CN114315970A - 一种具有增肌作用的豌豆肽及其制备方法、药物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有增肌作用的豌豆肽及其制备方法、药物和应用，属于多肽技术领域。本发明通过酶解豌豆蛋白，分离得到5条具有明显增肌作用的多肽。在体外衰老骨骼肌细胞试验，通过分析对骨骼肌细胞增殖分化、细胞凋亡自噬以及蛋白质合成和降解相关的调控通路的基因表达水平的变化，同时展开动物试验对其增肌效果及其机制进行研究，表明5条多肽序列具有显著增肌效果，有望开发为新型治疗或预防肌少症的多肽类药物。

Description

一种具有增肌作用的豌豆肽及其制备方法、药物和应用

技术领域

本发明属于多肽技术领域，具体涉及一种具有增肌作用的豌豆肽及其制备方法、药物和应用。

背景技术

肌肉减少症，是指因持续骨骼肌量流失、强度和功能下降而引起的综合症。骨骼肌是人体运动系统的动力，肌肉的衰老和萎缩是人体衰老的重要标志，非常容易引起骨折以及关节损伤等问题。肌少症是一种和年龄衰老相关的疾病，随着年龄的增加，活动量的减少，人的肌肉含量和强度会逐渐的衰减，而机体的肌肉并不能够维持平衡力和敏捷度，必然会造成行动力减弱，使身体变得行动迟缓，平衡感差，更容易摔倒。因此，肌少症会增加老年人的住院率及医疗花费，严重影响老年人的生活质量，甚至缩短老年人的寿命。

目前预防和治疗肌少症主要分为以下三个方面：（1）采用运动疗法确切的可以保持甚至是增加肌肉强度和肌肉含量；（2）采用药物进行干预治疗，但是，目前国内还没有针对肌肉症的药物上市，很多所谓的具有防治极少症功能的药物大多是激素，利弊尚不能完全搞清楚。（3）营养干预治疗，大多数老年人的饮食结构都存在热量、钙质、蛋白质和维生素D等摄入不足。那么平衡的膳食，丰富的营养，尤其是蛋白质之类的食物，就应该多吃。蛋白质、碳水化合物等营养物质摄入缺乏会增加少肌症的患病率。此外，营养吸收状况差，胃肠道疾病，或者多重用药等导致少食少餐，营养过剩等都对少肌症的进展起着“推波助澜”的作用。衰老过程引发的消化系统退化致使吞入的食物中的营养物得不到有效吸收利用，长期营养物缺乏状态降低了老年人的活动供能，同时存在肌肉蛋白降解远大于合成能力，肌组织调控负平衡，肌肉负担加剧，恶性循环致使少肌症产生。补充蛋白质等营养素可有效预防和治疗少肌症带来的肌肉数量和肌肉功能方面的病理改变，改变患者临床结局。小分子低聚肽具有致敏性低、易吸收、吸收速率快等特点，且氨基酸含量丰富，可促进肌肉蛋白合成，有效防治少肌症发生进展。

豌豆中含有丰富的蛋白质，含有9种人体必须氨基酸，且支链氨基酸含量丰富，支链氨基酸可以促进胰岛素和生长激素的释放，加快肌肉对糖分的利用。然而目前，还未明确豌豆中具有增肌作用的蛋白肽的种类，限制了防治肌少症的肽类药物的开发。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有增肌作用的豌豆肽及其制备方法和应用。

本发明提供了一种具有增肌作用的豌豆肽，包括以下一种或几种多肽：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的PP1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的PP2、氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示的PP3、氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的PP4和氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的PP5。

优选的，包括PP2或PP2与以下一种或几种多肽形成的混合物：PP1、PP3、PP4和PP5。

本发明提供了所述豌豆肽的制备方法，包括以下步骤：

1）将豌豆蛋白在碱性蛋白酶的作用下酶解，得到第一酶解液；

2）将所述第一酶解液在木瓜蛋白酶和纤维素酶共同作用下酶解，得到第二酶解液；

3）将所述第二酶解液灭酶后过3000Da陶瓷膜，所得透过液过1KDa有机膜，收集有机膜膜透过液，得到豌豆肽；

4）将所述豌豆肽经凝胶色谱层析，收集12~18min的组分S2；

5）将所述组分S2经制备型液相色谱分离纯化，收集55~63min的组分W5；

6）将所述组分W5进行分析型液相色谱分离纯化，分别在14.444min、18.110min、20.906min、22.973min、24.462min收集到5个多肽片段，依次为PP1、PP2、PP3、PP4和PP5。

优选的，步骤4）中凝胶色谱层析的条件如下：

洗脱液为超纯水；洗脱时间2h；洗脱速度：2.5mL/min；色谱柱规格为600 mm×25mm，种类为Sephadex G50色谱柱；检测波长：214nm。

优选的，步骤5）中制备型液相色谱分离纯化的条件如下：制备型液相色谱柱的规格550mm×40μm，粒度20μm，流速为15mL/min，流动相A为体积浓度0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为体积浓度0.1%三氟乙酸乙腈溶液；梯度洗脱，洗脱程序如下：

洗脱时间0~10min，流动相A的体积百分含量为100%~90%，流动相B的体积百分含量为0~10%；

洗脱时间10~20min，流动相A的体积百分含量为90%~50%，流动相B的体积百分含量为10%~50%；

洗脱时间20min~60min，流动相A的体积百分含量为50%~10%，流动相B的体积百分含量为50%~90%；

洗脱时间60min~65min，流动相A的体积百分含量为10%~95%，流动相B的体积百分含量为90%~5%。

优选的，步骤6）中分析型液相色谱分离纯化的条件为Gemini-NX 10μm C18 100A，4.6×250mm，流速为15mL/min，流动相A为体积浓度0.1%三氟乙酸的水溶液，流动相B为0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；流速1.0mL/min，进样量10μL，吸光度220nm；梯度洗脱，洗脱程序如下：洗脱时间0~5min，流动相A的体积百分含量由95%下降至90%，流动相B的体积百分含量由5%上升至10%；

