CN101466400A - 共价凝血因子ⅶ-组织因子复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及凝血因子VII多肽和组织因子多肽的新颖共价复合物，尤其涉及该类具有功能活性并且与相应的游离凝血因子VII多肽相比对凝血因子X具有增强的蛋白水解活性的复合物以及生产这些新颖复合物的方法。

Description

共价凝血因子Ⅶ-组织因子复合物
发明领域
本发明涉及凝血因子VII多肽和组织因子多肽的新颖共价复合物，尤其涉及具有功能活性并与相应的游离凝血因子VII多肽相比对凝血因子X的蛋白水解活性增强的复合物。该类复合物被认为特别适用于出血性疾病的治疗。
发明背景
生物活性增强的凝血因子VIIa多肽是治疗由于重组凝血因子VIIa的次优药效而使传统重组凝血因子VIIa疗法对其部分或完全不显疗效的不可控出血的有利分子。目前增强药效的方法反映了重组凝血因子VIIa的作用机制，即表现为不依赖于组织因子在活化的血小板上直接激活凝血因子X。
组织因子是由263个氨基酸组成的完整膜糖蛋白受体，位于血管外膜细胞上。其由折叠成两个各被单个二硫键稳定化的致密III型纤连蛋白-样结构域(1-219)的胞外部分、一个跨膜片段(220-242)和一个短的胞质尾区(243-263)组成。它通过与凝血因子VII形成在血管损伤时可从血液循环中捕获的紧密Ca2+-依赖复合物作为凝血的关键抑制剂。组织因子也可以通过提供最优大分子外结合位点相互作用的支架和通过诱导凝血因子VIIa蛋白酶结构域的构象变化使正确定义活性位点区域从而大大增加对其生理学底物凝血因子IX和凝血因子X的蛋白水解活性。由直接蛋白质-蛋白质相互作用引起的TF对凝血因子FVIIa的构象激活可在体外通过提供含有组织因子可溶性外结构域(sTF)的凝血因子VIIa重现。
Miyata等，生物化学(Biochemistry)，36，1997，5120-5127公开了一种重组凝血因子VIIa和可溶性组织因子通过同基双功能胺特异性试剂的方式化学交联的共价复合物。但是该交联复合物并未表现出对凝血因子X的蛋白水解活性。
发明概述
本发明涉及凝血因子VII多肽和组织因子多肽的新颖共价复合物。该复合物与相应的游离凝血因子VII多肽相比对大分子底物凝血因子X表现出增强的蛋白水解活性。
更具体而言，本发明涉及凝血因子VII多肽和组织因子多肽的共价复合物，其中凝血因子VII多肽和组织因子多肽通过(i)凝血因子VII多肽氨基酸和(ii)组织因子多肽氨基酸的组的氨基酸侧链之间的一个或多个指定连接的方式共价连接。
而且，本发明也涉及凝血因子VIIa多肽和组织因子子多肽的共价复合物，其中凝血因子VIIa多肽和组织因子多肽通过(i)凝血因子VIIa多肽氨基酸和(ii)组织因子多肽氨基酸的组的氨基酸侧链之间的一个或多个连接的方式共价连接，其中经本文定义的体外蛋白水解检测测定，凝血因子VIIa的蛋白水解活性是游离天然(野生型)凝血因子VIIa的至少2倍，例如至少50倍，如至少100倍，例如至少200倍或至少250倍。
本发明也涉及生产本文定义的凝血因子VII多肽和组织因子多肽复合物的方法，该方法包括a)用(i)包含编码该凝血因子VII多肽的核酸分子和与其操作性连接的表达控制区域的表达载体和(ii)包含编码组织因子多肽的核酸分子和与其操作性连接的表达控制区域的表达载体转染细胞，b)在表达凝血因子VIIa多肽和组织因子多肽的条件下培养已转染细胞，并c)通过适当方法分离已表达复合物。
附图简述
图1显示了凝血因子VIIa和可溶性组织因子共价复合物的模型，其包含可溶性组织因子V207C和凝血因子VIIa F40C之间的跨界面二硫化物。从V207C或F40C到天然(野生型)半胱氨酸残基跨越界面的Cα-距离显著大于7
Figure A200780021114D0007134728QIETU
，这排除了两个分子间无意二硫化物对的形成。
图2分别显示了非还原和还原条件下天然(野生型)凝血因子VIIa(A泳道)和纯化的凝血因子VIIa F40C-sTF(1-219)V207C(B泳道)复合物的考马斯染色SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。HC和LC表示VIIa的重链和轻链。
图3显示了野生型凝血因子VIIa(A泳道)、凝血因子VII Q64C和sTF(1-219)G109C瞬间共表达的条件培养基(B泳道)和纯化的凝血因子F40C-sTF(1-219)V207C复合物(C泳道)的免疫印记。
发明详述
本发明涉及凝血因子VII多肽和组织因子多肽的共价复合物，其中凝血因子VII多肽和组织因子多肽通过(i)凝血因子VII多肽氨基酸和(ii)组织因子多肽氨基酸的组的氨基酸侧链之间一个或多个指 定连接的方式共价连接。
在本文中，术语“共价复合物”指通过至少一个共价连接或共价键和多种非共价相互作用(例如氢键、疏水相互作用等)结合在一起的两个分子(本文中指凝血因子VII多肽和组织因子多肽)。因此，在这种方式中该凝血因子VII多肽和该组织因子多肽为共价连接。
这两个多肽通过(i)凝血因子VII多肽氨基酸和(ii)组织因子多肽的氨基酸的组的氨基酸侧链之间一个或多个指定连接的方式共价连接。
如本文中使用，术语“凝血因子VII多肽”包括野生型凝血因子VII(即具有美国专利4,784,950公开的氨基酸序列的多肽)及与野生型凝血因子VII相比表现出几乎相同或更高的生物活性的凝血因子VII变体、凝血因子VII衍生物和凝血因子VII缀合物。术语“凝血因子VII”包括非剪切(酶原)形式以及被蛋白水解加工产生它们各自的活性形式的凝血因子VII多肽，其可为指定凝血因子VIIa。通常凝血因子VII在残基152和153之间被剪切产生凝血因子VIIa。术语“凝血因子VII多肽”也包括与野生型凝血因子VIIa的活性相比其凝血因子VIIa生物活性被显著改变或有些降低的多肽，包括变体。这些多肽包括但不限于这类凝血因子VII或凝血因子VIIa，其中引入了可改变或干扰该多肽生物活性的特异氨基酸序列变动。
凝血因子VIIa凝血方面的生物活性来自于其(i)与组织因子(TF)结合和(ii)催化凝血因子IX或凝血因子X蛋白水解产生活化凝血因子IX或X(分别为凝血因子IXa或Xa)的能力。
在本文中，术语“功能活性凝血因子VII多肽”指被蛋白水解加工产生其各自生物活性形式的“凝血因子VII多肽”，其也常被称作“凝血因子VIIa多肽”。
在一些重要的实施方案中，该凝血因子VII多肽是具有功能活性的。
如本文所使用，“野生型人FVIIa”为具有美国专利4,784,950中公开的氨基酸序列的多肽。
如本文所使用的术语“凝血因子VII衍生物”指显示出与野生型凝血因子VII相比生物活性几乎相同或提高的FVII多肽，其中母体肽的一个或多个氨基酸被基因工程和/或化学和/或酶催化修饰，例如通过烷基化、糖基化、PFG化、酰基化、酯形成或酰胺形成或类似方式。这包括但不限于PEG化人凝血因子VIIa、半胱氨酸-PEG化人凝血因子VIIa及其变体。凝血因子VII衍生物的非限制性实例包括如WO03/31464和美国专利申请US 20040043446、US 20040063911、US20040142856、US 20040137557和US 2004132640(Neose Technologies公司)公开的糖基PEG化FVII衍生物；如WO 01/0428、美国专利申请20030165996、WO 01/58935、WO 03/93465(Maxygen ApS)和WO02/02764、美国专利申请20030211094(明尼苏达大学)公开的FVII缀合物。
术语“提高的生物活性”指i)与重组野生型人凝血因子VIIa相比具有几乎相同或增强的蛋白水解活性的FVII多肽或ii)与重组野生型人凝血因子VIIa相比具有几乎相同或增强的TF结合活性的FVII多肽或iii)与重组野生型人凝血因子VIIa相比具有几乎相同或增加的血浆半衰期的FVII多肽。术语“PEG化人凝血因子VIIa”指具有与人凝血因子VIIa多肽缀合的PEG分子的人凝血因子FVIIa。需要理解的是该PEG分子可与凝血因子VIIa多肽的任何部分结合，包括该凝血因子VIIa多肽的任何氨基酸残基或碳水化合物部分。术语“半胱氨酸-PEG化人凝血因子VIIa”指具有与引入人凝血因子VIIa的半胱氨酸的巯基缀合的PEG分子的凝血因子VIIa。
可使凝血因子多肽与重组野生型人凝血因子VIIa相比具有几乎相同或增强的蛋白水解活性的其他氨基酸置换的非限制性实例包括S52A、S60A(Lino等.，Arch.Biochem.Biophys.352：182-192，1998)；如美国专利5,580,560公开的可使FVIIa多肽显示出增强的蛋白水解稳定性的置换；可提供在残基290和291或残基315和316之间被蛋白水解剪切的FVIIa多肽的置换(Mollerup等.，Biotechnol.Bioeng.48：501-505，1995)；凝血因子VIIa的氧化形式(Kornfelt等.，Arch.Biochem.Biophys.363：43-54，1999)；如WO 02/077218公开的FVIIa多肽中的置换；如WO 02/38162(Scripps Research Institute)公开的显示出增强的蛋白水解稳定性的FVIIa多肽中的置换；如WO 99/20767、美国专利US 6017882和US 6747003、美国专利申请20030100506(明尼苏达大学)和WO 00/66753、美国专利申请US 20010018414、US2004220106、US 200131005、美国专利US 6762286和US 6693075(明尼苏达大学)公开的可使该多肽具有被修饰的Gla-结构域并显示出更强的膜结合力的FVIIa多肽中的置换；以及WO 01/58935、美国专利US 6806063、美国专利申请20030096338(Maxygen ApS)、WO03/93465(Maxygen ApS)、WO 04/029091(Maxygen ApS)、WO04/083361(Maxygen ApS)和WO 04/111242(Maxygen ApS)以及WOWO 04/108763(Canadian Blood Services)中公开的FVIIa多肽中的置换。
