加入20g活性炭，继续处理1h后用离心机离心处理，转速为8500转/分钟，采用孔径为100目的滤布板框过滤料液至澄清；

6)AMK树脂脱芳处理

称取200gAMK树脂，树脂在首次使用前需彻底清洗，加入高于树脂层10cm的75％浓度乙醇浸泡2小时，放出浸液，用75％浓度乙醇继续洗至滴出液在试管中加水稀释不浑浊，水洗至出口无醇味，乙醇和水的用量为5倍树脂体积；加入5倍树脂量的1M氢氧化钠洗出树脂内残余溶剂和杂质离子，去离子水洗至滴出液pH＜9；加入5倍树脂量的1M盐酸洗出金属离子，去离子水洗至滴出液pH＞4，即完成预处理；

将经过步骤5)的酶解液缓慢加入到离子交换柱中，利用恒流泵控制流速在15ml/min，收集树脂吸附后的透过液；

7)采用孔径为0.12μm的陶瓷膜过滤透过液，截流没有彻底酶解的大分子玉米蛋白，最后采用截流分子量为300Da的有机膜过滤料液，目的是去除游离氨基酸，收集滤液；

8)冷冻干燥及物料性质检测：将离心纯化后的酶解液，冷冻干燥，得高F值玉米低聚肽组合物。

对比例1

与实施例1的区别在于不进行2)酸性蛋白酶预处理步骤，高温处理步骤中“将步骤2)中的酶解液升温至80℃，调节pH至8.0，”相应的修改为“量取10L无离子水升温至80℃，调节pH至8.0，加入1kg玉米蛋白”，其余均同实施例1。

检测结果如图2和表2所示：亮氨酸含量为2.96％，异亮氨酸含量为1.13％，缬氨酸含量为3.97％；苯丙氨酸含量为0.38％，酪氨酸含量为0.45％，色氨酸含量为0.01％，经计算制备的高F值玉米肽的F值为13.46。

表2为对比例1所得玉米肽的水解氨基酸分布

对比例2

与实施例1的区别在于不进行5)外切蛋白酶处理步骤，其余均同实施例1。

检测结果如图3和表3所示：亮氨酸含量为13.36％，异亮氨酸含量为3.00％，缬氨酸含量为3.60％；苯丙氨酸含量为4.92％，酪氨酸含量为3.09％，色氨酸含量为0.06％，经计算制备的高F值玉米肽的F值为3.3。

表3为对比例2所得玉米肽的水解氨基酸分布

对比例3

与实施例1的区别在于不进行4)内切蛋白酶处理步骤，其余均同实施例1。

检测结果如图4和表4所示：亮氨酸含量为2.92％，异亮氨酸含量为1.11％，缬氨酸含量为3.89％；苯丙氨酸含量为0.38％，酪氨酸含量为0.44％，色氨酸含量为0.02％，经计算制备的高F值玉米肽的F值为13.24。

表4为对比例3所得玉米肽的水解氨基酸分布

对比例4

与实施例1的区别在于不进行7)AMK树脂脱芳处理步骤，其余均同实施例1。

检测结果如表5和图5所示：亮氨酸含量为13.58％，异亮氨酸含量为3.1％，缬氨酸含量为3.58％；苯丙氨酸含量为4.90％，酪氨酸含量为2.91％，色氨酸含量为0.09％，经计算制备的高F值玉米肽的F值为3.42。

表5为对比例4所得玉米肽的水解氨基酸分布

实施例3

高F值玉米肽的分离纯化：

本发明通过采用高效液相色谱法对实施例1制备获得的高F值玉米低聚肽组合物进行分离纯化，以C2C12细胞(小鼠成肌细胞的亚株)为模型，采用MTT法检测不同组分的细胞增殖效果，具体操作如下：

采用高效液相色谱法对实施例1制备获得的高F值玉米低聚肽组合物进行分离纯化，具体操作步骤如下：

(1)分析条件：流动相A：0.1％三氟乙酸+99.9％超纯水；流动相B：0.1％三氟乙酸+99.9％乙腈；检测波长：214nm；检测时间50min；柱温：21℃～25℃。

(2)采用流动相A以5ml/min的速度平衡6个柱体积，直到基线稳定为止。

(3)将得到的高F值玉米肽用流动相A溶解，配制高F值乳清蛋白肽的浓度为10mg/mL，10000r/min离心5min，上清液采用0.22μm的滤膜过滤处理，上样量为15mL。

(4)采用流动相A和流动相B的混合液进行梯度洗脱，洗脱梯度如表6所示：

表6流动相梯度

时间	0min	5min	30min	45min	50min
						流动相A	100％	95％	35％	95％	100％
流动相B	0％	5％	65％	5％	0％