洗脱时间5min~55 min，流动相A的体积百分含量由90%下降至15%，流动相B的体积百分含量由10%上升至85%；

洗脱时间55min~60min，流动相A的体积百分含量由15%上升至95%，流动相B的体积百分含量为85%下降至5%。

本发明提供了所述豌豆肽或所述制备方法制备得到的豌豆肽在制备预防和/或治疗少肌症的药物中的应用。

优选的，所述药物具有促进成肌细胞增殖、激活成肌细胞中生长和增殖信号通路、提高雄性机体睾酮水平、提高骨骼肌再生调控因子表达、提高骨骼肌线粒体中ATP酶活性、激活胰岛素信号通路的药效。

本发明提供了一种预防和/或治疗少肌症的药物，活性成分包括所述豌豆肽或所述制备方法制备得到的豌豆肽。

优选的，所述药物的剂型为口服剂。

本发明提供的具有增肌作用的豌豆肽，包括以下一种或几种多肽：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的PP1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的PP2、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的PP3、氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的PP4和氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的PP5。本发明通过体外衰老骨骼肌细胞试验，通过分析对骨骼肌细胞增殖分化、细胞凋亡自噬以及蛋白质合成和降解相关的调控通路的基因表达水平的变化，从豌豆肽中筛分得到5条具有修复衰老肌肉的寡肽序列，通过展开动物试验对其增肌效果及其机制进行研究，结果表明5条多肽序列具有显著增肌效果，有望开发为新型治疗或预防肌少症的多肽类药物。而且豌豆肽具有分子量小，易吸收，支链氨基酸含量多的特点，具有食用安全性。

附图说明

图1为本发明实施例中豌豆肽层析谱图；

图2为本发明实施例中凝胶层析后获得不同组分（S1、S2、S3）促进骨骼肌细胞增殖的结果；

图3为本发明实施例中S2组分经制备型液相色谱图分析结果图；

图4为本发明实施例中制备行液相色谱分析所得不同组分（W1~W7）促进骨骼肌细胞增殖结果图；

图5为本发明实施例中W5经分析型液相色谱分析得到的谱图；

图6为本发明实施例中豌豆肽（P1~P5）促进C2C12细胞增殖结果，其中*P<0.05表示CN组相应时间的细胞增殖结果比呈显著性差异；

图7为本发明实施例中豌豆肽样品上调C2C12细胞中生长与增殖相关蛋白表达结果图；

图8为本发明实施例中豌豆肽样品上调C2C12细胞中生长与增殖相关蛋白表达量统计结果；其中A为cyclinD1表达量（对照百分比）的统计分析；B为CDK6表达量（对照百分比）的统计分析；C为p-AMPK/t-AMPK表达量（对照百分比）统计分析；D为IGF-1R表达量（对照百分比）统计分析，其中对照百分比是指以CN组蛋白的表达量为1计，各组中蛋白的表达量相对于CN组对应蛋白的表达量的比值；

图9为本发明实施例中少肌症模型小鼠实验流程图；

图10为本发明实施例中豌豆肽样品提高小鼠前肢抓力结果；

图11为本发明实施例中豌豆肽样品提高小鼠睾酮水平统计结果；

图12为本发明实施例中豌豆肽样品提高小鼠血清中调IGF-1含量统计结果图；

图13为本发明实施例中豌豆肽样品降低小鼠血清中IGFBP-3含量统计结果图；

图14为本发明实施例中样品提高骨骼肌线粒体中ATP酶活性；

图15为本发明实施例中豌豆肽样品激活IGF/IGF-1R信号通路结果；

图16为豌豆肽未被消化的液相色图谱，其中横轴表示时间，单位为min，纵坐标数值单位为mAU；

图17为豌豆肽被胃蛋白酶消化后的液相色图谱，其中横轴表示时间，单位为min，纵坐标数值单位为mAU；

图18为豌豆肽被胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后的液相色图谱，其中横轴表示时间，单位为min，纵坐标数值单位为mAU；

图19为三种条件下的液相液相谱图重合情况对比，其中横轴表示时间，单位为min，纵坐标数值单位为mAU；

图20为PP2组分体外消化试验结果。

具体实施方式

本发明提供了一种具有增肌作用的豌豆肽，包括以下一种或几种多肽：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的PP1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的PP2、氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示的PP3、氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的PP4和氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的PP5。

在本发明中，所述PP1、PP2、PP3、PP4或PP5单独处理骨骼肌细胞，均能显著促进细胞增殖，并能激活细胞中生长与增殖信号通路，显著提高IGF-1R、cyclinD1、CDK6和p-AMPK的表达；并且与其他豌豆肽相比，PP2增肌效果最佳。因此所述豌豆肽优选包括PP2或PP2与以下一种或几种多肽形成的混合物：PP1、PP3、PP4和PP5，例如PP2+PP1、PP2+PP3、PP2+PP4、PP2+PP5、PP2+PP1+PP3、PP2+PP1+PP4、PP2+PP1+PP5、PP2+PP3+PP4、PP2+PP3+PP5、PP2+PP3+PP1+PP4、PP2+PP3+PP1+PP5、PP2+PP3+PP1+PP5+PP4。

本发明提供了所述豌豆肽的制备方法，包括以下步骤：

1）将豌豆蛋白在碱性蛋白酶的作用下酶解，得到第一酶解液；

2）将所述第一酶解液在木瓜蛋白酶和纤维素酶共同作用下酶解，得到第二酶解液；

3）将所述第二酶解液灭酶后过3000Da陶瓷膜，所得滤下部分过1KDa有机膜，收集膜上成分，得到豌豆肽；

4）将所述豌豆肽经凝胶色谱层析，收集12~18min的组分S2；

5）将所述组分S2经制备型液相色谱分离纯化，收集55~63min的组分W5；

6）将所述组分W5进行分析型液相色谱分离纯化，分别在14.444min、18.110min、20.906min、22.973min、24.462min收集到5个多肽片段，依次为PP1、PP2、PP3、PP4和PP5。

