CN114836503A - 一组具有肝损伤保护作用的乳清蛋白肽、高f值寡肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一组具有肝损伤保护作用的乳清蛋白肽、高f值寡肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一组具有肝损伤保护作用的乳清蛋白肽、高F值寡肽及其制备方法和应用，涉及活性肽技术领域。本发明采用三酶水解乳清蛋白制备高F值寡肽，首先用少量的碱性蛋白酶对其进行预处理，提高其溶解性并破坏其肽链，提高后续酶解的效率，然后依次采用内切蛋白酶处理和外切蛋白酶处理，最终以游离状态的形式存在于酶解液中，最终利用特异性树脂将芳香族氨基酸吸附，得到F值大于20的乳清蛋白肽，并最终分离筛选得到两条高F值寡肽。本发明所述乳清蛋白肽以及高F值寡肽可降低肝脏中丙二醛和甘油三酯的含量，升高还原型谷胱甘肽的含量，对化学性肝损伤有辅助保护作用。

Description

一组具有肝损伤保护作用的乳清蛋白肽、高F值寡肽及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于活性肽技术领域，具体涉及一组具有肝损伤保护作用的乳清蛋白肽、高F值寡肽及其制备方法和应用。
背景技术
F值(Fischer ratio)，是支链氨基酸(BCAA:Val，Ile，Leu)与芳香族氨基酸(AAA:Trp，Tyr，Phe)含量的摩尔数比值，为了纪念德国著名学者Fischer.J.E在20世纪70年代提出“伪神经递质假说”而命名。高F寡肽是利用蛋白酶作用于植物蛋白或动物蛋白后制得的支链氨基酸与芳香族氨基酸的摩尔数比值大于20，远高于人体中这两类氨基酸比值模式的一类生物活性肽。
高F值寡肽由于它具有独特的氨基酸组成和生理功能，已经受到食品和医药界的高度关注，且小分子肽相较于单体氨基酸具有渗透压低、抗原性低等优点，更容易被机体吸收，同时也具有诸多调节生理功能的功效。
虽然高F值寡肽具有非常广泛的生物活性，但是由于其产品的高标准，规模化生产非常不容易，如定向酶解工艺控制较差，重现性较差，以及芳香族氨基酸的去除效果差、效率低。因此亟需一种新的可满足工业化生产的高F值寡肽的制备方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一组具有肝损伤保护作用的乳清蛋白肽、高F值寡肽及其制备方法和应用，制备方法简单且可满足工业化要求，酶解定向性好，芳香族氨基酸去除效率高，且得到的乳清蛋白肽和高F值寡肽具有良好的肝损伤保护作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了乳清蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：利用碱性蛋白酶对乳清蛋白进行预处理后，然后利用内切蛋白酶将肽链的芳香族氨基酸暴露在C末端或N末端，而后采用外切蛋白酶水解暴露的芳香族氨基酸，得酶解液；对酶解液进行离子交换柱层析，收集透过液，所述透过液中包括所述乳清蛋白肽。
优选的，所述预处理时，体系pH值为8.5，处理温度为52～55℃；
利用内切蛋白酶进行处理时，体系的pH值为7.0～7.5，处理温度为37～42℃。
优选的，所述预处理的时间为15～30min；
所述内切蛋白酶包括胰蛋白酶，酶解时间为2h；
所述外切蛋白酶包括风味蛋白酶，酶解时间为4h。
优选的，所述预处理时碱性蛋白酶的质量为乳清蛋白质量的1/1000；
所述胰蛋白酶的质量为乳清蛋白质量的13/1000；
所述风味蛋白酶的质量为乳清蛋白质量的3/1000。
优选的，所述离子交换柱层析时，所述酶解液的添加流速为9ml/min。
优选的，所述酶解液经灭酶后进行离子交换柱层析；所述灭酶包括将酶解液加热至100℃保持10min。
优选的，在进行所述离子交换柱层析前，还包括对离子交换柱中的树脂进行预处理。
本发明还提供了利用上述制备方法制备得到的乳清蛋白肽，所述乳清蛋白肽的F值＞20。
本发明还提供了从上述乳清蛋白肽中分离筛选出的具有肝损伤保护作用的高F值寡肽。
优选的，所述高F值寡肽包括W1和W2，其中W1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，W2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述乳清蛋白肽或上述高F值寡肽在制备肝损伤保护药物或对肝损伤有辅助治疗作用的保健品中的应用。