(5)每间隔5min收集不同液相色谱峰组分，结果如表7所示。其中高效液相色谱图如图6和图7所示。

表7不同组分出峰时间分布表

然后以C2C12细胞(小鼠成肌细胞的亚株)为模型，采用MTT法检测不同组分的细胞增殖效果：将C2C12细胞接种在密度为1×10⁴个细胞/孔的96孔细胞培养板中，并利用不同组分孵育12、24、36或48小时。未经处理的细胞作为对照组。处理后，在每个孔中加入最终浓度为5mg/mL的MTT，并在37℃下进一步培养4h。移除培养基后，在每个孔中加入二甲基亚砜(100μl)。摇动平板5分钟后，使用微孔板酶联免疫吸附试验(ELISA，SpecterMax i3x，奥地利)在490nm处测量混合物的吸光度(OD值)。结果如表8所示。

表8不同分离组分对C2C12细胞生长的影响

由表8可以看出，在处理48小时后，发现与对照组相比，组分2、3、5等均显著促进C2C12细胞的增殖。值得注意的是，与其他组分相比，组分2(P2)共孵育导致了更明显的C2C12细胞增殖，并且即使在24小时内也呈现出明显的细胞生长促进效应。进一步采用纳升级液相色谱-Q EXACTIVE质谱联用系统，对所得到的组分2进行纯度和结构鉴定。

检测条件：

(1)流动相：A相：100％纯净水+0.1％甲酸；B相:100％乙腈+0.1％甲酸；

(2)流动相流速：300nL/min；

(3)进样量：1μL上清；

(4)流动相梯度程序如下表9所示。

表9流动相梯度程序

时间(min)	0	2.0	36.0	38.0	41.0	42.0	45.0
								A(％)	97	97	63	10	10	97	97
B(％)	3	3	37	90	90	3	3

利用纳升级液相色谱-Q EXACTIVE质谱联用，对组分2进行结构鉴定结果如图8所示，共鉴定到一条多肽，其氨基酸组成为TPPDEVVVPY

(Thr-Pro-Pro-Asp-Glu-Val-Val-Val-Pro-Tyr)，其分子量为1115.2Da，通过液质联用技术测定此条单链多肽在实施例1所得高F值玉米低聚肽组合物中的质量百分含量为0.86％，将所述此单链多肽命名为C1。

委托武汉星皓医药有限公司对该单链多肽进行合成，并展开体外消化试验，

体外消化试验：

制备人工胃液：取240mLHCl溶液(pH＝2)，胃蛋白酶(3000-3500U/g)1.8g，摇匀后，加水稀释至300mL，置于4℃冰箱备用。制备人工小肠液：取磷酸二氢钾2g，加水150mL使其溶解，用0.1mol/LNaOH溶液调节pH值至6.8，取胰酶3g，加水适量使溶解，将以上配制的溶液混合后，加水稀释至300mL，置于4℃冰箱备用。

以人工胃液和肠液为溶剂，添加样品浓度控制为4mg/mL。取1mg样品，加入20mL人工胃液，温度37℃，100r/min震荡2h后，pH调至6.8，移入20mL人工小肠液摇匀，温度37℃，100r/min震荡3h，最后85℃灭酶10min，降至室温后进行超滤离心处理，保留滤出液，采用实施例3的高效液相检测方法对消化前和消化后进行检测，检测前后色谱峰无明显变化，与图7结果一致。结果表明该单链多肽不被消化蛋白酶降解。

实施例4

实施例3所得高F值玉米肽和实施例1所得高F值玉米低聚肽组合物对少肌症斑马鱼模型的作用

随机选取270尾2hpf(受精后2小时)转基因运动神经元荧光斑马鱼NBT品系于六孔板中，每个孔30尾，每孔容量为3mL，水溶给予高F值玉米肽(实施例1制备所得高F值玉米低聚肽组合物)25、75和215μg/mL，高F值玉米肽C1(实施例3所得)2.5、7.5和21.5μg/mL浓度，阳性对照药为谷胱甘肽采用水溶给药浓度为200μg/mL，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组。水溶给予地塞米松300μM浓度建立肌少症模型，给药70h后，在荧光显微镜下拍照，采集斑马鱼泄殖孔上方三个体节所在区域的外周运动神经长度平均值(L)，以运动神经长度统计学意义评价高F值玉米肽和高F值玉米肽C1的运动神经促再生作用。运动神经损伤的促再生作用计算公式如下：

统计学分析采用T检验和单因素方差分析，p<0.05表明具有显著性差异，提供具有代表性的实验图谱。

试验结果如表10和图9所示：模型对照组斑马鱼运动神经长度为179像素，与正常对照组(309像素)比较P＜0.001，表明模型建立成功。阳性对照组谷胱甘肽200μg/mL组斑马鱼运动神经长度为269像素，与模型对照组(179像素)比较均P＜0.01。表明在本实验浓度条件下，谷胱甘肽对外周神经损伤斑马鱼有明显的保护作用。

