KR101337311B1 - 투석 여과 방법 - Google Patents

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KR101337311B1
KR101337311B1 KR1020077017130A KR20077017130A KR101337311B1 KR 101337311 B1 KR101337311 B1 KR 101337311B1 KR 1020077017130 A KR1020077017130 A KR 1020077017130A KR 20077017130 A KR20077017130 A KR 20077017130A KR 101337311 B1 KR101337311 B1 KR 101337311B1
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제임스 피어스
엔다 모란
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화이자 아일랜드 파마슈티칼즈
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Abstract

투석 여과 동안 완충액을 수거 스트림에 첨가하면 혼탁도를 증가시키고, 생성물 회수 제한을 포함하는 기타 바람직하지 않은 효과를 제공할 수 있다. 본 발명은 투석 여과를 개선시키기 위해 비이온성 계면활성제를 사용하는 것과 관련된 방법 및 조성물에 관한 것이다.
투석 여과, 비이온성 계면활성제, 혼탁도, 보유액, 폴리비닐 알코올

Description

투석 여과 방법{Method for diafiltration}
본 출원은 세포 배양 수거 미세여과 분야에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 이의 전체 내용이 본 명세서 내에서 참조문헌으로 인용되는 2005년 1월 25일자로 출원된 미국 가특허원 제60/647,184호를 우선권으로 주장한다.
투석 여과(diafiltration)는 작동 모드에 따라 완충액 교환 및 생성물 회수를 위해 생물공학적 적용에 사용된다. 투석 여과에서, 완충액은 여액을 시스템으로부터 제거하면서 재순환 또는 보유액 탱크로 도입된다. 투석 여과는 생성물인 보유액을 세척하는 방법으로서 사용되거나 수거를 위해 여과 시스템을 통해 생성물을 세척하기 위해 사용될 수 있다. 투석 여과를 사용하는 미세여과 수거 공정의 목적은 공정 스트림으로부터 생성물의 회수를 최대화하는 것이다.
요약
본 발명은 비이온성 계면활성제, 예를 들면, 플루로닉(Pluronic
Figure 112011005619647-pct00001
) F68, 폴리에틸렌 글리콜 또는 기타 비이온성 블럭 공중합체 계면활성제를 미세여과 공정[예: 접선 유동 여과(tangential flow filtration; TFF)]의 일부로서 투석 여과 단계에 사용된 완충액에 첨가하면 공정 유체의 혼탁도를 감소시킬 수 있다는 발견에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 투석 여과 방법을 포함한다. 본 발명의 방법은 투석 여과용 보유액을 제공하는 단계 및 비이온성 계면활성제를 상기 보유액에 첨가하는 단계를 포함한다. 비이온성 계면활성제는, 예를 들면, 플루로닉(Pluronic
Figure 112011005619647-pct00002
) F68 또는 폴리비닐 알코올(PVA)일 수 있다. 몇몇 양태에서, 비이온성 계면활성제는 완충액, 예를 들면, 인산염 완충된 염수(PBS) 중에 존재한다. 완충액 중의 비이온성 계면활성제의 농도는 0.2 내지 4g/ℓ, 0.2 내지 3g/ℓ, 0.5 내지 2.5g/ℓ, 0.5 내지 2g/ℓ, 및 0.5 내지 1.5g/ℓ일 수 있다. 몇몇 양태에서, 완충액 중의 비이온성 계면활성제의 농도는 약 1g/ℓ 또는 2.5g/ℓ이다. 특정 양태에서, 보유액은 세포 및 배양 배지를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 투석 여과로부터의 여액의 혼탁도는 비이온성 계면활성제의 부재하에 수행되는 투석 여과와 비교하여 감소된다. 다른 양태에서, 비이온성 계면활성제의 존재하에 보유액으로부터의 생성물의 회수는 비이온성 계면활성제의 부재하에 생성물의 회수와 비교하여 증가한다. 다른 양태에서, 보유액은 약제학적 생성물, 예를 들면, 재조합 단백질, 재조합 펩타이드, 또는 천연 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 몇몇 경우에서, 보유액은 보유액 중의 세포에 등장성인 완충액, 예를 들면, PBS를 포함한다. 다른 양태에서, 투석 여과는 약 20 내지 25℃, 2 내지 37℃, 또는 2 내지 25℃의 온도에서 수행된다. 투석 여과는, 예를 들면, 불연속 투석 여과 또는 일정 용적 투석 여과일 수 있다. 특정 경우에서, 비이온성 계면활성제의 농도는 투석 여과 동안 사실상 변하지 않는다. 비이온성 계면활성제는 세포 배양 배지 중에 존재할 수 있다.