有益效果：本发明提供了乳清蛋白肽的制备方法，适用于工业化生产，采用三酶水解乳清蛋白制备高F值寡肽，首先用少量的碱性蛋白酶对其进行预处理，提高其溶解性并破坏其肽链，提高后续酶解的效率，然后采用内切蛋白酶处理将肽链的芳香族氨基酸暴露在C末端或N末端，然后采用外切蛋白酶将暴露的芳香族氨基酸从末端水解下来，最终以游离状态的形式存在于酶解液中，最终利用特异性树脂将芳香族氨基酸吸附，得到F值大于20的乳清蛋白肽，并最终分离筛选得到两条高F值寡肽。经实施例验证，所述乳清蛋白肽以及高F值寡肽高、中、低剂量组可降低肝脏中丙二醛和甘油三酯的含量，升高还原型谷胱甘肽的含量，并且各剂量组与模型对照组的肝细胞脂肪病变评分均存在显著性差异(P＜0.01)。根据《保健食品检验与评价技术规范》判定标准，高F值乳清蛋白肽对化学性肝损伤有辅助保护作用。
附图说明
图1为实施例1高F值乳清蛋白肽氨基酸分布结果图；
图2为实施例1乳清蛋白肽氨基酸分布结果图；
图3为实施例2乳清蛋白肽氨基酸分布结果图；
图4为实施例3乳清蛋白肽氨基酸分布结果图；
图5为实施例4乳清蛋白肽氨基酸分布结果图；
图6为制备型高效液相分离高F值乳清蛋白肽色谱图；
图7为W1的质谱图；
图8为W1的液相谱图；
图9为W2的质谱图；
图10为W2的液相谱图；
图11为斑马鱼酒精性肝损伤表型图，图中L：肝脏，Y：卵黄囊；黄色框线内为肝脏，红色框线内为卵黄囊。
具体实施方式
本发明提供了乳清蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：利用碱性蛋白酶对乳清蛋白进行预处理后，然后利用内切蛋白酶将肽链的芳香族氨基酸暴露在C末端或N末端，而后采用外切蛋白酶水解暴露的芳香族氨基酸，得酶解液；对酶解液进行离子交换柱层析，收集透过液，所述透过液中包括所述乳清蛋白肽。
本发明利用碱性蛋白酶对乳清蛋白进行预处理，所述预处理包括在碱性条件下，利用碱性蛋白酶对乳清蛋白进行第一酶解，得第一酶解液。本发明所述第一酶解的体系pH值优选为8.5左右，第一酶解的温度优选为55℃。本发明在进行所述第一酶解时，优选将碱性蛋白酶和所述乳清蛋白按照1:1000的质量比混合后，于搅拌条件下进行第一酶解，得到第一酶解液，所述搅拌的转速优选为45rpm。本发明所述第一酶解的时间优选为15～30min。本发明所述预处理，可提高乳清蛋白的溶解性并破坏其肽链，提高后续酶解的效率。
本发明在所述预处理期间，优选还包括不断检测体系的pH值，待所述pH值下降至7.0～7.5时，同时温度下降至37～42℃，可添加内切蛋白酶，将肽链的芳香族氨基酸暴露在C末端或N末端。本发明所述内切蛋白酶优选包括胰蛋白酶，且所述胰蛋白酶的用量优选为所述乳清蛋白质量的13/1000。本发明利用所述胰蛋白酶对第一酶解液进行第二酶解，所述第二酶解的体系的pH值优选为7.0～7.5，处理温度优选为37～42℃，处理时间优选为2h，得第二酶解液。
本发明优选直接向所述第二酶解液中加入外切蛋白酶，进行第三酶解，从而将暴露的芳香族氨基酸从末端水解下来，最终以游离状态的形式存在于酶解液中。本发明所述外切蛋白酶优选包括风味蛋白酶，所述风味蛋白酶的质量优选为乳清蛋白质量的3/1000。本发明进行所述第三酶解时，酶解温度优选与第二酶解相同，且酶解时间优选为4h。本发明优选在第三酶解后，升温至100℃后，灭酶10min后得到第三酶解液。本发明通过采用水解位点相对单一的蛋白酶进行定向酶解，高效释放芳香族氨基酸。
本发明对所述第三酶解液进行离子交换柱层析，所述层析柱中填充AMK树脂(山东鲁抗立科药物化学有限公司)，本发明在进行所述离子交换柱层析前，优选还包括对树脂进行预处理，所述预处理优选包括：利用2～5倍树脂体积的乙醇浸泡1～2h完成彻底清洗，放出浸液后，利用2～5倍树脂体积乙醇再次洗至滴出液在试管中加水稀释不浑浊，水洗至出口无醇味；再用3～5倍树脂体积的氢氧化钠洗出树脂内残余溶剂和杂质离子，去离子水洗至滴出液pH＜9；加入3～5倍树脂体积的盐酸洗出金属离子，去离子水洗至滴出液pH＞4，即完成预处理。
本发明优选将所述第三酶解液加入到经上述预处理后的离子交换柱中，并利用恒流泵控制流速在9ml/min，将透过液收集进行冷冻干燥后进行相关指标检测。本发明所述指标优选包括氨基酸分布检测、色氨酸含量检测、蛋白质含量测定、水分含量的测定和灰分含量的测定，且对上述指标的检测方法并没有特殊限定，利用本领域的常规检测方法即可。
本发明还提供了基于上述制备方法得到的乳清蛋白肽，所述乳清蛋白肽的F值＞20，且经实施例验证所述高F值的乳清蛋白肽对肝脏萎缩具有保护作用分。
本发明还提供了从上述乳清蛋白肽中分离筛选得到的具有肝损伤保护作用的乳清蛋白肽，所述乳清蛋白肽包括W1和W2，其中W1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，W2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明中，W1的氨基酸组成为LELLL(Leu-Glu-Leu-Leu-Leu)，分子量为598.2Da，W2的氨基酸组成为IIGAVV(Ile-Ile-Gly-Ala-Val-Val)，分子量为571.6Da。本发明所述W1和W2两条单链多肽均不被消化蛋白酶降解；且所述乳清蛋白肽的F值＞20。本发明所述W1和W2的肝损伤保护作用优于所述乳清蛋白肽。