本发明将豌豆蛋白在碱性蛋白酶的作用下酶解，得到第一酶解液。

在本发明中，所述碱性蛋白酶的添加质量占豌豆蛋白质量的1.5%~2.5%，更优选为2%。所述碱性蛋白酶优选分两次添加，在添加豌豆蛋白前添加碱性蛋白酶，添加总量的6~7成，添加豌豆肽后再添加剩余碱性蛋白酶。碱性蛋白酶的酶解条件优选如下：温度52~57℃，体系的pH值为9，酶解时间为2.5~3.5h，持续搅拌，所述搅拌的转速优选为65rpm。所述碱性蛋白酶的酶活优选为300万U/mg。在本发明实施例中，所述碱性蛋白酶购自山东隆科特酶制剂有限公司。

得到第一酶解液后，本发明将所述第一酶解液在木瓜蛋白酶和纤维素酶共同作用下酶解，得到第二酶解液。

在本发明中，所述木瓜蛋白酶的添加质量占占豌豆蛋白质量的0.8~1.2%，更优选为1%。所述纤维素酶的添加质量占豌豆蛋白质量的0.8~1.2%，更优选为1%。所述木瓜蛋白酶的酶活优选为100万U/mg。在本发明实施例中，所述木瓜蛋白酶购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司。所述纤维素酶的酶活优选为500U/mg。在本发明实施例中，所述纤维素酶购自山东隆科特酶制剂有限公司。共同酶解期间，酶解条件优选为温度50~55℃，更优选为55℃；酶解时间优选为1.5~2.5h，更优选为2h。

得到第二酶解液后，本发明将所述第二酶解液灭酶后过3000Da陶瓷膜，所得过滤液过1KDa有机膜，收集滤下部分，得到豌豆肽。

本发明对所述酶解的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶解方法即可。在本发明实施例中，所述灭酶的方法优选高温短时灭酶，例如在110℃下保持5℃，有利于使体系中酶失活，终止酶解反应。

灭酶后，升温至室温进行过膜。收集滤下部分经常规喷雾干燥，得到豌豆肽。

得到豌豆肽后，本发明将所述豌豆肽经凝胶色谱层析，收集12~18min的组分S2。

在本发明中，凝胶色谱层析的条件优选如下：洗脱液为超纯水；洗脱时间2h；洗脱速度：2.5mL/min；色谱柱规格为600 mm×25 mm，种类为Sephadex G50色谱柱；检测波长：214nm。凝胶色谱层析分别收集三个时间的组分，依次为S1（6min~12min）、S2（12min~18min）、S3（18min~24min）。经过骨骼肌细胞培养增殖实验表明，S1~S3组分均能促进细胞的增殖，但S2组分的细胞增殖效果最佳，表明S2组分的增肌效果最好。

得到S2组分后，本发明将所述组分S2经制备型液相色谱分离纯化，收集55~63min的组分W5。

在本发明中，制备型液相色谱分离纯化的条件优选如下：制备型液相色谱柱的规格550mm×40μm，粒度20μm，流速为15mL/min，流动相A为体积浓度0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为体积浓度0.1%三氟乙酸乙腈溶液；梯度洗脱，洗脱程序如下：

洗脱时间0~10min，流动相A的体积百分含量为100%~90%，流动相B的体积百分含量为0~10%；

洗脱时间10~20min，流动相A的体积百分含量为90%~50%，流动相B的体积百分含量为10%~50%；

洗脱时间20min~60min，流动相A的体积百分含量为50%~10%，流动相B的体积百分含量为50%~90%；

洗脱时间60min~65min，流动相A的体积百分含量为10%~95%，流动相B的体积百分含量为90%~5%。

经过制备型液相色谱分离纯化，收集了7个组分，23~31min（W1）、31~39min（W2）、39~47min（W3）、47~55min（W4）、55~63min（W5）、63~71min（W6）、71~79min（W7）。经过增肌效果实验表明，W5组分的增肌效果最佳。

得到组分W5后，本发明将所述组分W5进行分析型液相色谱分离纯化，分别在14.444min、18.110min、20.906min、22.973min、24.462min收集到5个多肽片段，依次为PP1、PP2、PP3、PP4和PP5。

在本发明中，分析型液相色谱分离纯化的条件优选为Gemini-NX 10μm C18 100A，4.6×250mm，流速为15mL/min，流动相A为体积浓度0.1%三氟乙酸的水溶液，流动相B为0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；流速1.0mL/min，进样量10μL，吸光度220nm；梯度洗脱，洗脱程序如下：

洗脱时间0~5min，流动相A的体积百分含量由95%下降至90%，流动相B的体积百分含量由5%上升至10%；

洗脱时间5min~55 min，流动相A的体积百分含量由90%下降至15%，流动相B的体积百分含量由10%上升至85%；

洗脱时间55min~60min，流动相A的体积百分含量由15%上升至95%，流动相B的体积百分含量为85%下降至5%。

在本发明中，PP1、PP2、PP3、PP4和PP5经细胞增殖实验，PP1、PP2、PP3、PP4、PP5样品组细胞浓度与CN组细胞浓度相比有显著性增长，其中PP2样品组促进C2C12细胞增殖效果最佳，表明PP2样品组增肌效果最好。同时动物水平实验结果表明，PP1、PP2、PP3、PP4和PP5形成的豌豆肽混合组以及PP2组均可提高小鼠前肢抓力，并且PP2的效果优于增肌蛋白粉组和豌豆肽混合组。