高F值玉米肽在25、75和215μg/mL浓度时，运动神经长度分别为215、238和251像素，与模型对照组(179像素)比较P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01，表明在该实验浓度条件下高F值玉米肽对外周神经损伤斑马鱼有保护作用。

高F值玉米肽C1在2.5、7.5和21.5μg/mL浓度时，运动神经长度分别为209、221和255像素，与模型对照组(179像素)比较P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01，表明在该实验浓度条件下高F值玉米肽C1对外周神经损伤斑马鱼有保护作用。

表10样品处理后运动神经长度

与模型对照组比较，***表示P＜0.01；n＝10。

实施例5

本实施例的目的主要是，利用6月龄SAMR1快速衰老型小鼠为研究对象，研究高F值玉米肽(实施例1所得高F值玉米低聚肽组合物)和高F值玉米肽C1(实施例3所得)对衰老性肌萎缩小鼠的影响。设置6月龄SAMR1作为正常对照组。研究8周抗阻运动联合高F值玉米肽和高F值玉米肽C1对衰老性肌萎缩小鼠的影响。实验前后分别检测其前肢抓力。实验结束，处死实验小鼠，取血清以及股直肌待用。

试验方案

采取SPF级SAMR1快速衰老型小鼠为模型鼠，分别随机分为4组，每组10只：模型对照组(A组)，支链氨基酸组(B组)，高F值玉米肽组(实施例1所得高F值玉米低聚肽组合物)(C组)以及高F值玉米肽C1组(实施例3所得)(D组)。各实验组均进行8周负重爬梯抗阻运动。实验前后分别检测其前肢抓力。实验结束，处死实验小鼠，取血清以及部分组织肌肉待用。整体试验方案的流程如图10所示。

(1)抓力测定：

选用40只SPF级SAMR1快速衰老型小鼠(江西中洪博元生物技术有限公司)为模型鼠，所有动物适应性喂养1周，饲养在恒温(22±2)℃和恒湿(55±5)％和明暗交替周期12小时/12小时动物房内，普通饲料购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，自由摄食与饮水。最后将小鼠随机分为模型对照组(A组)，支链氨基酸组(江西百盈生物技术有限公司)(B组)，高F值玉米肽组(实施例1所得高F值玉米低聚肽组合物)(C组)以及高F值玉米肽C1组(实施例3所得)(D组)，每组10只。A组小鼠每天灌胃等量的生理盐水，B组小鼠每天灌胃1g/kg体重的支链氨基酸，C组小鼠每天灌胃1g/kg体重的高F值玉米肽，D组小鼠每天灌胃0.5g/kg体重的高F值玉米肽C1，同时所有4组小鼠进行8周的阻力运动训练。

详细的运动方案如下：在熟悉爬梯一周后，小鼠在1米长爬梯上进行8周的爬梯运动，梯子上有一个倾斜85°的2厘米网格梯子，重量附着在小鼠的尾巴上。在整个梯子长度内成功承载的最大负载被认为是抗阻训练的最大负荷能力，分别于试验开始前和结束前检测到最大负载能力。每只小鼠在第一个训练周的负荷为其最大负荷的50％，运动负荷增加至其最大负荷的100％，直到第八周结束，频率为每周3次，每次5组，每组3个重复，重复之间休息60秒，两组之间休息5分钟。

结果如图11所示。高F值玉米肽肽可以显著性提高小鼠前肢抓力，效果优于支链氨基酸。而高F值玉米肽C1增加抓力效果优于高F值玉米肽和支链氨基酸。

(2)睾酮、IGF-1、IGFBP-3以及ATP酶活性测定

取实验小鼠血清，按照ELISA试剂盒操作说明书，分别检测睾酮、IGF-1、IGFBP-3的含量以及ATP酶活性，结果如图12-15所示。

睾酮可以增加肌纤维的体积进而促进肌肉的生长，同时睾酮可以维持骨骼的强度，避免骨质疏松，还可以帮助肌肉的生长，增加肌肉的体积，提高肌肉的力量，避免肌肉萎缩。因此睾酮与肌肉生长关系非常密切，高水平的睾酮可以使蛋白质降解明显减少，有效避免肌萎缩的发生。由图12的实验结果可以看出，相比于模型对照组，服用支链氨基酸可以显著性提高小鼠睾酮水平，而且睾酮水平明显高于服用支链氨基酸的小鼠。而高F值玉米肽C1对于睾酮增加效果优于高F值玉米肽和支链氨基酸。

IGF-1是骨骼肌再生过程中的一个关键正向调控因子，在促进骨胳肌生长方面发挥重要作用。由图13可以看出，相比于模型对照组，服用支链氨基酸可以显著性提高小鼠外周血中IGF-1的含量，而且增加量高于高F值玉米肽，而高F值玉米肽C1对于IGF-1增加效果优于服用支链氨基酸。