本发明还提供了上述乳清蛋白肽或上述高F值寡肽在制备肝损伤保护药物或对肝损伤有辅助治疗作用的保健品中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的一组具有肝损伤保护作用的乳清蛋白肽、高F值寡肽及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
步骤一、碱性蛋白酶预处理
量取6L无离子水，用1M NaOH调节其pH为8.5左右，升温至55℃，称量0.5g碱性蛋白酶，搅拌均匀后缓慢加入500g乳清蛋白，期间以45转/分钟的转速不断搅拌，得到第一酶解液；
步骤二、内切酶进一步处理
第一酶解液反应过程中，期间不断检测pH，待pH下降至7.0～7.5左右时，同时温度下降至37～42℃，称取6.5g胰蛋白酶，酶解2h后，得到第二酶解液；
步骤三、外切酶处理
称取1.5g风味蛋白酶，加入到第二酶解液中，继续酶解4h后，升温至100℃后，灭酶10min后得到第三酶解液；
步骤四、AMK树脂脱芳处理
(1)树脂预处理：称取200g树脂，树脂在首次使用前的彻底清洗，加入高于树脂层10～20厘米的乙醇浸泡1～2小时，放出浸液，用乙醇继续洗至滴出液在试管中加水稀释不浑浊，水洗至出口无醇味，乙醇和水的用量约在2～5倍树脂体积；加入3～5倍树脂量的1M氢氧化钠洗出树脂内残余溶剂和杂质离子，去离子水洗至滴出液pH＜9；加入3～5倍树脂量的1M盐酸洗出金属离子，去离子水洗至滴出液pH＞4，即完成预处理。
(2)样品处理：将第三酶解液缓慢加入到离子交换柱中，利用恒流泵控制流速在9ml/min，将透过液收集进行冷冻干燥后进行相关指标检测。
(3)树脂再生：常规蒸汽解析工艺后继续使用，当树脂吸附量出现明显下降时需要90％以上的乙醇浸2～4小时，用量2～3倍树脂排出后使用失效的树脂先用4％HCl浸2～3小时，体积为树脂量的2倍，水洗至中性，然后用4％NaOH浸2～3小时，水洗至中性，如吸附色素较多，树脂颜色较深可用95％乙醇浸3～4小时，水洗循环使用。
步骤五、相关指标检测
高F值乳清蛋白肽基本理化性质测定指标如下：氨基酸分布检测(GB/T22492-2008)、色氨酸含量检测(GB 5009.124-2016)蛋白质含量测定(GB5009.9)、水分含量的测定(GB5009.3)、灰分含量的测定(GB5009.4)。
高F值乳清蛋白肽的氨基酸分布如图1所示，相关指标的检测结果如表1所示。
表1高F值乳清蛋白肽相关指标检测结果
项目 蛋白质含(％) 水分含量(％) 灰分含量(％) 色氨酸含量(mg/g) F值
高F值乳清蛋白肽 79.2 6.5 3.9 0 26.34
对比例1(碱性蛋白酶+风味蛋白酶双酶处理)
步骤一、碱性蛋白酶内切预处理
量取6L无离子水，用1M NaOH调节其pH为8.5左右，升温至55℃，称量5.0g碱性蛋白酶，搅拌均匀后缓慢加入500g乳清蛋白，酶解前1h内维持pH在8.5～8.8附近，期间以45转/分钟的转速不断搅拌，得到第一酶解液；
步骤三、外切酶处理
将第一酶解液降温至37～42℃，称取1.5g风味蛋白酶，加入到第一酶解液中，继续酶解4h后，升温至100℃后，灭酶10min后得到第二酶解液；
步骤四、AMK树脂脱芳处理
(1)树脂预处理：称取200g树脂，树脂在首次使用前的彻底清洗，加入高于树脂层10～20厘米的乙醇浸泡1～2小时，放出浸液，用乙醇继续洗至滴出液在试管中加水稀释不浑浊，水洗至出口无醇味，乙醇和水的用量约在2～5倍树脂体积；加入3～5倍树脂量的1M氢氧化钠洗出树脂内残余溶剂和杂质离子，去离子水洗至滴出液pH＜9；加入3～5倍树脂量的1M盐酸洗出金属离子，去离子水洗至滴出液pH＞4，即完成预处理。
(2)样品处理：将第二酶解液缓慢加入到离子交换柱中，利用恒流泵控制流速在9ml/min，将透过液收集进行冷冻干燥后进行相关指标检测。
(3)树脂再生：常规蒸汽解析工艺后继续使用，当树脂吸附量出现明显下降时需要90％以上的乙醇浸2～4小时，用量2～3倍树脂排出后使用失效的树脂先用4％HCl浸2～3小时，体积为树脂量的2倍，水洗至中性，然后用4％NaOH浸2～3小时，水洗至中性，如吸附色素较多，树脂颜色较深可用95％乙醇浸3～4小时，水洗循环使用。
乳清蛋白肽的氨基酸分布如图2所示，相关指标的检测结果如表2所示。
表2对比例1中相关指标的检测结果
项目 蛋白质含量(％) 水分含量(％) 灰分含量(％) 色氨酸含量(mg/g) F值
高F值乳清蛋白肽 80.2 6.3 3.5 5.5 6.58
对比例2(胰蛋白酶酶+风味蛋白酶双酶处理)
步骤一、胰蛋白酶内切处理
量取6L无离子水，用1M NaOH调节其pH为7.0～7.5左右，升温至37～42℃，搅拌均匀后缓慢加入500g乳清蛋白，称取6.5g胰蛋白酶，以45转/分钟的转速不断搅拌，酶解4h后得到第一酶解液；
步骤三、外切酶处理
称取1.5g风味蛋白酶，加入到第一酶解液中，继续酶解4h后，升温至100℃后，灭酶10min后得到第二酶解液；