또한, 본 발명은 방법, 예를 들면, 본원에 기술된 투석 여과를 사용하여 제조된 생성물에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 약 1g/ℓ의 비이온성 계면활성제[예: 플루로닉(Pluronic
Figure 112007053906442-pct00003
) F68 또는 PVA] 농도를 유지시킴을 포함하는, 투석 여과 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 비이온성 계면활성제 약 1g/ℓ[예: 플루로닉(Pluronic
Figure 112007053906442-pct00004
) F68] 또는 2.5g/ℓ(예: PVA)를 포함하는 투석 여과용 조성물에 관한 것이다. 또한, 조성물은 등장성 완충액, 예를 들면, PBS를 포함할 수 있다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 방법 및 재료와 동일하거나 유사한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으나, 적합한 방법 및 재료는 이하 기술된다. 본원에서 언급된 모든 공보, 특허원, 특허 및 기타 참조문헌은 이의 전체 내용이 참조문헌으로 인용된다. 또한, 재료, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며 이로 한정하고자 하는 것은 아니다.
발명의 기타 특징 및 이점은 상세한 설명, 도면 및 특허청구범위로부터 명백할 것이다.
단백질 공학에서, TFF는 공급액 스트림 중의 기타 성분으로부터 완전한 세포 및 파쇄물을 분리하기 위한 회수 공정의 일부로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 배양된 세포를 사용하는 제조 공정은 농축 및 투석 여과를 포함하는 수거 미세여과 ( harvest microfiltration) 단계를 사용할 수 있다. 이러한 공정은, 예를 들면, TFF를 사용하여 생산 세포주로부터 재조합 단백질과 같은 생성물을 함유하는 세포 배양 유체를 분리한다. 초기 수거 미세여과(농축)에 이어, 일반적으로 초기 여과 전 보다 고밀도로 세포를 함유하는 보유액을 여과 시스템을 통해 재순환시키고, 투석 여과하여 수거 미세여과 시스템에 보유된 추가의 생성물을 회수한다(투석 여과). 이러한 투석 여과 단계에서, 등장성 완충액(예: PBS)을 일반적으로 보유액에 첨가한다. 이러한 투석 여과는 완충액 첨가에 대하여 불연속 또는 일정 용적 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
일반적으로, 용어 "공정 스트림"은 공급액 스트림, 투과액 스트림 및 보유액 스트림, 즉 세포 배양물의 생성물을 함유하는 공정 중의 이동성 액체를 나타낸다. 여액은 필터를 통과한 임의의 물질, 즉 투과액 스트림이다. "보유액 (retentate)"은 필터를 통과하지 않으나, 여과 장치와 접촉하여 저장기로 반송되는 물질을 나타낸다. "공급액 스트림"은 저장기에 잔류하고, 펌프를 통과하여 필터에 공급되는 물질을 나타낸다.