基于豌豆肽具有增肌作用，本发明提供了所述豌豆肽或所述制备方法制备得到的豌豆肽在制备预防和/或治疗少肌症的药物中的应用。

在本发明中，所述药物优选具有促进成肌细胞增殖、激活成肌细胞中生长和增殖信号通路、提高雄性机体睾酮水平、提高骨骼肌再生调控因子表达、提高骨骼肌线粒体中ATP酶活性、激活胰岛素信号通路的药效。所述激活成肌细胞中生长和增殖信号通路优选包括提高IGF-1R、cyclinD1、CDK6和p-AMPK的表达。睾酮与肌肉生长关系非常密切，高水平的睾酮可以使蛋白质降解明显减少，提高雄性机体睾酮水平可以促进肌肉生长。提高骨骼肌再生调控因子表达优选为提高IGFBP-3含量。线粒体是合成ATP的主要场所，而ATP是机体运动所需能量，由ATP水解酶水解高能磷酸键可生成游离ATP，供给机体活动所需能量，所述提高骨骼肌线粒体中ATP酶活性有利于提供大量游离ATP，为机体活动提供能量。胰岛素（IGFs）信号通路在肌肉生长与损伤修复中发挥重要作用，激活胰岛素信号通路优选为显著性增加IGF-1R的表达，进而促进IGF-1与IGF-1R的结合，进一步促进AMPK的磷酸化，然后诱导细胞周期相关蛋白cyclinD1与CDK6表达上调，最终导致细胞增殖发生。

本发明提供了一种预防和/或治疗少肌症的药物，活性成分包括所述豌豆肽或所述制备方法制备得到的豌豆肽。

所述药物的剂型优选为口服剂。本发明对所述口服剂的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的口服剂的种类即可，例如口服液、片剂、丸剂等。本发明对所述口服剂中所述豌豆肽的含量没有特殊限制，保证每日摄入1.0g/kg体重小鼠即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种具有增肌作用的豌豆肽及其制备方法、药物和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

豌豆肽的生产方法，步骤如下：

步骤一.向酶解罐中加入10000L无离子水，利用浓度为10mol/L的 NaOH，调pH值至9.0，加入10kg碱性蛋白酶，期间以65 r/min的转速不断搅拌处理，并利用蒸汽升温至55℃左右。

步骤二.准备豌豆蛋白700kg进行投料，保证在30min内投放完毕，期间不断搅拌处理，投料完成后，再次利用浓度为10mol/L的NaOH调pH至9.0，并继续添加4kg碱性蛋白酶，继续酶解3h。

步骤三.碱性蛋白酶酶解3h后加入1%的木瓜蛋白酶（7.0kg）和0.1%的纤维素酶（0.7kg），继续酶解2h。

步骤四.将步骤三中的溶液升温至110℃，保持5min，对两种蛋白酶及纤维素酶进行灭活。

步骤五.将步骤六的灭酶溶液降温至50℃，过30000Da陶瓷膜，收集滤下液，然后过1KDa有机膜，收集滤下成分经喷雾干燥，得到豌豆肽。

豌豆肽基本理化性质测定：蛋白质含量测定（GB5009.9）、水分含量的测定（GB5009.3）、灰分含量的测定（GB5009.4）。

表1 豌豆肽基本理化性质测定结果

蛋白质含量（%）	水分（%）	灰分（%）
			89.6	5.1	5.3

实施例2

豌豆肽分离纯化及增肌活性鉴定

1.凝胶色谱层析

取实施例1制备的豌豆肽10g，加入200ml 2%醋酸溶液搅拌溶解0.5h。将豌豆肽离心处理，离心条件为8000r/min，15℃，15min，经孔径为0.45μm滤头过滤后备用。

Sephadex G50色谱柱分离：首先用超纯水平衡柱子冲洗4个柱体积后上样，然后超纯水2.5mL/min冲柱2h，将过膜后的豌豆肽按照色谱峰收集流份并将各流份浓缩后用真空干燥机冷冻干燥成粉。其分离条件为：洗脱液为超纯水；洗脱时间2h；洗脱速度：2.5mL/min；色谱柱规格为600 mm×25 mm；检测波长：214nm。层析图谱见图1。收集三个组分分别为：S1（6min~12min）、S2（12min~18min）、S3（18min~24min）。比较不同组分对骨骼肌细胞生长的作用，选择效果最佳的组分继续分离纯化。

将处于对数生长期的上述C2C12细胞接种至96孔板中，细胞分为4个组，空白对照组（CN，不添加任何肽成分），豌豆肽S1组，豌豆肽S2组，豌豆肽S3组，每个处理组设置3个孔重复，每孔大约1000个细胞，除正常组外细胞中分别加入0.4μg/ml豌豆肽，且分别在0 h、12h、24 h、36 h和48 h时加入10 μL CCK-8溶液，混匀，37 ℃的CO₂培养箱中孵育2 h，使用酶标仪于450 nm条件下测定OD值，并绘制细胞增殖曲线。

通过比较经过凝胶色谱层析三个组分的增肌效果，结果见图2，其中OD值代表细胞浓度，OD值越高，C2C12细胞数目越多，表明增肌效果越好。图2结果表明，与空白对照组相比，S1、S2和S3组份均明显促进成肌细胞C2C12的增殖，其中S2组分促进成肌细胞C2C12的增殖最好，增肌效果最佳（见图2），采用制备型液相色谱对S2组分进一步分离纯化，并筛选增肌效果较好的组分，进一步通过分析型液相分离纯化。色谱条件：制备型液相色谱柱（550mm×40μm，粒度20μm），流速为15mL/min，流动相A（水+0.1%三氟乙酸），流动相B（乙腈+0.1%三氟乙酸）进行梯度洗脱，洗脱程序见表2。制备型液相色谱图见图3。得到7个组分，23~31min（W1）、31~39min（W2）、39~47min（W3）、47~55min（W4）、55~63min（W5）、63~71min（W6）、71~79min（W7）。分别检测7个组分对骨骼肌细胞生长的作用，选择增肌效果较好的组分进一步研究，并通过分析型液相进一步分离纯化，同时设置空白对照组（CN，不添加任何肽成分）。