步骤四、AMK树脂脱芳处理
(1)树脂预处理：称取200g树脂，树脂在首次使用前的彻底清洗，加入高于树脂层10～20厘米的乙醇浸泡1～2小时，放出浸液，用乙醇继续洗至滴出液在试管中加水稀释不浑浊，水洗至出口无醇味，乙醇和水的用量约在2～5倍树脂体积；加入3～5倍树脂量的1M氢氧化钠洗出树脂内残余溶剂和杂质离子，去离子水洗至滴出液pH＜9；加入3～5倍树脂量的1M盐酸洗出金属离子，去离子水洗至滴出液pH＞4，即完成预处理。
(2)样品处理：将第二酶解液缓慢加入到离子交换柱中，利用恒流泵控制流速在9ml/min，将透过液收集进行冷冻干燥后进行相关指标检测。
(3)树脂再生：常规蒸汽解析工艺后继续使用，当树脂吸附量出现明显下降时需要90％以上的乙醇浸2～4小时，用量2-3倍树脂排出后使用失效的树脂先用4％HCl浸2～3小时，体积为树脂量的2倍，水洗至中性，然后用4％NaOH浸2～3小时，水洗至中性，如吸附色素较多，树脂颜色较深可用95％乙醇浸3～4小时，水洗循环使用。
乳清蛋白肽的氨基酸分布如图3所示，相关指标的检测结果如表3所示。
表3对比例2中相关指标的检测结果
项目 蛋白质含量(％) 水分含量(％) 灰分含量(％) 色氨酸含量(mg/g) F值
高F值乳清蛋白肽 79.6 6.1 3.8 6.5 6.3
对比例3(中性蛋白酶+风味蛋白酶双酶处理)
步骤一、中性蛋白酶内切预处理
量取6L无离子水，用1M NaOH调节其pH为7.0左右，升温至55℃，称量5.0g中性蛋白酶，搅拌均匀后缓慢加入500g乳清蛋白，期间以45转/分钟的转速不断搅拌，得到第一酶解液；
步骤三、外切酶处理
降温至37～42℃，称取1.5g风味蛋白酶，加入到第一酶解液中，继续酶解4h后，升温至100℃后，灭酶10min后得到第二酶解液；
步骤四、AMK树脂脱芳处理
(1)树脂预处理：称取200g树脂，树脂在首次使用前的彻底清洗，加入高于树脂层10～20厘米的乙醇浸泡1～2小时，放出浸液，用乙醇继续洗至滴出液在试管中加水稀释不浑浊，水洗至出口无醇味，乙醇和水的用量约在2～5倍树脂体积；加入3～5倍树脂量的1M氢氧化钠洗出树脂内残余溶剂和杂质离子，去离子水洗至滴出液pH＜9；加入3～5倍树脂量的1M盐酸洗出金属离子，去离子水洗至滴出液pH＞4，即完成预处理。
(2)样品处理：将第二酶解液缓慢加入到离子交换柱中，利用恒流泵控制流速在9ml/min，将透过液收集进行冷冻干燥后进行相关指标检测。
(3)树脂再生：常规蒸汽解析工艺后继续使用，当树脂吸附量出现明显下降时需要90％以上的乙醇浸2～4小时，用量2～3倍树脂排出后使用失效的树脂先用4％HCl浸2～3小时，体积为树脂量的2倍，水洗至中性，然后用4％NaOH浸2～3小时，水洗至中性，如吸附色素较多，树脂颜色较深可用95％乙醇浸3～4小时，水洗循环使用。
乳清蛋白肽的氨基酸分布如图4所示，相关指标的检测结果如表4所示。
表4对比例3中相关指标的检测结果
项目 蛋白质含量(％) 水分含量(％) 灰分含量(％) 色氨酸含量(mg/g) F值
高F值乳清蛋白肽 81.3 5.9 4.1 5.6 7.13
对比例4(木瓜蛋白酶+风味蛋白酶双酶处理)
步骤一、木瓜蛋白酶内切预处理
量取6L无离子水，用1M NaOH调节其pH为7.0左右，升温至55℃，称量5.0g木瓜蛋白酶，搅拌均匀后缓慢加入500g乳清蛋白，期间以45转/分钟的转速不断搅拌，得到第一酶解液；
步骤三、外切酶处理
降温至37～42℃，称取1.5g风味蛋白酶，加入到第一酶解液中，继续酶解4h后，升温至100℃后，灭酶10min后得到第二酶解液；
步骤四、AMK树脂脱芳处理
(1)树脂预处理：称取200g树脂，树脂在首次使用前的彻底清洗，加入高于树脂层10～20厘米的乙醇浸泡1～2小时，放出浸液，用乙醇继续洗至滴出液在试管中加水稀释不浑浊，水洗至出口无醇味，乙醇和水的用量约在2～5倍树脂体积；加入3～5倍树脂量的1M氢氧化钠洗出树脂内残余溶剂和杂质离子，去离子水洗至滴出液pH＜9；加入3～5倍树脂量的1M盐酸洗出金属离子，去离子水洗至滴出液pH＞4，即完成预处理。
(2)样品处理：将第二酶解液缓慢加入到离子交换柱中，利用恒流泵控制流速在9ml/min，将透过液收集进行冷冻干燥后进行相关指标检测。
(3)树脂再生：常规蒸汽解析工艺后继续使用，当树脂吸附量出现明显下降时需要90％以上的乙醇浸2～4小时，用量2～3倍树脂排出后使用失效的树脂先用4％HCl浸2～3小时，体积为树脂量的2倍，水洗至中性，然后用4％NaOH浸2～3小时，水洗至中性，如吸附色素较多，树脂颜色较深可用95％乙醇浸3～4小时，水洗循环使用。
乳清蛋白肽的氨基酸分布如图5所示，相关指标的检测结果如表5所示。
表5对比例4中相关指标的检测结果
项目 蛋白质含量(％) 水分含量(％) 灰分含量(％) 色氨酸含量(mg/g) F值
高F值乳清蛋白肽 80.6 6.3 3.2 3.9 7.47