상기 기술된 절차와 같은 절차의 목적은 세포 배양물 또는 보유액으로부터 회수된 생성물, 예를 들면, 분비된 단백질 또는 펩타이드 생성물의 양을 최대로 하면서, 동시에 세포 배양물 및 공정 스트림 중의 원치 않는 물질의 양을 최소로 하는 것이다. 세포 배양물 또는 보유액 중의 혼탁도 부하의 증가는 일반적으로 투과액의 혼탁도 증가와 관련된다. 원치 않는 물질은, 예를 들면, 세포내 미립자 및 잔해를 포함할 수 있다. 일반적으로, 혼탁도는 공정 스트림 중의 원치 않는 물질의 부하 척도로서 사용된다. 세포가 현탁된 용액, 예를 들면, 배양 배지 또는 완충액 또는 이들 둘 다의 혼합물 중의 과도한 혼탁도는 바람직하지 않으며, 이는 혼탁도가 필터 블라인딩, (예를 들면, 기공 막힘을 통해) 정화 트레인에서 막힘을 초래하는 상태를 나타내고 세포 효소의 방출의 개재를 포함하는, 생성물 특성에 유해할 수 있기 때문이다. 수거되는 배양물 중의 (예를 들면, 전단에 의한) 세포의 파괴는 공정 스트림의 혼탁도를 증가시킬 수 있다. 본원에서 보고한 바와 같이, 완충액이 등장성이더라도, 완충액을 투석 여과 동안 보유액에 첨가하면 혼탁도가 증가할 수 있다는 것을 관찰하였다. 본 발명은 비이온성 계면활성제[예: 비이온성 블럭 공중합체 계면활성제, 예를 들면, 플루로닉(Pluronic
Figure 112011005619647-pct00005
) F68 또는 폴리비닐 알코올(PVA)]를 포함하는 완충액(예: PBS)을 첨가하면 보유액에 완충액 만을 첨가한 경우와 비교하여, 보유액 및 투과액 스트림에서 혼탁도의 양이 감소된다는 발견에 관한 것이다. 일반적으로, 보유액에 첨가한 완충액 또는 기타 용액 중의 비이온성 계면활성제의 존재하에 보유액의 혼탁도는 계면활성제의 부재하에서 보다 더 낮다. 또한, 여액의 혼탁도는 전형적으로 감소한다. 통상적으로, 비이온성 계면활성제는 플루로닉(Pluronic
Figure 112011005619647-pct00006
) F68 또는 PVA이다. 사용할 수 있는 기타 비이온성 계면활성제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 예를 들면, 분자량이 약 1000 이상인 PEG를 포함한다. 이온성 특성이 있으나, 전단 보호제로서 작용할 수 있는 특정 화합물, 예를 들면, 덱스트란을 사용할 수 있다. 본원에 기술된 방법에 사용되는 덱스트란의 예시적인 농도는 10g/ℓ 이상이다. 기타 적합한 화합물은 본원에 기술된 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 본원에 기술된 방법에 사용되는 비이온성 계면활성제 또는 기타 전단 보호제의 농도는 일반적으로 0.2 내지 3g/ℓ, 0.2 내지 4g/ℓ, 0.5 내지 2g/ℓ, 0.5 내지 2.5g/ℓ, 0.5 내지 1.5g/ℓ, 또는 약 1g/ℓ이다. 몇몇 경우에서, 비이온성 계면활성제 또는 기타 전단 보호제의 농도는 1g/ℓ 이상 또는 1.5g/ℓ 이상이다. 최대양은 몇몇 경우에서, 2g/ℓ 이하, 5g/ℓ 이하, 또는 10g/ℓ 이하일 수 있다.
몇몇 경우에서, 완충액, 예를 들면, 등장성 완충액, 예를 들면, PBS를 보유액에 첨가하여 TFF를 개시한다. 완충액은 일반적으로 비이온성 계면활성제, 예를 들면, 플루로닉(Pluronic
Figure 112007053906442-pct00007
) F68을 포함한다.
본원에 기술된 방법의 적용예에서, 생산 세포주로부터 재조합 단백질을 함유하는 세포 배양 유체를 분리하기 위해 수거 미세여과 단계를 사용하는 시판되는 재조합 단백질 약물 물질 제조 공정을 사용한다. 수거 시스템은 0.65㎛ 미세여과(MF) 막 모듈을 포함하는 프로스택(Prostak) 접선 유동 여과(TFF) 단위(제조원: Millipore, Billerica, MA)이다. 전(全) 세포 배양 유체(세포-함유)를 TFF 시스템의 보유액측 상에서 일련의 프로스택 모듈을 통해 재순환시키고, 수거 탱크로 다시 보낸다. 세포-비함유 배양 유체는 다른 0.65㎛ 프로스택 필터 모듈 막측으로 투과되어 추가의 공정을 위해 수거된다.
전 세포 배양 유체를 초기 TFF 공정에 의해 10배로 농축한다. 여과 트레인의 보유액측 상에서 생성된 유체를 본원에서 보유액이라 한다. 세포 농축에 이어, 완충액 투석 여과 단계를 미세여과의 최종 보유액 용적의 1.8배로 수행하여 수거 미세여과 및 정화 시스템 중에서 보유된 생성물 수율을 증가시킨다.
