CN117402215B - 抑制α-葡萄糖苷酶活性的玉米肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了抑制α‑葡萄糖苷酶活性的玉米肽及其制备方法与应用，属于活性肽制备技术领域。本发明首次从玉米蛋白水解物中分离鉴定获得了一种氨基酸序列为AVSVNIS的玉米肽，本发明提供的玉米肽具有抑制α‑葡萄糖苷酶活性的作用，可以用于制备具备抑制α‑葡萄糖苷酶活性功能的食品或药品，为糖尿病的预防及治疗提供新的思路。
Description
技术领域
本发明属于活性肽制备技术领域，尤其涉及抑制α-葡萄糖苷酶活性的玉米肽及其制备方法与应用。
背景技术
α-葡萄糖苷酶抑制剂(α-glucosidase inhibitor, AGI)：α-葡萄糖苷酶是生物体内一种负责分解复杂碳水化合物的酶，它特异性水解α-吡喃葡萄糖苷键以释放葡萄糖，并在碳水化合物代谢和糖蛋白加工中起关键作用。AGI通过抑制小肠上段刷状缘处的膜与α-葡糖苷酶的结合来阻断碳水化合物的分解，从而延迟葡萄糖的产成和吸收，从而降低餐后血糖并减少高血糖氧化应激对胰腺等脏器的刺激，保护胰腺功能，达到预防和治疗糖尿病的功效。
目前，临床上广泛使用α-葡萄糖苷酶抑制剂降低餐后高血糖，使用效果最好的有阿卡波糖和米格列醇，是2型糖尿病的首选药和1型糖尿病膜岛素治疗的辅助药物。但是，两种药物均会引起患者胃肠不适。因此，在食物或药用植物中发现更高效和安全的α-葡萄糖苷酶抑制剂是2型糖尿病干预研究的热点。报道显示，多种天然α-葡萄糖苷酶抑制剂己经从植物中分离获得，分别为黄酮、生物碱、萜类、酚类、多糖类和多肽类化合物等等。
玉米蛋白粉（corn gluten meal，CGM）是玉米湿法生产淀粉中产量最大、蛋白质含量最高的副产物（约占60%），但是因其溶解性差和疏水性强的特性限制了其在食品行业中的应用，导致大多玉米蛋白粉均直接作为饲料使用，造成了其粮食资源的极大浪费。因此，倘若能够对玉米蛋白进行改性，开发具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的功能食品，提高其附加值，对玉米蛋白的精深加工具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的玉米肽及其制备方法与应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的玉米肽，所述玉米肽的氨基酸序列为AVSVNIS（SEQ ID NO.1）。
本发明还提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂的活性成分包括上述的玉米肽。在本发明中，所述抑制剂优选的以上述玉米肽（AVSVNIS）作为唯一活性成分。
本发明还提供了一种降血糖产品，所述降血糖产品包括上述的玉米肽或上述的α-葡萄糖苷酶抑制剂。
本发明还提供了一种上述玉米肽的制备方法，包括如下步骤：采用风味蛋白酶和碱性蛋白酶酶解玉米蛋白粉，得酶解液；收集酶解液中分子量小于1kDa的组分，进行离子交换色谱分离，测定各峰收集液抑制α-葡萄糖苷酶的活性，收集抑制α-葡萄糖苷酶活性最高的组分，进行高效液相色谱分离，测定各峰收集液抑制α-葡萄糖苷酶的活性，收集抑制α-葡萄糖苷酶活性最高的组分，进行质谱测序经过数据库检索，化学合成即得上述的玉米肽。
在本发明中，所述玉米蛋白粉优选的为经挤压膨化并去除淀粉的玉米蛋白粉，所述玉米蛋白粉可以充分的去掉与蛋白质紧密结合的淀粉物质，有利于蛋白质的酶解。在本发明中，优选的先用风味蛋白酶对玉米蛋白粉进行酶解，所述风味蛋白酶的用量以蛋白重量计，优选为每克蛋白添加1650 U风味蛋白酶，所述风味蛋白酶的酶解温度优选为50 ℃，酶解的时间优选为240 min，pH优选为6.5。风味蛋白酶酶解结束后，再采用碱性蛋白酶进行酶解，所述碱性蛋白酶的用量以蛋白重量计，优选为每克蛋白添加4000 U碱性蛋白酶，所述碱性蛋白酶的酶解温度优选为50 ℃，酶解的时间优选为120 min，pH优选为8.5。
在本发明中，所述离子交换色谱分离的色谱柱优选为强阴离子交换色谱QSepharose Fast Flow，洗脱液A优选的为：pH9.0的20 mM的Tris-HCl缓冲液，洗脱液B优选的为：含0.4 mol/L NaCl的pH9.0的20 mM的Tris-HC1级冲液；柱型优选的为：φ（直径）1.6×30 cm；检测波长优选的214 nm；上样量优选的为50 mL，流速优选的为2 mL/min，梯洗体积优选的为120 mL，峰组分收集的体积优选为6mL/管。