实施例2
对乙醇脱氢酶(ADH)的激活率测定
乙醇脱氢酶(ADH)在氧化醒辅酶Ⅰ(NAD+)存在的弱碱范围内，催化乙醇的脱氢生成乙醛的反应如下：
Figure BDA0003625588680000101
本发明采用瓦勒-霍赫方法并稍作修改，测定高F值乳清蛋白肽对乙醇脱氢酶的抑制活性；准备5mL试管，加入pH8.8的焦磷酸钠缓冲液1.5mL，27mmol/L氧化性辅酶酶Ⅰ(NAD+)1.0mL，体积分数为11.5％的乙醇溶液0.5mL，试验样品0.1ml(50μg/mL的样品溶液或超纯水)，以上样品混合均匀后置于25℃水浴锅中温浴5min，最后向试管中加入25℃温浴的乙醇脱氢酶(ADH，0.25U/mL)0.1mL。使用多功能酶标仪于波长340nm处测定吸光度，每10s测定吸光度，连续测定10min，绘制拟合反应曲线，计算从0min拟合曲线的一阶导数作为NADH的增加率，即初始反应速率，每个样品设置3个重复样，乙醇脱氢酶的激活率按照以下公式计算：
Figure BDA0003625588680000111
式中：Vs代表测试样品的初始反应速率；Vo代表阴性对照的初始的反应速率。经测定，实施例1至对比例1～4的激活率依次为52.9％、23.5％、39.1％、26.3％和29.2％。
实施例3
乳清肽的分离纯化及其氨基酸序列结构鉴定
采用制备型高效液相色谱仪对高F值乳清蛋白肽进行分离纯化：
(1)流动相A：0.1％三氟乙酸+99.9％超纯水；流动相B：0.1％三氟乙酸+99.9％乙腈；
(2)检测波长：214nm；检测时间40min；柱温：21℃～25℃。
(3)采用流动相A以5ml/min的速度平衡6个柱体积，直到基线稳定为止。
(4)将得到的高F值乳清蛋白肽用流动相A溶解，配制高F值乳清蛋白肽的浓度为10mg/mL，10000r/min离心5min，上清液采用0.22μm的滤膜过滤处理，上样量为15mL。
(5)采用流动相A和流动相B的混合液进行梯度洗脱，洗脱梯度如下：
0至5min流动相B占比由0％梯度上升到5％；5至35min，流动相B梯度由5％梯度上升到95％；35至40min流动相B占比965％梯度下降到5％；
(6)每隔5min收集不同液相色谱峰的峰尖组分，进行活性检测。
收集得到了12个组分(图6)，12个组分的出峰时间情况见表6。
表6 36个组分的出峰时间情况
组分 出峰时间
1 0～5min
2 6～10min
3 11～15min
4 16～20min
5 21～25min
6 26～30min
7 31～35min
8 36～40min
采用实施例2的方法，对高F值乳清蛋白肽的8个组分进行乙醇脱氢酶激活率进行测定，并针对激活率较高的组分进一步分离纯化，并利用液质联用系统对组分3和组分4进行氨基酸序列结构鉴定。
进一步利用采用纳升级液相色谱-Q EXACTIVE质谱联用系统，对所得到的组分3和组分4进行纯度和结构鉴定。
1.检测条件：
(1)流动相:A相:100％纯净水+0.1％甲酸；B相:100％乙腈+0.1％甲酸；
(2)流动相流速:300nl/min；
(3)进样量：1μL上清；
(4)流动相梯度程序如下表7所示。
表7流动相梯度程序
Figure BDA0003625588680000121
Figure BDA0003625588680000131
利用纳升级液相色谱-Q EXACTIVE质谱联用，对组分3和组分4进行结构鉴定，共鉴定到两条多肽，其氨基酸组成为LELLL(Leu-Glu-Leu-Leu-Leu)和IIGAVV(Ile-Ile-Gly-Ala-Val-Val)，其分子量分别为598.2Da和571.6Da，通过液质联用技术测定此两条单链多肽在高F值乳清蛋白肽的质量百分含量分别为1.02％和0.46％。因此，将所述两条单链多肽命名为W1(图7～8)和W2(图9～10)。委托武汉星皓医药有限公司对两条单链多肽进行合成，并展开体外消化试验，结果表明两条单链多肽不被消化蛋白酶降解。
实施例4
高F值乳清蛋白肽对酒精性肝损伤的辅助保护作用
本发明采用酒精性肝损伤斑马鱼模型研究高F值乳清蛋白肽对其保护作用。
实验动物：斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100mg/L CaCO3)，由环特生物公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171，饲养管理符合国际AAALAC认证(认证编号：001458)的要求。
野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行，共180尾，每实验组为30尾，年龄为受精后5天(5dpf)。用于高F值乳清蛋白肽对斑马鱼化学性肝损伤辅助保护作用。
仪器和设备：体式显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)；CCD相机(VertA1，上海土森视觉科技有限公司，China)；精密电子天平(CP214，OHAUS，America)；6孔板(Nest Biotech，China)。