수거 계획에 사용된 투석 여과 완충액은 PBS이다. 기타 등장성 용액, 예를 들면, 완충액, 예를 들면, 트리스 완충된 염수 또는 성장 배지를 본원에 기술된 방법에 사용할 수 있다. 비이온성 용액을 또한 사용할 수 있다. PBS는 등장성이고, 세포 생존능에 유해한 효과를 가질거라 예측되지 않는다. 그러나, 원치 않는 혼탁도 수준은 완충액을 보유액에 첨가한 후 관찰되었다. 수거 투석 여과 완충액에 1g/ℓ의 농도로 플루로닉(Pluronic
Figure 112007053906442-pct00008
) F68 또는 2.5g/ℓ의 농도로 PVA를 첨가하면 수거 공정 스트림에서 혼탁도 부하를 감소시킬 수 있다.
특정 이론에 결부시키지 않으면서, 비이온성 계면활성제가 본원에 기술된 회수 공정에 사용되는 경우 관찰된 감소된 혼탁도 부하는 적어도 부분적으로는 전단 보호제로서 비이온성 계면활성제를 사용한 수거 동안 감소된 전단-유도 세포 파괴 때문일 수 있다.
비이온성 계면활성제, 예를 들면, 플루로닉(Pluronic
Figure 112011005619647-pct00009
) F68 또는 PVA를 투석 여과 동안 완충액에 첨가하면 1) 예를 들면, 수거 동안 생산 세포주로부터 방출된 프로테아제의 보다 적은 수준의 결과로서 수거 보유 풀 (pool)에서 생성물 안정성 증진, 2) 하류처리 전에 공정 스트림 중의 세포-유도 불순물 부하 감소, 및 3) 수거 필터 트레인에 표면적 요구 감소와 같은 이점이 있다.
유용한 비이온성 계면활성제를 확인하는 방법
비이온성 계면활성제를, 예를 들면, 본원에 기술된 방법을 사용하여 수거 스트림에서 원치 않는 물질(예: 세포 잔해)의 양을 감소시킴으로써 보유액의 특질을 개선시키는 이들의 능력에 대하여 시험할 수 있다. 특질은 또한, 예를 들면, 비이온성 계면활성제의 사용의 존재 및 부재하에 회수된 생성물의 양 또는 생성물의 순도에 대하여 여액을 분석함으로써 측정할 수 있다. 일반적으로, 비이온성 계면활성제는 보유액이 보유액 중에 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 50%, 80%(v/v) 또는 그 이상의 완충액을 함유하도록 투석 여과 동안 첨가된 완충액 중에 포함된다. 보유액에서 원치 않는 물질의 양을 분석하고, 비이온성 계면활성제를 첨가하지 않은 동일한 완충액을 사용하여 투석 여과된 보유액 중의 원치 않는 물질의 양과 비교한다. 완충액과 함께 첨가된 비이온성 계면활성제는 세포 배양 배지 중에 존재하는 비이온성 계면활성제와 동일하거나 상이할 수 있다. 일반적으로, 비이온성 계면활성제는 세포 배양 배지 중의 비이온성 계면활성제와 동일하고, 완충액 중의 계면활성제의 농도는 세포 배양 배지 중의 농도와 동일하다. 각종 농도의 비이온성 계면활성제를 분석하여 보유액 중의 원치 않는 물질의 양을 최소화하고 생성물 회수를 최대화시키는데 바람직한 농도를 결정할 수 있다. 몇몇 경우에서, 여액의 혼탁도를 보유액 분석에 더하여 또는 보유액 분석 대신 분석한다.
몇몇 양태에서, 보유액의 혼탁도를 완충액 또는 비이온성 계면활성제를 함유하는 완충액을 보유액으로 투석 여과한 후 시험한다. 혼탁도는 세포내 미립자 및 세포 잔해의 척도를 제공한다. 일반적으로, 보다 적은 혼탁도는 보유액의 보다 바람직한 특질과 관련된다. 혼탁도는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 분석할 수 있다. 예를 들면, 혼탁분석 방법 (nephelometric method) (참조: Baker et al., Trends Biotechnol. 2002 Apr; 20(4): 149-56) 또는 광학 밀도를 사용할 수 있다. 광학 밀도는 일반적으로는 흡광도를 측정하여 분석한다: 550 내지 650nm. 비이온성 계면활성제의 존재하에 감소된 혼탁도는 비이온성 계면활성제가 TFF에서 보유액의 특질을 증가시킴을 나타낸다. 몇몇 경우에서, 각종 농도의 비이온성 계면활성제를 특정 공정에서 바람직한 농도를 결정하기 위해 시험한다.