可使FVIIa多肽与野生型FVIIa相比生物学活性增加的其它置换的非限制性实例包括WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、WO 03/027147、WO 04/029090、WO 03/027147、WO 02/38162(ScrippsResearch Institute)中公开的置换；和如JP 2001061479(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst)中公开的活性增强的FVIIa多肽。
本发明FVIIa多肽的其它置换实例包括但不限于L305V、L305V/M306D/D309S、L305I、L305T、F374P、V158T/M298Q、V158D/E296V/M298Q、K337A、M298Q、V158D/M298Q、L305V/K337A、V158D/E296V/M298Q/L305V、V158D/E296V/M298Q/K337A、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A、K157A、E296V、E296V/M298Q、V158D/E296V、V158D/M298K、and S336G、L305V/K337A、L305V/V158D、L305V/E296V、L305V/M298Q、L305V/V158T、L305V/K337A/V158T、L305V/K337A/M298Q、L305V/K337A/E296V、L305V/K337A/V158D、L305V/V158D/M298Q、L305V/V158D/E296V、L305V/V158T/M298Q、L305V/V158T/E296V、L305V/E296V/M298Q、L305V/V158D/E296V/M298Q、L305V/V158T/E296V/M298Q、L305V/V158T/K337A/M298Q、L305V/V158T/E296V/K337A、L305V/V158D/K337A/M298Q、L305V/V158D/E296V/K337A、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、S314E/K316H、S314E/K316Q、S314E/L305V、S314E/K337A、S314E/V158D、S314E/E296V、S314E/M298Q、S314E/V158T、K316H/L305V、K316H/K337A、K316H/V158D、K316H/E296V、K316H/M298Q、K316H/V158T、K316Q/L305V、K316Q/K337A、K316Q/V158D、K316Q/E296V、K316Q/M298Q、K316Q/V158T、S314E/L305V/K337A、S314E/L305V/V158D、S314E/L305V/E296V、S314E/L305V/M298Q、S314E/L305V/V158T、S314E/L305V/K337A/V158T、S314E/L305V/K337A/M298Q、S314E/L305V/K337A/E296V、S314E/L305V/K337A/V158D、S314E/L305V/V158D/M298Q、S314E/L305V/V158D/E296V、S314E/L305V/V158T/M298Q、S314E/L305V/V158T/E296V、S314E/L305V/E296V/M298Q、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q、S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A、S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、K316H/L305V/K337A、K316H/L305V/V158D、K316H/L305V/E296V、K316H/L305V/M298Q、K316H/L305V/V158T、K316H/L305V/K337A/V158T、K316H/L305V/K337A/M298Q、K316H/L305V/K337A/E296V、K316H/L305V/K337A/V158D、K316H/L305V/V158D/M298Q、K316H/L305V/V158D/E296V、K316H/L305V/V158T/M298Q、K316H/L305V/V158T/E296V、K316H/L305V/E296V/M298Q、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q、K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A、K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、K316Q/L305V/K337A、K316Q/L305V/V158D、K316Q/L305V/E296V、K316Q/L305V/M298Q、K316Q/L305V/V158T、K316Q/L305V/K337A/V158T、K316Q/L305V/K337A/M298Q、K316Q/L305V/K337A/E296V、K316Q/L305V/K337A/V158D、K316Q/L305V/V158D/M298Q、K316Q/L305V/V158D/E296V、K316Q/L305V/V158T/M298Q、K316Q/L305V/V158T/E296V、K316Q/L305V/E296V/M298Q、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q、K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A、K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、F374Y/K337A、F374Y/V158D、F374Y/E296V、F374Y/M298Q、F374Y/V158T、F374Y/S314E、F374Y/L305V、F374Y/L305V/K337A、F374Y/L305V/V158D、F374Y/L305V/E296V、F374Y/L305V/M298Q、F374Y/L305V/V158T、F374Y/L305V/S314E、F374Y/K337A/S314E、F374Y/K337A/V158T、F374Y/K337A/M298Q、F374Y/K337A/E296V、F374Y/K337A/V158D、F374Y/V158D/S314E、F374Y/V158D/M298Q、F374Y/V158D/E296V、F374Y/V158T/S314E、F374Y/V158T/M298Q、F374Y/V158T/E296V、F374Y/E296V/S314E、F374Y/S314E/M298Q、F374Y/E296V/M298Q、F374Y/L305V/K337A/V158D、F374Y/L305V/K337A/E296V、F374Y/L305V/K337A/M298Q、F374Y/L305V/K337A/V158T、F374Y/L305V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V、F374Y/L305V/V158D/M298Q、F374Y/L305V/V158D/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q、F374Y/L305V/E296V/V158T、F374Y/L305V/E296V/S314E、F374Y/L305V/M298Q/V158T、F374Y/L305V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158T/S314E、F374Y/K337A/S314E/V158T、F374Y/K337A/S314E/M298Q、F374Y/K337A/S314E/E296V、F374Y/K337A/S314E/V158D、F374Y/K337A/V158T/M298Q、F374Y/K337A/V158T/E296V、F374Y/K337A/M298Q/E296V、F374Y/K337A/M298Q/V158D、F374Y/K337A/E296V/V158D、F374Y/V158D/S314E/M298Q、F374Y/V158D/S314E/E296V、F374Y/V158D/M298Q/E296V、F374Y/V158T/S314E/E296V、F374Y/V158T/S314E/M298Q、F374Y/V158T/M298Q/E296V、F374Y/E296V/S314E/M298Q、F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E、F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A、F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A、F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E、F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A、F374Y/L305V/V158T/E296V/K33/A、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E、S52A、S60A；R152E、S344A、T106N、K143N/N145T、V253N、R290N/A292T、G291N、R315N/V317T、K143N/N145T/R315N/V317T；及从233THr至240Asn的氨基酸序列的置换、添加或删除；从304Arg至329Cys的氨基酸序列的置换、添加或删除；和从153Ile至223Arg的氨基酸序列的置换、添加或删除。