IGFBP是IGFs结合蛋白，IGFBP与IGF-1或者IGF-2结合时，会阻碍IGFs信号通路的进行，IGFBP-3是IGFBP种最重要的一种，其余IGF-1由高亲和性。在进行8周抗阻力训练后，服用高F值玉米肽的实验小鼠外周血中IGFBP-3含量明显低于对照组，而且也低于支链氨基酸组，但是当服用高F值玉米肽C1时，小鼠外周血中IGFBP-3含量最低(图14)。

细胞线粒体与肌肉的功能密切相关，肌肉的收缩需要大量的能量，肌肉的能量代谢主要通过ATP的合成来实现，而ATP合成酶是机体合成ATP的关键作用酶，因此它的酶活和肌肉生长有密切关系。从图15结果来看，相比于模型对照组，支链氨基酸、高F值玉米肽及高F值玉米肽C1均能够显著性提高骨骼肌线粒体中ATP合成酶活性，其中高F值玉米肽C1可以更好的促进ATP合成酶的活性。

(3)骨骼肌组织信号通路的检测

胰岛素信号通路在肌肉生长过程中发挥重要作用，为了考察样品对胰岛素信号通路的激活，采用Western Blot方法考察了检测样品对胰岛素信号通路相关蛋白的表达情况。具体操作方法是：取实验大鼠小腿三头肌，匀浆，超声破碎细胞，上清液中加入上样缓冲液，12％SDS-PAGE分离蛋白，350mA电转2.5小时，取出PVDF膜，5％脱脂奶粉室温封闭1小时，TBS-T洗膜3次，然后加入一抗4℃孵育过夜，TBS-T洗膜3次，室温孵育二抗1小时，洗膜，加入ECL发光剂，显色。

结果如图16所示，支链氨基酸、高F值玉米肽及高F值玉米肽C1均可以显著性增加IGF-1R的表达，进而促进IGF-1与IGF-1R的结合，进一步促进AMPK的磷酸化，然后诱导细胞周期相关蛋白cyclinD1与CDK6表达上调，最终导致肌肉细胞的增殖。其中，高F值玉米肽C1可以更好激活胰岛素信号通路。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种高F值玉米肽，其特征在于，所述高F值玉米肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种高F值玉米低聚肽组合物，其特征在于，所述玉米低聚肽组合物包括权利要求1所述的高F值玉米肽。

3.权利要求2所述高F值玉米低聚肽组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：采用酸性蛋白酶预处理玉米蛋白粉，得酶解液1；将酶解液1、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶混合酶解，得酶解液2；将酶解液2与碱性蛋白酶混合酶解，待pH下降至7.0-7.3时添加中性蛋白酶，继续酶解，得酶解液3；将酶解液3、胰蛋白酶和风味蛋白酶混合酶解，得酶解液4；将酶解液4灭酶处理后，过滤，将滤液采用AMK树脂进行脱芳处理，将透过液采用截流分子量为300Da的膜过滤，所得滤液为高F值玉米低聚肽组合物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述酸性蛋白酶的用量以玉米蛋白粉的重量计，为1kg玉米蛋白粉添加4.5g-5.5g酸性蛋白酶。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，获得酶解液2时所添加的碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的用量以玉米蛋白粉的重量计，碱性蛋白酶为：18g-22g/kg玉米蛋白粉，木瓜蛋白酶为：4.5g-5.5g/kg玉米蛋白粉。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，获得酶解液3时所添加的碱性蛋白酶的用量以玉米蛋白粉的重量计，为9g-11g/kg玉米蛋白粉；所述中性蛋白酶的用量以玉米蛋白粉的重量计，为4.5g-5.5g/kg玉米蛋白粉。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述胰蛋白酶的用量以玉米蛋白粉的重量计，为1.9-2.1g/kg玉米蛋白粉，所述风味蛋白酶的用量以玉米蛋白粉的重量计，为9g-11g/kg玉米蛋白粉。

8.权利要求1高F值玉米肽的制备方法，其特征在于，在权利要求3-7任意一项所述制备方法的基础上，还包括高效液相色谱分离纯化以及对不同时间收集的液相色谱峰组分进行成肌细胞增殖效果活性检测的步骤。

9.以下任意一项在制备防治肌少症产品中的应用，其特征在于，(1)权利要求1所述玉米肽，(2)权利要求2所述玉米低聚肽组合物，(3)权利要求3-7任意一项所述制备方法，(4)权利要求8所述制备方法。

10.以下任意一项在制备激活胰岛素信号通路产品中的应用，其特征在于，(1)权利要求1所述玉米肽，(2)权利要求2所述玉米低聚肽组合物，(3)权利要求3-7任意一项所述制备方法，(4)权利要求8所述制备方法。