보유액의 특질 분석 또는 세포 잔해의 존재에 대한 시험에 사용되는 당해 분야에 공지된 다른 방법을 사용하여 완충액을 함유하는 보유액의 특질을 개선시키는 비이온성 계면활성제의 능력을 분석할 수 있다. 예를 들면, 보유액 및/또는 투과액 중의 세포간 락테이트 데하이드로게나제(LDH)에 대한 시험을 세포 용해 검출 방법으로서 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 다른 방법은 완충액을 첨가한 보유액 중의 세포의 수를 측정하는 것을 포함한다. 일반적으로, 보유액 중의 세포의 수는 비이온성 계면활성제를 함유하는 완충액의 존재 및 완충액 만의 존재하에 분석한다. 유용한 완충액 조성은 세포의 총수가 비이온성 계면활성제를 함유하는 완충액을 사용하여 투석 여과하는 경우, 투석 여과 개시와 비교하여 투석 여과 종료시에 보유액 중에 일정하게 유지되는 것이다. 유용한 조성, 즉 완충액 + 비이온성 계면활성제는 또한 투석 여과후 보유액 중의 세포의 총수가 완충액 만을 사용하는 투석 여과 후 보유액 중의 세포의 수보다 더 많은, 완충액 조성을 포함한다.
투석 여과 공정의 온도는 또한 보유액으로부터 생성물의 회수를 개선시키거나, 혼탁도를 감소시키거나, 필터 블라인딩을 감소시키거나, 완충액을 함유하는 보유액의 기타 원치 않는 특질을 감소시키도록 조절할 수 있다. 일반적으로, 투석 여과는, 예를 들면, 약 20 내지 25℃, 2 내지 37℃, 또는 2 내지 25℃의 온도에서 수행한다.
본원에 기술된 방법을 사용하여 회수할 수 있는 생성물의 비제한적인 예는 단백질 및 펩타이드, 예를 들면, 항체, 항체 단편, 재조합 단백질, 자연 분비 단백질, 분비되도록 개량된 단백질 및 펩타이드, 및 세포에 의해 생성되는 비-단백질 생성물을 포함한다.
본 발명은 다음 실시예에 의해 추가로 예시된다. 실시예는 예시 목적으로만 제공된다. 이들은 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위 또는 내용을 제한하지 않는다.
실시예 1: 수거 미세여과의 개발
상기 기술한 수거 및 정화 공정을 재조합 단백질을 생성하는 세포를 사용하여 시험하였다. 미세여과 단계의 세포 농축 단계 동안, 세포를 세포 배양 배지 중에서 전단 보호제, 예를 들면, PVA(제조원: Celvol, Celanese Chemicals, Dallas, Texas) 또는 플루로닉(Pluronic
Figure 112011005619647-pct00010
) F68(제조원: BASF Ludwigshafen, Germany)의 존재하에 재순환시켰다. 투과액(여액)의 혼탁도는 이들 조건하에 낮게 유지되고, 보유액은 세포량 증가에 비례하여 증가한다. 혼탁분석 방법을 사용하여 측정된 혼탁도를 사용하여 공정 스트림에서 세포내 미립자 및 잔해 부하를 정량화하였다. 보유액에 PBS 투석 여과 완충액(비이온성 계면활성제를 첨가하지 않음)을 첨가하면 보유액 및 투과액의 혼탁도를 증가시킬 수 있다.
투과액 스트림 중의 과도한 혼탁도는 기공 막힘 및 기타 메카니즘을 통해 정화 트레인에서 필터 블라인딩/막힘을 야기할 수 있으므로 바람직하지 않다. PBS 완충액 만을 첨가하는 경우, 완충액이 첨가될 때 희석에 의해 효과적으로 전단 보호제의 농도를 감소시킬 수 있다. 따라서, 세포주를 전단 보호제의 부재하에 증가된 전단 수준에 노출시킨다. 수거 시스템에서 전단 메카니즘을 통한 세포의 파괴는 공정 스트림 혼탁도를 증가시킬 수 있다.