甲基纤维素(批号079K0054V，Sigma，USA)；二甲基亚砜(DMSO，批号BCBZ1685，Sigma，USA)；
组别设置：
Figure BDA0003625588680000132
Figure BDA0003625588680000141
模型制作：随机选取150尾5dpf野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼，用2％的无水乙醇处理5dpf野生型AB品系斑马鱼建立酒精性肝损伤斑马鱼模型。斑马鱼机体大量摄入乙醇后，在乙醇脱氢酶的催化下大量脱氢氧化，使三羧酸循环障碍和脂肪酸氧化减弱而影响脂肪代谢，致使脂肪在肝细胞内沉积。同时乙醇能激活氧分子，产生氧自由基导致肝细胞膜的脂质过氧化及体内还原型谷胱甘肽的耗竭。无水乙醇可使斑马鱼肝脏结构发生改变；肝脏肿大，肝脏发生变性，卵黄囊吸收延迟；肝脏损伤也导致斑马鱼体内谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量升高。
检测方法：处理结束后：1)观察统计各实验组斑马鱼的死亡数量和毒性反应情况；2)取正常对照组、阳性对照组、模型对照组和样品组，每个组别随机选取10尾斑马鱼在体式显微镜下拍照并保存图片，用NIS-Elements D3.10高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼斑马鱼肝脏面积(A)、肝脏明亮度平均值(S)和卵黄囊吸收延迟面积(A)，以肝脏面积、肝脏明亮度平均值和卵黄囊面积的统计学分析结果评价高F值乳清蛋白肽对酒精性性肝损伤的辅助保护作用。统计学处理结果用mean±SE表示。肝脏萎缩改善作用、肝脏变性改善作用和卵黄囊吸收延迟改善作用计算公式如下：
Figure BDA0003625588680000142
Figure BDA0003625588680000143
Figure BDA0003625588680000144
结果如表8所示，模型对照组斑马鱼肝脏面积像素(42356)相较于正常对照组(53892)比较p＜0.01，表明模型建立成功。阳性药物组多烯磷脂酰胆碱50μg/mL浓度组斑马鱼肝脏面积像素为47651，与模型对照组相比p＜0.05，其对肝脏萎缩的保护作用为45.9％，对模型斑马鱼肝脏有一定的保护效果。
表8样品处理后斑马鱼肝脏面积(n＝10)
Figure BDA0003625588680000151
注：与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，下同。
高F值乳清蛋白肽、高F值乳清蛋白肽W1、高F值乳清蛋白肽W2组别的肝脏面积像素分别为49865、51269和50031，与模型对照组相比p＜0.01，其对肝脏萎缩的保护作用分别为65.1％、77.3％和66.5％，表明高F值乳清蛋白肽对模型斑马鱼肝脏有一定的保护效果，其中高F值乳清蛋白肽W1样品效果最佳。
表9样品处理后斑马鱼肝脏亮度平均值(n＝10)
Figure BDA0003625588680000152
模型对照组斑马鱼肝脏亮度平均值(62.59)相较于正常对照组(69.38)比较p＜0.01，表明模型建立成功。阳性药物组多烯磷脂酰胆碱50μg/mL浓度组斑马鱼肝脏亮度平均值为66.72，与模型对照组相比p＜0.01，其对肝脏变性改善作用为60.8％(表9)，对模型斑马鱼肝脏变性具有一定的改善作用。
高F值乳清蛋白肽、高F值乳清蛋白肽W1、高F值乳清蛋白肽W2组别的肝脏亮度平均值分别为67.63、68.82和68.01，与模型对照组相比p＜0.01，其对肝脏变性改善作用分别为74.2％、91.8％和79.8％，表明高F值乳清蛋白肽对模型斑马鱼肝脏变性具有一定的改善作用，其中高F值乳清蛋白肽W1组的肝脏变性改善作用最佳。
表10样品处理后斑马鱼卵黄囊面积(n＝10)
Figure BDA0003625588680000161
模型对照组斑马鱼卵黄囊面积(122561)相较于正常对照组(9036)比较p＜0.01，表明模型建立成功。阳性药物组多烯磷脂酰胆碱50μg/mL浓度组斑马鱼卵黄囊面价为89321，与模型对照组相比p＜0.01，其对卵黄囊吸收延迟改善作用为29.3％(表10)，对模型斑马鱼肝脏变性具有一定的改善作用。
高F值乳清蛋白肽、高F值乳清蛋白肽W1、高F值乳清蛋白肽W2组别的卵黄囊面积分别为65176/52762和56311，与模型对照组相比p＜0.01，其对卵黄囊吸收延迟改善作用分别为50.7％、61.6％和58.5％，表明高F值乳清蛋白肽对模型斑马鱼卵黄囊吸收延迟具有一定的改善作用，其中高F值乳清蛋白肽W1组的卵黄囊吸收延迟改善改善作用最佳(图11)。
实施例5
高F值乳清蛋白肽对化学性肝损伤有辅助保护功能实验