如本文中使用，术语“一个变异体”或“多个变异体”指具有美国专利4,784,950中公开的氨基酸序列的凝血因子VII，其中母体蛋白质的一个或多个氨基酸被另一种氨基酸置换和/或母体蛋白质的一个或多个氨基酸被删除和/或在蛋白质中插入了一个或多个氨基酸和/或在母体蛋白质中添加了一个或多个氨基酸。这些添加可发生在母体蛋白质的N-端和/或C-端。这一定义下的“一个变异体”或“多个变异体”的活性形式仍然具有FVII活性。在一个实施方案中变体与美国专利4,784,950公开的氨基酸序列70％相同。在一个实施方案中，变体与美国专利4,784,950公开的氨基酸序列80％相同。在一个实施方案中，变体与美国专利4,784,950公开的氨基酸序列95％相同。
在本文中术语“组织因子多肽”指包含组织因子可溶性外结构域即氨基酸1-219(下文中被称作sTF或sTF(1-219))或其功能变体或截短形式的多肽。该组织因子多肽优选至少包含与组织因子6-209氨基酸序列相应的片段。其实例具体为sTF(6-209)、sTF(1-209)和sTF(1-219)。
成熟人组织因子(1-263)的氨基酸序列见SEQ ID NO：2并公开于Spicer等.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，5148-5152。
Ser1-Gly-Thr-Thr-Asn-Thr-Val-Ala-Ala-Tyr10-Asn-Leu-Thr-Trp-Lys-Ser-Thr-Asn-Phe-Lys20-Thr-Ile-Leu-Glu-Trp-Glu-Pro-Lys-Pro-Val30-Asn-Gln-Val-Tyr-Thr-Val-Gln-Ile-Ser-Thr40-Lys-Ser-Gly-Asp-Trp-Lys-Ser-Lys-Cys-Phe50-Tyr-Thr-Thr-Asp-Thr-Glu-Cys-Asp-Leu-Thr60-Asp-Glu-Ile-Val-Lys-Asp-Val-Lys-Gln-Thr70-Tyr-Leu-Ala-Arg-Val-Phe-Ser-Tyr-Pro-Ala80-Gly-Asn-Val-Glu-Ser-Thr-Gly-Ser-Ala-Gly90-Glu-Pro-Leu-Tyr-Glu-Asn-Ser-Pro-Glu-Phe100-Thr-Pro-Tyr-Leu-Glu-Thr-Asn-Leu-Gly-Gln110-Pro-Thr-Ile-Gln-Ser-Phe-Glu-Gln-Val-Gly120-Thr-Lys-Val-Asn-Val-Thr-Val-Glu-Asp-Glu130-Arg-Thr-Leu-Val-Arg-Arg-Asn-Asn-Thr-Phe140-Leu-Ser-Leu-Arg-Asp-Val-Phe-Gly-Lys-Asp150-Leu-Ile-Tyr-Thr-Leu-Tyr-Tyr-Trp-Lys-Ser160-Ser-Ser-Ser-Gly-Lys-Lys-Thr-Ala-Lys-Thr170-Asn-Thr-Asn-Glu-Phe-Leu-Ile-Asp-Val-Asp180-Lys-Gly-Glu-Asn-Tyr-Cys-Phe-Ser-Val-Gln1 90-Ala-Val-Ile-Pro-Ser-Arg-Thr-Val-Asn-Arg200-Lys-Ser-Thr-Asp-Ser-Pro-Val-Glu-Cys-Met210-Gly-Gln-Glu-Lys-Gly-Glu-Phe-Arg-Glu-Ile220-Phe-Tyr-Ile-Ile-Gly-Ala-Val-Val-Phe-Val230-Val-Ile-Ile-Leu-Val-Ile-Ile-Leu-Ala-Ile240-Ser-Leu-His-Lys-Cys-Arg-Lys-Ala-Gly-Val250-Gly-Gln-Ser-Trp-Lys-Glu-Asn-Ser-Pro-Leu260-Asn-Val-Ser263(SEQ ID NO：2)。
在本文中，术语“一个指定连接”或“多个指定连接”指该凝血因子VII多肽和该组织因子多肽通过一组或多组共价连接的氨基酸侧链(可能通过接头部分)的方式共价连接，其中至少90％复合物种类的组就整个复合物种类群中各组内两个氨基酸的至少一个的位置和类型而言是相同的。该类连接可以是氨基酸侧链之间建立的直接连键例如半胱氨酸氨基酸侧链之间的S-S桥形式，或通过连接氨基酸侧链的接头部分的方式。
优选至少95％或甚至至少98％或甚至全部复合物种类(的组)就整个复合物种类群中各组内两个氨基酸的至少一个的位置和类型而言是相同的。
共价连接的氨基酸侧链组的数量并不非常关键，但是鉴于本实验结果，我们认为只有一个组是必需的。由于连接是“指定的”，即每一组内两个氨基酸的至少一个的位置和类型是预先确定的，需要理解的是可以保持甚至增强相关多肽的功能性和蛋白水解活性，与使用普通(同基)双功能交联剂的“散弹(shotgun)”法相反。由于这一点，我们认为共价连接氨基酸侧链组的数量通常在1-10的范围内，例如1-5，如1-4，或1-3、1-2，或2-4，或2-3，或1或2个连接，尤其是1或2个连接，优选仅一个连接。
可通过在一个或两个多肽(均可与另一多肽的氨基酸反应)中引入一个或多个氨基酸，或通过加入可与一个或多个特异氨基酸(优选1-10个氨基酸)反应的交联剂(最优选异基双功能交联剂)形成一个或多个指定连接。
在一个重要的实施方案中，各凝血因子VII多肽和组织因子多肽包括一个或多个半胱氨酸氨基酸，其并未被指定建立分子间的二硫键但是其可在该凝血因子VII多肽和该组织因子多肽之间形成分子间二硫键，即共价连接。
为了保持凝血因子VII多肽的蛋白水解活性，如果该半胱氨酸位于相应的非共价连接复合物中凝血因子VII多肽和组织因子多肽之间的天然界面中是有利的，如图1所示。如果成功设计的话，该分子间二硫键可稳定该化合物并促进凝血因子VIIa具有催化活性构象的形成。通过应用该凝血因子VIIa/组织因子复合物的X-射线结构(尤其是PDB登记号为1DAN的结构(Banner等.(1996)Nature，380，41-46))进行该二硫键设计。在两个引入的半胱氨酸氨基酸之间建立二硫键的一个重要标准是它们Cα原子之间的距离应小于7
Figure A200780021114D0007134728QIETU
(Petersen等.(1999)Protein Eng.，12，535-548)。对凝血因子VIIa-组织因子复合物中凝血因子VIIa和组织因子的Cα原子之间距离的计算得到17个潜在的半胱氨酸对。通过建模该二硫化物(使用CHARMM package，Accelrys，SanDiego)然后视觉检查进行这些氨基酸之间形成二硫键可行性的进一步评价。然后将满足Petersen等(1999)Protein Eng.，12，535-548设立的条件的二硫化物作为生化评价的候选。
在另一个实施方案中，凝血因子VII多肽和/或组织因子多肽包括一个或多个反应性氨基酸，尤其是光-反应性氨基酸，其在光活化后可在凝血因子VII多肽和组织因子多肽之间形成相应的分子间连键，即共价连接。该光-反应性氨基酸的实例包括Suchanek等(Suchanek etal.2005；see Scheme 1)研发的光-异亮氨酸(photo-Ile)、光-甲硫氨酸(photo-Met)和光-亮氨酸(photo-Leu)，以及对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸。
Figure A200780021114D00181
方案1
Suchanek等.(2005)Nature methods，2，261-267描述了在蛋白质中掺入photo-Ile、photo-Met和photo-Leu之后进行光诱导交联。
或者可通过一个或多个凝血因子VII多肽氨基酸和组织因子多肽氨基酸的组的氨基酸侧链之间的接头部分建立一个或多个指定连接。该接头部分的实例来自异基双功能试剂，当凝血因子VII多肽与组织因子多肽形成非共价连接复合物时其可与特异氨基酸侧链例如多肽之一的半胱氨酸侧链反应并接着可与该特异氨基酸侧链空间接近的另一氨基酸侧链反应。
尤其适用的异基双功能试剂实例为可首先与半胱氨酸氨基酸侧链反应并接着(优选活化后，如光活化或铑催化)可与空间接近的另一个氨基酸侧链反应的试剂。具体实例公开于Zhang等.(Biochem.Biophys.Res.Comm.，Vol.217，3，1995，1177-1184)，例如对-叠氮碘乙酰苯胺、对-叠氮溴苯乙酮和对-叠氮溴乙酰苯胺，和
Figure A200780021114D00191
N-(4-叠氮-2，3，5，6-四氟苄基)-3-马来酰亚胺基丙酰胺，
Figure A200780021114D00192
硫甲磺酸4-叠氮-2，3，5，6-四氟苯甲酰氨基半胱氨酸酯，
Figure A200780021114D00201
N-(2-((2-(((4-叠氮-2，3，5，6-四氟)苯甲酰基)氨基)乙基)二硫基)乙基)马来酰亚胺，
Figure A200780021114D00202
N-[4-(对-叠氮水杨酰氨基)丁基]-3’-(2’-吡啶基二硫基)丙酰胺，
Figure A200780021114D00203
N-((2-吡啶基二硫基)乙基)-4-叠氮水杨酰胺，
Figure A200780021114D00204
[1-(对-叠氮水杨酰氨基)-4-(碘代乙酰氨基)丁烷]等。
鉴于以上内容，很明显在通过反应性侧链或异基双功能试剂的方式建立共价连接的实施方案中可能导致产生并不是所有的种类都相同的复合物种类群。这是由于反应性侧链(如光反应性侧链)和异基双功能试剂(甚至在与氨基酸侧链特异反应之后)可能在进一步反应中遇到不止一个潜在的“反应配偶体”，尽管随着侧链/试剂的大小(长度)的降低“反应配偶体”的数量会大大降低。
然而在一些实施方案中，可以通过仅存在一种可能的“反应配偶体”的方式筛选相关的氨基酸侧链(或双功能试剂)。当连接形式为二硫键时更是如此，因为可能的“反应配偶体”(即另一个半胱氨酸)的数量非常有限。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供了以上定义的复合物，其中凝血因子多肽和组织因子多肽通过(i)凝血因子VII多肽的氨基酸和(ii)组织因子多肽的氨基酸的组的氨基酸侧链之间的一个或多个特异连接的方式共价连接。