在本发明中，所述高效液相系色谱分离包括两步，第一步优选为使用半高效液相制备色谱柱，型号为XSelect CSH C18 OBD Prep Column，130Å (φ10×250 mm,10 μm)；第二步优选为使用分析柱高效液相换色谱，型号为XSelect Peptide CSH C18 Column，130Å，(φ4.6×150 mm,3.5 um)。
本发明还提供了一种上述的玉米肽或上述的制备方法在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性产品中的应用。在本发明中，所述产品优选的包括药物。
本发明的有益效果：
本发明首次从玉米蛋白水解物中分离鉴定获得了一种氨基酸序列为AVSVNIS的玉米肽，本发明提供的玉米肽具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，可以用于制备具备抑制α-葡萄糖苷酶活性功能的药品，为糖尿病的预防及治疗提供新的思路。
附图说明
图1为本发明试验的流程图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的玉米肽，具体制备方法如下：
1、玉米蛋白酶解液的制备
取经挤压膨化并去除淀粉的玉米蛋白粉（购自齐齐哈尔龙江阜丰生物科技有限公司），加水配制成底物浓度为10%（w/v）的悬浊液，然后用风味蛋白酶进行酶解，酶解条件为：加酶量1650 U/g蛋白（以玉米蛋白粉中的蛋白重量计为每克蛋白添加1650 U），酶解温度50℃，酶解时间240min，酶解pH 6.5，风味蛋白酶酶解结束，调节pH至7.0，加入碱性蛋白酶，加酶量4000 U/g蛋白（以玉米蛋白粉中的蛋白重量计为每克蛋白添加4000 U），酶解温度50℃，酶解时间120min，酶解结束后100 ℃加热灭酶10min，酶解物在4000 r/min离心10 min并弃去沉淀，所得上清液为玉米蛋白酶解液。
2、玉米蛋白酶解液的超滤分级
采用截留分子量为8 kDa、1 kDa超滤膜超滤。用8 kDa膜包与超滤系统连接，将酶解液通过系统，将分子量小于8 kDa组分透过膜包，并收集。用1 kDa膜包与超滤系统连接，将分子量小于8 kDa组分通过系统，将分子量小于1 kDa组分透过膜包，并收集。超滤压力为0.1 MPa，温度为室温。将收集的大于8kDa、在1kDa和8kDa之间的、小于1kDa的三种组分进行抑制α-葡萄糖苷酶活性测定：
取缓冲液(67 mmol/L，pH6.8)3.0 mL，待测样本(50 mg/mL)100 μL，对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG）底物溶液(0.01 mol/L)100 μL。37 ℃保温5 min后，添加α-葡萄糖苷酶溶液(0.4 mg/mL)200 μL，于37 ℃条件下恒温水浴反应60 min后加入质量分数为4%Na2CO3溶液(0.2 mol/L)5 mL终止反应，405 nm处确定吸光值(A1)，重复3次，取平均值。空白组(A0)用缓冲液代替待测样本溶液和酶溶液，A2是用等体积缓冲溶液替代酶液时的吸光度值，A3是用缓冲液替代待测样本溶液时的吸光度值。待测样品按下式计算α-葡萄糖苷酶活抑制率：
式中：A1待测样本组吸光度是在添加样品和酶时确定的；A2用同等体积缓冲溶液替代酶液时的吸光度值；A3将样品替换为等体积缓冲液时的吸光度值；A0为空白组吸光度值。
结果显示，超滤分级所得分子量小于1 kDa的组分抑制α-葡萄糖苷酶活性最高。
3、离子交换色谱分离
将超滤分级所得抑制α-葡萄糖苷酶活性最高的组分（分子量小于1 kDa）过0.22μm的微孔滤膜，所得样品蛋白浓度为5.242 mg/mL，使用强阴离子交换剂为强阴离子交换色谱Q Sepharose Fast Flow，洗脱液A：pH9.0的20 mM的Tris-HCl缓冲液，洗脱液B：含0.4 mol/L NaCl的pH9.0的20 mM的Tris-HC1级冲液；柱型：φ1.6×30 cm；检测波长214 nm；上样量50 mL，流速为2 mL/min，梯洗体积120 mL，峰组分收集的体积为6mL/管。测定各管收集液的抑制α-葡萄糖苷酶的活性（具体测定方法同步骤2），收集抑制α-葡萄糖苷酶活性最高的组分用于半制备高效液相色谱分离。