1材料与方法
1.1样品：高F值乳清蛋白肽；联苯双酯。
1.2实验动物
选用中国医学科学院实验动物研究所(许可证号为SCXK(京)2004-0001)繁殖的SPF级KM雌性小鼠，体重18～22g，共72只，随机分为六组，分别为样品低剂量组、中剂量组、高剂量组、空白对照组、模型对照组和联苯双酯阳性对照组(250mg/kg.bw)。实验环境为屏障环境，实验动物使用许可证号为SYXK(鲁)2003-0006。实验动物标准饲料由山东省实验动物中心提供,许可证号：SCXK(鲁)2004-0014号。
1.3剂量选择
人体推荐量为每天4g/人/日(人均体重按60kg计)，实验设三个剂量组，即：0.33g/kg.bw组、0.67g/kg.bw组、2.00g/kg.bw组，低、中、高三个组的剂量分别相当于人体推荐摄入量的5倍、10倍、30倍。分别称取0.66g、1.34g、4.00g样品用蒸馏水溶解，定容至40ml，作为低、中、高剂量组受试物。同时设立空白对照组、模型对照组和联苯双酯阳性对照组(250mg/kg.bw)。
1.4仪器与试剂：
紫外可见分光光度计，高速分散器，恒温水浴锅，离心机，混旋器。
无水乙醇：分析纯，天津市广成化学试剂有限公司，批号20061106。
联苯双酯滴丸：德州德药制药有限公司，批号070104。
丙二醛试剂盒(100T)：南京建成生物工程研究所，批号20080704。
还原型谷胱甘肽试剂盒(100T)：南京建成生物工程研究所，批号20080704。
甘油三酯试剂盒(GPO-PAD法)：温州津玛生物科技有限公司，批号2007100289。
1.5实验方法
1.5.1实验步骤
各剂量组给予受试样品，空白对照组、模型对照组和阳性对照组给予蒸馏水，按每天0.2ml/10g.bw连续经口灌胃31d，阳性对照组于第26d开始，灌胃给予联苯双酯连续5d。实验第31d将模型组、阳性对照组及各样品组按14ml/kg.bw一次灌胃给予50％无水乙醇，空白对照组给蒸馏水。隔夜禁食16h后处死动物，取肝脏进行肝组织中MDA、GSH、TG的测定，并作病理组织学检查。称取动物处死时体重与初期体重计算体重增值，称量肝重，计算肝脏系数。
1.5.2观察指标
1.5.2.1检测指标：MDA、GSH、TG，采用试剂盒法测定,
1.5.2.2病理解剖：取小鼠肝脏左叶，从肝左叶中部做横切面取材，常规冰冻切片。镜检时，从肝脏的—端视野开始记录细胞的病理变化，用40倍物镜连续观察整个组织切片。主要观察脂滴在肝脏的分布、范围和面积进行计分，评分标准：
Figure BDA0003625588680000181
1.6实验数据用Excel软件建立数据库，用SPSS软件进行方差分析，方差齐时，采用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法(Dunnett检验法)进行统计分析；方差不齐时，改用秩和检验进行统计。
2结果
2.1动物的一般表现
造模前，各剂量组小鼠一般情况可，正常饮食，体重逐期增长。造模后，空白对照组小鼠动作自如，反应灵敏，毛发光泽；模型对照组、阳性对照组和样品各剂量组小鼠步态不稳，活动减少。
2.2样品对小鼠体重的影响
表11样品对小鼠体重影响(
Figure BDA0003625588680000182
n＝12)
Figure BDA0003625588680000183
Figure BDA0003625588680000191
P：与模型对照组比较，下同。
由表11可见，模型对照组、阳性对照组、各实验组小鼠的造模前体重和体重增加值与空白对照组比较均无显著性差异(p≥0.05)。
2.3肝匀浆中各项指标的检测结果
2.3.1肝匀浆中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)的测定结果：
表12肝匀浆中丙二醛的测定结果(
Figure BDA0003625588680000192
n＝12)
Figure BDA0003625588680000193
由表12可见，模型对照组的丙二醛含量与空白对照组之间存在极显著性差异(P＜0.01)，表明本模型成立。硬性对照组，样品低、中、高剂量组的丙二醛含量与模型对照组之间存在极显著性差异(P＜0.01)。
2.3.2肝匀浆中还原型谷胱甘肽测定结果：
表13肝匀浆中还原型谷胱甘肽的测定结果(
Figure BDA0003625588680000201
n＝12)
Figure BDA0003625588680000202
由表13可见，模型对照组的还原型谷胱甘肽含量与对照组之间存在极显著性差异(P＜0.01)，表明本模型成立。阳性对照组，样品低、中、高剂量组的还原型谷胱甘肽含量与模型对照组之间存在极显著性差异(P＜0.01)。
2.3.3肝匀浆中甘油三酯的测定结果：
表14肝匀浆中甘油三酯的测定结果(
Figure BDA0003625588680000203
n＝12)