在本文中，术语“一个特定连接”和“多个特定连接”指凝血因子VII多肽和组织因子多肽通过一组或多组共价连接氨基酸侧链(可能通过接头部分)的方式共价连接，其中至少90％复合物种类的组就整个复合物种类群中各组内两个氨基酸的至少一个的位置和类型而言是相同的。
优选至少95％或甚至至少98％或甚至全部复合物种类(的组)就整个复合物种类群中各组内两个氨基酸的至少一个的位置和类型而言是相同的。
更优选将一个或多个特异连接建立为一个或多个凝血因子VII多肽氨基酸和组织因子多肽氨基酸的组的氨基酸侧链之间的一个或多个直接连键。
因此本发明进一步提供了上文定义的复合物，其中凝血因子VII多肽和组织因子多肽通过一个或多个(i)凝血因子VII多肽氨基酸和(ii)组织因子多肽氨基酸的组的氨基酸侧链之间的一个或多个直接 连键的方式共价连接。
在本文中术语“一个直接连键”和“多个直接连键”指凝血因子VII多肽氨基酸侧链和组织因子多肽氨基酸侧链之间至少一个共价连接不包含来自交联剂、试剂等的残基，而是由来自于各自氨基酸侧链的原子形成，例如以半胱氨酸氨基酸侧链之间S-S桥的形式，然而考虑到该类氨基酸不必为天然氨基酸所以也可能是例如光-反应性侧链。因此，直接连键的形成不包括双功能试剂及类似试剂。
基于上述内容，优选包含一个或多个半胱氨酸氨基酸的氨基酸组。
在一个变体中，各组包含一个半胱氨酸氨基酸，例如用于和异基双功能试剂偶联。
在另一个变体中，各组包含两个半胱氨酸氨基酸。在该变体中建立了二硫键。
研究发现蛋白水解活性被大部分保留或者甚至被增强。因此在优选的实施方案中经本文定义的体外蛋白水解检测测定，凝血因子VIIa多肽的蛋白水解活性是游离天然(野生型)凝血因子VIIa的至少2倍，例如至少50倍，如至少100倍，例如至少200倍或至少250倍。
因此，本文也涉及凝血因子VIIa多肽与组织因子多肽的共价复合物，其中该凝血因子VIIa多肽和该组织因子多肽通过(i)凝血因子VIIa多肽氨基酸和(ii)组织因子多肽氨基酸的组的氨基酸侧链之间一个或多个连接的方式共价连接，其中经本文定义的体外蛋白水解试验测定，凝血因子VIIa多肽的蛋白水解活性是游离天然(野生型)凝血因子VIIa的至少2倍，例如至少50倍，如至少100倍，例如至少200倍或至少250倍。
如上所述，该组织因子多肽为组织因子的可溶性外结构域(1-219)或其功能变体或截短形式。
在一些重要的实施方案中，该可溶性组织因子多肽的Thr17、Lys20、Ile22、Ser42、Gly43、Asp44、Trp45、Lys46、Ser47、Phe50、Cys57、Asp58、Asp61、Gly109、Gln110、Leu133、Ser205、Pro206和Val207，尤其是该可溶性组织因子多肽的Trp45、Asp58、Gly109、Pro206和Val207位上的至少一个氨基酸被含有可生成指定连接如特异连接尤其是直接连键的反应性侧链的氨基酸置换。在优选的变体中，该至少一个氨基酸为半胱氨酸。
在其他重要的实施方案中，优选与之前所述结合，该凝血因子VII多肽的Leu39、Phe40、Ile42、Ser43、Tyr44、Gln64、Leu65、Ile69、Glu77、Gly78、Arg79、Val92、Phe275、Val276、Arg277、Met306、Thr307和Glu325，尤其是该凝血因子VII多肽的Phe40、Ser43、Gln64、Glu77和Phe275位上的至少一个氨基酸被含有可生成指定连接如特异连接尤其是直接连键的反应性侧链的氨基酸置换。在优选的变体中，该至少一个氨基酸为半胱氨酸。
更具体而言，以下氨基酸组中至少一组：
FVII-Ile69-sTF-Thr17，
FVII-Ile69-sTF-Lys20，
FVII-Arg79-sTF-Ile22，
FVII-Val92-sTF-Ser47，
FVII-Val92-sTF-Phe50，
FVII-Gly78-sTF-Cys57，
FVII-Glu77-sTF-Asp58，
FVII-Gly78-sTF-Asp58，
FVII-Arg79-sTF-Asp58，
FVII-Arg277-sTF-Ser42，
FVII-Val276-sTF-Gly43，
FVII-Arg277-sTF-Gly43，
FVII-Phe275-sTF-Asp44，
FVII-Val276-sTF-Asp44，
FVII-Arg277-sTF-Asp44，
FVII-Phe275-sTF-Trp45，
FVII-Val276-sTF-Trp45，
FVII-Arg134-sTF-Trp45，
FVII-Phe275-sTF-Lys46，
FVII-Gln64-sTF-Gly109，
FVII-Gln64-sTF-Gln110，
FVII-Leu65-sTF-Gln110，
FVII-Phe71-sTF-Leu133，
FVII-Ser43-sTF-Ser205，
FVII-Leu39-sTF-Pro206，
FVII-Phe40-sTF-Pro206，
FVII-Ile42-sTF-Pro206，
FVII-Ser43-sTF-Pro206，
FVII-Tyr44-sTF-Pro206，
FVII-Leu39-sTF-Val207，
FVII-Phe40-sTF-Val207和
FVII-Ser43-sTF-Val207，
尤其是以下氨基酸组中至少一组：
FVII-Phe40-sTF-Val207，
FVII-Ser43-sTF-Pro206，
FVII-Gln64-sTF-Gly109，
FVII-Glu77-sTF-Asp58，和
FVII-Phe275-sTF-Trp45
的一个或两个氨基酸被含有可生成指定连接如特异连接尤其是直接连键的反应性侧链的氨基酸置换。
在优选的变体中，至少一个直接连键为二硫键，即两个半胱氨酸氨基酸之间的键。更优选所有的共价连接为二硫键形式的直接连键。具体而言，该键的数量为1-5，尤其是1个键。
在另一个变体中，至少一个直接连键是通过光-反应性氨基酸形成的，尤其是选自photo-Ile、photo-Leu和photo-Met的光-反应性氨基酸。
在又一个实施方案中该凝血因子VII多肽和该组织因子多肽通过(i)凝血因子VIIa多肽氨基酸和(ii)组织因子多肽氨基酸的组的氨基酸侧链之间的接头部分的方式共价连接。具体而言，该接头部分来自异基双功能试剂。
复合物的制备
使用异基双功能试剂交联组织因子和凝血因子VII
在一个有趣的变体中，制备该复合物的方法涉及生产可溶性组织因子的半胱氨酸变体，接着用异基双功能试剂(其中一个官能团为半胱氨酸反应性)标记可溶性组织因子的半胱氨酸，最后通过该试剂的第二个官能团与凝血因子VIIa交联。在大肠杆菌中克隆和表达组织因子半胱氨酸突变体以及之后用半胱氨酸特异性试剂标记的方法之前已描述于(Stone等.(1995)Biochem.J.，310，605-614；
Figure A200780021114D0025135723QIETU
等.(1996)Protein Sci.，5，1521-1540；Owenius等.(1999)Biophys.J.，77，2237-2250；
Figure A200780021114D0025135745QIETU
等.(2001)Biochemistry，40，9324-9328)。使用包含一个半胱氨酸特异性和一个光可激活官能团的异基双功能试剂光交联连接蛋白质已描述于Zhang等.(1995)Biochem.Biophys.Res.Commun.，217，1177-1184。
凝血因子VII多肽和组织因子多肽的共表达
在一个尤其有趣的变体中，制备该复合物的方法涉及共表达凝血因子VII多肽和组织因子多肽，籍此可轻松建立两个多肽之间的共价连接。
更具体而言，本发明也涉及生产本文定义的凝血因子VII多肽和组织因子多肽复合物的方法，该方法包括a)用(i)包含编码凝血因子VII多肽的核酸和与其操作性连接的表达控制区域的表达载体和(ii)包含编码组织因子多肽的核酸和与其操作性连接的表达控制区域的表达载体转染细胞，b)在表达凝血因子VII多肽和组织因子多肽的条件下培养该转染细胞，及c)通过适当方法分离表达的复合物。
在本文一个特别有趣的实施方案中，这两个多肽通过特异连接的方式连接，更具体而言是通过直接连键，如凝血因子VII多肽和组织因子多肽之间的一个或多个二硫键。
蛋白质生产领域的技术人员熟知蛋白质在细胞中的表达。在实施本发明方法时，所使用细胞通常为真核细胞，更优选已建立的真核细胞系，包括但不限于CHO(例如，ATCC CCL61)、COS-1(例如，ATCCCRL1650)、幼仓鼠肾(BHK)和HEK293(例如，ATCC CRL 1573；Graham等，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)细胞系。优选的BHK细胞系为tk-ts13BHK细胞系(Waechter和Baserga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：1106-1110，1982)，下文中称作BHK570细胞系。该BHK570细胞系可从美国典型培养物保藏中心(12301 Parklawn Dr.，Rockville，MD20852)获得，ATCC登录号为CRL 10314。tk-ts13 BHK细胞系也从ATCC获得，登录号为CRL 1632。优选的CHO细胞系为ATCC登录号为CCI61的CHO K1细胞系。
其它适合的细胞系包括但不限于Rat Hep I(Rat hepatoma；ATCCCRL1600)、Rat Hep II(Rat hepatoma；ATCC CRL1548)、TCMK(ATCCCCL139)、人肺细胞(ATCC HB 8065)、NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)；DUKX细胞(CHO细胞系)(Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220，1980)(DUKX细胞也被称作DXB11细胞)和DG44(CHO细胞系)(Cell，33：405，1983，体细胞和分子遗传学(Somatic Cell and Molecular Genetics)12：555，1986)。其它可用的细胞为3T3细胞、Namalwa细胞、骨髓瘤及骨髓瘤和其它细胞的融合体。在一些实施方案中该细胞可为突变或重组细胞，例如与它们的来源细胞类型表达数量或性质不同的可催化蛋白质转录后修饰(如糖基化酶例如羰基转移酶和/或糖苷酶，或加工酶例如前肽)的酶的细胞。适当的昆虫细胞系包括但不限于鳞翅目细胞系，例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(例如见US5077214)。