4、高效液相色谱分离
4.1 半制备高效液相色谱分离
步骤3中分离得到的高活性组分使用半制备高效液相换色谱进一步分离。将上一步透析脱盐所得活性组分溶于99.5 μL的2%乙腈水溶液中，用0.22 um微孔滤膜过滤，所述色谱柱的型号为XSelect CSH C18 OBD Prep Column，130Å (φ10×250 mm，10 um)，上样量为99.5 uL，流速为1.5 mL/min，检测波长为214 nm，流动相A为含0.065%三氟乙酸（TFA）的2%乙腈水溶液，流动相B为含0.05%TFA的65%乙腈水溶液，洗脱策略如表1；测定各峰收集液的抑制α-葡萄糖苷酶的活性（具体测定方法同步骤2），收集抑制α-葡萄糖苷酶活性最高的组分备用。
表1 XSelect CSH C18柱的梯度洗脱策略
| 时间/min | A/% | B/% |
| 0 | 100 | 0 |
| 6 | 90 | 10 |
| 45 | 60 | 40 |
| 60 | 0 | 100 |
| 62.5 | 100 | 0 |
| 65 | 0 | 100 |
4.2 半制备高效液相色谱分离
步骤4.1中分离得到的高活性组分使用分析柱高效液相换色谱进一步分离。将上一步所得活性组分溶于99.5 μL的2%乙腈水溶液中，用0.22 um微孔滤膜过滤，所述色谱柱的型号为XSelect Peptide CSH C18 Column，130Å，(φ4.6×150 mm,3.5 um)，上样量为20μL，流速为1 mL/min，检测波长为214 nm，流动相A为含0.065% TFA的2%乙腈水溶液，流动相B为含0.05% TFA的100%乙腈，洗脱策略如表2；测定各峰收集液的抑制α-葡萄糖苷酶的活性（具体测定方法同步骤2），收集抑制α-葡萄糖苷酶活性最高的组分备用。
表2 XSelect Peptide CSH C18柱的梯度洗脱策略
| 时间/min | A/% | B/% |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 85 | 15 |
| 35 | 30 | 70 |
| 45 | 10 | 90 |
| 55 | 100 | 0 |
5、LC-MS/MS质谱测序
将步骤4.2中得到的组分脱盐冻干后进行质谱测序，经过数据库检索得到氨基酸序列为AVSVNIS的玉米肽。
实施例2
实施例1所得玉米肽抑制α-葡萄糖苷酶活性的测定
将实施例1步骤5得到的玉米肽化学合成后（委托上海强耀生物科技有限公司合成），测定其抑制α-葡萄糖苷酶的活性。
α-葡萄糖苷酶活性测定采用的方法，取缓冲液(67 mmol/L，pH6.8)3.0 mL，抑制剂（实施例1所得玉米肽）(50 mg/mL)100 μL，PNPG底物溶液(0.01 mol/L)100 μL。37℃保温5min后，添加α-葡萄糖苷酶溶液(0.4 mg/mL)200 μL，于37℃条件下恒温水浴反应60 min后加入质量分数为4% Na2CO3溶液(0.2 mol/L)5 mL终止反应，405 nm处确定吸光值(A1)，重复3次，取平均值。空白组(A0)用缓冲液代替待抑制剂溶液和酶溶液，A2是用等体积缓冲溶液替代酶液时的吸光度值，A3是用缓冲液替代抑制剂溶液时的吸光度值。抑制剂（实施例1所得玉米肽）按下式计算α-葡萄糖苷酶活抑制率：
式中：A1抑制组吸光度是在添加抑制剂和酶时确定的；A2用同等体积缓冲溶液替代酶液时的吸光度值；A3将抑制剂替换为等体积缓冲液时的吸光度值；A0为空白组吸光度值。
结果为：当玉米肽（AVSVNIS）的浓度为0.832 mg/mL时，其抑制α-葡萄糖苷酶活性为50%。
实施例1和实施例2整体试验的流程图如图1所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的玉米肽，其特征在于，所述玉米肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的活性成分包括权利要求1所述的玉米肽。
3.一种降血糖产品，其特征在于，所述降血糖产品包括权利要求1所述的玉米肽或权利要求2所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂。
4.权利要求1所述的玉米肽在制备降血糖产品中的应用。
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