表2制备型液相色谱洗脱条件

时间	流动相A	流动相B
			0~10min	100%~90%	0~10%
10~20min	90%~50%	10%~50%
			20min~60min	50%~10%	50%~90%
60min~65min	10%~95%	90%~5%
			65~100min	95%	5%

通过比较经过制备型液相分离纯化的7个组分的增肌效果，结果见图4，其中OD值代表细胞浓度，OD值越高，细胞数目越多，表明增肌效果越好。图4结果表明，与空白对照组相比，W4和W5组份均明显促进成肌细胞C2C12的增殖，其中W5组分促进成肌细胞C2C12的增殖效果最好，增肌效果最佳。采用分析型液相色谱对W5组分进一步分离纯化，并筛选增肌效果较好的组分，进一步通过高分辨质谱仪对其组分的氨基酸组成进行鉴定。色谱条件：Gemini-NX 10μm C18 100A，4.6×250mm，流速为15mL/min，流动相A（水+0.1%三氟乙酸），流动相B（乙腈+0.1%三氟乙酸）进行梯度洗脱，洗脱程序见表3，流速1.0mL/min，进样量10μL，吸光度220nm。分析型液相色谱结果见图6。得到7个组分，14.444min（P1）、18.110min（P2）、20.906min（P3）、22.973min（P4）、24.462min（P5）、分别5个组分对骨骼肌细胞生长的作用，针对增肌效果较好的组分进一步研究。

表3 分析型液相流动相梯度

时间	流动相A	流动相B
			0min	95%	5%
60min	35%	65%

进一步利用采用纳升级液相色谱-Q EXACTIVE质谱联用系统，对所得到的豌豆肽P1、P2、P3、P4、P5进行纯度和结构鉴定。

1.检测条件：

(1) 流动相: A相:100%纯净水+0.1%甲酸；B相:100%乙腈+0.1%甲酸；

(2) 流动相流速: 300nl/min；

(3) 进样量：1mL上清；

(4) 流动相梯度程序如下表4所示。

表4 流动相梯度程序

时间（min）	0	2.0	36.0	38.0	41.0	42.0	45.0
								A（%）	97	97	63	10	10	97	97
B（%）	3	3	37	90	90	3	3

利用纳升级液相色谱-Q EXACTIVE质谱联用，对5个组分的结构进行鉴定，结果（图5）如下，5条蛋白肽的序列分别为Glu-Gly-Ser-Leu-Leu-Leu-Pro-His (EGSLLLPH)、Leu-Asp-Leu-Pro-Val-Leu (LDLPVL)、Leu-Leu-Tyr-Val-Ile-Arg (LLYVIR)、Thr-Asn-Tyr-Glu-Glu-Ile-Glu-Lys-Val-Leu-Leu (TNYEEIEKVLL)、Asn-Thr-Asn-Tyr-Glu-Glu-Ile-Glu-Lys-Val-Leu (NTNYEEIEKVL)，经过NCBI比对5条蛋白肽的来源见下表5。

表5 豌豆肽增肌结构序列鉴定

豌豆肽组分	氨基酸序列	序列来源
			1 (PP1)	Glu-Gly-Ser-Leu-Leu-Leu-Pro-His (EGSLLLPH，SEQ ID NO:1)	P13918|VCLC_PEA
2 (PP2)	Leu-Asp-Leu-Pro-Val-Leu (LDLPVL，SEQ ID NO:2)	tr|O24294|O24294_PEA:P14594|LEGB_PEA:P05692|LEGJ_PEA:P05693|LEGK_PEA
			3 (PP3)	Leu-Leu-Tyr-Val-Ile-Arg (LLYVIR，SEQ ID NO:3)	tr|Q9T0P5|Q9T0P5_PEA:P15838|LEGA2_PEA:tr|Q41036|Q41036_PEA
4 (PP4)	Thr-Asn-Tyr-Glu-Glu-Ile-Glu-Lys-Val-Leu-Leu (TNYEEIEKVLL，SEQID NO:4)	tr|D3VNE1|D3VNE1_PEA:tr|D3VNE2|D3VNE2_PEA
			5 (PP5)	Asn-Thr-Asn-Tyr-Glu-Glu-Ile-Glu-Lys-Val-Leu (NTNYEEIEKVL，SEQID NO:5)	tr|D3VNE1|D3VNE1_PEA:tr|D3VNE2|D3VNE2_PEA

实施例3

PP1、PP2、PP3、PP4、PP5对骨骼肌细胞生长的影响

1.材料与方法

实验用PP1、PP2、PP3、PP4、PP5委托武汉星皓医药有限公司合成；

细胞系与培养基

本实验中所使用细胞系为购自CCTCC（中国典型物保藏培养中心）的C2C12细胞；胎牛血清（FBS）、高糖DMEM、0.25%胰酶购自Gibco公司；青链霉素混合液、PBS缓冲液、4%多聚甲醛、Triton X-100均购自Solaibio 公司；细胞培养板与细胞培养瓶均为康宁公司；CCK-8试剂盒购自南京建成生物有限公司；PVDF膜购自默克Millipore公司。

C2C12细胞培养

从液氮罐中取出C2C12细胞，37℃水浴锅快速融化，离心弃上清后用完全培养基（10%FBS+1%青链霉素+高糖DMEM）重悬细胞，接种于培养皿中。待细胞汇合度达到80%～90%时，进行传代，每2 d更换细胞培养液一次。

细胞增殖实验

将处于对数生长期的上述C2C12细胞接种至96孔板中，细胞分为6个组，空白对照组（CN，不添加任何肽成分），样品组分别为豌豆肽PP1组（PP1）、豌豆肽PP2组（PP2）、豌豆肽PP3组（PP3）、豌豆肽PP4组（PP4）、豌豆肽PP5组（PP5），每个处理组设置3个孔重复，每孔大约1000个细胞，样品组细胞中分别加入0.4μg/ml样品，且分别在0 h、12 h、24 h、36 h和48 h时加入10 μL CCK-8溶液，混匀，37 ℃的CO₂培养箱中孵育2 h，使用酶标仪于450 nm条件下测定OD值，并绘制细胞增殖曲线。