Figure BDA0003625588680000204
Figure BDA0003625588680000211
由表4可见，模型对照组的甘油三酯含量与对照组之间存在极显著性差异(P＜0.01)，表明本次模型成立。阳性对照组，样品低、中、高剂量组的甘油三酯含量与模型对照组之间存在极显著性差异(P＜0.01)。
2.4病理检查结果：
2.4.1对小鼠肝脏重量、肝脏系数和病理指标的影响
表15对小鼠肝脏重量、肝脏系数和病理指标的影响(
Figure BDA0003625588680000212
n＝12)
Figure BDA0003625588680000213
由表15可见，模型对照组病理组织学变化平均积分与空白对照组之间有极显著性差异(P＜0.01)，表明模型成立。阳性对照组和中、高剂量组与模型对照组之间均有显著性差异(P＜0.01)。
2.4.2组织学检查结果：
空白对照组正常结构清楚，肝小叶排列整齐，结构完整，可见规则放射状排列肝细胞索、正常血窦、中央静脉、门管区。肝细胞呈多边形，胞浆轻度嗜酸性着色，细胞核圆形，中央位，细胞无变性、坏死及炎细胞浸润。
模型对照组以中央静脉为中心出现弥漫性病理改变，肝细胞排列紊乱，肿胀及气球样变，可见肝细胞脂肪变性，肝细胞胞浆内出现界限清晰、大小不一的圆形脂滴空泡，脂肪病变总分明显增加。
阳性对照组和样品各剂量组与模型对照组比较：肝小叶结构较清晰，肝细胞浊肿、脂肪变性明显减轻，各组动物肝脏病理指标评分见表15。
实验结果表明，模型对照组和空白对照组有显著性差异，表明本实验模型成立。与模型对照组比较，高F值乳清蛋白肽高、中、低剂量组可降低肝脏中丙二醛和甘油三酯的含量，升高还原型谷胱甘肽的含量。病例结果表明，各剂量组与模型对照组的肝细胞脂肪病变评分均存在显著性差异(P＜0.01)。根据《保健食品检验与评价技术规范》判定标准，高F值乳清蛋白肽对化学性肝损伤有辅助保护作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏祈瑞医药科技有限公司
<120> 一组具有肝损伤保护作用的乳清蛋白肽、高F值寡肽及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Glu Leu Leu Leu
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Ile Gly Ala Val Val
1 5

Claims (10)

1.一种乳清蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：利用碱性蛋白酶对乳清蛋白进行预处理后，然后利用内切蛋白酶将肽链的芳香族氨基酸暴露在C末端或N末端，而后采用外切蛋白酶水解暴露的芳香族氨基酸，得酶解液；对酶解液进行离子交换柱层析，收集透过液，所述透过液中包括所述乳清蛋白肽。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述预处理时，体系pH值为8.5，处理温度为52～55℃；
利用内切蛋白酶进行处理时，体系的pH值为7.0～7.5，处理温度为37～42℃。
3.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于，所述预处理的时间为15～30min；
所述内切蛋白酶包括胰蛋白酶，酶解时间为2h；
所述外切蛋白酶包括风味蛋白酶，酶解时间为3.5h～4h。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述预处理时碱性蛋白酶的质量为乳清蛋白质量的1/1000；
所述胰蛋白酶的质量为乳清蛋白质量的13/1000；
所述风味蛋白酶的质量为乳清蛋白质量的2.5～3/1000。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述离子交换柱层析时，所述酶解液的添加流速为9ml/min。
6.根据权利要求1或5所述制备方法，其特征在于，所述酶解液经灭酶后进行离子交换柱层析；所述灭酶包括将酶解液加热至100℃保持10min。
7.利用权利要求1～6任一项所述制备方法制备得到的乳清蛋白肽，所述乳清蛋白肽的F值＞20。
8.从权利要求7所述乳清蛋白肽中分离筛选出的具有肝损伤保护作用的高F值寡肽。
9.根据权利要求8所述高F值寡肽，其特征在于，所述高F值寡肽包括W1和W2，其中W1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，W2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
10.权利要求7所述乳清蛋白肽或权利要求8或9所述高F值寡肽在制备肝损伤保护药物或对肝损伤有辅助治疗作用的保健品中的应用。
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