在一些实施方案中，用于实施本发明的细胞可在悬浮培养基中生长。如本文所使用，具有悬浮能力的细胞为可在悬浮液中生长而不会形成大块、坚实凝聚物的细胞，即单分散或形成松散凝聚物且每个聚集物中仅包含数个细胞的细胞。具有悬浮能力的细胞包括但不限于不需要适应或处理就可悬浮生长的细胞(例如造血细胞或淋巴样细胞)和通过贴壁细胞的逐渐适应变得可悬浮生长的细胞(例如上皮细胞或成纤维细胞)。
用于实施本发明的细胞可为粘附细胞(也被称作锚着依赖细胞或贴壁细胞)。如本文所使用，粘附细胞为需要将自身粘附或锚定至适当表面以繁殖和生长的细胞。在本发明的一个实施方案中，所使用细胞为粘附细胞。在这些实施方案中，繁殖阶段和生产阶段包括使用微载体。所使用的粘附细胞在繁殖阶段应可迁移至载体之上(如果使用大孔载体还应进入该载体的内部结构)并在被转移至生产生物反应器时迁移至新的载体。如果粘附细胞自身迁移至新载体的能力不足，可通过将含有细胞的微载体与蛋白质水解酶或EDTA接触将其从载体释放。所使用的培养基(尤其当不含有来自动物的组分时)应进一步包含适于支持粘附细胞的组分；适用于培养粘附细胞的培养基可从供应厂商购得，例如Sigma。
该细胞也可为悬浮适应性或具有悬浮能力的细胞。如果使用了这类细胞，细胞繁殖可在混悬液中进行，因此微载体只用于其生产培养器中的终繁殖阶段和生产阶段。在使用悬浮适应性细胞的情况下，所使用的微载体通常为大孔载体，其中细胞通过物理包埋的方式附于载体的内部结构内。在该类实施方案中，真核细胞通常选自CHO、BHK、HEK293和骨髓瘤细胞等。
也可在大肠杆菌或细菌或转基因动物中共表达凝血因子VII多肽和组织因子多肽，例如如国际专利申请WO 05/075635所公开。
实施例
用于下列实施例的氨基酸置换的命名法如下。第一个字母表示天然存在于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2位置上的氨基酸。接下来的数字表示在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中的位置。第二个字母表示置换天然氨基酸的不同氨基酸。例如凝血因子VIIa F40C，其中SEQID No：140位的苯丙氨酸被半胱氨酸置换。在另一个例子sTF(1-219)V207C中，SEQ ID NO：2207位的丙氨酸被半胱氨酸置换。
实施例1
材料-D-Phe-Phe-Arg-氯甲基酮购自Bachem。生色的Z-D-Arg-Gly-Arg-p-硝基苯胺(S-2765)和H-D-Ile-Pro-Arg-p-硝基苯胺(S-2288)底物购自Chromogenix(Sweden)。人血浆衍生的凝血因子X(hFX)、凝血因子Xa(hFXa)和凝血因子IXa(hFIXa)购自EnzymeResearch Laboratories Ltd.(South Bend，IN)。人全脑Marathon-readycDNA文库购自Clontech(Mountain View，CA)。根据已公开文献(
Figure A200780021114D0028140021QIETU
等(1996)Protein Sci.，5，1531-1540)制备在大肠杆菌中表达的可溶性组织因子1-219(sTF(1-219))。根据之前所述(Thim等.(1988)Biochemistry，27，7785-7793；Persson等.(1996)FEBS Lett.，385，241-243)表达和纯化重组凝血因子VIIa。其它试剂均为分析纯或更高等级。
编码凝血因子VII和凝血因子VII F40V突变体的DNA的构建-使用引物oHOJ104-f及oHOJ104-r，并根据操作说明使用Expand HighFidelity PCR体系(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)扩增包括其前(信号序列)和后-区的凝血因子VII的DNA编码序列，引入限制性酶切位点NheI和NotI(引物序列见表1)。用于PCR反应的DNA模板为公开于国际专利申请WO 02/077218的pLN174。用NheI和NotI剪切已纯化的PCR产物，然后连接进pCI-neo(Promega，Madison，WI)的相应位点得到pHOJ300。天然(野生型)凝血因子VII的氨基酸见SEQ ID NO：1。包括其前(信号序列)和后-区的天然(野生型)凝血因子VII的DNA序列见SEQ ID NO：3。
根据操作说明通过
Figure A200780021114D0028140059QIETU
定点突变(Stratagene，La Jolla，CA)使用引物oHOJ143-f、oHOJ143-r和pHOJ300作为模板构建编码凝血因子F40C的质粒pHOJ344。通过DNA测序验证所有克隆序列的正确性。
编码sTF(1-219)和sTF(1-219)V207C突变体DNA的构建-使用引物oHOJ152-f和oHOJ152-r，以及根据操作说明使用Expand HighFidelity PCR体系(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)通过PCR从人全脑cDNA文库(Marathon-ready cDNA；ClontechLaboratories Inc.，Mountain View，CA)中扩增包括其信号序列的sTF(1-219)DNA编码序列，引入侧翼NheI和XhoI限制性酶切位点(引物序列见表1)。用NheI和XhoI剪切已纯化的PCR产物然后连接至pCI-neo(Promega，Madison，WI)的相应位点得到pHOJ356。
表1-用于构建质粒的寡聚DNA
 
引物 质粒 序列(5’→3’)
oHOJ104-f pHOJ300 GGCGGCGGCTAGCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCC
oHOJ104-r pHOJ300 CCGCCGCCGCGGCCGCCTAGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGG
oHOJ143-f pHOJ344 GCGGAGAGGACGAAGCTGTGCTGGATTTCTTACAGTGATG
oHOJ143-r pHOJ344 CATCACTGTAAGAAATCCAGCACAGCTTCGTCCTCTCCGC
oHOJ152-f pHOJ356 GGCGGCGGGCTAGCATGGAGACCCCTGCCTGGCCCCGG
oHOJ152-r pHOJ356 CCGCCGCCCTCGAGTTATTCTCTGAATTCCCCTTTCTCCTGG
oHOJ144-f pHOJ357 GAGTACAGACAGCCCGTGCGAGTGTATGGGCCAG
oHOJ144-r pHOJ357 CTGGCCCATACACTCGCACGGGCTGTCTGTACTC
sTF(1-219)的氨基酸见SEQ ID NO：4。包括其信号序列的sTF(1-219)DNA序列见SEQ ID NO：5。
根据操作说明通过
Figure A200780021114D00301
定点突变(Stratagene，La Jolla，CA)使用引物oHOJ144-f、oHOJ144-r和pHOJ356作为模板构建编码sTF(1-219)V207C的质粒pHOJ357。通过DNA测序验证所有克隆序列的正确性。
凝血因子VIIF40C和sTF(1-219)V207C的共表达-根据操作说明在FreestyleTM 293表达体系(Invitrogen，Carlsbad，CA)中通过瞬时表达共表达凝血因子VIIa F40C和sTF(1-219)V207C。简略而言，首先在FreeStyleTM 293表达培养基中(Invitrogen，Carlsbad，CA)建立1.5x107个细胞的72-ml摇瓶培养物从冷藏保存的培养物繁殖HEK293F细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。然后在12天的时间内将该培养物扩增至2000ml 2.2x109个细胞。细胞于37℃、8％CO2的条件下在转速为100-125rpm的定轨摇床培养箱(Multitron II，Infors，Switzerland)中在具有挡板且盖子松散的圆锥形PEGT摇瓶(Nunc，Denmark)中生长。在扩增培养物之前细胞密度不得超过1.4x106细胞/ml，并且摇瓶：培养物体积保持在约3:1。除起始的72ml培养物外，在所提供的生长培养基中加入维生素K1至5ppm(Sigma)用于凝血因子的翻译后γ-羧化作用。然后使已扩增的HEK293F培养物(2000ml，2.2x109细胞)转染含有800μg质粒pHOJ344(1μg/μl)和1500μg质粒DNA pHOJ357(1μg/μl)的混合物。向 I溶液(Invitrogen，Carlsbad，CA)中加入质粒DNA和239fectinTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)并将其混合，然后根据操作说明边轻微搅拌所得溶液边向该细胞培养物中逐滴加入已形成的脂质DNA复合物。将已转染培养物于37℃、8％ CO2和100rpm温育96小时后通过离心回收含有凝血因子VIIa F40C-sTF(1-219)V207C复合物的条件生长培养基并保存于-80℃直至进一步加工。