Western blots检测相关蛋白表达

将处于对数生长期的C2C12细胞按照1×10⁶接种至6孔板中，细胞分为6个组，对照组（CN），样品组分别为豌豆肽PP1组（P1）、豌豆肽PP2组（PP2）、豌豆肽PP3组（PP3）、豌豆肽PP4组（PP4）、豌豆肽PP5组（PP5），每个处理组设置3个孔重复，每孔大约1000000个细胞，样品组细胞中分别加入0.4μg/ml样品，每个处理组设置3个孔重复，共孵育24 h后，收集不同处理组细胞，充分裂解后提取总蛋白，使用核酸蛋白测定仪测定蛋白浓度。将蛋白样品与上样缓冲液充分混合，100 ℃变性10 min，进行SDS-PAGE凝胶电泳，程序为：80 V 30 min；100V 80 min。进行转膜，转膜程序为：100 V 90 min；转膜后放入5%脱脂奶粉中，室温摇床封闭1 h；分别加入GAPDH抗体（1：2 000）和PCNA 抗体，AMPK抗体，p-AMPK抗体，IGF-1抗体（1：1000），4 ℃过夜；加入二抗（1：20 000），室温孵育1 h；TBST洗膜3次，然后在加入Pierce加强型发光剂，自动曝光机器曝光。

2.结果

5条豌豆肽均能显著性促进C2C12细胞增殖

多肽比整蛋白更容易被消化吸收，并且能够被细胞吸收利用，例如黄凌凌等报道了胸腺五肽能够被巨噬细胞吸收利用（黄凌凌, 谢婷, 梁宁生,胸腺五肽对大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响研究, 2016, 11(3): 346-349.），例如，冯群等报道了抗菌肽能够被HTC-8细胞吸收利用（冯群, 田忠, 高嘉敏, 李笑驹等,黑水虻抗菌肽分离纯化及活性组分对HTC-8细胞的增殖抑制作用,医学研究生学报,2022,35(1): 17-19.），再例如，李娜等报道了鳕鱼鳔胶原肽能够被2BS细胞吸收利用（李娜等,鳕鱼鳔胶原肽对H₂O₂诱导2BS细胞早期衰老的保护作用, 中国食品学报, 2021, 21(11): 101-103.），再例如李顺等报道了肿瘤抑素19肽对SK-Hep-1细胞增殖和凋亡作用的影响（李顺等,肿瘤抑素19肽对SK-Hep-1细胞增殖和凋亡作用的影响, 中国当代医学, 2022,29 (2) : 42-44.）。本发明提供的这5个寡肽均为小分子肽，因此可以穿过细胞膜，进入胞质中，从而激活一系列细胞内信号通路。

结果见表6。

表6 不同多肽组分对C2C12细胞增殖影响

以各组均值作图，见图6。结果显示，当加入（PP1、PP2、PP3、PP4或PP5）样品与C2C12细胞共孵育12 h后，与CN相比，样品组细胞浓度与其相似；而当共孵育至24h或者36h时，PP2组细胞浓度与CN组细胞浓度相比有显著性增长，而当共孵育至48 h时，（PP1、PP2、PP3、PP4或PP5）样品组细胞浓度与CN组细胞浓度相比有显著性增长，其中PP2样品组促进C2C12细胞增殖效果最佳。

5条豌豆肽激活C2C12细胞中生长与增殖信号通路

进一步考察了5条豌豆肽对C2C12细胞中生长与增殖信号通路的影响，结果发现共孵育豌豆肽样品（PP1、PP2、PP3、PP4或PP5）24h后，其中PP2样品组增肌效果最佳，相应地，western blot分析（见图7和图8）也表明，与对照组（CN）相比，共培养PP2显著提高C2C12细胞的生长信号通路p-AMPK/IGF-1/IGF-1R的激活更明显，另外，PP2也显著上调了细胞周期G0/S期关键调控蛋白CyclinD1和CDK6蛋白的表达，促进细胞周期进程，这也是PP2更好促进C2C12细胞增殖的原因。总之，结果提示，PP2显著上调了周期蛋白的表达，促进C2C12细胞的周期进程，也激活了生长信号通路，最终促进C2C12细胞的增殖。这些信号通路的激活是促进肌肉生长的重要环节，因此寡肽PP2比其他几个寡肽的增肌效果要更加明显。此外，PP2（LDLPVL）氨基酸序列的寡肽比其他寡肽对C2C12细胞的增殖更为显著。

实施例3

豌豆肽是一种优质多肽，在健身健美领域获得广泛应用，特别受素食主义健身健美爱好者的青睐。相比于大豆多肽，豌豆肽富含支链氨基酸，因此，从增肌角度来讲，豌豆肽具有更好的效果。本实施例旨在确定长期服用上述制备的豌豆肽的增肌效果并初步探讨其作用机制，具体实验流程见图9。

1. 实验材料与方法

1.1 试验方案

本实验中，采取SPF级C57小鼠为模型鼠，分别随机分为4组：正常对照组（A组，小鼠每日灌胃0.4 g/kg体重的生理盐水），豌豆肽（实施例1制备的肽）组（B组），增肌蛋白粉组（C组），以及豌豆肽PP2组（D组）。各实验组均进行8周负重爬梯抗阻运动。豌豆肽组小鼠每日灌胃0.4 g/kg体重的豌豆肽并进行抗阻运动训练；增肌蛋白粉组（C组）每日灌胃1.0g/kg体重的增肌蛋白粉并进行抗阻训练；豌豆肽PP2组（D组）小鼠每日灌胃0.1g/kg体重的豌豆肽并进行抗阻运动训练；CN组小鼠每日灌胃等体积生理盐水并不进行抗阻运动训练。其中抗阻训练的增肌原理是肌纤维（肌肉细胞）的不断破坏，修复和再生过程。具体运动方案如下：熟悉梯子一周后，样品组小鼠在1 m梯子上进行8周梯子攀爬运动，梯子倾斜85º，2 cm网格梯子附有重物到它们的尾巴。在整个梯子长度上成功承载的最大负载被认为是训练课程的最大负载能力，并且在最初一周、2周、4周、6周和8周检测到最大负载能力。每只小鼠在第一个训练周承受其体重的50%的负荷，并且运动负荷增加到其体重的100%，直到第8周结束，频率为每周3次，休息时间为60s重复次数和组间5min的休息间隔。实验前后分别检测其前肢抓力。实验结束，处死实验小鼠，取血清以及股直肌待用。