투석 여과 완충액에 전단 보호제로서 작용할 수 있는 비이온성 계면활성제[예: PVA 또는 플루로닉(Pluronic
Figure 112011005619647-pct00011
) F68)]를 첨가한 효과는 표 1에 예시하였다. 이들 연구는 투석 여과 종료시에 최종 보유액 혼탁도가 8 내지 33 NTU/106개의 세포이고, 투과액에서 2.6 내지 4.1 NTU/106개의 세포임을 보여준다. 전단 보호제를 투석 여과 완충액에 첨가한 수거물은 혼탁도가 보유액에서 9.7 내지 10.1 NTU/106개의 세포이고, 투과액에서 0.7 내지 2.4 NTU/106개의 세포이다. 따라서, 투석 여과 동안 비이온성 계면활성제의 존재 및 보유액 혼탁도의 감소 사이에는 상관 관계가 있다. 투과액 혼탁도도 또한 감소한다.
세포 수, 보유액 회전 (spun) 혼탁도[1000rpm, 5분(약 201 x g)], 및 미세여과 투석 여과 개시시 및 종료시의 투과액 혼탁도. 회전 혼탁도는 세포를 공정 샘플로부터 원심분리한 후 상청액 혼탁도의 척도이다.
배취 투석 여과 개시 투석 여과 종료 비율
NTU/106개
의 세포
보유액		 비율
NTU/106개
의 세포
투과액		 완충액
세포 수 보유액
회전
혼탁도		 투과액
혼탁도		 보유액
회전
혼탁도		 투과액
혼탁도
x 106 개시 개시 종료 종료
SFP-150-004 R2 58.9 371 9.82 1160 151 19.7 2.6 PBS
SFP-150-004 R1 55.4 918 14 1836 157 33.1 2.8 PBS
SFP-150-005 R2 92.1 569 9.05 739 377 8.0 4.1 PBS
SFP-150-006 R2 86.6 493 6.73 874 155 10.1 1.8 PBS + PVA
SFP-150-006 R1 120.0 546 6.47 814 286 6.8 2.4 PBS + 플루로닉
SFP-150-007 R2 82.6 381 6.33 802 58.8 9.7 0.7 PBS + 플루로닉
실시예 2: 벤취 스케일 모델(Bench-scale model)
수거 투석 여과 완충액으로 전단 보호제를 혼입시키는 효과를 시험하기 위해 벤취 스케일 모델을 사용하여 연구를 수행하였다. 당해 모델은 세포를 미세여과 접선 유동 여과(microfiltration tangential flow filtration: MFTFF) 장치를 통해 펌핑한 다음 저장기로 반송시키는 세포 저장기로 이루어진다. 상청액을 MFTFF 장치로부터 제거하면서, 투석 여과 완충액을 저장기에 첨가하여, 일정 용적 투석 여과를 실시하는 것이 가능해지도록 하였다. 각각의 조사에 대하여, 완충액 그 자체만 상이한 동일한 생반응기 및 동일한 시험 조건으로부터의 세포를 사용하였다. 완충액은 PBS 또는 전단 보호제 폴리비닐 알코올(PVA)을 2.5g/ℓ의 농도로 함유하는 PBS이다. 혼탁도를 혼탁분석 방법을 사용하여 분석하였다.
일반적으로, 투과액에서 혼탁도는 투석 여과 완충액 중의 PVA의 포함에 의해 감소하였다. 이는 투석 여과 전 출발 세포 농도에 대하여 표준화된 투과액 스트림 혼탁도의 측정에 의해 나타난다(표 2, 시험 1 및 2). 제3 시험(표 2, 시험 3)은 현저한 효과가 보다 덜하며, 투과액 혼탁도는 PBS 및 PBS/PVA 조건에 대부분 상당한다.