凝血因子VII F40C-sTF(1-219)V207C复合物的纯化-将加入了CaCl2至10mM的条件培养基上样至含有与CNBr-活化Sepharose 4B(Amersham Biosciences，GE Healthcare)偶联的单克隆抗体F1A2(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)的25-ml柱中。用50mMHEPES、100mM NaCl、10mM CaCl2，pH7.5平衡柱子。用平衡缓冲液和含有2M NaCl的平衡缓冲液冲洗后用含有10mM EDTA而不是CaCl2的平衡缓冲液洗脱已结合物质。然后在所收集的峰组份中加入氯化钙至终浓度为20mM。
为了去除少量的凝血因子VIIaF40C，将该制剂通过1-ml HiTrapNHS柱(GE Healthcare)，根据操作说明将后者与4mg sTF(1-219)偶联。在上样之前用50mM HEPES、100mM NaCl、10mM CaCl2，pH7.5平衡柱子。收集含有凝血因子VII F40C-sTF(1-219)V207C复合物但不含可检测的游离凝血因子VII F40C和sTF(1-219)V207C的流通物。
为了促进对凝血因子VII F40C-sTF(1-219)V207C复合物的活化，加入人凝血因子Ixa至终浓度为0.1mg/ml。在还原SDS-PAGE验证完全活化之后，通过如上所述的F1A2 Sepharose4B亲和色谱法纯化凝血因子VIIa F40C-sTF(1-219)V207C复合物，只是使用5-ml柱和平衡缓冲液为10mM MES、100mM NaC、10mM CaCl2，pH6.0。将终蛋白制剂等分保存于-80℃。
活性位点滴定检测-如其它文献所述(Bock P.E.(1992)J.Biol.Chem.，267，14963-14973)在用亚化学计量水平的D-Phe-Phe-Arg-氯化甲基酮(FFR-cmk)滴定时通过酰胺分解活性的不可逆减少测定天然(野生型)凝血因子VIIa和凝血VIIa F40C-sTF(1-219)V207C的活性位点的浓度。简略而言，用50mM HEPES、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01％吐温80，pH7.0缓冲液将各蛋白质稀释至约300nM的浓度。然后将已稀释蛋白(20μl)与游离凝血因子VIIa情况中的20μl1.5μM sTF和凝血因子VIIa F40C-sTF(1-219)V207C情况中的20μl缓冲液混合，最后与0-1.2μM FFR-cmk(用缓冲液从溶解于DMSO的FFR-cmk储备液新鲜制备并保存于-80℃)混合。在室温下温育过夜后测定残余酰胺分解活性。在聚苯乙烯微量滴定板(Nunc，Denmark)中，在含有约10nM凝血因子VIIa或凝血因子VIIa-sTF复合物终体积为200μl的检测缓冲液中(50mM HEPES、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.01％Tween 80，pH7.4)进行活性检测，相当于将样品稀释10倍。室温下预温育15分钟后加入1mM生色底物S-2288，在安装有SOFTmax PRO软件(v2.2；Molecular Devices Corp.，Sunnyvale，CA)的SpectraMaxTM340微板分光光度计中于405nm处持续监测吸光度10分钟。酰胺分解活性表示为减去空白后线性回归曲线的斜率。通过外推法至活性为0测定活性位点的浓度，相对于可完全去除酰胺分解活性的最小FFR-cmk浓度。
体外蛋白质水解检测-平行测定天然(野生型)凝血因子VIIa和凝血因子VIIa F40C-sTF(1-219)V207C以直接比较他们的特异活性。在微量滴定板(Nunc，Denmark)中进行该检测。将凝血因子VIIa(300nM)或凝血因子VIIa F40C-sTF(1-219)V207C(15nM)和人凝血因子X(0.2μM)在100μl 50mM HEPES、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.01％吐温80，pH7.4的缓冲液中于室温下温育20分钟。然后加入50μl 50mM HEPES、100mM NaCl、40mM EDTA、0.01％ Tween 80，pH7.4并含有0.5μM阻断TF上FX结合位点的TF8-5G9抗体(Ruf等.(1991)Thromb.Haemost.，66，529-533)的缓冲液停止凝血因子X活化。通过加入50μl生色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-p-硝基苯胺(S-2765)至终浓度0.5mM测定FXa的产生量。在安装有SOFTmax PRO软件(v2.2；Molecular Devices Corp.，Sunnyvale，CA)的SpectraMaxTM340微板分光光度计中于405nm处持续监测吸光度。特异酰胺分解活性表示为减去空白后线性回归曲线的斜率除以检测中蛋白质的浓度，将其用于计算凝血因子VIIa-sTF复合物和野生型凝血因子VIIa特异蛋白水解活性间的比值：
比值＝((A405nm凝血因子VIIa-sTF复合物)/[凝血因子VIIa-sTF复合物])/((A405nm凝血因子VIIa野生型)/[凝血因子VIIa野生型])
结果见表2。
表2-体外蛋白质水解检测所述的相对蛋白质水解活性
 
蛋白质 蛋白质水解相对活性(比值)
凝血因子VIIa F40C-STF(1-219)V207C 65.5
野生型凝血因子VIIa 1
SDS-PAGE分析-根据操作说明通过非还原和还原SDS-PAGE在4-12％ Bis-Tris 凝胶上(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)于200V在MES缓冲液中(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)跑胶35分钟分析凝血因子VIIa和凝血因子VIIaF40C-sTF(1-219)V207C(各约1.5μg)。根据操作说明用水冲洗凝胶并用Simply BlueTM SafeStain(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)染色。凝胶见图2。
SEQ ID NO：1-天然(野生型)人凝血因子VII的氨基酸序列(1-406)。三字母标记“GLA”指4-羧基谷氨酸(γ-羧基谷氨酸)。
Ala1-Asn-Ala-Phe-Leu-GLA-GLA-Leu-Arg-Pro10-Gly-Ser-Leu-GLA-Arg-GLA-Cys-Lys-GLA-GLA20-Gln-Cys-Ser-Phe-GLA-GLA-Ala-Arg-GLA-Ile30-Phe-Lys-Asp-Ala-GLA-Arg-Thr-Lys-Leu-Phe40-Trp-Ile-Ser-Tyr-Ser-Asp-Gly-Asp-Gln-Cys50-Ala-Ser-Ser-Pro-Cys-Gln-Asn-Gly-Gly-Ser60-Cys-Lys-Asp-Gln-Leu-Gln-Ser-Tyr-Ile-Cys70-Phe-Cys-Leu-Pro-Ala-Phe-Glu-Gly-Arg-Asn80-Cys-Glu-Thr-His-Lys-Asp-Asp-Gln-Leu-Ile90-Cys-Val-Asn-Glu-Asn-Gly-Gly-Cys-Glu-Gln100-Tyr-Cys-Ser-Asp-His-Thr-Gly-Thr-Lys-Arg110-Ser-Cys-Arg-Cys-His-Glu-Gly-Tyr-Ser-Leu120-Leu-Ala-Asp-Gly-Val-Ser-Cys-Thr-Pro-Thr130-Val-Glu-Tyr-Pro-Cys-Gly-Lys-Ile-Pro-Ile140-Leu-Glu-Lys-Arg-Asn-Ala-Ser-Lys-Pro-Gln150-Gly-Arg-Ile-Val-Gly-Gly-Lys-Val-Cys-Pro160-Lys-Gly-Glu-Cys-Pro-Trp-Gln-Val-Leu-Leu170-Leu-Val-Asn-Gly-Ala-Gln-Leu-Cys-Gly-Gly180-Thr-Leu-Ile-Asn-Thr-Ile-Trp-Val-Val-Ser190-Ala-Ala-His-Cys-Phe-Asp-Lys-Ile-Lys-Asn200-Trp-Arg-Asn-Leu-Ile-Ala-Val-Leu-Gly-Glu210-His-Asp-Leu-Ser-Glu-His-Asp-Gly-Asp-Glu220-Gln-Ser-Arg-Arg-Val-Ala-Gln-Val-Ile-Ile230-Pro-Ser-Thr-Tyr-Val-Pro-Gly-Thr-Thr-Asn240-His-Asp-Ile-Ala-Leu-Leu-Arg-Leu-His-Gln250-Pro-Val-Val-Leu-Thr-Asp-His-Val-Val-Pro260-Leu-Cys-Leu-Pro-Glu-Arg-Thr-Phe-Ser-Glu270-Arg-Thr-Leu-Ala-Phe-Val-Arg-Phe-Ser-Leu280-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-Leu-Leu-Asp-Arg290-Gly-Ala-Thr-Ala-Leu-Glu-Leu-Met-Val-Leu300-Asn-Val-Pro-Arg-Leu-Met-Thr-Gln-Asp-Cys310-Leu-Gln-Gln-Ser-Arg-Lys-Val-Gly-Asp-Ser320-Pro-Asn-Ile-Thr-Glu-Tyr-Met-Phe-Cys-Ala330-Gly-Tyr-Ser-Asp-Gly-Ser-Lys-Asp-Ser-Cys340-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-His-Ala-Thr350-His-Tyr-Arg-Gly-Thr-Trp-Tyr-Leu-Thr-Gly360-Ile-Val-Ser-Trp-Gly-Gln-Gly-Cys-Ala-Thr370-Val-Gly-His-Phe-Gly-Val-Tyr-Thr-Arg-Val380-Ser-Gln-Tyr-Ile-Glu-Trp-Leu-Gln-Lys-Leu390-Met-Arg-Ser-Glu-Pro-Arg-Pro-Gly-Val-Leu400-Leu-Arg-Ala-Pro-Phe-Pro406