1.2抓力测定

右手抓住实验小鼠放在抓力板上，左手向前推住拉力板，然后右手向后滑至尾部，待小鼠用力抓住抓力板时应及时加力向后拉，使其能测到动物最大抓力。

1.3睾酮、IGF-1以及IGFBP-3测定

取实验小鼠血清，按照ELISA试剂盒操作说明书，分别检测睾酮、IGF-1以及IGFBP-3的含量。

1.4 ATP酶活性测定

取新鲜肌肉组织，加入冰生理盐水，用眼科小剪刀尽快剪碎肝脏组织块。将剪碎的肌肉组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3冷生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的烧杯中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8min），充分研碎，使肌肉组织匀浆化（10%组织匀浆）。然后离心取上清，按照ATP酶试剂盒操作说明书步骤测定股直肌组织线粒体中ATP酶活性。

1.5 样品对胰岛素信号通路的影响

胰岛素信号通路在肌肉生长过程中发挥重要作用。在本实施例中，采用Westernblot方法检测豌豆肽对胰岛素信号通路的影响。具体操作方法是：取实验小鼠小腿三头肌，匀浆，超声破碎细胞，上清液中加入上样缓冲液，12% SDS-PAGE分离蛋白，350mA电转2.5小时，取出PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1小时，TBS-T洗膜3次，然后加入一抗4℃孵育过夜，TBS-T洗膜3次，室温孵育二抗1小时，洗膜，加入ECL发光剂，显色。

2. 结果与讨论

2.1 样品可提高小鼠前肢抓力

表7 小鼠前肢抓力结果

项目	A组	B组	C组	D组
					初始抓力值（g）	142.6±12.5	151.3±15.6	147.7±16.1	149.2±15.4
8周后	212±25.7	273.8±31.5	254.5±27.3	292.6±35.4

由测定小鼠前肢抓力结果（表7）发现，豌豆肽PP2组（D组）可以显著性提高小鼠前肢抓力，效果优于增肌蛋白粉组（C组）和豌豆肽（混合肽）组（B组）。相较于正常对照组（A组），B组、C组和D组均可提高小鼠前肢抓力（见图10）。

2. 2样品提高小鼠睾酮水平

睾酮与肌肉生长关系非常密切，高水平的睾酮可以使蛋白质降解明显减少。而且提高睾酮水平可以帮助有效减少脂肪。实验结果如图11所示，其中横轴为不同处理组，纵轴表示对照倍数，所述对照倍数是以进行增肌训练的正常组为基准，B组、C组和D组小鼠睾丸提高的倍数，睾酮是一种类固醇荷尔蒙，由男性的睾丸或女性的卵巢分泌，肾上腺亦分泌少量睾酮，具有维持肌肉强度及质量、维持骨质密度及强度、提神及提升体能等作用。相比于对照组，服用豌豆肽（混合肽，等质量混合）组（B组）和豌豆肽PP2组（D组）可以显著性提高小鼠睾酮水平，而且睾酮水平明显高于服用增肌粉的小鼠。服用豌豆肽（混合肽）组（B组）和豌豆肽PP2组（D组）对于睾酮增加效果优于单纯服用增肌蛋白粉组（C组）。

2.3豌豆肽提高小鼠血清中调IGF-1含量

IGF-1是骨骼肌再生过程中的一个关键正向调控因子，在促进骨骼肌生长方面发挥重要作用。结果发现，相比于对照组，服用豌豆肽（混合肽）组（B组）和豌豆肽PP2组（D组）可以显著性提高小鼠外周血中IGF-1的含量，而且增加量高于增肌蛋白粉组（C组）（见图12）。

2.4样品降低小鼠血清中调节IGFBP-3含量

IGFBP是IGFs结合蛋白，IGFBP与IGF-1或者IGF-2结合时，会阻碍IGFs信号通路的进行，IGFBP-3是IGFBP种最重要的一种，其余IGF-1由高亲和性。在进行8周抗阻力训练后，服用豌豆肽（混合肽）组（B组）和豌豆肽PP2组（D组）的实验小鼠外周血中IGFBP-3含量明显低于正常对照组（A组），而且也低于增肌蛋白粉组（C组）（图13）。

2.5样品提高骨骼肌线粒体中ATP酶活性

线粒体是合成ATP的主要场所，而ATP是机体运动所需能量，由ATP水解酶水解高能磷酸键可生成游离ATP，供给机体活动所需能量。从本实验结果来看，相比于对照组和增肌粉，服用豌豆肽（混合肽）组（B组）和豌豆肽PP2组（D组）能够显著性提高骨骼肌线粒体中ATP水解酶活性，而且ATP水解酶活性也高于增肌蛋白粉组（C组）（图14）。

2.6 样品激活IGF/IGF-1R信号通路

胰岛素（IGFs）信号通路在肌肉生长与损伤修复中发挥重要作用，为了考察样品对胰岛素信号通路的激活，采用western blot方法考察了胰岛素信号通路相关蛋白的表达情况，结果发现，与正常对照组（A组）比，豌豆肽PP2组（D组）IGF-1R的条带宽度和颜色明显比对照组得到的条带更深更宽（图15），说明与对照相比（未共孵育PP2)，加入PP2刺激后，C2C12细胞中IGF-1R的表达量显著增加。IGF-1R是IGF-1的受体，IGF-1与IGF-1R结合后，启动下游生长信号的激活，IGF-1R表达量增加，意味着生长信号激活程度更高，促进AMPK的磷酸化，然后诱导细胞周期相关蛋白cyclinD1与CDK6表达上调，最终导致细胞增殖发生。当同时给予豌豆肽PP2可以更好激活胰岛素信号通路。