PBS 또는 PVA를 함유하는 PBS를 사용한 세포의 투석 여과
시험 투석 여과 개시 투석 여과 종료 비율(투과액) 완충액
VCD 투과액 혼탁도 투과액 혼탁도
x 106개의 세포/ml NTU NTU NTU/106개의 세포/ml
1a 55 9.1 54.5 1.0 PBS
1b 55 12.5 40.7 0.7 PBS/PVA
2a 57 13.3 77.8 1.1 PBS
2b 57 11.9 64.3 1.1 PBS/PVA
3a 73 14.1 80.8 1.1 PBS
3b 73 15.1 87.3 1.2 PBS/PVA
투석 여과 완충액 중의 PVA의 존재 또는 부재하에 생존 가능한 세포 밀도(VCD) 및 생존 가능한 세포 손실 시험은 명백하게는 PVA를 함유하는 투석 여과 완충액의 보호 성질을 보여준다(참조: 표 3). 시험 3에서 이러한 세포 손실로부터 생성된 혼탁 물질은 여과 장치의 보유액측 상에 잔류하므로, 투과액 혼탁도에서 현저한 증가를 반영하지 않는다. 이는 투석 여과 개시시 증가된 생존 가능한 세포 밀도를 고려하게 하며, 예를 들면, 추가의 케이크 형성 및/또는 막 분극화를 통해 필터의 보유능을 변화시킬 수 있다.
모든 시험에서 PVA의 포함을 통한 생존 가능한 세포 손실의 최소화(시험 1 내지 3)는 공정 스트림의 여과 특성을 개선시키고, 기공 막힘 메카니즘을 통한 필터 블라이딩의 위험을 감소시킨다.
표 2의 시험 1 내지 3에서 투석 여과 전 및 후의 생존 가능한 세포 밀도
시험 투석 여과 개시 투석 여과 종료 생존 가능한 세포 손실 완충액
VCD VCD
x 106개의 세포/ml x 106개의 세포/ml x 106개의 세포/ml
1a 55 42 13 PBS
1b 55 47 8 PBS/PVA
2a 57 40 17 PBS
2b 57 40 14 PBS/PVA
3a 73 49 24 PBS
3b 73 59 14 PBS/PVA
기타 양태
본 발명을 상세한 설명과 관련하여 기술하였지만, 상기 설명은 본 발명을 예시하기 위함이며, 첨부된 특허청구범위의 범위에 의해 한정된 본 발명의 범위를 이로 한정하고자 하는 것은 아니다. 기타 측면, 이점 및 변형은 다음 특허청구범위의 범주 내에 포함된다.

Claims (26)

  1. (a) 세포 배양물의 수거 미세여과로부터의 보유액(retentate)인, 투석 여과 (diafiltration)를 위한 보유액을 제공하는 단계,
    (b) 비이온성 계면활성제를 상기 보유액에 첨가하는 단계, 및
    (c) 상기 보유액의 투석여과를 수행하여 세포 배양물 기원의 생성물을 수거하는 단계를 포함하는, 투석 여과에 의해 세포 배양물로부터 생성물을 수거하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 플루로닉(Pluronic
    Figure 112013018483271-pct00012
    ) F68인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 폴리비닐 알코올(PVA)인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 완충액 중에 존재하는, 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 완충액 중에 존재하고, 상기 완충액 중의 상기 비이온성 계면활성제의 농도가 0.2 내지 4g/ℓ, 0.2 내지 3g/ℓ, 0.5 내지 2.5g/ℓ, 0.5 내지 2g/ℓ, 및 0.5 내지 1.5g/ℓ인, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 완충액 중의 상기 비이온성 계면활성제의 농도가 1g/ℓ 또는 2.5g/ℓ인, 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 보유액이 세포 및 배양 배지를 포함하는, 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 투석 여과로부터 수득된 여액의 혼탁도가 비이온성 계면활성제의 부재하에 수행된 투석 여과와 비교하여 감소되는, 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 비이온성 계면활성제의 존재하에 보유액으로부터의 생성물의 정량적 또는 정성적 회수가 비이온성 계면활성제의 부재하의 생성물 회수와 비교하여 증가되는, 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 보유액이 약제학적 생성물을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 보유액이 재조합 단백질을 포함하는, 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 보유액이 상기 보유액 중의 세포에 등장성인 완충액을 포함하는, 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 보유액이 인산염 완충된 염수(PBS)를 포함하는, 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 투석 여과 단계가 20 내지 25℃, 2 내지 37℃, 또는 2 내지 25℃의 온도에서 수행되는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 투석 여과가 불연속 투석 여과인, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 투석 여과가 일정 용적 투석 여과인, 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제의 농도가 투석 여과 동안 사실상 변하지 않는, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 세포 배양 배지 중에 존재하는, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제의 농도가 1g/L로 유지되는, 방법.
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