SEQ ID NO：3-包括其前(信号序列)和后-区(下划线部分)的天然(野生型)凝血因子VII的DNA序列。
ATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCTTCTGCTTGGGCT TCAGGGCTGCCTGGCTGCAGTCTTCGTAACCCAGGAGGAAGCC CAAGGCGTCCTGCACCGGCGCCGGCGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCGGCCGGGCTCCCTGGAGAGGGAGTGCAAGGAGGAGCAGTGCTCCTTCGAGGAGGCCCGGGAGATCTTCAAGGACGCGGAGAGGACGAAGCTGTTCTGGATTTCTTACAGTGATGGGGACCAGTGTGCCTCAAGTCCATGCCAGAATGGGGGCTCCTGCAAGGACCAGCTCCAGTCCTATATCTGCTTCTGCCTCCCTGCCTTCGAGGGCCGGAACTGTGAGACGCACAAGGATGACCAGCTGATCTGTGTGAACGAGAACGGCGGCTGTGAGCAGTACTGCAGTGACCACACGGGCACCAAGCGCTCCTGTCGGTGCCACGAGGGGTACTCTCTGCTGGCAGACGGGGTGTCCTGCACACCCACAGTTGAATATCCATGTGGAAAAATACCTATTCTAGAAAAAAGAAATGCCAGCAAACCCCAAGGCCGAATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCCCCAAAGGGGAGTGTCCATGGCAGGTCCTGTTGTTGGTGAATGGAGCTCAGTTGTGTGGGGGGACCCTGATCAACACCATCTGGGTGGTCTCCGCGGCCCACTGTTTCGACAAAATCAAGAACTGGAGGAACCTGATCGCGGTGCTGGGCGAGCACGACCTCAGCGAGCACGACGGGGATGAGCAGAGCCGGCGGGTGGCGCAGGTCATCATCCCCAGCACGTACGTCCCGGGCACCACCAACCACGACATCGCGCTGCTCCGCCTGCACCAGCCCGTGGTCCTCACTGACCATGTGGTGCCCCTCTGCCTGCCCGAACGGACGTTCTCTGAGAGGACGCTGGCCTTCGTGCGCTTCTCATTGGTCAGCGGCTGGGGCCAGCTGCTGGACCGTGGCGCCACGGCCCTGGAGCTCATGGTCCTCAACGTGCCCCGGCTGATGACCCAGGACTGCCTGCAGCAGTCACGGAAGGTGGGAGACTCCCCAAATATCACGGAGTACATGTTCTGTGCCGGCTACTCGGATGGCAGCAAGGACTCCTGCAAGGGGGACAGTGGAGGCCCACATGCCACCCACTACCGGGGCACGTGGTACCTGACGGGCATCGTCAGCTGGGGCCAGGGCTGCGCAACCGTGGGCCACTTTGGGGTGTACACCAGGGTCTCCCAGTACATCGAGTGGCTGCAAAAGCTCATGCGCTCAGAGCCACGCCCAGGAGTCCTCCTGCGAGCCCCATTTCCCTA
SEQ ID NO：4-sTF(1-219)的氨基酸序列
Ser1-Gly-Thr-Thr-Asn-Thr-Val-Ala-Ala-Tyr10-Asn-Leu-Thr-Trp-Lys-Ser-Thr-Asn-Phe-Lys20-Thr-Ile-Leu-Glu-Trp-Glu-Pro-Lys-Pro-Val30-Asn-Gln-Val-Tyr-Thr-Val-Gln-Ile-Ser-Thr40-Lys-Ser-Gly-Asp-Trp-Lys-Ser-Lys-Cys-Phe50-Tyr-Thr-Thr-Asp-Thr-Glu-Cys-Asp-Leu-Thr60-Asp-Glu-Ile-Val-Lys-Asp-Val-Lys-Gln-Thr70-Tyr-Leu-Ala-Arg-Val-Phe-Ser-Tyr-Pro-Ala80-Gly-Asn-Val-Glu-Ser-Thr-Gly-Ser-Ala-Gly90-Glu-Pro-Leu-Tyr-Glu-Asn-Ser-Pro-Glu-Phe100-Thr-Pro-Tyr-Leu-Glu-Thr-Asn-Leu-Gly-Gln110-Pro-Thr-Ile-Gln-Ser-Phe-Glu-Gln-Val-Gly120-Thr-Lys-Val-Asn-Val-Thr-Val-Glu-Asp-Glu130-Arg-Thr-Leu-Val-Arg-Arg-Asn-Asn-Thr-Phe140-Leu-Ser-Leu-Arg-Asp-Val-Phe-Gly-Lys-Asp150-Leu-Ile-Tyr-Thr-Leu-Tyr-Tyr-Trp-Lys-Ser160-Ser-Ser-Ser-Gly-Lys-Lys-Thr-Ala-Lys-Thr170-Asn-Thr-Asn-Glu-Phe-Leu-Ile-Asp-Val-Asp180-Lys-Gly-Glu-Asn-Tyr-Cys-Phe-Ser-Val-Gln1 90-Ala-Val-Ile-Pro-Ser-Arg-Thr-Val-Asn-Arg200-Lys-Ser-Thr-Asp-Ser-Pro-Val-Glu-Cys-Met210-Gly-Gln-Glu-Lys-Gly-Glu-Phe-Arg-Glu219
SEQ ID NO：5-包括其信号序列(下划线部分)的sTF(1-219)DNA序列
ATGGAGACCCCTGCCTGGCCCCGGGTCCCGCGCCCCGAGACCG CCGTCGCTCGGACGCTCCTGCTCGGCTGGGTCTTCGCCCAGGT GGCCGGCGCTTCAGGCACTACAAATACTGTGGCAGCATATAATTTAACTTGGAAATCAACTAATTTCAAGACAATTTTGGAGTGGGAACCCAAACCCGTCAATCAAGTCTACACTGTTCAAATAAGCACTAAGTCAGGAGATTGGAAAAGCAAATGCTTTTACACAACAGACACAGAGTGTGACCTCACCGACGAGATTGTGAAGGATGTGAAGCAGACGTACTTGGCACGGGTCTTCTCCTACCCGGCAGGGAATGTGGAGAGCACCGGTTCTGCTGGGGAGCCTCTGTATGAGAACTCCCCAGAGTTCACACCTTACCTGGAGACAAACCTCGGACAGCCAACAATTCAGAGTTTTGAACAGGTGGGAACAAAAGTGAATGTGACCGTAGAAGATGAACGGACTTTAGTCAGAAGGAACAACACTTTCCTAAGCCTCCGGGATGTTTTTGGCAAGGACTTAATTTATACACTTTATTATTGGAAATCTTCAAGTTCAGGAAAGAAAACAGCCAAAACAAACACTAATGAGTTTTTGATTGATGTGGATAAAGGAGAAAACTACTGTTTCAGTGTTCAAGCAGTGATTCCCTCCCGAACAGTTAACCGGAAGAGTACAGACAGCCCGGTAGAGTGTATGGGCCAGGAGAAAGGGGAATTCAGAGAATAA
实施例2
构建编码sTF(1-219)W45C、sTF(1-219)D58C、sTF(1-219)G109C和sTF(1-219)P206C的DNA-通过
Figure A200780021114D0036141644QIETU
定点突变根据操作说明(Stratagene，La Jolla，CA)使用表3列出的引物对(正向和反向)和pHOJ356作为模板构建sTF(1-219)突变体。通过DNA测序验证所有被克隆序列的正确性。
表3-用于TF cDNA定点突变的正向和反向(寡聚)引物
 
引物 突变 序列(5’→3’)
oHOJ172-f W45C CACTAAGTCAGGAGATTGCAAAAGCAAATGCTTTTAC
oHOJ172-r W45C GTAAAAGCATTTGCTTTTGCAATCTCCTGACTTAGTG
oHOJ173-f D58C CAACAGACACAGAGTGTTGCCTCACCGACGAGATTG
oHOJ173-r D58C CAATCTCGTCGGTGAGGCAACACTCTGTGTCTGTTG
oHOJ174-f G109C CCTGGAGACAAACCTCTGCCAGCCAACAATTCAGAG
oHOJ174-r G109C CTCTGAATTGTTGGCTGGCAGAGGTTTGTCTCCAGG
oHOJ175-f P206C GAAGAGTACAGACAGCTGCGTAGAGTGTATGGGC
oHOJ175-r P206C GCCCATACACTCTACGCAGCTGTCTGTACTCTTC
构建编码凝血因子VIIS43C、凝血因子VII Q64、凝血因子VIIE77C和凝血因子VIIF275C的DNA-通过
Figure A200780021114D0036141644QIETU
定点突变根据操作说明(Stratagene，La Jolla，CA)使用表4列出的引物对(正向和反向)和pHOJ300作为模板构建凝血因子VII突变体。通过DNA测序验证所有被克隆序列的正确性。
表4-用于凝血因子VII cDNA定点突变的正向和反向(寡聚)引物
 
引物 突变 序列(5’→3’)
oHOJ23-f S43C GGACGAAGCTGTTCTGGATTTGCTACAGTGATGGGGAC
oHOJ23-r S43C GTCCCCATCACTGTAGCAAATCCAGAACAGCTTCGTCC
oHOJ20-f Q64C GGGCTCCTGCAAGGACTGCCTCCAGTCCTATATCTG