实施例4

豌豆肽（实施例1制备的混合肽）的体外消化试验

首先，分别配制质量浓度为500 mg/L的豌豆肽水溶液和豌豆肽PP2水溶液，加入胃蛋白酶（20 mg/g），调节pH值至2.0，在37℃恒温水浴90 min。水浴结束后将pH值调整至7.5，加入胰酶（40 mg/g），在37℃恒温水浴150 min。水浴结束后放入95℃水浴5 min使酶失活。将样品冷冻干燥，利用HPLC进行分析，比较消化前后的液相色谱图变化情况。同时设置未经消化的豌豆肽和仅被胃蛋白酶消化而未经胰酶消化的豌豆肽。

豌豆肽未经消化样品、经胃蛋白酶消化后样品、经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化的样品进行高效液相进行分析，结果见图16~图18，三图重叠拟合结果见图19。比较不同组别的出峰时间、信号强度以及峰形，豌豆肽经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，与豌豆肽未经蛋白酶处理的液相色谱比较，其它处理组液相色谱图中未明显观察增加或减少色谱峰，且峰形和出峰时间没有显著变化，说明豌豆肽经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，基本保持了豌豆肽原有的成分和特性，具有很好的稳定性。

实施例5

按照实施例4的方法体外消化豌豆肽PP2。利用液质联用技术，对其进行检测，结果如20。PP2的分子量668.82，与图20中669.6（加了一个电荷，实际分子量为减一）一致，表明PP2组分不被胃蛋白酶和胰蛋白酶消化降解。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中食都庆（山东）生物技术有限公司

<120> 一种具有增肌作用的豌豆肽及其制备方法、药物和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Gly Ser Leu Leu Leu Pro His

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Leu Asp Leu Pro Val Leu

1 5

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Leu Leu Tyr Val Ile Arg

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Thr Asn Tyr Glu Glu Ile Glu Lys Val Leu Leu

1 5 10

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asn Thr Asn Tyr Glu Glu Ile Glu Lys Val Leu

1 5 10

Claims (9)

1.一种具有增肌作用的豌豆肽，其特征在于，包括以下一种或几种多肽：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的PP1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的PP2、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的PP3、氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的PP4和氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的PP5。

2.权利要求1所述豌豆肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将豌豆蛋白在碱性蛋白酶的作用下酶解，得到第一酶解液；

2）将所述第一酶解液在木瓜蛋白酶和纤维素酶共同作用下酶解，得到第二酶解液；

3）将所述第二酶解液灭酶后过3000Da陶瓷膜，得到的透过液过1KDa有机膜，收集有机膜膜透过液，得到豌豆肽；

4）将所述豌豆肽经凝胶色谱层析，收集12~18min的组分S2；

5）将所述组分S2经制备型液相色谱分离纯化，收集55~63min的组分W5；

6）将所述组分W5进行分析型液相色谱分离纯化，分别在14.444min、18.110min、20.906min、22.973min、24.462min收集到5个多肽片段，依次为PP1、PP2、PP3、PP4和PP5。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤4）中凝胶色谱层析的条件如下：

洗脱液为超纯水；洗脱时间2h；洗脱速度：2.5mL/min；色谱柱规格为600 mm×25 mm，种类为Sephadex G50色谱柱；检测波长：214nm。

4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤5）中制备型液相色谱分离纯化的条件如下：制备型液相色谱柱的规格550mm×40μm，粒度20μm，流速为15mL/min，流动相A为体积浓度0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为体积浓度0.1%三氟乙酸乙腈溶液；梯度洗脱，洗脱程序如下：

洗脱时间0~10min，流动相A的体积百分含量为100%~90%，流动相B的体积百分含量为0~10%；

洗脱时间10~20min，流动相A的体积百分含量为90%~50%，流动相B的体积百分含量为10%~50%；

洗脱时间20min~60min，流动相A的体积百分含量为50%~10%，流动相B的体积百分含量为50%~90%；

洗脱时间60min~65min，流动相A的体积百分含量为10%~95%，流动相B的体积百分含量为90%~5%；

洗脱时间65~100min，流动相A的体积百分含量为95%，流动相B的体积百分含量为5%。

5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤6）中分析型液相色谱分离纯化的条件为Gemini-NX 10μm C18 100A，4.6×250mm，流速为15mL/min，流动相A为体积浓度0.1%三氟乙酸的水溶液，流动相B为0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；流速1.0mL/min，进样量10μL，吸光度220nm；梯度洗脱，洗脱程序如下：

洗脱时间0~5min，流动相A的体积百分含量由95%下降至90%，流动相B的体积百分含量由5%上升至10%；

洗脱时间5min~55 min，流动相A的体积百分含量由90%下降至15%，流动相B的体积百分含量由10%上升至85%；

洗脱时间55min~60min，流动相A的体积百分含量由15%上升至95%，流动相B的体积百分含量为85%下降至5%。

6.权利要求1所述豌豆肽或权利要求2~5任意一项所述制备方法制备得到的豌豆肽在制备预防和/或治疗少肌症的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述药物具有促进成肌细胞增殖、激活成肌细胞中生长和增殖信号通路、提高雄性机体睾酮水平、提高骨骼肌再生调控因子表达、提高骨骼肌线粒体中ATP酶活性和激活胰岛素信号通路的药效。

8.一种预防和/或治疗少肌症的药物，其特征在于，活性成分包括权利要求1所述豌豆肽或权利要求2~5任意一项所述制备方法制备得到的豌豆肽。

9.根据权利要求8所述药物，其特征在于，所述药物的剂型为口服剂。

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