oHOJ20-r Q64C CAGATATAGGACTGGAGGCAGTCCTTGCAGGAGCCC
oHOJ176-f E77C CTGCCTCCCTGCCTTCTGCGGCCGGAACTGTGAG
oHOJ176-r E77C CTCACAGTTCCGGCCGCAGAAGGCAGGGAGGCAG
oHOJ177-f F275C GAGAGGACGCTGGCCTGCGTGCGCTTCTCATTG
 
oHOJ177-r F275C CAATGAGAAGCGCACGCAGGCCAGCGTCCTCTC
凝血因子VII S43C-sTF(1-219)P206C、凝血因子VIIQ64C-sTF(1-219)G109C、凝血因子VII E77C-sTF(1-219)D58C和凝血因子VII F275C-sTF(1-219)W45C的共表达-根据操作说明在FreestyleTM293表达体系(Invitrogen，Carlsbad，CA)中通过瞬时表达共表达凝血因子VIIa和sTF(1-219)的半胱氨酸突变体，详细内容见实施例1。
免疫印迹检测凝血因子VII Q64C-sTF(1-219)G109C-根据操作说明通过非还原SDS-PAGE在4-12％ Bis-Tris 
Figure A200780021114D00381
凝胶(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)上于200V在MES缓冲液(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)中跑胶35分钟分析凝血因子VIIQ64C和sTF(1-219)G109C的瞬时共表达条件培养基。然后通过本领域技术人员已知的免疫印迹法使用单克隆鼠抗-人FVIIa和抗-人TF第一抗体和与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的兔抗-鼠第二抗体的混合物检测复合物。使用
Figure A200780021114D00382
 West Pico Chemiluminescent检测盒(Pierce)和LAS-3000 Image Reader(FUJIFILM Corporation)检测免疫复合物。结果见图3。
实施例3
构建编码sTF(1-209)和sTF(1-209)V207的CDNA-使用ExpandHigh Fidelity PCR体系(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)并使用引物oHOJ152-f(序列见表1)和oHOJ178-r(序列见表5)根据操作说明通过PCR从人全脑cDNA文库(Marathon-ready cDNA；Clontech Laboratories Inc.，MountainView，CA)中扩增包括其信号肽序列的TF(1-219)的DNA编码序列，引入侧翼NheI和XhoI限制性酶切位点。用NheI和XhoI剪切已纯化PCR产物然后连接至pCI-neo(Promega，Madison，WI)的相应位点。根据操作说明(Stratagene，LaJolla，CA)使用
Figure A200780021114D00383
定点突变和引物oHOJ179-f和oHOJ179-r(序列见表5)，所得质粒作为模板构建sTF(1-209)V207C。
通过DNA测序验证所有被克隆序列的正确性。
表5-构建TF(1-209)和TF(1-209)V207C DNA的引物
 
引物 序列(5’→3’)
oHOJ177-r CCGCCGCCCTCGAGTTAACACTCTACCGGGCTGTCTGTACTC
oHOJ179-f GAGTACAGACAGCCCGTGCGAGTGTTAACTCGAG
oHOJ179-r CTCGAGTTAACACTCGCACGGGCTGTCTGTACTC

Claims (18)

1.凝血因子VII多肽和组织因子多肽的共价复合物，其中凝血因子VII多肽和组织因子多肽通过(i)凝血因子VII多肽的氨基酸和(ii)组织因子多肽的氨基酸的组的氨基酸侧链之间的一个或多个指定连接方式共价连接。
2.根据权利要求1的复合物，其中所述凝血因子VII多肽和所述组织因子多肽通过(i)凝血因子VII多肽的氨基酸和(ii)组织因子多肽的氨基酸的组的氨基酸侧链之间的一个或多个特异连接方式共价连接。
3.根据权利要求2的复合物，其中所述凝血因子VII多肽和所述组织因子多肽通过(i)凝血因子VII多肽的氨基酸和(ii)组织因子多肽的氨基酸的组的氨基酸侧链之间的一个或多个直接连键方式共价连接。
4.根据之前权利要求中任一项的复合物，其中所述凝血因子VII多肽为功能活性凝血因子VII多肽。
5.根据权利要求4的复合物，其中经本文定义的体外蛋白水解检测测定，凝血因子VIIa多肽的蛋白水解活性是游离天然(野生型)凝血因子VIIa的至少2倍，例如至少50倍，如至少100倍，例如至少200倍或至少250倍。
6.凝血因子VIIa多肽与组织因子多肽的共价复合物，其中所述凝血因子VIIa多肽和所述组织因子多肽通过(i)凝血因子VIIa多肽的氨基酸和(ii)组织因子多肽的氨基酸的组的氨基酸侧链之间一个或多个连接的方式共价连接，其中经本文定义的体外蛋白水解检测测定，凝血因子VIIa多肽的蛋白水解活性是游离天然(野生型)凝血因子VIIa的至少2倍，例如至少50倍，如至少100倍，例如至少200倍或至少250倍。
7.根据之前权利要求中任一项的复合物，其中所述氨基酸的组包含一个或多个半胱氨酸氨基酸。
8.根据权利要求7的复合物，其中各组包含一个半胱氨酸氨基酸。
9.根据权利要求7的复合物，其中各组包含两个半胱氨酸氨基酸。
10.根据之前权利要求中任一项的复合物，其中所述可溶性组织因子多肽的Thr17、Lys20、Ile22、Ser42、Gly43、Asp44、Trp45、Lys46、Ser47、Phe50、Cys57、Asp58、Asp61、Gly109、Gln110、Leu133、Ser205、Pro206和Val207位，尤其是所述可溶性组织因子多肽的Trp45、Asp58、Gly109、Pro206和Val207位上的至少一个氨基酸被具有可生成指定连接如特异连接尤其是直接连键的反应性侧链的氨基酸置换。
11.根据之前权利要求中任一项的复合物，其中所述凝血因子VII多肽的Leu39、Phe40、Ile42、Ser43、Tyr44、Gln64、Leu65、Ile69、Glu77、Gly78、Arg79、Val92、Phe275、Val276、Arg277、Met306、Thr307和Glu325位，尤其是所述凝血因子VII多肽的Phe40、Ser43、Gln64、Glu77和Phe275位上的至少一个氨基酸被具有可生成指定连接如特异连接尤其是直接连键的反应性侧链的氨基酸置换。
12.根据之前权利要求中任一项的复合物，其中以下氨基酸组中的至少一组：
FVII-Ile69-sTF-Thr17，
FVII-Ile69-sTF-Lys20，
FVII-Arg79-sTF-Ile22，
FVII-Val92-sTF-Ser47，
FVII-Val92-sTF-Phe50，
FVII-Gly78-sTF-Cys57，
FVII-Glu77-sTF-Asp58，
FVII-Gly78-sTF-Asp58，
FVII-Arg79-sTF-Asp58，
FVII-Arg277-sTF-Ser42，
FVII-Val276-sTF-Gly43，
FVII-Arg277-sTF-Gly43，
FVII-Phe275-sTF-Asp44，
FVII-Val276-sTF-Asp44，
FVII-Arg277-sTF-Asp44，
FVII-Phe275-sTF-Trp45，
FVII-Val276-sTF-Trp45，
FVII-Arg134-sTF-Trp45，
FVII-Phe275-sTF-Lys46，
FVII-Gln64-sTF-Gly109，
FVII-Gln64-sTF-Gln110，
FVII-Leu65-sTF-Gln110，
FVII-Phe71-sTF-Leu133，
FVII-Ser43-sTF-Ser205，
FVII-Leu39-sTF-Pro206，
FVII-Phe40-sTF-Pro206，
FVII-Ile42-sTF-Pro206，
FVII-Ser43-sTF-Pro206，
FVII-Tyr44-sTF-Pro206，
FVII-Leu39-sTF-Val207，
FVII-Phe40-sTF-Val207和
FVII-Ser43-sTF-Val207，
尤其是以下氨基酸组中的至少一组：
FVII-Phe40-sTF-Val207，
FVII-Ser43-sTF-Pro206，
FVII-Gln64-sTF-Gly109，
FVII-Glu77-sTF-Asp58，和
FVII-Phe275-sTF-Trp45
的一个或两个氨基酸被具有可生成指定连接如特异连接尤其是直接连键的反应性侧链的氨基酸置换。
13.根据之前权利要求中任一项的复合物，其中至少一个直接连键在两个半胱氨酸氨基酸之间。
14.根据之前权利要求中任一项的复合物，其中至少一个直接连键通过光-反应性氨基酸形成。
15.根据权利要求14的复合物，其中所述光-反应性氨基酸选自photo-Ile、photo-Leu和photo-Met。
16.根据之前权利要求中任一项的复合物，其中所述凝血因子VII多肽和所述组织因子多肽通过(i)凝血因子VII多肽的氨基酸和(ii)组织因子多肽的氨基酸的一个或多个组的氨基酸侧链之间的接头部分的方式共价连接。
17.权利要求16的复合物，其中所述接头部分来自异基双功能试剂。
18.生产如权利要求1-17中任一项定义的凝血因子VII多肽和组织因子多肽复合物的方法，该方法包括a)用(i)含编码凝血因子VII多肽的核酸分子和与其操作性连接的表达控制区域的表达载体和(ii)含编码组织因子多肽的核酸分子和与其操作性连接的表达控制区域的表达载体转染细胞，b)在表达凝血因子VII多肽和组织因子多肽的条件下培养已转染细胞，及c)通过适当方法分离已表达的复合物。
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